CN102952761A

CN102952761A - 一株能将奎宁酮转化为(r)-3-奎宁醇的诺卡氏菌及转化方法

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Publication number: CN102952761A
Application number: CN2011102446456A
Authority: CN
Inventors: 李键煚; 王玉; 吴洽庆; 朱敦明
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: CN102952761B

Abstract

本发明公开了一株诺卡氏菌WY1202及用该菌发酵奎宁酮生产(R)-3-奎宁醇的方法。本发明菌种以奎宁酮盐酸盐为唯一碳源，是从天津市西青区农家果园土壤中筛选而得。菌株Nocardia sp.WY1202现保藏在中国普通生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.5095。生产方法为：采用诺卡氏菌WY1202为菌种，经过一级种子培养和二级发酵扩大培养，取发酵培养液，离心收集菌体并洗涤菌体，将菌体重悬于缓冲液中，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖，反应24-48h后，离心分离，上清液调pH值至碱性，减压旋干，得到的残留物用有机溶剂固液萃取，滤液旋干得到(R)-(-)-3-奎宁醇，且产物的产率为95％、纯度为96％、e.e.值＞95％，反应过程中操作简单，能耗低，符合绿色化学要求，可应用于较大规模的(R)-(-)-3-奎宁醇生物转化生产。

Description

一株能将奎宁酮转化为(R)-3-奎宁醇的诺卡氏菌及转化方法

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，本发明涉及一种发酵合成手性奎宁醇的菌株及其生产方法。

背景技术：

(R)-(-)-3-奎宁醇，英文名：(R)-(-)-3-Quinuclidinol，化学名：(R)-(-)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-醇，分子式为C₇H₁₃NO，分子量为127.18，CAS号为25333-42-0，EINECS号为246-857-6，R-3-奎宁醇纯品为白色晶体，熔点为217-224℃，沸点为120℃，比旋光度为-44.5°(c＝3g/100ml，1N HCl)，在水中的溶解度为100g/100mL。(R)-3-奎宁醇是合成多种抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛(Bossard P.[P].DE19715465，1997)和瑞伐托酯(尤启冬，林国强，手性药物：研究与应用北京：化学工业出版社，2004，294.)等都是含有(R)-3-奎宁醇的最新抗胆碱药物，其对于治疗尿频尿失禁和慢性阻塞性肺病都有很好的疗效。手性药物是当前研究的热点，(R)-3-奎宁醇制备方法的研究对于许多抗胆碱药物的合成具有十分重要的意义。同时(R)-3-奎宁醇也是手性催化剂的重要前体(Nomoto F.[P].JP10210997，1998)，广泛应用于各种不对称氢化反应中。

现有的合成(R)-3-奎宁醇的方法主要有化学合成和生物催化合成两种方法。

化学方法合成

一、以奎宁酮为原料先合成奎宁醇，再拆分为(R)-3-奎宁醇

1.以4-乙烯基吡啶为原料合成3-奎宁醇(Aaron H.S.，Owens O.O.Synthesis of3-quinuclidinol by the cyclodehydration of(4-piperidyl)-1，2-ethanediol.J.Org.Chem，1965，30(4)：1331-1333)。4-乙烯基吡啶在冷的高锰酸盐水溶液中被氧化为(4-吡啶)-1，2-乙二醇，(4-吡啶)-1，2-乙二醇在酸性环境中被氢化为相应的哌啶乙二醇盐酸盐，哌啶乙二醇盐酸盐在300℃活性氧化铝的催化下生成3-奎宁醇。

2.以奎宁酮为原料合成3-奎宁醇(Klaus K.J.Labelled Compd.RadioPharm，1989，27(9)：983-993)。在0℃-5℃条件下，向奎宁酮盐酸盐的甲醇溶液中，分批加入NaBH₄，TLC控制反应，还原得到奎宁醇。反应进行的非常迅速，是制备3-奎宁醇较实用的方法。

奎宁醇消旋体先经过乙酸酐衍生，再通过拆分剂酒石酸等手性识别，选择性的生成(R)-3-奎宁醇(Ringdahl，B.，Resul，B.，Dahlbom，R.Facile preparation of the enantiomers of3-acetoxyquinucline and 3-quinuxlidinaol.Acta Pharm.Suee.，1979(16)：281-283)。

二、以奎宁酮为原料不对称合成(R)-3-奎宁醇

奎宁酮为反应前提，以二茂铁衍生物、[RuCl(P-cymene)&]Cl等配体为手性催化剂，合成得到(R)-3-奎宁醇(Masaya I.Biocatalysis from the perspective of an industrial practitioner：let abiocatalyst do a job that no chemocatalyst can.Catal.Today，2004(96)：93-102)。

用化学方法合成(R)-3-奎宁醇反应步骤多，副反应多，对环境污染严重。理论产率为50％，得到的奎宁醇光学纯度不高。

生物催化合成

1.通过微生物或者酶不对称拆分3-奎宁醇衍生物的方法合成。如曲霉菌蛋白酶(Aspergillus melleus)(Rehavi M.，Maayani S.Enzymic resolution and cholinergic properties of3-quinuclidinol derivatives.Life.Sci.，1977，21(9)：1293-1302.)，枯草杆菌蛋白酶(David C，US5215918，1993)等，其产率为42％，e.e.值为96％。它是通过拆分奎宁醇衍生物的消旋体来得到手性化合物，其理论产率为50％。这种方法得到的(R)-3-奎宁醇光学纯度不高，并有衍生反应。

2.利用微生物细胞或者酶催化3-奎宁酮的不对称还原合成(R)-3-奎宁醇，此种方法大大简化了实验步骤，并且理论产率可以达到100％，具有很大的应用前景。到目前为止，研究发现的奎宁酮还原酶的微生物有真菌中的红酵母属Rhodotorula(Atsuko U.，Fumiki N.，Akiko S.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2009(83)：617-626)，假丝酵母属Candida(Akikazu M.，Takeshi H.[P].JP10243795，1997)，短梗霉属Aureobasidium(Makato G.，Makato U.[P].JP2000245495，2000)等，细菌中的产碱杆菌属Alcaligenes，棒状杆菌属Corynebacterium(Makato G.，MakatoU.[P].JP2000245495，2000)等。

本发明过程中，通过大量微生物筛选，国内首次发现了一种放线菌Nocardia sp.WY1202，它能高效催化奎宁酮盐酸盐不对称合成手性化合物(R)-3-奎宁醇，反应过程中不需要添加辅酶体系，不需要衍生化就可一步合成产品醇，产量和立体选择性高。筛选得到的Nocardia sp.WY1202菌体易于培养，催化稳定，环境适应性强。催化反应条件温和，反应过程简单，易于操作，能耗低，产率高，副产物少，符合绿色化学要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效利用奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的诺卡氏菌株。

本发明的另一目的是提供一种用诺卡氏菌株发酵奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的生产方法。

本发明提供的一株转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇的诺卡氏菌，命名为诺卡氏菌Nocardiasp.WY1202，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.5095。菌株Nocardia sp.WY1202是从天津市西青区农家果园里分离、筛选得到的一株革兰氏阳性细菌。

本发明中的诺卡氏菌株WY1202具有以下生物学特性：

1形态特征：诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202革兰氏染色结果为阳性。基丝有横隔，形成球形膨胀孢子状结构，气丝断裂为长杆状。

2培养特征：菌落表面皱褶，隆起，边缘波状，表面无光泽，质地干燥。颜色黄色。菌株WY1202菌落照片见图1。

3生理生化特征

注：“+”代表阳性反应，“-”代表阴性反应。

该菌株的16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有如序列表中所示的核苷酸序列，序列长度为1394bp。

根据其形态特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列，鉴定该菌株为诺卡氏菌(Nocardiasp.)。

使用本发明的诺卡氏菌株转化奎宁酮盐酸盐为(R)-3-奎宁醇的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养

将诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202接入灭菌后的种子液体培养基中，于30～37℃，200～250r/min培养24～48h，得到种子液。

所述种子培养基成分为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0。

(2)发酵培养

将步骤(1)得到的种子液按接种量1～10％接种到发酵培养基中进行发酵培养。培养条件：30～37℃，摇床转速200～250r/min，发酵时间48～60h，即得到诺卡氏菌的发酵液。

所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15～20g/L，酵母提取物3g/L，蛋白胨7g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0。

(3)生物催化反应

用培养后的发酵液获得的湿菌体作为酶源，以奎宁酮盐酸盐的磷酸缓冲液为底物，葡萄糖为辅助底物进行反应。底物浓度为1-9g/L，缓冲液pH值在6.5-9，更优的范围为7-8.5，转化温度为20-50℃，最佳温度为30℃，转化反应时间为24-48h，一般48h反应完全。

(4)后处理过程

反应液离心分离，全细胞沉淀水洗，再离心，两次得到的上清液合并后用饱和碳酸钾、氢氧化钠等无机碱调节pH值至9-14，最佳pH值为10-12，然后减压旋蒸，得到的残留物用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲苯等有机溶剂固液萃取，滤液旋干得部分(R)-3-奎宁醇产品。滤饼溶于二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂中搅拌半小时后过滤，滤液旋干得到粗产品，再用丙酮、二氯甲烷等有机溶剂重结晶得另一部分(R)-3-奎宁醇产品。

(5)(R)-3-奎宁醇产率和对映体过量值的鉴定

产品产率和对映异构体过量(e.e.值)值采用手性气相色谱法(GC)测定。样品处理方法：反应结束后，反应液用氢氧化钠溶液调pH值至12，适量的异辛醇萃取，无水Na₂SO₄干燥，过滤，GC分析。使用Agilent 7890气相色谱仪，Gamma DEX 225气相毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色谱条件为：温度：120℃；保留时间：35min；柱流速：0.2ml/min；载气：He；进样口温度：220℃；检测口温度：220℃。

本发明的有益效果：发现了一种能高效催化奎宁酮盐酸盐不对称合成手性化合物(R)-3-奎宁醇的菌体Nocardia sp.WY1202，且反应过程中无需衍生化就可一步合成产品醇，理论产率为100％，实际产率95％。Nocardia sp.WY1202具有高选择性，奎宁醇的对映异构体过量值大于95％。筛选得到的Nocardia sp.WY1202菌体易于培养，催化稳定，催化环境适应性强，催化反应条件温和，反应过程简单，易于操作，能耗低，产率高，副产物少，符合绿色化学要求。

附图说明

图1所示的是诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202的菌落形态图；

图2所示的是实施例2中Nocardia sp.WY1202的生长曲线及产羰基还原酶曲线；

图3所示的是实施例3中碳源的单因素实验，分别是葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉、柠檬酸、麦芽糖七种碳源；

图4所示的是实施例3中氮源的单因素实验，分别是酵母提取物、蛋白胨、酵母提取物∶蛋白胨＝8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，牛肉膏，玉米浆11种氮源。

图5所示的是购买的(R)-3-奎宁醇标样的GC图谱；

图6所示的是实施例4中转化产品(R)-3-奎宁醇的GC图谱。

具体实施方式

下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1.1培养基

无机盐培养基：K₂HPO₄·3H₂O 1.0g，Na₂HPO₄·3H₂O 1.0g，(NH₄)₂HPO₄ 2.0g，NaNO₃ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 10mg，FeSO₄·7H₂O 1.0mg，ZnSO₄ 0.1mg，蒸馏水1000mL。

无机盐培养基中加入一定浓度的奎宁酮盐酸盐配成相应的富集培养基。

1.2菌株的分离纯化

将采集的样品取5g放入含有50mL无菌水的250mL摇瓶中，加入玻璃珠，250r/min的摇床上振荡2h，静置3-5min，待土壤颗粒沉淀后，从中取2mL上清加入到50mL液体富集培养基(含奎宁酮盐酸盐5g/L)中。30℃，200r/min摇床上培养3-4天后，按2％接种量转移到下一批富集培养基中(含奎宁酮盐酸盐7g/L)，同条件培养3-4天。取富集培养液稀释涂平板(含奎宁酮盐酸盐7g/L的固体富集培养基)，分离，纯化直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上。

1.3菌株将奎宁酮转化为3-奎宁醇能力的测定

将纯化后的单个菌株从斜面接种到液体发酵培养基(葡萄糖15g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0)中，以不接菌的培养液作对照，30℃，200r/min摇床上振荡培养至培养基明显浑浊时，加入5g/L奎宁酮盐酸盐开始反应，分别转化48h，72h，96h后取样分析。取培养液用饱和的K₂CO₃调pH值至碱性，用等体积的正丁醇萃取两次，每次涡旋振荡10min以萃取充分，12000r/min离心10min，取上清并合并萃取液，进行TLC分析。展开剂为MeOH∶CH₂Cl₂∶NH₃＝50∶1∶1，碘粉中显色。

通过上述方法筛选得到一株能高效转化奎宁酮盐酸盐为(R)-3-奎宁醇的菌株。该菌株基丝有横隔，形成球形膨胀孢子状结构，气丝断裂为长杆状。菌落表面皱褶，隆起，边缘波状，表面无光泽，质地干燥，呈现革兰氏染色阳性。只能利用小部分的碳源，如葡萄糖等，不能水解淀粉，不能使明胶液化，使牛奶凝固。进一步以该菌株的总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到扩增片段经回收、测序。根据形态特征、生理生化特征及其16S rDNA基因序列，鉴定该菌株为诺卡氏菌(Nocardia sp.)。

实施例2：诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202的催化特性

诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202在实施例1中发酵培养基中30℃下培养的生长曲线及产酶曲线如图2所示。由图2可见在菌体培养的前40h，转化率随着菌体的生长而升高，在对数生长期中后期(40h)转化率最高，达到92.7％。在菌体培养后期，对奎宁酮的转化率开始下降，但下降不明显。

实施例3：诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202发酵条件的初步优化

1碳源的单因素实验

发酵培养基中不同碳源的添加量均为15g/L。

表1，不同碳源发酵培养的菌体转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇的反应

从图3结果可以看出，甘油是最适合菌体生长的碳源，其次是葡萄糖，但是对于奎宁酮的转化，甘油不是特别理想的碳源。以葡萄糖为碳源时，对奎宁酮的转化率最高，综合考虑转化率和细胞干重，葡萄糖为最优的碳源。

2氮源的单因素实验

发酵培养基中不同氮源的添加量均为10g/L。

表2，不同氮源发酵培养的菌体转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇的反应

从图4结果可以看出，以复合氮源(酵母提取物∶蛋白胨＝3∶7)培养的菌体转化奎宁酮的能力最强，转化率最高，但是以此为氮源时，菌体的生长不是最好的。复合氮源(酵母提取物∶蛋白胨＝7∶3)是最适合菌体生长的氮源，但对奎宁酮的转化不是很理想。综合比较转化率和生物量，选取复合氮源(酵母提取物∶蛋白胨＝3∶7)为最优氮源。

实施例4：菌株转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇的方法

1制备种子液

将诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202接入灭菌后的液体培养基中，于30℃培养48h，摇床转速200r/min，得到种子液。

所述液体培养基按下述比例配置：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0。

2发酵扩大培养

将步骤1得到的种子液体按接种量1％接种到发酵培养基中进行发酵培养。培养条件：30℃，摇床转速200r/min，发酵时间48h，即得到诺卡氏菌的发酵液。

所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15g/L，酵母提取物3g/L，蛋白胨7g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0。

3(R)-3-奎宁醇的制备和鉴定

取1.5L诺卡氏菌发酵液，离心收集菌体，得到15.8g湿菌体，用100mmol/L，pH为8.0的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液洗涤2次后重新悬浮于150mL同一缓冲液中，加入1g底物奎宁酮盐酸盐，葡萄糖2.25g，30℃，200r/min的摇床上反应，24h后停止反应，离心分离，全细胞沉淀用水洗，再离心，两次得到的上清液合并后用氢氧化钠溶液调节pH值到12，然后减压旋蒸，得到的残留物用二氯甲烷固液萃取，滤液旋干得部分(R)-3-奎宁醇产品。滤饼溶于二氯甲烷中搅拌半小时后过滤，滤液旋干得到粗产品，再用丙酮重结晶得另一部分(R)-3-奎宁醇产品，两次得到的(R)-3-奎宁醇共0.74g。产率为95％，用GC检测产品纯度为96％，e.e.值大于95％。GC图谱5为(R)-3-奎宁醇标准品，图6为本实例转化产品(R)-3-奎宁醇。

Claims

1.诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5095。

2.由权利要求1所述菌株能转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇。

3.权利要求1所述菌株的发酵培养方法，其包括步骤：

1)种子培养

将诺卡氏菌Nocardia sp.WY1202接入灭菌后的种子液体培养基中，于30～37℃，200～250r/min培养24～48h，得到种子液，

液体培养基的配制如下：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠1g/L，pH为7.0；

2)发酵培养

将步骤(1)得到的种子液体按接种量1～10％接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件：30～37℃，摇床转速200～250r/min，发酵时间48～60h，即得到诺卡氏菌的发酵液，

4.一种制备权利要求2所述的(R)-3-奎宁醇的方法，其包括如下步骤：

1)收集菌体：发酵培养权利要求1所述的菌株，得到发酵液，离心收集菌体，得到湿菌体；

2)转化反应：用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液洗涤湿菌体后重新悬浮于同一缓冲液中，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖，在20-50℃摇床上反应，反应24-48h后，停止反应；

3)分离纯化(R)-3-奎宁醇产品：

反应液离心分离，上清液用无机碱调节pH值到9-14，然后减压旋蒸，得到的残留物用二氯甲烷等有机溶剂固液萃取，滤液旋干得部分(R)-3-奎宁醇产品。滤饼溶于二氯甲烷等有机溶剂中搅拌半小时后过滤，滤液旋干得到粗产品，再用丙酮等有机溶剂重结晶得另一部分(R)-3-奎宁醇产品。

5.本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。