JPS58155098A - 微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法 - Google Patents
微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法Info
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- JPS58155098A JPS58155098A JP57037116A JP3711682A JPS58155098A JP S58155098 A JPS58155098 A JP S58155098A JP 57037116 A JP57037116 A JP 57037116A JP 3711682 A JP3711682 A JP 3711682A JP S58155098 A JPS58155098 A JP S58155098A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅ−ｏ
ｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）の製造方法・ζ係わり
、特に、微生物変換の方法により、出発物質としてのり
トコール酸（Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）か
ら目的物質としてのウルソデオキシコール酸を製造する
方法に関するものである。
ｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）の製造方法・ζ係わり
、特に、微生物変換の方法により、出発物質としてのり
トコール酸（Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）か
ら目的物質としてのウルソデオキシコール酸を製造する
方法に関するものである。
この発明の目的物質としてのウルソデオキシコール酸は
第１図書と示す構造式（Ｉ）で表わされるように、ステ
ロイド環の３α及びＴβの位置啓こ水酸基を有する胆汁
酸の一つである。
第１図書と示す構造式（Ｉ）で表わされるように、ステ
ロイド環の３α及びＴβの位置啓こ水酸基を有する胆汁
酸の一つである。
この物質は従前から利胆剤として多用されているが近年
番ζ至うては、胆石溶解作用を有することが認められ、
特務と、−口投与によるコレステロール胆石の治療に有
効であることを示す多数の治験データが報告されている
。
番ζ至うては、胆石溶解作用を有することが認められ、
特務と、−口投与によるコレステロール胆石の治療に有
効であることを示す多数の治験データが報告されている
。
ウルソデオキシコール酸は、天然には熊の胆汁中番こ存
在し、それより抽出することもできるが、自然界中の存
在量は極少であり、応需困難であるので、従前から化学
的合成による製造方法が採用されてきた。
在し、それより抽出することもできるが、自然界中の存
在量は極少であり、応需困難であるので、従前から化学
的合成による製造方法が採用されてきた。
化学的合成による従前の製造方法では、第２図の化学反
応式に示されるように、出発物質としてのコール酸（５
）のカルボ牛シル基をメチル化し罰、次いで、無水酢酸
により３α位及びγα位の水酸基をアセチル化スるＩＶ
）。
応式に示されるように、出発物質としてのコール酸（５
）のカルボ牛シル基をメチル化し罰、次いで、無水酢酸
により３α位及びγα位の水酸基をアセチル化スるＩＶ
）。
クロム酸でもって酸化し、カルボニルとしたＭ後、更に
、これをケン化することにより、１２−ケトケノデオキ
シコール酸■を得る。
、これをケン化することにより、１２−ケトケノデオキ
シコール酸■を得る。
次に、この１２−ケトケノデオキシコール酸的の１２位
のカルボニルをファンーミンロン（Ｈｕａｎｇ−Ｍｉｎ
ｌｏｎ）法番こより還元し、ケノデオキシコール酸（■
）を得る。
のカルボニルをファンーミンロン（Ｈｕａｎｇ−Ｍｉｎ
ｌｏｎ）法番こより還元し、ケノデオキシコール酸（■
）を得る。
更に、ケノデオキシコール酸（■）のアセトン溶液にＮ
−ブロムコハク酸イミドを加えて１α位の水酸基を酸化
することにより、７−ケトリトコール酸（Ｖｌ）を得る
。
−ブロムコハク酸イミドを加えて１α位の水酸基を酸化
することにより、７−ケトリトコール酸（Ｖｌ）を得る
。
そして、最後に、Ｔ−ケトリトコール酸（■）をｎ−ブ
タノール中にて金属ナトリウムにより、接触還元して、
目的物質としてのウルソデオキシコール酸（Ｉ）を得る
ものであった。
タノール中にて金属ナトリウムにより、接触還元して、
目的物質としてのウルソデオキシコール酸（Ｉ）を得る
ものであった。
しかしながら、かかる従前の製造方法はＴ段階にも及ぶ
複雑な工程を含むので、反応処理時間が長大になるばか
りか各工程ごとに精製作業を必要とするので、処理作業
が煩雑で生産能率が良好でないという欠点を伴っていた
。
複雑な工程を含むので、反応処理時間が長大になるばか
りか各工程ごとに精製作業を必要とするので、処理作業
が煩雑で生産能率が良好でないという欠点を伴っていた
。
その上、各工程にて望ましくない副反応を生じ易いので
、収率が低いという難点もあった。
、収率が低いという難点もあった。
この発明の目的は、上記従来技術に基づくウルソデオキ
シコール酸の生産能率等の問題点に艦み、微生物変換の
方法を用いて出発物質としてのりトコール酸から目的物
質としてのウルソデオキシコール酸を直接的に生産する
ことにより、上記欠点を除去し、難点を克服し、反応処
理時間が著しく短かく、生産能率が良好で、し １か
も、収率の高い優れたウルソデオキシコール酸の製造方
法を提供せんとするものである。
シコール酸の生産能率等の問題点に艦み、微生物変換の
方法を用いて出発物質としてのりトコール酸から目的物
質としてのウルソデオキシコール酸を直接的に生産する
ことにより、上記欠点を除去し、難点を克服し、反応処
理時間が著しく短かく、生産能率が良好で、し １か
も、収率の高い優れたウルソデオキシコール酸の製造方
法を提供せんとするものである。
上記目的に沿うこの発明の構成は、第３図暴ζ示すよう
に、フザリウム属（Ｆｕｓｍｒｉｓｎｎ属）ＩＣ属
（する特定の不完全菌群、即ち、特定のカビ群の一つを
出発物質としてのリトコール酸（ＩＸ）に接触させてス
テロイド環の１位の炭素原子に対しテ水酸基をＢｌｌに
特異的に導入することにより、目的物質としてのウルソ
デオキシコール酸（Ｉ）を製造することを要旨とするも
のである。
に、フザリウム属（Ｆｕｓｍｒｉｓｎｎ属）ＩＣ属
（する特定の不完全菌群、即ち、特定のカビ群の一つを
出発物質としてのリトコール酸（ＩＸ）に接触させてス
テロイド環の１位の炭素原子に対しテ水酸基をＢｌｌに
特異的に導入することにより、目的物質としてのウルソ
デオキシコール酸（Ｉ）を製造することを要旨とするも
のである。
より・詳細ｊとは、この発明の方法はダトコール腋から
ウルソデオキシコール酸への変＃１爺を有するフザリ９
ム属−こ属する菌株、典型的には、７ザリウムエクイー
ｋ ｆ ４ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ）
Ｍ−４１株（以下、Ｍ−４１株という）の一部若しくは
全部をリトコール酸に対して接触させることにより、微
生物変換の方法を用いてウルソデオキシコール酸を製造
する方法であって、具体的には下記の方法を包含する。
ウルソデオキシコール酸への変＃１爺を有するフザリ９
ム属−こ属する菌株、典型的には、７ザリウムエクイー
ｋ ｆ ４ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ）
Ｍ−４１株（以下、Ｍ−４１株という）の一部若しくは
全部をリトコール酸に対して接触させることにより、微
生物変換の方法を用いてウルソデオキシコール酸を製造
する方法であって、具体的には下記の方法を包含する。
１１１１Ｊ）コール酸の存在する培地にて上記特定の菌
株群を培養することにより、培地中にウルソデオキシコ
ール酸を蓄積させてこれを採取する方法。
株群を培養することにより、培地中にウルソデオキシコ
ール酸を蓄積させてこれを採取する方法。
、２）上記特定の菌株群が良好に生育する栄養培地にて
該菌株群を培養して得た菌体をリトコール酸に接触させ
ることにより、ウルソデオキシコール酸を生成させて、
これを採取する方法。
該菌株群を培養して得た菌体をリトコール酸に接触させ
ることにより、ウルソデオキシコール酸を生成させて、
これを採取する方法。
（３）馬鈴薯澱粉またはオートミール培地番こて、上記
特定の菌株群を胞子の形成に至るまで培養し、該胞子を
採取し、これを蒸留水あるいは緩衝液中に’Ｊ）コール
酸と共に懸濁し、胞子をリトコール酸に接触させること
により、ウルソデオキシコール酸を生成させて、これを
採取する方法。
特定の菌株群を胞子の形成に至るまで培養し、該胞子を
採取し、これを蒸留水あるいは緩衝液中に’Ｊ）コール
酸と共に懸濁し、胞子をリトコール酸に接触させること
により、ウルソデオキシコール酸を生成させて、これを
採取する方法。
更に付言すれば、上記（１）の方法では、リトコール酸
の添加時期は培養工程の適宜の段階でよく、例えば、菌
株を栄養培地にて培養した機番と、リトコール酸を添加
してもよい。− 次に、上記（２）の方法では、培養液から菌体を一旦分
離した後に、これをリトコール酸の溶液あるいは懸濁液
中番ζ投入してもよい。また、分離した画体をポリアク
リルアミドやカルシウムアルギネート等を用いて固定化
した後に１３ ）コール酸番こ接触させてもよい。
の添加時期は培養工程の適宜の段階でよく、例えば、菌
株を栄養培地にて培養した機番と、リトコール酸を添加
してもよい。− 次に、上記（２）の方法では、培養液から菌体を一旦分
離した後に、これをリトコール酸の溶液あるいは懸濁液
中番ζ投入してもよい。また、分離した画体をポリアク
リルアミドやカルシウムアルギネート等を用いて固定化
した後に１３ ）コール酸番こ接触させてもよい。
更に、上記（３）の方法では、反応液中に有機物質、典
型的には、グルコース、その他の炭水化物、カゼイン加
水分解物等を低濃度に添加して゛もよい。また、採取さ
れた胞子を、画体の場合と同゛様に、固定化した機番こ
りトコール酸ｌζ接触させることは随意である。
型的には、グルコース、その他の炭水化物、カゼイン加
水分解物等を低濃度に添加して゛もよい。また、採取さ
れた胞子を、画体の場合と同゛様に、固定化した機番こ
りトコール酸ｌζ接触させることは随意である。
以上のように、この発明はリトコーに酸ｔＰ ６ウルソ
デオ牛シコール酸への変換能を有するフザリウム属に属
する特定の菌株群、典型的には、フザリウム エクイ七
ティＭ−４１株を、出発物質としてのＩＪ ）コール酸
に対して接触させることにより、微生物変換の方法を用
いて目的物質としてのウルソデオキシコール酸を直接的
に製造する方法を構成しているので、従前の化学的合成
の方法のように、Ｔ段階にも及ぶ工程の各段階ごとに処
理作業を行う必要がなく、処理作業の観点からは、実質
的に１段階の反応工程でもって目的物質を製造すること
ができる。
デオ牛シコール酸への変換能を有するフザリウム属に属
する特定の菌株群、典型的には、フザリウム エクイ七
ティＭ−４１株を、出発物質としてのＩＪ ）コール酸
に対して接触させることにより、微生物変換の方法を用
いて目的物質としてのウルソデオキシコール酸を直接的
に製造する方法を構成しているので、従前の化学的合成
の方法のように、Ｔ段階にも及ぶ工程の各段階ごとに処
理作業を行う必要がなく、処理作業の観点からは、実質
的に１段階の反応工程でもって目的物質を製造すること
ができる。
したがって、この発明Ｇとよれば、反応時間が大幅に短
縮し、而して、生産能率が格段に向上するという優れた
効果がある。
縮し、而して、生産能率が格段に向上するという優れた
効果がある。
更に、この発明番ζよれば、微生物変換に際して望まし
くない副反応を伴わないので、目的物質を５０９６にも
及ぶ高収率でもって製造することができるという優れた
効果もある。
くない副反応を伴わないので、目的物質を５０９６にも
及ぶ高収率でもって製造することができるという優れた
効果もある。
次に、この発明の方法に使用する微生物の一実施例であ
るＭ−４１株の培地における生育形態を説明すれば以下
の通りである。
るＭ−４１株の培地における生育形態を説明すれば以下
の通りである。
該菌株を馬鈴薯寒天（ＰＤＡ）培地に接種して、ｎｏ’
ｃｓζて培養すると、培養の初期魯ζは、分生子柄（ｃ
ｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ）の横に単独の種子（ｐｈｉ
ａｌｉｄｅ）をつ（す、そこから大胞子（ｍａｃｒｏｃ
ｏｎｄｉａ）を生じて参り、該種子の大きさはＬｉ 〜
５ＸＩＯ〜１２．ｉ ｓｔｎである。
ｃｓζて培養すると、培養の初期魯ζは、分生子柄（ｃ
ｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ）の横に単独の種子（ｐｈｉ
ａｌｉｄｅ）をつ（す、そこから大胞子（ｍａｃｒｏｃ
ｏｎｄｉａ）を生じて参り、該種子の大きさはＬｉ 〜
５ＸＩＯ〜１２．ｉ ｓｔｎである。
分生子柄は決して分生子鹿（５ｐｏｒｏｄｏｃｈｉａ
）をつくらない。２遍間後には、分生子柄の先端近くで
、ホウキ状に分枝し、その先端番ζ！〜４個の種子をつ
（す、該種子の形はトクリ形（ｏｂ−ｃｌａｖａｔｅ）
であって、最初に、分生子柄の横にできた種子よりもや
や大会（、Ｓ−４×１２〜１μｍである。
）をつくらない。２遍間後には、分生子柄の先端近くで
、ホウキ状に分枝し、その先端番ζ！〜４個の種子をつ
（す、該種子の形はトクリ形（ｏｂ−ｃｌａｖａｔｅ）
であって、最初に、分生子柄の横にできた種子よりもや
や大会（、Ｓ−４×１２〜１μｍである。
大胞子（ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉｉ ）は、紡錘形、三
日月形、を含む種々の形状を有し、その大きさも一定し
ていない。大胞子の巾は太くなく、特Ｋ。
日月形、を含む種々の形状を有し、その大きさも一定し
ていない。大胞子の巾は太くなく、特Ｋ。
両端は細い。多くの大胞子は、Ｓつの隔壁（ｓｅｐｉｍ
）ヲ持チ、’ｔの大ｍｓは、Ｓ、 ＠ ｗ４． Ｓ Ｘ
Ｈｅ〜＠１＃ｍである。３つの隔壁を持つ大胞子も認
められ、その大きさは、３．１〜４．１ＩＸ３０〜３・
μｍである。
）ヲ持チ、’ｔの大ｍｓは、Ｓ、 ＠ ｗ４． Ｓ Ｘ
Ｈｅ〜＠１＃ｍである。３つの隔壁を持つ大胞子も認
められ、その大きさは、３．１〜４．１ＩＸ３０〜３・
μｍである。
小胞子（＋ｎ１ｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ ）の形成は、き
わめて少い。
わめて少い。
また、分生子柄の中間に球形あるいは楕円形の厚膜胞子
をつくり、球形のものは、その直径が１〜ＳμＩｎであ
り、楕円形のものは、その長径が５〜８．７Ｘ１１〜１
２．ｓμｍである。
をつくり、球形のものは、その直径が１〜ＳμＩｎであ
り、楕円形のものは、その長径が５〜８．７Ｘ１１〜１
２．ｓμｍである。
かかるＭ−４１株を馬鈴薯（ＰＤＡ）培地にて４日間培
養すると、直径がそれぞれ３１°Ｃでは４．４Ｃｍ、ｚ
ｙ’ｅでは’ａ、 Ｉ ｃｍ、２ｓＣではＳ、５ＣＩｎ
のコロニーが形成される。
養すると、直径がそれぞれ３１°Ｃでは４．４Ｃｍ、ｚ
ｙ’ｅでは’ａ、 Ｉ ｃｍ、２ｓＣではＳ、５ＣＩｎ
のコロニーが形成される。
更に、トウモロコシ寒天、オートミール寒天ならびに馬
鈴薯寒天培地にて２Ｓ℃及びｇ ｏ ’ｃで２ケ月培養
したけれども子嚢果、子嚢、子嚢胞子の形成は認められ
ない。
鈴薯寒天培地にて２Ｓ℃及びｇ ｏ ’ｃで２ケ月培養
したけれども子嚢果、子嚢、子嚢胞子の形成は認められ
ない。
そして、オートミール寒天培地（オートミールａｏ ｇ
、寒天２０ｇ、水道水１ｚ、ｐｎｓ、ｓ）を用いて２８
°Ｃにて３６時間培養したときのＭ−４１株の生育形態
を績微鏡写真（倍率・００倍）で示すものが第４囚であ
る。
、寒天２０ｇ、水道水１ｚ、ｐｎｓ、ｓ）を用いて２８
°Ｃにて３６時間培養したときのＭ−４１株の生育形態
を績微鏡写真（倍率・００倍）で示すものが第４囚であ
る。
上記の生育形態を有するＭ−４１株に関して、ブースの
分類、（Ｂｏｏｔｈ、 Ｃ，、ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｆ
ｕｓａｒｉｕ＋ｎ：ｇｏｍ＋ｎｏｎｗｅａ１ｔｈ Ｍｙ
ｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｗ。
分類、（Ｂｏｏｔｈ、 Ｃ，、ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｆ
ｕｓａｒｉｕ＋ｎ：ｇｏｍ＋ｎｏｎｗｅａ１ｔｈ Ｍｙ
ｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｗ。
８ｕｒｒｅｙ（１＠７１））を参照して同定を試みたと
ころ、Ｓつの隔壁を持つ大胞子が、ブース（Ｂｏｏｔｈ
）の記載よりやや長い（Ｓμ＋ｎ）ものがあるが、そ
の他の生育形態は、ｈ旦Ω朋り組畦阻旦（ｅｏｒｄａ）
８ｓｓｃｃ、 、 ８ｙｌｌｏｇｅ ｒｕｎｇ、のそれ
と一致したので、この菌株をｚ見す１力ｖ１−對トユＶ
す」と同定し、ハ１村ｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔ ｉ
（７ザリウム エフ４−にティ）Ｍ−４１として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した（微工研菌寄第・
６３５１号）。
ころ、Ｓつの隔壁を持つ大胞子が、ブース（Ｂｏｏｔｈ
）の記載よりやや長い（Ｓμ＋ｎ）ものがあるが、そ
の他の生育形態は、ｈ旦Ω朋り組畦阻旦（ｅｏｒｄａ）
８ｓｓｃｃ、 、 ８ｙｌｌｏｇｅ ｒｕｎｇ、のそれ
と一致したので、この菌株をｚ見す１力ｖ１−對トユＶ
す」と同定し、ハ１村ｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔ ｉ
（７ザリウム エフ４−にティ）Ｍ−４１として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した（微工研菌寄第・
６３５１号）。
そして、・かかるＭ−４１株の生理的、生態的性質は以
下の通りである。
下の通りである。
（１）最適生育条件（ｐＨ１温度）
最適生育ｐ＝Ｈは・〜６．５、最適生育温度は２Ｔ〜２
１１”Ｃ，□・ （２）生育の範囲（ｐＨ，温度） やＨの範囲は３．ト８、温度の範囲は１０〜ｓｙ’ｅ０
（３）その他の■著な特徴 すると、培養後期に薄いピンク色を呈する。
１１”Ｃ，□・ （２）生育の範囲（ｐＨ，温度） やＨの範囲は３．ト８、温度の範囲は１０〜ｓｙ’ｅ０
（３）その他の■著な特徴 すると、培養後期に薄いピンク色を呈する。
続いて、上記Ｍ−４１株の採取径路を説明すれば以下の
通りである。
通りである。
大阪府下を中心に６ケ所の土壌よりＳＯＳ株のカビを単
離し、２０ｍ１の分離用培地を含む１００ｍ１容量の三
角フラスコに１株づつ接種し、２８℃で５日間振盪培養
し、培養終了後ＳＮの塩酸でＰＨ３に調整した後、５Ｏ
ｔｎｌの酢酸エチルで抽出し、この抽出液に芒硝を加え
て脱水後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、そ
の濃縮液を薄層クロマトグラフィーにより定性分析し、
標準ウルソデオキシコール酸と比較することにより、’
Ｊ）コール酸からウルソデオキシコール酸への変換能を
有する菌株をスクリーニングした。
離し、２０ｍ１の分離用培地を含む１００ｍ１容量の三
角フラスコに１株づつ接種し、２８℃で５日間振盪培養
し、培養終了後ＳＮの塩酸でＰＨ３に調整した後、５Ｏ
ｔｎｌの酢酸エチルで抽出し、この抽出液に芒硝を加え
て脱水後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、そ
の濃縮液を薄層クロマトグラフィーにより定性分析し、
標準ウルソデオキシコール酸と比較することにより、’
Ｊ）コール酸からウルソデオキシコール酸への変換能を
有する菌株をスクリーニングした。
その結果、リトコール酸°からウルソデオキシングされ
たＭ−４１株は昭和ｓ６年１月２＠日に大阪府箕面市内
の山林の土壌から分離されたものである。
たＭ−４１株は昭和ｓ６年１月２＠日に大阪府箕面市内
の山林の土壌から分離されたものである。
菌株の分離用培地としては、水道水１１に対しグルコー
ス３０ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン
酸１力リウム２ｇ、リン酸２カリウム３ｇ、硫酸マグネ
シウム０．５ｇ、塩化カルシウム０．５ｇ、硫酸第１鉄
２０＋ｎｇ、及び変換反応基質としてのりトコール酸０
．５ ｇを含む培地を使用した。
ス３０ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン
酸１力リウム２ｇ、リン酸２カリウム３ｇ、硫酸マグネ
シウム０．５ｇ、塩化カルシウム０．５ｇ、硫酸第１鉄
２０＋ｎｇ、及び変換反応基質としてのりトコール酸０
．５ ｇを含む培地を使用した。
続いて、この発明の実施例について説明すれば以下の通
りである。
りである。
〈実施例１〉
水道水１１に対して、グルコースＳＯｇ 、 ＮａＮ（
ｊ。
ｊ。
Ｓｇ、 Ｋ、ＨＰＯ４３ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、 Ｍ
ｇ ８０．・ＩＨｌｏｏ、 Ｓｇ、Ｋｅｌ ０．５ ｇ
、 Ｆｅ ８０４２０＋ｎｇ およびす）コール酸Ｑ、
Ｓ ｇを混合して成る６１の液体培地を１０！容量の
醗酵種薯ζ投入し、予め同じ組成の培地を用いて、２ｓ
Ｃにて２４時間振盪培養したＭ −４１株を上記醗酵槽
内の液体培地にＳ％接種し、培養温度２８°ｅ、ｐＨ７
に調整しながら撹拌速度３００ ｒｐ＋ｎ 、通気量０
．Ｓｖｖ＋ｎで３日間、好気的に培養する。培養終了後
、培養液を塩酸でｐＨ３に調整してから、２倍量の酢酸
エチルで３回抽出する。この酢酸エチル層を数回水洗し
た後、無水芒硝を添加し、脱水後、減圧丁番ζて酢酸エ
チルを装置する。次いで、これをシリカゲル（ワコーゲ
ルＣ−２００） ＩＩ、Ｏｇをつめたカラム暴と吸着さ
せ、クロロホルム：アセトン（酢酸（１００；１ｏｏ
： １ ）から成る混合溶媒で溶出し、ウルソデオキシ
コール酸を含む゛溶出画分を採取する。
ｇ ８０．・ＩＨｌｏｏ、 Ｓｇ、Ｋｅｌ ０．５ ｇ
、 Ｆｅ ８０４２０＋ｎｇ およびす）コール酸Ｑ、
Ｓ ｇを混合して成る６１の液体培地を１０！容量の
醗酵種薯ζ投入し、予め同じ組成の培地を用いて、２ｓ
Ｃにて２４時間振盪培養したＭ −４１株を上記醗酵槽
内の液体培地にＳ％接種し、培養温度２８°ｅ、ｐＨ７
に調整しながら撹拌速度３００ ｒｐ＋ｎ 、通気量０
．Ｓｖｖ＋ｎで３日間、好気的に培養する。培養終了後
、培養液を塩酸でｐＨ３に調整してから、２倍量の酢酸
エチルで３回抽出する。この酢酸エチル層を数回水洗し
た後、無水芒硝を添加し、脱水後、減圧丁番ζて酢酸エ
チルを装置する。次いで、これをシリカゲル（ワコーゲ
ルＣ−２００） ＩＩ、Ｏｇをつめたカラム暴と吸着さ
せ、クロロホルム：アセトン（酢酸（１００；１ｏｏ
： １ ）から成る混合溶媒で溶出し、ウルソデオキシ
コール酸を含む゛溶出画分を採取する。
かかる操作により、原料リトコール酸からウルソデオキ
シコール酸を容易に分離できる。更に、上記画分から得
られた試料を少量のエタノールに溶解し、常法通り、シ
リカゲルの薄層（メルクキーゼルゲルＧ ６０％ Ｆ
２Ｂ４、厚さ２ｍ＞ｎ ） ｉこ塗布し、上記の混合溶
媒で展開する。風乾後、ウルソデオキシコール酸画分を
定量的−ζ削り取り、エタノールで抽出する。抽出液を
濃縮し、エタノール−水系からの結晶化を行い、零衾場
キシコール酸の結晶を採取する。
シコール酸を容易に分離できる。更に、上記画分から得
られた試料を少量のエタノールに溶解し、常法通り、シ
リカゲルの薄層（メルクキーゼルゲルＧ ６０％ Ｆ
２Ｂ４、厚さ２ｍ＞ｎ ） ｉこ塗布し、上記の混合溶
媒で展開する。風乾後、ウルソデオキシコール酸画分を
定量的−ζ削り取り、エタノールで抽出する。抽出液を
濃縮し、エタノール−水系からの結晶化を行い、零衾場
キシコール酸の結晶を採取する。
〈実施例２〉
水道水１１に対して、オートミール５０ｇ及びリトコー
ル酸０．１ｇを含む＠ｌの培地（ｐＨ７，０）番ζて実
施例１に準じて、Ｍ−４１株を接種し、醗酵槽を用いて
好気的に培養する。培養開始から２４時間後に、ｏ、ｓ
ｇ／ｌのりトコール酸を添加し、更に、４一時間培養を
続行する。
ル酸０．１ｇを含む＠ｌの培地（ｐＨ７，０）番ζて実
施例１に準じて、Ｍ−４１株を接種し、醗酵槽を用いて
好気的に培養する。培養開始から２４時間後に、ｏ、ｓ
ｇ／ｌのりトコール酸を添加し、更に、４一時間培養を
続行する。
培養終了後、実施例１の場合と同一の操作でもってウル
ソデオキシコール酸を抽出単離することにより、反応培
地１ｊ当り１．７ｇ （４７９６）の結晶を採取する。
ソデオキシコール酸を抽出単離することにより、反応培
地１ｊ当り１．７ｇ （４７９６）の結晶を採取する。
〈実施例３〉
水道水１１に対して、澱粉２０ｇ、コーンステイープリ
カーｓｏｇ、カッオニキスｓｇ、ポリペプトンＳｇ、塩
化ナトリウム５ｇ、及びリトコール酸Ｏ，Ｓｇを混合し
て成る６Ｉの培地にＭ−４１株を接種し、醗酵槽を用い
てＰＨ７、培養温度ｚｓｔにてＳ＠時間培養する。
カーｓｏｇ、カッオニキスｓｇ、ポリペプトンＳｇ、塩
化ナトリウム５ｇ、及びリトコール酸Ｏ，Ｓｇを混合し
て成る６Ｉの培地にＭ−４１株を接種し、醗酵槽を用い
てＰＨ７、培養温度ｚｓｔにてＳ＠時間培養する。
生成した菌体を遠心分離にて回収し、ｐＨＴのリン酸峨
衝液で洗浄した後、これをリン酸１力リウム２ｇ、リン
酸２カリウム３ｇ％ グルコース１０ｇ、！ｊ）コール
酸＆２ｇ、水道水１１から成る反応培地（ｐＨ７，０）
に、菌体濃度ｌｅｇ／／になるように懸濁させて、ｚｓ
’ｃｓζて４８時間、酸素通気下で変換反応を行わせる
。
衝液で洗浄した後、これをリン酸１力リウム２ｇ、リン
酸２カリウム３ｇ％ グルコース１０ｇ、！ｊ）コール
酸＆２ｇ、水道水１１から成る反応培地（ｐＨ７，０）
に、菌体濃度ｌｅｇ／／になるように懸濁させて、ｚｓ
’ｃｓζて４８時間、酸素通気下で変換反応を行わせる
。
以後は実施例１の場合と同一の操作により反応培地１を
当り０．１ ｇ （５０％）のウルソデオキシコール酸
の結晶を採取する。
当り０．１ ｇ （５０％）のウルソデオキシコール酸
の結晶を採取する。
実施例４〉
水道水１１に対して、３０ｇのオートミール、０．２ｇ
のＩＪ ）コール酸、及びＨｇの寒天を含むオートミー
ル寒天培地（ｐＨ７）にＭ−４１株を接種し、これを２
８′ｃにて２遍間、好気的に培養する。
のＩＪ ）コール酸、及びＨｇの寒天を含むオートミー
ル寒天培地（ｐＨ７）にＭ−４１株を接種し、これを２
８′ｃにて２遍間、好気的に培養する。
次いで、菌体をか毒集め、ｐＨ１のリン酸緩衝液中にこ
れを懸濁し、ガーゼで菌糸を濾別した後、濾液中の胞子
゛を遠心分離し、これを水洗する。
れを懸濁し、ガーゼで菌糸を濾別した後、濾液中の胞子
゛を遠心分離し、これを水洗する。
しかる後、ｐＨ７のリン酸緩衝液中に胞子を投入し、１
０１０胞子／ｍｌとなるように調整した胞子反応液を作
成する。
０１０胞子／ｍｌとなるように調整した胞子反応液を作
成する。
これに、ｚｇ／ｌのグルコース及びｏ、２ｇ／ｊのリト
コール酸を添加し、無菌空気を通気して、５ｏｏｃにて
４畠時間の変換反応を行わせる。
コール酸を添加し、無菌空気を通気して、５ｏｏｃにて
４畠時間の変換反応を行わせる。
以後は実施例１の場合と同一の操作により、変換反応液
１１当たり０．１ｇ、（８０５％）のウルソデオキシコ
ール酸の結晶を採取する。
１１当たり０．１ｇ、（８０５％）のウルソデオキシコ
ール酸の結晶を採取する。
なお、上記この発明の実施例１〜４にて採取されたウル
ソデオキシコール酸の結晶を標準物質（ガスクロ工業株
製ウルソデオ牛シコール酸）に対して薄層クロマトグラ
ツー−（メルクキーゼルゲルＧ−１１０，Ｆ嘗ｏ 、
厚さ０．２５ｍｍ）を用いて同定したところ、下記の展
開溶媒の各々について実測された該結晶のＲｆ値と該標
準物質のそれとが完全に一致した。
ソデオキシコール酸の結晶を標準物質（ガスクロ工業株
製ウルソデオ牛シコール酸）に対して薄層クロマトグラ
ツー−（メルクキーゼルゲルＧ−１１０，Ｆ嘗ｏ 、
厚さ０．２５ｍｍ）を用いて同定したところ、下記の展
開溶媒の各々について実測された該結晶のＲｆ値と該標
準物質のそれとが完全に一致した。
展開溶媒 Ｒｆ値
１）ジエチルエーテル：酢酸（ｚ４ｓ：１＞・・・・・
ｏ、１６υ クロロホルムニア七トン：酢酸 （１００：１００：１）・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．４１展 開
溶 媒 Ｒ，ｆ値３）２，２．４−
）リメチルペンタン：酢酸エチル；酢酸：ブタノール（
２０＝１０： ３： ３）・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．
４５４）２，２．４−）リメチルペンタン：イソプロパ
ノール：酢酸（１１０： ２０ ：０．５）・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・ ０．３６Ｓ）２，２．４−
）リメチルベンタン：酢酸エチル：酢酸（Ｓ： １：
１）・・・・・・ Ｏ，５Ｓ６）クロロホルム：メ
タノール：酢酸 （１１０：１２：３） ・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・ ｏ、ｙｓｌ）ク
ロロホルム：メタノール：水 （ＴＯ： ２５ ： ＠ ）・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．７
２１１） ２． ２． ４−）リメチルペンタン：ジ
イソプロビルエーテル：酢酸：プタ ノール：水（１０：Ｓ：Ｉｓ：１）・・・・・・・・・
・・・ ０．３６展 開 溶 媒
Ｂｆ値９）クロロホルム：酢酸エチル：酢酸；（１：Ｉ
：２） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・ ０．５４１０）２，２．
４−）リメチルペンタン：酢酸ニジイソプロピルエーテ
ル：イソ プロパノール（１０：＠：Ｓ：１）・・・・・・・・・
・・・ ０．５１１１）クロロホルム：メタノール：
７ＮＮＨ４０Ｈ：水（２１：Ｉｓ： １： ２） ・−
・−・−・−−−−−・０．７１１２）２，２．４−ト
リメチルペンタン：ジイソプロビルエーテルニ酢酸：イ
ソ プロパノール（２：１：１：１）・・・・・・・・・・
・・ ０．１１１ｓ） イソプロパツール：酢酸エチ
ル；水：ＮＨ４０Ｈ（２０： ２５： ＠： ４）・・
・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．１１１４）
２． ２． ４−）ツメ１チ、、ルペンタン：ジイソ
プロビルエーテル：酢酸：プタ ノール：イソプロパノール二本 （１０：Ｓ：５：Ｓ：１１：１）・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・ Ｏ，５Ｏ１５）プロパツール
：酢酸：水（９５：４：１）・・・ｏ、ｓｒ１＠）
フタ／−ｓ、Ｈ酢酸：水（１００： Ｔ ： ！１）−
０，ａｍｌｌＦ） 酢酸エチル：メタノール：酢酸（
７：２：１） ・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・川・・・・・１・・ ｏ、ｓｙ更に、上記この
発明の実施例１〜４にて採取されたウルソデオキシコー
ル酸の結晶を前記標準物質に対して以下番ζ列記する分
析法を用いて同定したところ、各分析法番とて得られた
該結晶の緒特性と該標準物質のそれとが完全に一致した
。
ｏ、１６υ クロロホルムニア七トン：酢酸 （１００：１００：１）・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．４１展 開
溶 媒 Ｒ，ｆ値３）２，２．４−
）リメチルペンタン：酢酸エチル；酢酸：ブタノール（
２０＝１０： ３： ３）・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．
４５４）２，２．４−）リメチルペンタン：イソプロパ
ノール：酢酸（１１０： ２０ ：０．５）・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・ ０．３６Ｓ）２，２．４−
）リメチルベンタン：酢酸エチル：酢酸（Ｓ： １：
１）・・・・・・ Ｏ，５Ｓ６）クロロホルム：メ
タノール：酢酸 （１１０：１２：３） ・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・ ｏ、ｙｓｌ）ク
ロロホルム：メタノール：水 （ＴＯ： ２５ ： ＠ ）・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．７
２１１） ２． ２． ４−）リメチルペンタン：ジ
イソプロビルエーテル：酢酸：プタ ノール：水（１０：Ｓ：Ｉｓ：１）・・・・・・・・・
・・・ ０．３６展 開 溶 媒
Ｂｆ値９）クロロホルム：酢酸エチル：酢酸；（１：Ｉ
：２） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・ ０．５４１０）２，２．
４−）リメチルペンタン：酢酸ニジイソプロピルエーテ
ル：イソ プロパノール（１０：＠：Ｓ：１）・・・・・・・・・
・・・ ０．５１１１）クロロホルム：メタノール：
７ＮＮＨ４０Ｈ：水（２１：Ｉｓ： １： ２） ・−
・−・−・−−−−−・０．７１１２）２，２．４−ト
リメチルペンタン：ジイソプロビルエーテルニ酢酸：イ
ソ プロパノール（２：１：１：１）・・・・・・・・・・
・・ ０．１１１ｓ） イソプロパツール：酢酸エチ
ル；水：ＮＨ４０Ｈ（２０： ２５： ＠： ４）・・
・・・・・・・・・・・・・・・・ ０．１１１４）
２． ２． ４−）ツメ１チ、、ルペンタン：ジイソ
プロビルエーテル：酢酸：プタ ノール：イソプロパノール二本 （１０：Ｓ：５：Ｓ：１１：１）・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・ Ｏ，５Ｏ１５）プロパツール
：酢酸：水（９５：４：１）・・・ｏ、ｓｒ１＠）
フタ／−ｓ、Ｈ酢酸：水（１００： Ｔ ： ！１）−
０，ａｍｌｌＦ） 酢酸エチル：メタノール：酢酸（
７：２：１） ・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・川・・・・・１・・ ｏ、ｓｙ更に、上記この
発明の実施例１〜４にて採取されたウルソデオキシコー
ル酸の結晶を前記標準物質に対して以下番ζ列記する分
析法を用いて同定したところ、各分析法番とて得られた
該結晶の緒特性と該標準物質のそれとが完全に一致した
。
（１）元素分析
（２）融点詔よび混融試験
（３）赤外吸収スペクトル（分析）
（４）質屋分析 ４
（５）核磁気共鳴スペクトル（分析）
第１図はこの発明の方法における目的物質としてのウル
ソデオキシコール酸の構造式を示す説明図、第２図は従
前の化学合成番とよる方法における出発物質としてのコ
ール酸から目的物質としてのウルソデオキシコール酸に
至る反応式を示す説明図、第３図はこの発明に係わる微
生物変換の方法における出発物質としてのリトコール酸
から目的物質としてのウルソデオキシコール酸に至る反
応式を示す説明図、第４図はこの発明に係わる微生物の
一例である７ザリウム工クイセデイＭ−４１株の生育形
態を示す顕微鏡写真である。 特許出願人 株式会社 ヤクルト本社 箇Ｉｌｌ ウルツデオキシツール１１ （夏） 手続補正書 昭１４１５７年特許 願第３１１１６号：３ ＦＩＱ
正をする者 ＊ｒ＋との関係 特許出願人 １４−′＋’Ｆｉ 東京都港区東新橋１丁目１番１９
号１゜６（＆い、（６８Ｂ）株式会社 ヤクルト本社代
表取締役 松 園 尚 已 ４、代理人 ５ 補ＩＩ−命令の日付 自発補正 そ） 補止によ°り増加する発明の数 ０７ 補正の
対象 ８ 明ｗ豪の［発明の詳細な説明］の横の計＃を以下の
ように補正する。 （１）第５負第１８行 「Ｂ型」を「β型」に補正する。 （２）８Ｆ、９頁＃Ｌ１３行 「１２〜Ｔ」を［１２〜ＨＪに補正する。 （３）ν１０負第１８行 「３６時間」を１１４日間」に補正する。 （リ 第１４頁！２０行 ［反応培地１を当り１．５ ｇ （５０％）」を［反応
培地１を当り０．２５ｇ（ＳＬ１％）」に補正する。 （５〕 第１５３ｊ＃１１行 ［反応培地１を当り１． ｒ ｇ （４ｙ９６） Ｊを
［反応培地１を当りＬｌ、２８ｇ （４Ｆ九）」に補正
する。
ソデオキシコール酸の構造式を示す説明図、第２図は従
前の化学合成番とよる方法における出発物質としてのコ
ール酸から目的物質としてのウルソデオキシコール酸に
至る反応式を示す説明図、第３図はこの発明に係わる微
生物変換の方法における出発物質としてのリトコール酸
から目的物質としてのウルソデオキシコール酸に至る反
応式を示す説明図、第４図はこの発明に係わる微生物の
一例である７ザリウム工クイセデイＭ−４１株の生育形
態を示す顕微鏡写真である。 特許出願人 株式会社 ヤクルト本社 箇Ｉｌｌ ウルツデオキシツール１１ （夏） 手続補正書 昭１４１５７年特許 願第３１１１６号：３ ＦＩＱ
正をする者 ＊ｒ＋との関係 特許出願人 １４−′＋’Ｆｉ 東京都港区東新橋１丁目１番１９
号１゜６（＆い、（６８Ｂ）株式会社 ヤクルト本社代
表取締役 松 園 尚 已 ４、代理人 ５ 補ＩＩ−命令の日付 自発補正 そ） 補止によ°り増加する発明の数 ０７ 補正の
対象 ８ 明ｗ豪の［発明の詳細な説明］の横の計＃を以下の
ように補正する。 （１）第５負第１８行 「Ｂ型」を「β型」に補正する。 （２）８Ｆ、９頁＃Ｌ１３行 「１２〜Ｔ」を［１２〜ＨＪに補正する。 （３）ν１０負第１８行 「３６時間」を１１４日間」に補正する。 （リ 第１４頁！２０行 ［反応培地１を当り１．５ ｇ （５０％）」を［反応
培地１を当り０．２５ｇ（ＳＬ１％）」に補正する。 （５〕 第１５３ｊ＃１１行 ［反応培地１を当り１． ｒ ｇ （４ｙ９６） Ｊを
［反応培地１を当りＬｌ、２８ｇ （４Ｆ九）」に補正
する。
Claims (4)
- （１） リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
の変換能を有するフザリウム属に属するカビを、リトコ
ール酸と接触させることを特徴とする微生物変換の方法
によるウルソデオキシコール酸の製造法。 - （２） リトコール酸を含む培地番ζて、リトコール
酸からウルソデオキシコール酸への変換能を有するフザ
リウム属に属するカビを培養し、培地中にウルソデオキ
シコール酸を蓄積させ、これを採取することを特徴とす
る特許請求の範囲（１）に記載の微生物変換の方法６ζ
よるウルソデオキシコール酸の製造法。 - （３） リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
の変換能を有するフザリウム属に属するカビを栄養培地
にて培養して得た菌体を、’Ｊ）コール酸と接触させて
、ウルソデオキシコール酸を生成させ、これを採取する
ことを特徴とする特許請求の範１（１）記載の微生物変
換の方法によるウルソデオキシコール酸の製造法。 - （４） リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
の変換能を有するフザリウム属に属するカビの胞子を、
襟番嗜肴≠≠リトコール酸と接触させてウルソデオキシ
コール酸を生成させ、これを採取することを特徴とする
特許請求の範囲（１）記載の微生物変換の方法によるウ
ルソデオキシコール酸の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57037116A JPS58155098A (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | 微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法 |
| US06/471,460 US4579819A (en) | 1982-03-09 | 1983-03-02 | Method for production of ursodeoxycholic acid by means of microbial transformation |
| EP83301303A EP0088637B1 (en) | 1982-03-09 | 1983-03-09 | A method for producing ursodeoxycholic acid |
| DE8383301303T DE3365067D1 (en) | 1982-03-09 | 1983-03-09 | A method for producing ursodeoxycholic acid |
| AT83301303T ATE21262T1 (de) | 1982-03-09 | 1983-03-09 | Verfahren zur herstellung von ursodeoxycholsaeure. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57037116A JPS58155098A (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | 微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58155098A true JPS58155098A (ja) | 1983-09-14 |
| JPH0329397B2 JPH0329397B2 (ja) | 1991-04-24 |
Family
ID=12488622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57037116A Granted JPS58155098A (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | 微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4579819A (ja) |
| EP (1) | EP0088637B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58155098A (ja) |
| AT (1) | ATE21262T1 (ja) |
| DE (1) | DE3365067D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59159795A (ja) * | 1983-03-04 | 1984-09-10 | Yakult Honsha Co Ltd | 微生物変換による抱合型ウルソデオキシコ−ル酸の製造方法 |
| FR2653127B1 (fr) * | 1989-10-17 | 1994-12-09 | Sanofi Sa | Procede pour la preparation de 12-oxocholanates. |
| FR2653126B1 (fr) * | 1989-10-17 | 1994-12-09 | Sanofi Sa | Procede pour la preparation de diacetoxycholanates. |
| DK0424232T3 (da) * | 1989-10-17 | 1996-06-17 | Sanofi Sa | Fremgangsmåde til fremstilling af chenodesoxycholsyre |
| FR2653129B1 (fr) * | 1989-10-17 | 1995-03-17 | Sanofi Sa | Procede pour la preparation de 7-oxocholanates. |
| AU1944097A (en) * | 1996-03-29 | 1997-10-22 | Tokyo Tanabe Company Limited | Novel bile acid converting microorganism and process for preparing bile acid |
| CN101215311B (zh) * | 2008-01-10 | 2010-10-27 | 辽宁百隆生物工程有限公司 | 用含量86%的鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸的生产方法 |
| CN101987860B (zh) * | 2009-08-06 | 2011-12-14 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种熊去氧胆酸的制备方法 |
| CN109929896B (zh) * | 2019-04-23 | 2022-06-14 | 南京久安源环保科技有限公司 | 一种熊去氧胆酸的生产工艺 |
| WO2023081166A1 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Sandhill One, Llc | Stereoselective steroidal reductions |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3429778A (en) * | 1967-08-24 | 1969-02-25 | Squibb & Sons Inc | Synthesis of steroids |
| US4303754A (en) * | 1980-03-17 | 1981-12-01 | Macdonald Ian | Method for obtaining 7β hydroxy steroids |
-
1982
- 1982-03-09 JP JP57037116A patent/JPS58155098A/ja active Granted
-
1983
- 1983-03-02 US US06/471,460 patent/US4579819A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-09 DE DE8383301303T patent/DE3365067D1/de not_active Expired
- 1983-03-09 EP EP83301303A patent/EP0088637B1/en not_active Expired
- 1983-03-09 AT AT83301303T patent/ATE21262T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE21262T1 (de) | 1986-08-15 |
| US4579819A (en) | 1986-04-01 |
| DE3365067D1 (en) | 1986-09-11 |
| EP0088637A3 (en) | 1983-10-12 |
| JPH0329397B2 (ja) | 1991-04-24 |
| EP0088637A2 (en) | 1983-09-14 |
| EP0088637B1 (en) | 1986-08-06 |
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