JPS63500563A - キナアルカロイドのヒドロキシル化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キナアルカロイドのヒドロキシル化方法技術分野 本発明はキナアルカロイドのヒドロキシル化方法に関し、更に詳細には、微生物 学的方法によりキニン、キニジンならびにその誘導体をヒドロキシル化する新規 方法に関する。

背景技術 哺乳動物の栄養摂取系あるいは血液循環系内にとり入れられた外来化学物質の代 謝の第１段階の１つは多くの場合肝ミクロンームのヒドロキシル化である。この 様なヒドロキシル化反応は他の反応例えば０−メチル化や抱合反応を後続して供 なって、これらの外来物質の水溶性を高めてこれらを除去しやすい様にする作用 を有する。

しかしながら場合によっては、その櫟にヒドロキシル化された化合物が元の分子 よりもよシ活性になりあるいはより毒性が強くなったりする場合があるので、こ れらを同定することは当然必要なことであり、又、その活性を研究する目的から 、これらを合成によシ得る必要性もある。

有機合成法は確かに単純な物質の代謝産物用には便利でおるが、より複雑な（そ して光学活性な）分子の化学的合成にはなお一層の努力と時間が必要である。

微生物学的方法によるヒドロキシル化は、ステロイドの分野においてすでに長年 に亘りかなシ発展して来ており、該分野においては、非官能性炭素原子の特異的 酸化により工業的規模において、部位特異的に、又立体特異的にヒドロキシル化 した生成物を得ることが可能となっている。ところでこれらの分子を得るのに化 学的合成法を利用することが必要でめったならば、その合成にはかなりの労力が 必要とされたことでろろう。以来この方法は他の分野の物質の製造にも応用され る様になり、そしである場合Ｋｌ”！、新規化合物を得るのに好ましい方法であ り、そして従来の発酵技術や装＃、ヲ利用することによυ大規模製造にも適応可 能でらる。更に又、微生物利用のヒドロキシル化の場合には、哺乳動物系内にお いて見られる代謝産物よシもより狭い範囲のヒドロキシル化生成物が得られる場 合が多く、従って生成物の分離の問題がないものと思われる。従って、種々の肝 代謝産物の再構築用に多様な菌株を利用することが可能である。

しかしながらアルカロイドの分野においては、この種の反応についてはむしろほ とんど知られておらず、又たとえそれについての記載かわったとしても大抵の場 合それは芳香族又は非ステロイド分子の窒素を含有しない部分における反応に関 するものでおる。従って、その生成物が活性代謝産物としてすでに知られている 、窒素含有アルカロイド核のヒドロキシル化を好ましい条件下で行えるというこ とは望まれていることでありかつ興味のあることである。特に、フランス特許第 ２．５０へ３１２号にはヒドロキシル化されたキニジン化合物、例えば３−ヒド ロキシ−１０，１１−ジヒドロキニシンおよびその３Ｒおよび３Ｓエピマーが記 載されており、これらは心拍不規則性不整脈の治療用に有用である。一方におい て本発明者らは、その薬理学的性質が公知であるキニンとキニジンとに２つの異 性体でろって、これらは８−および９−位の炭素レベルにおけるその立体配置を 異にするものであることを知得している。

従って、この櫟に活性なかつ光学的に純粋な化合物を工業的規模で実施可能な微 生物利用法によシ製造することは、その化学的ヒドロキシル化による方法が収率 が低く又ジアステンオマー混合物を生成してしまうことを考えると、大変に興味 深いことである。

発明の開示 従って本発明の目的は、キニン、キニジンおよびその誘導体、特にその水素化誘 導体を部位特異的および立体特異的に微生物学的方法によりヒドロキシル化して 光学的に純粋な化合物を作る新規方法ｔ−提供することである。

又本発明の他の目的は、工業的規模での適用が可能で、ｌ）又通常の装置を使用 して充分な収率で光学的に純粋な化合物を生成することが可能な、キニン、キニ ジンおよびその誘導体の微生物学的ヒドロキシル化方法を提供することである。

発明を実施するための最良の形態 本発明による部位特異的および立体特異的、微生物学的ヒドロキシル化方法とは 、下記式（１）（式中Ｒはエチル基又はビニル基でろる）で表わされるキニン、 キニジンならびにその誘導体に、アスペルギルス　フラパス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス　オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、アスペルギルス　ニガー（Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｎｉｇｅｒ）、クンニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｉｍｏｓｕｓ）　型 細菌を作用させることにより、その式（１）の３−位をヒドロキシル化して、そ の相当する下記式（ｎ） （式中只は前記と同じ意味でるる） で表わされる、３Ｂ−ヒドロキシル化誘導体を得ることを特徴とする方法でろる 。

前記式（１）　［おいて、キニンおよびキニジンの場合ＩＣＲはビニル基であシ 、両者は８−および９−位の炭素の立体配置を異にする。又水素化誘導体、すな わちジヒドロキニンおよびジヒドロキニシンの場合にＲ［エチル基である。そし て式（ＩＩ）のヒドロキシル化誘導体の場合も同様でおる。

本発明においては次の菌株を使用するのが好ましい。

＝ｎ　−（ＮＲＲＬ　ｓｑｑ　）、タンニンガメラ　エチヌラタ（１ＪＲＲＬ　 ２３ａｏ　）、ム：７−ルシルシネロイデス（（！ＥＳ１０８−１６　）、　ム コール　プルムヘウス（ＭＭＰ　４３０　、０ＢＳ１１１−０７　）、　リゾプ ス　アルリザス（ＡＴＣＣ！　１１１４５　）、ニーと２λノ、−二’：ｊｋ’ ；ｆ　Ｏ？ｆ’Ｌ　（ＭＭＰ　２２２　ｂｉｓ　）。本発明方法ではこれら微生 物の１種をヒドロキシル化すベキ化合物に作用させる。

前記菌株の表示ＩＣｂいて、「ＮＲＲＩＩＪは「ムｇｒｉｃｕ１．−ｔｕｒａｌ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｓ　Ｃｏｌ：Ｌａｃｔｉ＋ｌ　、　Ｎｏｒｔ ｈｅｒｎＲｓｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ！ｅｎｔｅｒ　、　Ｐｅｏｒ ｉａ　、工１ｘ、Ｊ　：「ＡＴ（！（Ｊは［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｓ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　ＭＤ、ＴＴＳＡ　Ｊ　：　ｌ”’　ｃ　Ｂ　Ｓ　Ｊは 「０ｓｎｔｒａａｌＢｕｒａａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ 　、　Ｂａａｒｎ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｃｌｓ　Ｊ　：「ＭＭｐＪはｒ　Ｍｙｃ ｏｔｈｅｑｕｅ　ｄｕ　Ｍｕｓｅｕｍ　ｄ’Ｈ１ｓｔｏｉｒａＮａｔｕｒｓｌｌ ｅ　、　Ｐａｒｉｅ　、　Ｆｒａｎｃｅ　Ｊ　の略称である。

本発明のヒドロキシル化方法ＶＣおいては、微生物を、同化源としての炭素、窒 素および無機塩を含有する培地中で好気性発酵培養条件下に液体浸漬培養法によ り生育させることが好ましい。そしてヒドロキシル化する化合物を好ましくは無 菌的にこの培地中に添加しそして充分な量のヒドロキシル化生成物が得られるま で培養し、次いで常法によシ抽出を行う。培養は通常の発酵槽中で、約２０〜３ ０℃の温度範囲で行うことができ、その培地のｐＨは７に近い値とする。又必要 ならば、約６〜８の範囲のｐＨの培地を使用することも出来、何らその効果は変 ることはない。

本発明においては、充分な生物量の微生物を得る様に適当な培地中で微生物の培 養を行うのであシ、その培地は、１〜１０％濃度の同化炭素源（デキストロース 、サッカロース、でん粉、マンニット）の他に、窒素源としての有機窒素源（ペ プトン、アスパラギン、たん白質氷解物）又は無機窒素源（アンモニウム塩、硝 酸塩）や必須無機塩ならびにビタミン類（例えばコーンスチープや酵母エキス中 に存在するビタミン類）等を含んでいても良い。培養温度はその菌株により約２ ０〜。５０℃に変えることができ、そして培養は攪拌しながら行う。生育が充分 でおると認められた時、通常は炭化水素基質が消費し尽された時、すなわち、約 ２〜５日後に、ヒドロキシル化するべき化合物を、固体状であるいは少量の水混 和性有機溶媒（例えばエタノール）中に溶かして、無菌条件下に、最終濃度がα ２〜数ｒ７ｔとなる様ＶＣ（なおこの最終濃度は化合物および菌株の種類によっ て変えられる）加える。混合物に空気を導入するためにはげしく攪拌しながら、 同温度で２〜４０日間培養を続け、これにより微生物がわずかであるが更に生育 する。

本発明方法の変法として、ヒドロキシル化するべき化合物の処理を、あらかじめ 洗浄しそして炭素又ハ窒素を含有しない緩衝化水性培地中に再けん濁した細胞に より行うこともできる。こうしてすでに生育ずみの微生物から集めた菌糸体を使 用して、これを更に生育させることなくヒドロキシル化用に使用する。

培養生成物ならびに残存基質の抽出は、菌糸体をろ過して除去した後に、水混和 性有機溶媒（飼えば塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル等）ｌｔ使用して これを塩（例えばＮａ０ｔ、Ｒａ１日０４）　で飽和することによシ行う。

ヒドロキシル化生成物の検出および同定は、シリカゲル上の薄層クロマトグラフ ィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。使用した基 質が残っている場合にはこれからヒドロキシル化生成物を単離しそして精製する のであるが、これらの操作は従来法による再結晶や又は無機吸着体を使用したク ロマトグラフィーにより行う。

精製したヒドロキシル化生成物は、種々のクロマトグラフィー系により、おるい は通常の分光分析法（ＵＶ。

ＩＢ−又鉱１”ｃ　−ＮＭＲ’）又は偏光分析法により、標品（３Ｂ）−ヒドロ キシ生成物（化学合成法により作ったか又は文献記載のもの）との比較により行 う。

下記の実施例では部位特異的および立体特異的にヒドロキシル化可能な数種の微 生物菌株を適当な数種の基質と一緒にこれを出発物質として使用してその割合を 種々に変えて実験を行った結果を示した。本発明においてその第１の特徴は使用 微生物のヒドロキシル化選択性でろるが・更にもう１つの特徴は、他の代謝産物 が著量に生成しないことであり、従って精製が簡単容易でおりかつ代謝変性しな かった基質を再使用することができる利点のあることでらる。

実施例 次に実施例により本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するもので はない。

実施例１ 一三角フラスコ中の下記の組成を持ちそのｐＥｉ７１ｃ調節した培地（Ａ）ｆｏ ｏ−中に加える。回転攪拌器（３２７ＲＰＭ　）中で２７℃で７２時間培養を続 ける。次いでエタノール１−中のキニジン５０ダの溶液を無菌条件下にこの培養 物中に加え、同条件下で攪拌５ｃ１４日間続ける。

培養物をセライト上でろ過し、ろ液ｆｔＮａ０ｔで飽和し、２　Ｎ　Ｎａ０Ｅで ｐＨｆ　１０〜１２　ＶＣｌ、、次いで塩化メチレンで６回抽出する。乾燥し次 いで蒸発後に有機画分を溶媒として０ＥＣ４！−ＭｅＯＥ−ＮＨ４０Ｈ（８５： 　Ｉ　Ａ　：　１　）　ｌｉ使用してシリカゲルのプレパラート層上でクロマト グラフィー処理ｆる。（３８）−ｓ−ヒドロキシ−キニジンバンドをその２５４ 　ｎｍ　における蛍光と移動度により同定（これはキニジンのものより小さい） し、これをかき取りそしてエタノールで溶出する。こうして標品と同一である（ ３日）−５−ヒドロキシキニジンを１１１ｑ得る。同様にして未反応のキニジン をほぼ定量的（４２ｍ９）Ｉｃ回収する。

培地（Ａ） コーンスチープ　１０２ Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈ！ＯＣＬ　５　ｆ Ｋｃｔ　ａ　ｓ　ｔ Ｎａｌ１０３　２　ｆ ＦｅＳＯ４−７Ｅｇｏ　α　ｏ　２　≦−Ｄ−デキストロース　３０２ 五Ｈ！ＰＯ４１ｙ Ｋ！ＥＰ０４　２　Ｆ 蒸留水で全量に１ｔとする。

実施例２ Ｍ、プルムベウスによるジヒドロキニシンのヒドロキシル化 Ｍ、プルムベウス（ＩＸＢｓ　１１１−０７　の同様の培養物を使用して、ジヒ ドロキニシン１ｆｔ：最終＃度１２／ｌで培養して、２０日後に標品サンプルと 同一の（ｓｓ）−！ｒ−ヒドロキシージヒドロキニシン５”ＰＴｈ回収ジヒドロ キニシン８０ｑを得る。

実ｍ列３ した培地（至））（下記植成を有する）の１００−中に加える。

２７℃で７２時間培養を行い、エタノールＩｄ中に溶解したジヒドロキニシン１ ００■を加え、同条件下で２５日間攪拌を続ける。同様にして、４ηの（ＳＳ） −３−ヒドロキシ−ジヒドロキニシンと８５りの回収ジヒドロキニシンを得る。

培地（Ｅ） バクトカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）　ｓｒ酵母エキス　３２ Ｄ−デキストロース　５０ｆ 蒸留水で全量を１ｔとする。

実施例４ に最終濃度１１／ｌのキニンを加えて同様に培養し、３０日後に標品サンプルと 同一の（３Ｂ）−３−ヒドロキシ−キニン９．５〜を回収キニン７５Ｍ１を得る 。尚、少量の他の２つの生成物（２５４ｎｍｌＣおける蛍光バンド）の生成が認 められた。

実施例５ の培養物に最終濃度１２／Ｌのジヒドロキニンを加えて同様に培養し、３６日後 に標品サンプルと同一の（３日）−３−ヒドロキシ−ジヒドロキニン１７ａＰｔ 回収ジヒドロキニン７０■を得る。

実施例６ Ｍ、プルムベウスによるジヒドロキニシンのヒドロキシル化 培養物各１００ｄｉ２つ混合し、遠心分離してその菌糸体を、１ｔの蒸留水につ き２２のに！ＨＰＯ，と１２のＫＥｔＰＯ４とを含有するりん酸緩衝液で無菌条 件下に洗浄し、これを同緩衝液１００−中に入れて最終！１度α５１／ｌのジヒ ドロキニシンと一緒に培養する。

２７Ｃで５日間培養の後に、同様の方法によシ＆５１１ＩＰの（３Ｂ）−３−ヒ ドロキシージヒドロキニジント４０〜の回収ジヒドロキニシンを得る。

国　際　調　査　邦　失 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’＋、ｄＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲ ＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．アスペルギルスブラパス、アスペルギルスオクラゼウス、アスペルギルスニ ガー、クンニンガメラエチヌラタ、クルブラリアルナタ、ムコールシルシネロイ デス、ムコールブルムペウス、ペニシラムブルブロゲナムおよびリソブスアルリ ザスから成る群から選択した下等真菌類微生物又はストレブトミセスリモサス型 細菌をヒドロキシル化すべき化合物に作用させることを特徴とする、キニン、キ ニジンおよびその誘導体の部位特異的かつ立体特異的ヒドロキシル化方法。
2. ２．該微生物を、同化用炭素、窒素および無機塩源を含有する培地中液体浸漬培 養法により好気的発酵条件下に生育させることから成る、前記請求の範囲第１項 に記載のヒドロキシル化方法。
3. ３．該微生物の生育が充分となつた時点でその培地にヒドロキシル化すべき化合 物を直接添加することから成る、前記請求の範囲第１又は第２項に記載の方法。
4. ４．ヒドロキシル化すべき化合物の培養を、あらかじめ洗浄しそして炭素又は窒 素源を含有しない培地中に再けん濁した細胞を直接に使用して行なうことから成 る、前記請求の範囲第１又は第２項に記載の方法。
5. ５．培養を常に２０〜３０℃の温度範囲内で行うことから成る、前記請求の範囲 第２項に記載のヒドロキシル化方法。
6. ６．培地のｐＨ値が約６〜８の間の範囲であるとする、前記請求の範囲第１又は ２項に記載の方法。