HU201355B - Process for microbiological hydroxylation of quinine, quinidine and their dihydro derivatives - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás cinchona-alkaloidok hidroxilezésére, közelebbről kinin, kinidin és dihidro-származékaik mikrobiológiai hidroxilezésére.

A találmány szerinti eljárással (II) általános képletű vegyületeket állítunk elő - a képletben

R jelentése etil- vagy vinilcsoport regiospecifikus és sztereospecifikus 3S-hidroxilezéssel.

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy egy (I) általános képletű kinint, kinidint vagy dihidro-származékukat - ahol az (I) általános képletben

R jelentése a fentiekben meghatározott Cunninghamella echinulata-, Mucor circinelloides-, Mucor plumbeus- vagy Streptomyces rimosus-tenyészettel hozunk kölcsönhatásba és a keletkezett terméket kinyerjük azzal a feltétellel, hogy a kinidin hidroxilezéséhez Cunninghamella echinulata-tól eltérő mikroorganizmus-tenyészetet alkalmazunk.

A majmikroszómákban végbemenő hidroxilezés gyakran az első lépések egyike emlősállatok gyomor-bélceatornájába vagy keringési rendszerébe juttatott testidegen anyagok metabolizmusa során. E hidroxilezések rendeltetése - melyeket egyéb reakciók, igy O-metilezés vagy konjugálódás (kapcsolódás) követnek - a testidegen vegyületek vizoldékonyságának a növelése, és ezáltal kiürülésük meggyorsítása. Egyes esetekben azonban a hidroxilezett vegyületek hatásosabbak vagy toxikusabbak, mint az eredeti molekulák; ezért figyelmet érdemel azonosításuk és ennek alapján előállításuk hatásuk felderítése céljából.

A szerves szintetikus módszerek egyszerű molekulák metabolitjainak az előállítására nyilvánvalóan alkalmasak; bonyolultabb (és optikailag aktív) molekulák kémiai előállítása sok munkával és időráfordítással járhat.

A mikrobiológiai úton végzett hidroxilezések végrehajtására jó néhány éven ét számos eljárást dolgoztak ki, s így ipari méretben állitottak elő olyan régió- és sztereoszelektiven hidroxilezett termékeket, amelyek funkciós csoportot nem viselő szénatomok specifikus oxidációjából eredtek. Az ilyen molekulák előállítása jelentős szintetikus munkát kívánt volna kémiai módszerek alkalmazásával. A szteroidok területén elért eredmények után a mikrobiológiai módszert más molekulatipusokra is alkalmazták, és egyes esetekben e módszer új vegyületek előállításának a legelőnyösebb módja, amely - klaszszikus fermentációs módszerek alkalmazásával - ipari méretekre is átvihető. Úgy látszik továbbá, hogy a mikrobiológiai hidroxilezés minden egyes molekulatípus esetében kevesebb metabolitot eredményez, mint amennyi az emlősök szervezetében képződik, s ennek következtében egyes elválasztási problémák kiküszöbölhetők. Több mikroorganizmus előnyösen felhasználható a májban képződő metabolitok különféle típusainak előállítására. A kinidin hidroxilezését Cunninghamella echinulata tenyészetével - bár igen csekély hozammal - ismerteti a J. Natural Product 47(5) 882-884. oldalán 1984-ben közölt, Echenrode

F.M.-től származó tanulmány. Ebből azonban nem lehet következtetni más mikroorganizmusok reakcióképességére, különösen a dihidroszármazékok esetén.

Az alkaloidok területén nagyon kevés mikrobiológiai hidroxilezési reakciót Írtak le, s ezek legnagyobb része az aromás vagy nem-szteroid molekulák nitrogént nem tartalmazó részét érinti. Kívánatos és érdekes tehát olyan, nitrogént tartalmazó alkaloid-molekulaegységek hidroxilezésének végrehajtása kedvező körülmények között, amelyek aktív metabolitokként ismertek. így például a 2 506 302 számú francia szabadalmi leírás ismerteti a kinidin hidroxi származékait, igy a 3-hidroxi-10,ll-dihidrokinidint és annak 3R és 3S epimerjeit, amelyeket a megfelelő 3-hidroxi-kinidin-származékból katalitikus hidrogénezéssel állitottak elő és szivarritmiák terápiás kezelésére alkalmazhatók. Ismert másrészt, hogy a kinin - amelynek farmakológiái tulajdonságai ismertek - és a kinidin két izomer, amelyek a 8-as és 9-es helyzetű szénatomok konfigurációjában különböznek.

Ezeknek az aktív, optikailag tiszta vegyületeknek olyan mikrobiológiai előállítása, amely léptéknővelés útján ipari méretre vihető át, figyelemre méltó, mivel a kémiai hidroxilezés mindeddig csekély hozamot és diasztereomer keverékeket eredményezett.

A fentiek alapján a találmány célja új eljárás kidolgozása kinin, kinidin és hidrogénezett származékaik - mikrobiológiai hidroxilezésére régió- és sztereospecifikus módon, optikailag tiszta vegyületek előállítása céljából.

A találmány további célja a kinin, kinidin és származékaik mikrobiológiai hidroxilezésére olyan eljárás kidolgozása, amely ipari méretre alkalmas, és amelynek segítségével a szokásos típusú berendezésekben kielégítő hozamokkal optikailag tiszta vegyületek állíthatók eló.

A találmány szerint a kinin, kinidin és dihidro-szérmazékaik (II) általános képletű ahol

R jelentése etil- vagy vinilcsoport 3S hidroxilezett származékait regiospecifikus és sztereospecifikus mikrobiológiai hidroxilezéssel úgy állítjuk elő, hogy egy (I) általános képletű vegyületet - ahol R jelentése a fentiekben meghatározott - egy alacsonyabb rendű, gomba típusú mikroorganizmus tenyészetével, igy Cunninghamella echinulata-, Mucor circinelloides-, Mucor plumbeus- illetve baktérium típusú Streptomyces rimosus-tenyészettel hozunk kölcsönhatásba.

Az (I) általános képletben a kinin és kinidin esetében R jelentése vinilcsoport, a különbség a 8-as és 9-es helyzetű szénato3

HU 201355 Β mok konfigurációjában van. A hidrogénezett származékok esetében R jelentése etilcsoport, e származékok tehát a dihidrokinin és a dihidrokinidin. Ugyanez a meghatározás vonatkozik a (II) általános képletű, hidroxilezett származékokra is.

A mikrobiológiai hidroxilezés céljára előnyösen alkalmazhatók a következő törzsek: Cunninghamella echinulata (NRRL 3655, MMP 2203),

Mucor circinelloides Mucor plumbeus Streptomyces rimosus

A találmány hogy a fentebb (CBS 108-16), (MMP 430, CBS 111-07), (NRRL 2234).

szerinti eljárás abban áll, felsorolt mikroorganizmusok tenyészetének egyikét a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyülettel kölcsönhatásba hozzuk.

A fenti jelzések jelentése a szokásos, tehát a következő:

NRRL: Mezőgazdasági Kutatási Tenyészetgyűjtemény, Északi Körzeti Kutatóközpont, Peoria, Illinois;

CBS: Központi Penészgomba-Tenyészeti Hivatal, Baarn, Hollandia;

MMP: A Természettörténeti Múzeum Gombagyűjteménye, Párizs, Franciaország.

A találmány szerinti mikrobiológiai hidroxilező eljárás során előnyös a mikroorganizmusokat olyan tenyésztóközegben szaporítani, amelyek asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisó-forrést tartalmaznak; előnyős a tenyésztést aerob fermentációs körülmények között, süllyesztett tenyészettel végezni. A hidroxilezni kívánt vegyületet előnyösen steril körülmények között adjuk a közeghez, és addig inkubáljuk, amíg kielégítő mennyiségű hidroxilezett termék képződik. Az extrakciót szokásos módszerekkel végezzük. Az inkubálást szokásos típusú fermentorban hajtjuk végre, megközelítőleg 20-30 °C közötti hőmérsékleten, közel 7-es pH-érték mellett. Kívánt esetben olyan közeget is alkalmazhatunk, amelynek pH-értéke megközelítőleg 6 és 8 között van: ennek következtében az eredmények alig változnak.

A találmány szerinti eljárás során a mikroorganizmusokat alkalmas tenyésztőközegben szaporítjuk megfeleleő biomassza előállítása céljából. A közeghez asszimilálható szénforróst (például dextrózt, szacharózt, keményítőt vagy mannitot) adunk 1-10% koncentrációban; a közeg akár szerves (peptonok, aszparagin, fehérjehidrolizótum), akár szervetlen (ammóniumsók, nitrátok) nitrogénforrást tartalmazhat. A közeg tartalmazhatja továbbá a szükséges ásványi sókat, valamint vitaminokat, például az élesztókivonatban jelenlévő vitaminokat; az eljárás során a hőmérséklet megközelítőleg 20-30 °C között változtatható az alkalmazott törzstől függően. A tenyésztést keverés közben végezzük. Amikor a mikroorganizmusok szaporulata kielégítőnek tekinthető - általában amidőn a szénhidrogén-szubsztrátum elfogy - azaz körülbelül 2-5 nap elmúltával, akkor a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyületet szi5 lárd formában, vagy kis térfogatú, vízzel elegyedő szerves oldószerben, például etanolban oldva, steril körülmények között hozzáadjuk olyan mennyiségben, hogy a végső koncentráció a molekulának vagy az alkalma10 zott törzsnek megfelelően 0,2 g/liter és néhány g/liter között legyen. Az inkubálást aminek során kismértékű szaporodás még végbemehet - erélyes keverés közben azonos hőmérsékleten 2-40 napon ót végezzük.

A találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyület inkubálását előzőleg mosott, és szenet vagy nitrogént nem tartalmazó puffe20 rolt vizes közegben reszuszpendált sejtekkel végezzük. A hidroxilezés akkor valósul meg, amikor a mikroorganizmusok elszaporodtak, és a szaporodás megszűnte után a micéliumot összegyűjtöttük.

Az inkubálás termékeinek, valamint a maradék szubsztrátumnak az extrakcióját vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel (például diklór-metánnal, kloroformmal vagy etil-acetáttal) hajtjuk végre a micéliumnak szű30 rés útján való elkülönítése és az oldószernek sókkal (például nótrium-kloriddal, nátrium-szulfóttal) való telítése után.

A hidroxilezés termékeinek kimutatását és azonosítását szilikagél-rétegen végzett fo35 lyadékkromatográfiával végezhetjük. A hidroxilezett terméknek az eredeti anyag maradékától való elkülönítését (ha ilyen anyag marad) és tisztítását a hagyományos kristályosítási, vagy ásványi adszorbensekkel végzett kromatográfiás módszerekkel hajthatjuk végre.

A tisztított, hidroxilezett terméket úgy azonosítottuk, hogy az irodalomban leirt, kémiai eljárásokkal előállított, autentikus (3S)45 -hidroxi-származékokkal összehasonlítottuk egyrészt különböző kromatográfiás rendszerekben, másrészt a szokásos szinképi (UV, Hl-NMR vagy ¹³C-NMR) és polarimetriás módszerek segítségével.

Az így kapott eredményeinket az alábbi példákban írjuk le, amelyekben több, regioés sztereoszelektív hidroxilezés re alkalmas törzset alkalmaztunk és több (I) általános képletű kiinduló anyagot használhatunk.

Megállapítottuk a különböző konverziós arányokat. A mikrobiológiai hidroxilezés szelektivitása mellett azzal a további előnnyel jár, hogy egyéb metabolitok jelentős mennyiségben nem képződnek, így a tisztítás egysze60 rűbbé válik, és a nem-metabolizált szubsztrátum reciklizálható (a folyamatba visszavihető).

A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem-korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjü

HU 201355 Β

1. példa

Kinidin hidroxilezése M. plumbeus gomba alkalmazásával

Néhány csepp M. plumbeus MMP 430 spóraszuszpenziót adunk egy 250 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml, alábbiakban leírt .A' közeghez, amelynek pH értékét 7-re állítottuk. Az inkubálást 72 órán át 10 27 °C hőmérsékleten forgó-keverő berendezésben végezzük, percenként 327 fordulatszámmal. Ezután 1 ml etanolban oldott 50 mg kinidint adunk a tenyészethez steril körülmények között, és a keverést 14 napon át 15 azonos körülmények között folytatjuk, a tenyészetet celiten szűrjük, a szűrletet nótrium-kloriddal telitjük, pH-értékét 2 n nátrium-hidroxid hozzáadásával 10-12-re állítjuk, majd hatszor diklór-metánnal extraháljuk. Az 20 egyesített szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és a maradékot preparativ szilikagél-rétegen kromatografáljuk. Eluálószerként diklór-metán, metanol és ammónium-hidroxid 85:14:1 arányú elegyét alkalmazzuk. Azt a 25 csíkot, amely a 254 nm hullámhosszú fluereszcenciával azonosított (3S)-3-hidroxi-kinidint tartalmazza (ennek vándorlási sebessége kisebb, mint a kinidiné) lekaparjuk, és metanollal eluáljuk. igy 1 mg hozammal kapunk 30 (3S)-3-hidroxi-kinidint, amely az autentikusan előállított mintával azonos. A nem reagált kinidint hasonló módon, csaknem kvantitatív (42 mg) hozammal visszanyerjük.

Az .A közeg összetétele:

Kukoricalekvár

Magnézium-szulfát-heptahidrát

Kálium-klorid

Nátrium- nitrát

Vas-(II)-szulfát-heptahidrát

D-Glükóz

Kálium-dihidrogén-foszfát Dikélium-hidrogén-foszfát Desztillált víz, amennyi szükséges

0,00 g

0,50 g

0,50 g 40

2,00 g

0,02 g

10,00 g

1,00 g 45

2,00 g

1,00 literhez.

2. példa

Dihidrokinidin hidroxilezése M. plumbeus gomba alkalmazásával

Az 1. példában leirt tenyészethez hasonló M. plumbeus CBS 111-07 tenyészettel az 1. példában leírt inkubálást hajtjuk végre, 1 g/liter dihidrokinidin-végkoncentrációban. így 20 nap elmúltával 5 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-dihidrokinidint, amely az autentikus úton előállított mintával azonos, és 80 mg hozammal nyerjük vissza a dihidrokinidint.

3. példa

Dihidrokinidin hidroxilezése S. rimosus baktérium alkalmazásával

Néhány ml S. rimosus NRRL 2334 előtenyészetet adunk 100 ml, alább leírt .B közeghez, amelynek pH-értékét 7-re állítottuk. A tenyésztést 72 órán át 27 °C-on végezzük, majd 1 ml etanolban oldott 100 mg dihidro-kinidint adunk hozzá, és a keverést 25 napon át azonos körülmények között folytatjuk, igy hasonló módon 4 mg (3S)-3-hidroxi-dihidrokinidint kapunk, és 85 mg dihidrokinidint visszanyerünk.

A .B' közeg összetétele: Bacto Casaminosavak (Difco)

Élesztőkivonat D-Glükóz Desztillált viz, amennyi szükséges

5,0 g 3,0 g 30,0 g

1,0 literhez.

4. példa

Kinin hidroxilezése C. echinulata gomba alkalmazásával

A fentiekben leirt inkubálást hajtjuk végre .A’ közeg alkalmazásával C. echinulata NRRL 3655 hasonló tenyészetével. A kinin végkoncentrációja 1 g/liter. így 30 nap elmúltával 9,5 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-kinint, amely azonos egy autentikusan előállított mintával, és 75 mg kinint viszszanyerünk. Megfigyeltük, hogy kis mennyiségben két további termék képződik, amelyek 254 nm hullámhosszon fluoreszkálnak.

5. példa

Dihidrokinin hidroxilezése M. circinelloides gomba alkalmazásával

A fentiekben leírt inkubálást hajtjuk végre .A' közegben M. circinelloides CBS 108-16 hasonló tenyészetének alkalmazásával, 1 g/iiter dihidrokinin-végkoncentrációval. igy 36 nap elmúltával 17 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-dihidrokinint, amely azonos egy autentikusan előállított mintával, és 70 mg dihidrokinint nyerünk vissza.

HU 201355 Β

6. példa SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Dihidrokinidin hidroxilezése M. plumbeus gomba alkalmazásával

Két 100 ml térfogatú M. plumbeus MMP 430 tenyészetet az 1. példában leirt .A közeg alkalmazásával összekeverünk, centrifugáljuk, a micéliumot steril körülmények között literenként 2 g dikálium-hidrogén-fosz- 10 fátot és 1 g kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó, desztillált vizes pufferoldattal mossuk, majd 100 ml azonos összetételű pufferoldatba helyezzük, és 0,5 g/liter végkoncentrációban vett dihidrokinidinnel inkubáljuk. 15 °C hőmérsékleten végzett 5 napos inkubálás után 6,5 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-dihidrokinidint, és 40 mg dihidrokinidint nyerünk vissza a szokásos módszerekkel. 20

Claims (6)

1. Eljárás a (II) általános képletű vegyületek - ahol

R jelentése etil- vagy vinilcsoport előállítására regiospecifikus és sztereospecifikus 3S-hidroxilezéssel, azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletű kinint, kinidint vagy dihidro-származékukat - ahol az (I) képletben

R jelentése a fentiekben meghatározott Cunninghamella echinulata-, Mucor circinelloides-, Mucor plumbeus- vagy Streptomyces rimosus-tenyészettel hozunk kölcsönhatásba és a keletkezett terméket kinyerjük, azzal a feltétellel, hogy a kinidin hidroxilezéséhez Cunninghamella echinulata-tól eltérő mikroorganizmus-tenyészetet alkalmazunk.

2. Az 1. igénypont szerinti hidroxilezési eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisó-forrást tartalmazó közegben, aerob fermentációs körülmények között, süllyesztett kultúrában tenyésztjük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyületet közvetlenül adjuk a tenyésztőközeghez, ha a mikroorganizmus szaporodása a kielégítő mértéket elérte.

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyület inkubálását közvetlenül végezzük előzőleg mosott sejtekkel, amelyeket szén- vagy nitrogénforrást nem tartalmazó közegben reszuszpendálunk.

5. A 2. igénypont szerinti hidroxilezési eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubálást 20-30 °C hőmérséklet-tartományban végezzük.

6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztőközeg pH-értékét megközelítőleg 6-8-ra állítjuk.