JPH0329397B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はウルソデオキシコール酸
（Ursodeoxycholic acid）の製造方法に係り、特
に、微生物変換の方法により、出発物質としての
リトコール酸（Lithocholic acid）から目的物質
としてのウルソデオキシコール酸を製造する方法
に関するものである。 この発明の目的物質としてのウルソデオキシコ
ール酸は第１図に示す構造式（）で表わされる
ように、ステロイド環の3α及び7βの位置に水酸
基を有する胆汁酸の一つである。 この物質は従前から利胆剤として多用されてい
るが近年に至つては、胆石溶解作用を有すること
が認められ、特に、経口投与によるコレステロー
ル胆石の治療に有効であることを示す多数の治験
データが報告されている。 ウルソデオキシコール酸は、天然には熊の胆汁
中に存在し、それより抽出することもできるが、
自然界中の存在量は極少であり、応需困難である
ので、従前から化学的合成による製造方法が採用
されてきた。 化学的合成による従前の製造方法では第２図の
化学反応式に示されるように、出発物質としての
コール酸（）のカルボキシル基をメチル化し
（）、次いで、無水酢酸により3α位及び7α位の
水酸基をアセチル化する（）。 続いて、アセチル化されない12位の水酸基をク
ロム酸でもつて酸化し、カルボニルとした（）
後、更に、これをケン化することにより、12−ケ
トケノデオキシコール酸（）を得る。 次に、この12−ケトケノデオキシコール酸
（）の12位のカルボニルをフアン−ミンロン
（Huang−Minlon）法により還元し、ケノデオキ
シコール酸（）を得る。 更に、ケノデオキシコール酸（）のアセトン
溶液にＮ−ブロムコハク酸イミドを加えて7α位
の水酸基を酸化することにより、７−ケトリトコ
ール酸（）を得る。 そして、最後に、７−ケトリトコール酸（）
をｎ−ブタノール中にて金属ナトリウムにより、
接触還元して、目的物質としてのウルソデオキシ
コール酸（）を得るものであつた。 しかしながら、かかる従前の製造方法は７段階
にも及ぶ複雑な工程を含むので、反応処理時間が
長大になるばかりか各工程ごとに精製作業を必要
とするので、処理作業が煩雑で生産能率が良好で
ないという欠点を伴つていた。 その上、各工程にて望ましくない副反応を生じ
易いので、収率が低いという難点もあつた。 この発明の目的は、上記従来技術に基づくウル
ソデオキシコール酸の生産能率等の問題点に鑑
み、微生物変換の方法を用いて出発物質としての
リトコール酸から目的物質としてのウルソデオキ
シコール酸を直接的に生産することにより、上記
欠点を除去し、難点を克服し、反応処理時間が著
しく短かく、生産能率が良好で、しかも、収率の
高い優れたウルソデオキシコール酸の製造方法を
提供せんとするものである。 上記目的に沿うこの発明の構成は、第３図に示
すように、フザリウム属（Fusarium属）に属す
る特定の不完全菌群、即ち、特定のカビ群の一つ
を出発物質としてのリトコール酸（）に接触さ
せてステロイド環の７位の炭素原子に対して水酸
基をβ型に特異的に導入することにより、目的物
質としてのウルソデオキシコール酸（）を製造
することを要旨とするものである。 より詳細には、この発明の方法はリトコール酸
からウルソデオキシコール酸への変換能を有する
フザリウム属に属する菌株、典型的には、フザリ
ウム エクイセテイ（Fusarium equiseti）Ｍ−
41株（以下、Ｍ−41株という）の一部若しくは全
部をリトコール酸に対して接触させることによ
り、微生物変換の方法を用いてウルソデオキシコ
ール酸を製造する方法であつて、具体的には下記
の方法を包含する。 (1) リトコール酸の存在する培地にて上記特定の
菌株群を培養することにより、培地中にウルソ
デオキシコール酸を蓄積させてこれを採取する
方法。 (2) 上記特定の菌株群が良好に生育する栄養培地
にて該菌株群を培養して得た菌体をリトコール
酸に接触させることにより、ウルソデオキシコ
ール酸を生成させて、これを採取する方法。 (3) 馬鈴薯澱粉またはオートミール培地にて、上
記特定の菌株群を胞子の形成に至るまで培養
し、該胞子を採取し、これを蒸留水あるいは緩
衝液中にリトコール酸と共に懸濁し、胞子をリ
トコール酸に接触させることにより、ウルソデ
オキシコール酸を生成させて、これを採取する
方法。 更に付言すれば、上記(1)の方法では、リトコー
ル酸の添加時期は培養工程の適宜の段階でよく、
例えば、菌株を栄養培地にて培養した後に、リト
コール酸を添加してもよい。 次に、上記(2)の方法では、培養液から菌体を一
旦分離した後に、これをリトコール酸の溶液ある
いは懸濁液中に投入してもよい。また、分離した
菌体をポリアクリルアミドやカルシウムアルギネ
ート等を用いて固定化した後にリトコール酸に接
触させてもよい。 更に、上記(3)の方法では、反応液中に有機物
質、典型的には、グルコース、その他の炭水化
物、カゼイン加水分解物等を低濃度に添加しても
よい。また、採取された胞子を、菌体の場合と同
様に、固定化した後にリトコール酸に接触させる
ことは随意である。 以上のように、この発明はリトコール酸からウ
ルソデオキシコール酸への変換能を有するフザリ
ウム属に属する特定の菌株群、典型的には、フザ
リウム エクイセテイＭ−41株を、出発物質とし
てのリトコール酸に対して接触させることによ
り、微生物変換の方法を用いて目的物質としての
ウルソデオキシコール酸を直接的に製造する方法
を構成しているので、従前の化学的合成の方法の
ように、７段階にも及ぶ工程の各段階ごとに処理
作業を行う必要がなく、処理作業の観点からは、
実質的に１段階の反応工程でもつて目的物質を製
造することができる。 したがつて、この発明によれば、反応時間が大
幅に短縮し、而して、生産能率が格段に向上する
という優れた効果がある。 更に、この発明によれば、微生物変換に際して
望ましくない副反応を伴わないので、目的物質を
50％にも及ぶ高収率でもつて製造することができ
るという優れた効果もある。 次に、この発明の方法に使用する微生物の一実
施例であるＭ−41株の培地における生育形態を説
明すれば以下の通りである。 該菌株を馬鈴薯寒天（PDA）培地に接種して、
30℃にて培養すると、培養の初期には、分生子柄
（conidiophore）の横に単独の梗子（phialide）
をつくり、そこから大胞子（macrocondia）を生
じており、該梗子の大きさは2.5〜３×10〜12.5μ
ｍである。 分生子柄は決して分生子座（sporodochia）を
つくらない。２週間後には、分生子柄の先端近く
で、ホウキ状に分枝し、その先端に２〜４個の梗
子をつくり、該梗子の形はトクリ形（ob−
clavate）であつて、最初に、分生子柄の横にで
きた梗子よりもやや大きく、３〜４×12〜17μｍ
である。 大胞子（macroconidia）は、紡錘形、三日月
形、を含む種々の形状を有し、その大きさも一定
していない。大胞子の巾は太くなく、特に、両端
は細い。多くの大胞子は、５つの隔壁（septa）
を持ち、その大きさは、3.8〜4.5×50〜63μｍで
ある。３つの隔壁を持つ大胞子も認められ、その
大きさは、3.8〜4.5×50〜63μｍである。３つの
隔壁を持つ大胞子も認められ、その大きさは、
3.8〜4.8×30〜38μｍである。 小胞子（microconidia）の形成は、きわめて
少い。 また、分生子柄の中間に球形あるいは楕円形の
厚膜胞子をつくり、球形のものは、その直径が７
〜9μｍであり、楕円形のものは、その長径が５
〜8.7×11〜12.5μｍである。 かかるＭ−41株を馬鈴薯（PDA）培地にて４
日間培養すると、直径がそれぞれ31℃では4.4cm、
27℃では5.8cm、25℃では5.5cmのコロニーが形成
される。 更に、トウモロコシ寒天、オートミール寒天な
らびに馬鈴薯寒天培地にて25℃及び30℃で２ケ月
培養したけれども子嚢果、子嚢、子嚢胞子の形成
は認められない。 そして、オートミール寒天培地（オートミール
30ｇ、寒天20ｇ、水道水１、PH6.5）を用いて
28℃にて14日間培養したときのＭ−41株の生育形
態を顕微鏡写真（倍率600倍）で示すものが第４
図である。 上記の生育形態を有するＭ−41株に関して、ブ
ースの分類、（Booth.C.、the Genus
Fusarium：Commonwealth Mycological
Institute、Kew、Surrey（1971））を参照して同
定を試みたところ、５つの隔壁を持つ大胞子が、
ブース（Booth）の記載よりやや長い（5μｍ）も
のがあるが、その他の生育形態は、Fusarium
equiseti（Corda）Sacc.、Sylloge Fung.のそれ
と一致したので、この菌株をFusarium equiseti
と同定し、Fusarium equiseti（フザリウム エ
クイセテイ）Ｍ−41株として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した（微工研条寄第259号）。 そして、かかるＭ−41株の生理的、生態的性質
は以下の通りである。 (1) 最適生育条件（PH、温度） 最適生育PHは６〜6.5、最適生育温度は27〜
28℃。 (2) 生育の範囲（PH、温度） PHの範囲は3.5〜８、温度の範囲は10〜37℃。 (3) その他の顕著な特徴 ツアペツク寒天培地あるいは液体培地で培養
すると、培養後期に薄いピンク色を呈する。 続いて、上記Ｍ−41株の採取径路を説明すれば
以下の通りである。 大阪府下を中心に６ケ所の土壌より609株のカ
ビを単離し、20mlの分離用培地を含む100ml容量
の三角フラスコに１株づつ接種し、28℃で５日間
振盪培養し、培養終了後5Nの塩酸でPH３に調整
した後、50mlの酢酸エチルで抽出し、この抽出液
に芒硝を加えて脱水後、ロータリーエバポレータ
ーで減圧濃縮し、その濃縮液を薄層クロマトグラ
フイーにより定性分析し、標準ウルソデオキシコ
ール酸と比較することにより、リトコール酸から
ウルソデオキシコール酸への変換能を有する菌株
をスクリーニングした。 その結果、リトコール酸からウルソデオキシコ
ール酸への最も良好な変換能を有する菌株とし
て、Ｍ−41株を得た。なお、この、スクリーニン
グされたＭ−41株は昭和56年７月28日に大阪府箕
面市内の山林の土壌から分離されたものである。 菌株の分離用培地としては、水道水１に対し
グルコース30ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、リン酸１カリウム２ｇ、リン酸２カリウ
ム３ｇ、硫酸マグネシウム0.5ｇ、塩化カルシウ
ム0.5ｇ、硫酸第１鉄20mg、及び変換反応基質と
してのリトコール酸0.5ｇを含む培地を使用した。 続いて、この発明の実施例について説明すれば
以下の通りである。 実施例 １ 水道水１に対して、グルコース50ｇ、
NaNO₃3ｇ、K₂HPO₄3ｇ、KH₂PO₄2ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、KCl0.5ｇ、FeSO₄20mgお
よびリトコール酸0.5ｇを混合して成る６の液
体培地を10容量の醗酵槽に投入し、予め同じ組
成の培地を用いて、28℃にて24時間振盪培養した
Ｍ−41株を上記醗酵槽内の液体培地に５％接種
し、培養温度28℃、PH７に調整しながら撹拌速度
300rpm、通気量0.5vvmで３日間、好気的に培養
する。培養終了後、培養液を塩酸でPH３に調整し
てから、２倍量の酢酸エチルで３回抽出する。こ
の酢酸エチル層を数回水洗した後、無水芒硝を添
加し、脱水後、減圧下にて酢酸エチルを溜去す
る。次いで、これをシリカゲル（ワコーゲルＣ−
200）80ｇをつめたカラムに吸着させ、クロロホ
ルム：アセトン：酢酸（100：100：１）から成る
混合溶媒で溶出し、ウルソデオキシコール酸を含
む溶出画分を採取する。かかる操作により、原料
リトコール酸からウルソデオキシコール酸を容易
に分離できる。更に、上記画分から得られた試料
を少量のエタノールに溶解し、常法通り、シリカ
ゲルの薄層（メルクキ−ゼルゲルＧ−60、F₂₅₄、
厚さ２mm）に塗布し、上記の混合溶媒で展開す
る。風乾後、ウルソデオキシコール酸画分を定量
的に削り取り、エタノールで抽出する。抽出液を
濃縮し、エタノール−水系からの結晶化を行い、
更に、酢酸エチルからの再結晶化を行う。 上記操作により、反応培地１当り0.25ｇ（50
％）のウルソデオキシコール酸の結晶を採取す
る。 実施例 ２ 水道水１に対して、オートミール50ｇ及びリ
トコール酸0.1ｇを含む６の培地（PH7.0）にて
実施例１に準じて、Ｍ−41株を接種し、醗酵槽を
用いて好気的に培養する。培養開始から24時間後
に、0.5ｇ／のリトコール酸を添加し、更に、
48時間培養を続行する。 培養終了後、実施例１の場合と同一の操作でも
つてウルソデオキシコール酸を抽出単離すること
により、反応培地１当り0.28ｇ（47％）の結晶
を採取する。 実施例 ３ 水道水１に対して、澱粉20ｇ、コーンステイ
ープリカー50ｇ、カツオエキス５ｇ、ポリペプト
ン５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、及びリトコール酸
0.5ｇを混合して成る６の培地にＭ−41株を接
種し、醗酵槽を用いてPH７、培養温度28℃にて36
時間培養する。 生成した菌体を遠心分離にて回収し、PH７のリ
ン酸緩衝液で洗浄した後、これをリン酸１カリウ
ム２ｇ、リン酸２カリウム３ｇ、グルコース10
ｇ、リトコール酸0.2ｇ、水道水１から成る反
応培地（PH7.0）に、菌体濃度30ｇ／になるよ
うに懸濁させて、28℃にて48時間、酸素通気下で
変換反応を行わせる。 以後は実施例１の場合と同一の操作により反応
培地１当り0.1（50％）のウルソデオキシコール
酸の結晶を採取する。 実施例 ４ 水道水１に対して、30ｇのオートミール、
0.2ｇのリトコール酸、及び20ｇの寒天を含むオ
ートミール寒天培地（PH７）にＭ−41株を接種
し、これを28℃にて２週間、好気的に培養する。 次いで、菌体をかき集め、PH７のリン酸緩衝液
中にこれを懸濁し、ガーゼで菌糸を濾別した後、
濾液中の胞子を遠心分離し、これを水洗する。 しかる後、PH７のリン酸緩衝液中に胞子を投入
し、10¹⁰胞子／mlとなるように調整した胞子反応
液を作成する。 これに、２ｇ／のグルコース及び0.2ｇ／
のリトコール酸を添加し、無菌空気を通気して、
30℃にて48時間の変換反応を行わせる。 以後は実施例１の場合と同一の操作により、変
換反応液１当たり0.1ｇ（50％）のウルソデオ
キシコール酸の結晶を採取する。 なお、上記この発明の実施例１〜４にて採取さ
れたウルソデオキシコール酸の結晶を標準物質
（ガスクロ工業(株)製ウルソデオキシコール酸）に
対して薄層クロマトグラフイー（メルクキーゼル
ゲルＧ−60、F₂₅₄、厚さ0.25mm）を用いて同定し
たところ、下記の展開溶媒の各々について実測さ
れた該結晶のRf値と該標準物質のそれとが完全
に一致した。 【表】 【表】 更に、上記この発明の実施例１〜４にて採取さ
れたウルソデオキシコール酸の結晶を前記標準物
質に対して以下に列記する分析法を用いて同定し
たところ、各分析法にて得られた該結晶の諸特性
と該標準物質のそれとが完全に一致した。 (1) 元素分析 (2) 融点および混融試験 (3) 赤外吸収スペクトル（分析） (4) 質量分析 (5) 核磁気共鳴スペクトル（分析）

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の方法における目的物質とし
てのウルソデオキシコール酸の構造式を示す説明
図、第２図は従前の化学合成による方法における
出発物質としてのコール酸から目的物質としての
ウルソデオキシコール酸に至る反応式を示す説明
図、第３図はこの発明に係わる微生物変換の方法
における出発物質としてのリトコール酸から目的
物質としてのウルソデオキシコール酸に至る反応
式を示す説明図、第４図はこの発明に係わる微生
物の一例であるフザリウムエクイセテイＭ−41株
の生育形態を示す顕微鏡写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
   の変換能を有するフザリウム属に属するカビを、
   リトコール酸と接触させることを特徴とする微生
   物変換の方法によるウルソデオキシコール酸の製
   造法。 ２ リトコール酸を含む培地にて、リトコール酸
   からウルソデオキシコール酸への変換能を有する
   フザリウム属に属するカビを培養し、培地中にウ
   ルソデオキシコール酸を蓄積させ、これを採取す
   ることを特徴とする特許請求の範囲１に記載の微
   生物変換の方法によるウルソデオキシコール酸の
   製造法。 ３ リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
   の変換能を有するフザリウム属に属するカビを栄
   養培地にて培養して得た菌体を、リトコール酸と
   接触させて、ウルソデオキシコール酸を生成さ
   せ、これを採取することを特徴とする特許請求の
   範囲１記載の微生物変換の方法によるウルソデオ
   キシコール酸の製造法。 ４ リトコール酸からウルソデオキシコール酸へ
   の変換能を有するフザリウム属に属するカビの胞
   子を、リトコール酸と接触させてウルソデオキシ
   コール酸を生成させ、これを採取することを特徴
   とする特許請求の範囲１記載の微生物変換の方法
   によるウルソデオキシコール酸の製造法。