CN111778296B - 一种固定化酶催化生产槲皮素的方法 - Google Patents

一种固定化酶催化生产槲皮素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种固定化酶催化生产槲皮素的方法。以黑曲霉为菌种，曲克芦丁为诱导剂进行糖苷酶的生产，糖苷酶经纯化后进行固定化处理，固定化酶对芦丁溶液进行连续催化酶解生产槲皮素，酶解液利用中极性吸附树脂进行吸附提取。采用芦丁结构近似物对发酵菌种进行糖苷酶的诱导，控制诱导时间，完全切断了槲皮素进一步分解的途径，大幅度提高产品的收率；采用固定化糖苷酶技术对低浓度的芦丁溶液进行连续催化酶解，彻底解决了芦丁水溶性低¸催化效率不高的技术瓶颈，使单位酶的使用成本得到大幅度降低；全部操作在全水相¸常温下完成，杜绝了有机溶媒的使用，大幅度减少了高浓度酸碱的使用，具有巨大的环保效益和社会效益。

Description

一种固定化酶催化生产槲皮素的方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及到一种固定化酶催化生产槲皮素的方法。
背景技术
槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，研究表明:槲皮素药用效果明显,对缺血再灌性心律失常有保护作用，能够降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脂性、降低血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量；具有较好的祛痰、止咳作用,并具有一定的平喘作用；槲皮素能够络合或捕获自由基，防止机体脂质过氧化反应，在抗菌抗病毒、抗炎、防治糖尿病并发症方面也有较强的药理作用，是目前公认的最有效的抗癌物质之一。槲皮素应用广泛,市场需求量较大，特别是近年来欧美国家把槲皮素作为原材料用于保健食品领域，国际市场需求量大幅度增加，因此槲皮素生产具有良好的市场前景。
由于天然存在的槲皮素原料稀少，价格昂贵，因此目前市场上的槲皮素主要是利用从槐米中提取的芦丁为原料，通过化学法或生物转化法进行生产。
利用芦丁原料生产槲皮素，化学法生产的一般工艺是，首先从槐米中提取芦丁，用弱碱性热水浸提，用亚硫酸钠做抗氧化剂，加适量硼砂对邻位羟基进行保护，利用芦丁在热冷水中溶解度的巨大差异进行分离和精制；之后将芦丁在5%硫酸溶液中加热回流，水解掉芸香糖后生成槲皮素，利用其几乎不溶于水的性质，以60%的乙醇溶液浸提和热水洗涤进行精制和除杂。生物发酵法，有报道采用链霉菌发酵法或纳豆菌发酵法，但一般采用黑曲霉发酵，黑曲霉可产生丰富的糖苷酶，酶活高，转化效果好，黑曲霉发酵可分固体发酵和液体发酵。液体发酵一般以芦丁作为主要碳源，接种黑曲霉发酵；固体发酵是以槐米或槐米粉为基质，添加无机盐，调整水分后接种黑曲霉进行发酵，转化率一般低于液体发酵。
化学法需要消耗大量的酸碱及有机溶媒，产生大量的废水，对环保带来巨大压力；目前生物转化法生产槲皮素，是采用将芦丁添加到培养基中，诱导微生物产生糖苷酶，再利用产生的糖苷酶切除芦丁分子上面的葡萄糖和鼠李糖残基，虽然具有环境友好的特点，但诱导产生的酶不具有专一性，诱导过程中进一步产生的槲皮素分解酶将槲皮素分解破坏，使产品收率受到影响。化学法生产槲皮素的摩尔收率低于85%，生物发酵法生产槲皮素的摩尔收率低于79% 。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种固定化酶催化生产槲皮素的方法。以固定化糖苷酶为生物催化剂¸以芦丁为原料生产槲皮素，吸附、解析、结晶即得槲皮素。固定化酶装入树脂柱后对低浓度的芦丁溶液进行连续催化酶解，彻底解决了芦丁水溶性低¸催化效率低下的技术瓶颈，而且使单位酶的使用成本得到大幅度降低。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种固定化酶催化生产槲皮素的方法，包括以下步骤：将微生物菌种培养至对数生长末期，添加诱导剂继续培养；然后固定化处理；通入芦丁溶液；吸附、解析、结晶即得槲皮素。
上述固定化酶催化生产槲皮素的方法，具体包括如下步骤：
（1）将微生物菌种培养至对数生长末期，添加培养基质量0.5-3%的诱导剂继续培养4-12h；
（2）培养结束，培养液离心或过滤，收集清液，提取纯化糖苷酶，用载体进行固定化处理，制得固定化酶；装入层析柱中制成固定化酶树脂柱，待用；
（3）将芦丁、去离子水加热至50℃-80℃使芦丁溶液溶清，配制成0.2-0.6g/L芦丁溶液，调节PH7.2-7.4，降温至30℃-37℃；
（4）将芦丁溶液连续匀速通入固定化酶树脂柱中，流速1-15BV/h，收集过柱液；
（5）过柱液上中极性吸附树脂柱进行吸附，上柱流速1-5BV/h，去离子水冲洗，1%-2%的碱性溶液解吸，解吸流速0.5-2BV/h；
（6）收集解吸液，用酸调PH至6.8-7.2,0℃-8℃结晶4-8h；
（7）过滤，滤饼用去离子水顶洗，抽干，滤饼50-55℃真空干燥，即得槲皮素产品。
优选地，所述的步骤（1）中微生物菌种为：枯草芽孢杆菌¸根霉¸黑曲霉¸拟内孢酶¸红曲霉菌种中的任一种。
优选地，所述的步骤（1）中诱导剂为：曲克芦丁。
优选地，所述的步骤（2）中固定化酶载体为：环氧基载体或氨基载体。
优选地，所述的步骤（3）中芦丁配制浓度为0.4-0.5g/L。
优选地，所述的步骤（3）中芦丁溶液降温至32-35℃。
优选地，所述的步骤（4）中芦丁溶液通入固定化酶树脂柱的流速为4-8BV/h。
优选地，所述的步骤（1）中诱导培养时间为：6-8h。
更优选地，所述的步骤（1）中微生物菌种为黑曲霉菌种。
在微生物菌种的培养液中添加曲克芦丁诱导剂，β-葡萄糖苷酶和 α-鼠李糖苷酶在数小时内被诱导产生，曲克芦丁被糖苷酶切除葡萄糖和鼠李糖生成曲克槲皮素，曲克槲皮素可以继续诱导黑曲霉生成开环分解酶，使曲克槲皮素最终分解为二氧化碳和水。收集纯化糖苷酶，并进行固定化处理，装入树脂柱内，连续通入低浓度的芦丁溶液进行催化酶解，过柱酶解液通入中极性吸附树脂中进行吸附浓缩；吸附树脂柱接近饱和后，去离子水冲洗，稀碱液解吸，解吸液下调PH，于低温条件下结晶，过滤收集晶体，干燥即可得到槲皮素产品。
本发明有益效果：
1. 诱导生成β-葡萄糖苷酶和 α-鼠李糖苷酶
本发明采用芦丁结构近似物：曲克芦丁对发酵菌种进行糖苷酶的诱导，控制诱导时间，杜绝了曲克槲皮素分解酶的产生；同时即使少量的曲克槲皮素分解酶对槲皮素也不能够产生分解作用，这样就完全切断了槲皮素进一步分解的途径，大幅度提高了产品的收率。
2. 低浓度的芦丁溶液连续催化酶解
本发明采用固定化糖苷酶技术，固定化酶装入树脂柱后对低浓度的芦丁溶液进行连续催化酶解，彻底解决了芦丁水溶性低¸催化效率低下的技术瓶颈，而且使单位酶的使用成本得到大幅度降低。
3.不采用有机溶媒
本发明全部操作都是在全水相¸常温条件下完成，杜绝了有机溶媒的使用，大幅度减少了高浓度酸碱的使用，具有极大的环保效果。
附图说明
图1为空白组的高效液相色谱图；
图2为槲皮素对照品的高效液相色谱图；
图3为实施例3制备的槲皮素的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1：
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（一）15L全自动发酵罐，按照以下配方：硝酸钠 3g/L,磷酸氢二钾 1g/L,七水硫酸镁 0.5g/L,氯化钾 0.5g/L,硫酸亚铁 0.01g/L,蔗糖 20g/L,配制培养基，121℃灭菌20分钟，消后体积7L左右。
（二）接入提前培养好的黑曲霉液体种子700ml，菌种编号AS3.4309，培养温度28℃，空气流量0.6m³/h，调整搅拌转速使溶氧大于40%；培养13h，检测菌浓12.4%，蔗糖浓度0.67%，添加曲克芦丁细粉140g，继续培养7h。
（三）培养结束，培养液中加入140g硅藻土进行板框过滤，收集滤液6.68L，调整PH6.5，上层析柱进行纯化，层析柱直径22mm，高度400mm，装入DEAE填料100ml；上柱流速400ml/h，上柱结束用20mM PH6.5的磷酸盐缓冲液冲洗400ml体积，流速400ml/h；分别用200ml浓度为100mM¸500ml浓度为200mM的PH6.5氯化钠溶液进行解吸，收集200mM氯化钠解吸液中100ml-450段的解吸液。
（四）350ml纯化酶液中添加56g磷酸二氢钾，添加过程中随时用磷酸氢二钾调整PH8.0；过滤，滤液中添加环氧基树脂35g，缓慢搅拌状态下，于25℃温度下固定化40h。
（五）固定化处理结束，抽滤，固定化酶用去离子水漂洗3次，4-8℃冷藏备用。得固定化酶34.8g。
实施例2：
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（一）15L全自动发酵罐，按照以下配方：可溶性淀粉 20.0g/L， K2HPO4 1.0g/L，MgSO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，
CaCO3 2.0g/L，FeSO4 0.001g/L，MnCl2 0.005g/L， ZnSO4 0.001g/L，pH 6.8-7.0，配制培养基，121℃灭菌20分钟，消后体积7L左右。
（二）接入提前培养好的枯草芽孢杆菌液体种子200ml，培养温度37℃，空气流量0.6m³/h，调整搅拌转速使溶氧大于30%；培养18h，检测菌浓OD600值21.4，总糖浓度0.76%，添加曲克芦丁细粉120g，继续培养8h。
（三）培养结束，发酵液8000转/分钟离心20分钟，收集离心上清液6.53L，调整PH6.5，上层析柱进行纯化，层析柱直径22mm，高度400mm，装入DEAE填料80ml；上柱流速400ml/h，上柱结束用20mM PH6.5的磷酸盐缓冲液冲洗350ml体积，流速350ml/h；分别用160ml浓度为100mM¸400ml浓度为200mM的PH6.5氯化钠溶液进行解吸，收集200mM氯化钠解吸液中100ml-400ml段的解吸液。
（四）300ml纯化酶液中添加51g磷酸二氢钾，添加过程中随时用磷酸氢二钾调整PH8.0；过滤，滤液中添加环氧基树脂30g，缓慢搅拌状态下，于25℃水浴温度下固定化处理50h。
（五）固定化处理结束，抽滤，固定化酶用去离子水漂洗3次，4-8℃冷藏备用。得固定化酶30.1g 。
实施例3：
一种固定化酶催化生产槲皮素的方法，包括以下步骤：
（1）取玻璃层析柱，直径22mm，高度400mm，装入按照实施例1方法制备的固定化糖苷酶85.6g，制成固定化酶树脂柱；取玻璃层析柱，直径30mm，高度50mm，装入中极性吸附树脂200ml，质量178.3g，树脂型号：LXT-52，生产厂家：西安蓝晓科技有限公司；
（2）50L反应釜中加入40L左右的去离子水，开动搅拌，将20g芦丁加入反应釜中，加热至62℃使芦丁溶液溶清；调节PH7.3左右，降温至33℃左右；
（3）将芦丁溶液泵入固定化酶树脂柱，流速800ml/h，吸附树脂柱与固定化酶树脂柱串联，固定化酶树脂柱过柱液直接进入吸附树脂柱进行吸附，吸附树脂过柱液弃去或代替去离子水用于芦丁溶液的配制；
（4）吸附树脂柱吸附产品量达到15g左右时，切换至另一个经过洗涤再生的吸附柱，吸附产品接近饱和的吸附柱进行解吸；
（5）待解吸的吸附树脂柱用2BV的去离子水冲洗，之后用1.2%的氢氧化钠溶液进行解吸，流速100ml/h，解吸液用量300ml，收集50ml-300ml解吸段的解吸液，吸附树脂柱用去离子水冲洗至PH8.0-9.0后用于下一批吸附；
（6）将250ml解吸液用盐酸缓慢调节PH7.0，降温至2℃左右，缓慢搅拌状态下结晶6h；
（7）结晶液抽滤，滤饼用50ml去离子水顶洗，收集滤液，检测槲皮素含量0.14g/L，进吸附树脂回收结晶母液中残留的槲皮素；
（8）滤饼捻碎，放入真空干燥箱中干燥16h，干燥温度55℃，真空度≥0.098MPa。收集产品13.87g，水分含量0.60%，产品纯度99.85%，槲皮素含量98.52%。产品总摩尔收率92.3%。
实施例4
一种固定化酶催化生产槲皮素的方法，包括以下步骤：
（1）取玻璃层析柱，直径22mm，高度400mm，装入实施例1制备的固定化糖苷酶84.7g，制成固定化酶树脂柱；取玻璃层析柱，直径30mm，高度50mm，装入中极性吸附树脂200ml，质量178.6g，树脂型号：LXT-52，生产厂家：西安蓝晓科技有限公司；
（2）50L反应釜中加入40L左右的去离子水，开动搅拌，将8g芦丁加入反应釜中，加热至62℃使芦丁溶液溶清；调节PH7.3左右，降温至30℃左右；
（3）将芦丁溶液泵入固定化酶树脂柱，流速900ml/h，吸附树脂柱与固定化酶树脂柱串联，固定化酶树脂柱过柱液直接进入吸附树脂柱进行吸附，吸附树脂过柱液弃去或代替去离子水用于芦丁溶液的配制；
（4）吸附树脂柱吸附产品量达到15g左右时，切换至另一个经过洗涤再生的吸附柱，吸附产品接近饱和的吸附柱进行解吸；
（5）待解吸的吸附树脂柱用2BV的去离子水冲洗，之后用1%的氢氧化钠溶液进行解吸，流速100ml/h，解吸液用量300ml，收集50ml-300ml解吸段的解吸液，吸附树脂柱用去离子水冲洗至PH8.0-9.0后用于下一批吸附；
（6）将250ml解吸液用盐酸缓慢调节PH7.0，降温至4℃左右，缓慢搅拌状态下结晶6h；
（7）结晶液抽滤，滤饼用50ml去离子水顶洗，收集滤液，检测槲皮素含量0.13g/L，进吸附树脂回收结晶母液中残留的槲皮素；
（8）滤饼捻碎，放入真空干燥箱中干燥15h，干燥温度55℃，真空度≥0.098MPa。收集产品13.65g，水分含量1.34%，产品纯度99.65%，槲皮素含量98.42%。槲皮素总摩尔收率93.4%。
实施例5
一种固定化酶催化生产槲皮素的方法，包括以下步骤：
（1）取玻璃层析柱，直径22mm，高度400mm，装入实施例2制备的固定化糖苷酶87.1g，制成固定化酶树脂柱；取玻璃层析柱，直径30mm，高度50mm，装入中极性吸附树脂200ml，质量178.5g，树脂型号：LXT-52，生产厂家：西安蓝晓科技有限公司；
（2）50L反应釜中加入40L左右的去离子水，开动搅拌，将24g芦丁加入反应釜中，加热至62℃使芦丁溶液溶清；调节PH7.3左右，降温至37℃左右；
（3）将芦丁溶液泵入固定化酶树脂柱，流速800ml/h，吸附树脂柱与固定化酶树脂柱串联，固定化酶树脂柱过柱液直接进入吸附树脂柱进行吸附，吸附树脂过柱液弃去或代替去离子水用于芦丁溶液的配制；
（4）吸附树脂柱吸附产品量达到15g左右时，切换至另一个经过洗涤再生的吸附柱，吸附产品接近饱和的吸附柱进行解吸；
（5）待解吸的吸附树脂柱用5BV的去离子水冲洗，之后用2%的氢氧化钠溶液进行解吸，流速100ml/h，解吸液用量300ml，收集50ml-300ml解吸段的解吸液，吸附树脂柱用去离子水冲洗至PH8.0-9.0后用于下一批吸附；
（6）将250ml解吸液用盐酸缓慢调节PH7.0，降温至2℃左右，缓慢搅拌状态下结晶6h；
（7）结晶液抽滤，滤饼用50ml去离子水顶洗，收集滤液，检测槲皮素含量0.14g/L，进吸附树脂回收结晶母液中残留的槲皮素；
（8）滤饼捻碎，放入真空干燥箱中干燥16h，干燥温度55℃，真空度≥0.098MPa。收集产品13.82g，水分含量1.43%，产品纯度99.45%，槲皮素含量98.32%。槲皮素总摩尔收率93.1%。
实施效果例
含量测定
按照《中华人民共和国药典》四部通则0512（高效液相色谱法）测定 。
1方法
1.1对照品储备液的制备
精密称取槲皮素对照品10mg，置于25ml量瓶中，加80%甲醇溶液，超声，稀释至刻度，摇匀。对照品储备液的浓度为383.7μg/ml。
1.2对照溶液的制备
精密量取“1.1对照品储备液”1.00ml置于100ml容量瓶中，加80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。制得对照溶液浓度为3.837μg/ml。
1.3空白溶液的制备
不量取对照品储备液，其余步骤按上述“1.2对照溶液的制备”进行操作，制得空白溶液。
1.4供试品溶液的制备
精密称取槲皮素产品（实施例3制备的）10mg，置于25ml量瓶中，加80%甲醇溶液，超声，稀释至刻度，摇匀。再取上述溶液1.00ml置100ml量瓶中，加80%甲醇溶液，超声，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
1.5检测波长选择
取“1.2对照溶液” 2ml，用紫外分光光度计进行扫描，在360nm处有最大吸收，把360nm做为检测波长。
1.6色谱条件
Agilent C18色谱柱（4.6mm ×250mm，4μm），DAD检测器，检测波长360nm，流动相为甲醇-0.4%磷酸（50:50），流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10μl。
2结果
2.1系统适用性
取“1.3空白溶液”、“1.2对照溶液”、“1.4供试品溶液”，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。空白溶液与对照溶液相同保留时间处未显色谱峰，故无干扰。理论塔板数均大于2500，分离度大于1.5，峰对称性良好。
2.2绘制标准曲线：
分别精密量取“1.1对照品储备溶液”0.1，0.2，0.5，1，2，4ml置于50ml容量瓶中，加80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。按照上述色谱条件进样，测定峰面积。以表1中峰面积（Y）为纵坐标，以浓度（X）μg/ml为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算。得回归方程Y=26.9989X+32.5047（r2=0.9995），线性关良好。
表1 标准曲线峰面积
Figure 504986DEST_PATH_IMAGE002
2.3重复性实验
取“1.2对照溶液”，按照上述色谱条件，连续进样5次，测定峰面积。计算相对标准偏差RSD ＜2.0%，表明仪器精密度较好，见表2。
表2 重复性试验（n=5）
Figure 218864DEST_PATH_IMAGE004
2.4稳定性实验取1.4供试品溶液 ，分别于制备后0、3、6、9、12、24h进样测定，记录槲皮素的峰面积，计算RSD，结果为0.6%，表明供试品溶液在24小时内稳定，见表3。
表3稳定性实验
Figure 529760DEST_PATH_IMAGE006
2.5含量测定
取“1.4供试品溶液”，按上述色谱条件进样2次，测定峰面积，计算供试品中槲皮素的浓度和含量，结果见表4。
表4.含量测定结果
Figure 659390DEST_PATH_IMAGE008
2.6回收率的测定
精密称取上述含量测定后的供试品约10mg，对照品10mg，分别称取6份，置于25ml容量瓶中，加80%甲醇溶液，超声，稀释至刻度，摇匀。再取上述溶液1.00ml置100ml量瓶中，加80%甲醇溶液，超声，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按照上述色谱条件进样，测定峰面积，计算回收率，RSD%结果见为0.32，结果表明该检验方法的回收率良好，方法可行。见表5。
表5回收率测定结果
Figure 4920DEST_PATH_IMAGE010
。

Claims (5)

1.一种固定化酶催化生产槲皮素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将微生物菌种培养至对数生长末期，添加诱导剂继续培养；然后固定化处理；通入芦丁溶液；吸附、解析、结晶即得槲皮素；
方法具体包括如下步骤：
（1）将微生物菌种培养至对数生长末期，添加培养基质量0.5-3%的诱导剂继续培养4-12h；
（2）培养结束，培养液离心或过滤，收集清液，提取纯化糖苷酶，用载体进行固定化处理，制得固定化酶；装入层析柱中制成固定化酶树脂柱，待用；
（3）将芦丁、去离子水加热至50℃-80℃使芦丁溶液溶清，配制成0.2-0.6g/L芦丁溶液，调节PH7.2-7.4，降温至30℃-37℃；
（4）将芦丁溶液连续匀速通入固定化酶树脂柱中，流速1-15BV/h，收集过柱液；
（5）过柱液上中极性吸附树脂柱进行吸附，上柱流速1-5BV/h，去离子水冲洗，1%-2%的碱性溶液解吸，解吸流速0.5-2BV/h；
（6）收集解吸液，用酸调PH至6.8-7.2,0℃-8℃结晶4-8h；
（7）过滤，滤饼用去离子水顶洗，抽干，滤饼50-55℃真空干燥，即得槲皮素产品；
所述的步骤（1）中诱导剂为：曲克芦丁；
所述的步骤（1）中微生物菌种为：枯草芽孢杆菌或黑曲霉。
2.根据权利要求1所述的固定化酶催化生产槲皮素的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中固定化酶载体为：环氧基载体或氨基载体。
3.根据权利要求1所述的固定化酶催化生产槲皮素的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中芦丁配制浓度为0.4-0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的固定化酶催化生产槲皮素的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中芦丁溶液降温至32-35℃。
5.根据权利要求1所述的固定化酶催化生产槲皮素的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中微生物菌种为黑曲霉菌种。
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