CN101880698A

CN101880698A - 蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用

Info

Publication number: CN101880698A
Application number: CN 201010178064
Authority: CN
Inventors: 王俊; 吴福安; 王蒙; 张妍; 谢谢
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Beijing union Hongyuan Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2010-05-19
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2030-05-19
Also published as: CN101880698B

Abstract

蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，将蜗牛酶粗酶制剂加入浓度为0.005～0.100g/L的芦丁底物溶液中，使得溶液中蜗牛酶浓度为0.1～50g/L，pH 3～9，进行酶促水解反应，反应温度10～70℃，反应时间0.1～36h，反应结束，获得水解产物槲皮素。以蜗牛酶的粗酶制剂或固定化酶制剂用于催化水解芦丁定向生物合成槲皮素，不仅催化剂来源广泛、制备容易、成本低廉，而且酶制剂稳定性高、易于保存、催化效率和专一性高。因此，使用蜗牛酶可大幅度降低槲皮素的生产成本，酶催化转化率高，且产物专一。

Description

蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用

一、技术领域

本发明属于天然产物生物合成领域，具体涉及一种蜗牛酶在水解芦丁制备槲皮素中的应用方法。

二、背景技术

现有技术：槲皮素(Quercetin，3，5，7，3′，4′-pentahydroxyflavanone)是一种在自然界分布非常广泛的黄酮类苷元化合物，是一种优秀的天然抗氧化剂，具有去痰止咳平喘、抗炎、抗过敏、解痉、强心、降血压、降血脂、抗心律失常、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等广泛的药理作用。因此，槲皮素一直是药学界的热点化合物之一，国内外对其理化性质、提取分离、药理活性及临床应用均做了大量研究。

槲皮素作为芦丁(Rutin，Quercetin-3-rutinose)的苷元，是自然界中具有显著生理活性的代表性苷元型黄酮类化合物。尽管槲皮素广泛存在于食用或药用植物中，但真正以苷元形式分布在自然界中较少，绝大多数是以其芸香糖苷的形式(芦丁)存在，如在槐花中芦丁含量最高可达28％。此外，由于槲皮素分子中含有五个活泼的酚羟基，由于羟基的保护-去保护使得其化学合成的成本居高不下，因此其制备方法主要有以下两种：提取法和水解法。

提取法：从植物或植物提取物中采用溶剂萃取法提纯槲皮素，如CN00808993公开的从生物类黄酮中回收异槲皮素(Isoquercitrin，Quercetin-3-glucose)方法，即从生物类黄酮浆(回收类黄酮的母液残余物)中采用乙酸甲酯和水的混合溶剂提取，但由于类黄酮浆中含有槲皮素、异槲皮素以及其他类似物，单纯采用溶剂萃取法难以低成本制备槲皮素。

水解法：以芦丁等低成本糖苷型黄酮化合物为原料采用水解法制备槲皮素的报道较多，其水解反应过程常使用化学催化或酶催化水解法。(1)化学法水解文献报道最多，是由于芦丁苷键(鼠李糖苷键和葡萄糖苷键)为半缩醛结构，对酸不稳定，对碱较稳定，易被酸催化水解，主要采用盐酸、硫酸等无机酸作催化剂，水解反应机理是苷键原子先被质子化，然后苷键断裂形成糖基正离子或半椅型的中间体，该中间体再与水结合形成糖，并释放催化剂质子。但是酸催化水解法的水解温度较高，使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，对环境造成污染。水解方式除前述常规水解方法外，还有加压水解法，如CN200610065217公开的用芦丁制备槲皮素和异槲皮苷的方法，在高压反应釜中投入芦丁浆液，加热至沸，采用加压水解获得水解产物槲皮素和异槲皮苷，但芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得槲皮素。(2)酶催化水解法主要以糖苷酶为催化剂，如CN03133636公开的酶法水解芦丁制备异槲皮素和槲皮素的方法，以槐米为高温好氧菌或曲霉菌或罗伦隐球酵母菌的发酵产酶诱导物，液态或固态法产糖苷酶，通过调控反应条件水解芦丁产异槲皮苷和槲皮素的混合物，但未实现槲皮素的定向转化。综上，上述水解法均未能实现芦丁定向水解制备槲皮素。考虑到水解反应的效率和对环境友好，采用酶法制备槲皮素更适合于工业化生产。

蜗牛酶曾报道用于降解天然产物以及多糖，如CN01136891公开的应用蜗牛酶降解纤维素、人参、黄芪、甘草等天然产物和壳聚糖、果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等多糖的方法，均是以内切β(1-4)糖苷键的形式实现。类似的研究，还有CN01133410公开的用酶水解人参皂甙制备20-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇的方法，均表明蜗牛酶应用于天然产物的生物转化具有良好的可行性。但是，未见应用蜗牛酶定向水解芦丁分子中芸香糖苷键的报道。

因此，本专利首次应用蜗牛酶催化水解芦丁分子中的芸香糖苷键，实现槲皮素的定向生物合成，表现出酶法水解芦丁制备槲皮素过程的高度专一性，为今后大规模工业化生物合成槲皮素的应用奠定了基础，为推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

三、发明内容

发明目的：针对以上问题，本发明提供了一种应用蜗牛酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素的方法。该方法可以高效地实现定向水解芦丁分子中的芸香糖苷键，为酶法制备槲皮素的工业化应用提供了新工艺。

技术方案：蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，将蜗牛酶粗酶制剂加入浓度为0.005～0.100g/L的芦丁底物溶液中，使得溶液中蜗牛酶浓度为0.1～50g/L，pH 3～9，进行酶促水解反应，反应温度10～70℃，反应时间0.1～36h，反应结束，获得水解产物槲皮素。

上述反应时间优选为0.1～6h。

蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，配制作固定化酶用的胶体溶液，所述胶体溶液中胶体的质量浓度为0.5～15％，加入蜗牛酶粗酶粉，使得溶液中蜗牛酶的浓度为0.1～50g/L，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化0.5～12h，制成大小均匀的球状或方形固定化颗粒，洗涤后备用；将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.005～0.100g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度10～70℃，反应时间0.1～72h，反应结束，获得水解产物槲皮素。

上述胶体为海藻酸钠、卡拉胶或明胶。

上述反应时间为0.5～24h。

上述蜗牛酶粗酶在溶液中的浓度优选为0.5～20g/L。

上述芦丁底物溶液浓度优选为0.01～0.05g/L。

上述pH优选5～7。

上述反应温度优选为20～45℃。

有益效果：(1)以蜗牛酶的粗酶制剂或固定化酶制剂用于催化水解芦丁定向生物合成槲皮素，不仅催化剂来源广泛、制备容易、成本低廉，而且酶制剂稳定性高、易于保存、催化效率和专一性高。因此，使用蜗牛酶可大幅度降低槲皮素的生产成本，酶催化转化率高，且产物专一。

(2)采用本发明所述的技术方案得到的槲皮素由于在极性溶剂中的溶解度低于底物芦丁，可以通过常规的减压浓缩轻易地从酶促转化体系中分离，剩余的底物芦丁可以继续酶促水解。因而，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，催化剂价格低廉，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业和日化工业的需要。

四、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明实施例中使用的芦丁和槲皮素测定方法为高效液相色谱法：

(1)芦丁：色谱柱：Alltima C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：四氢呋喃-0.02％磷酸(25∶75，V/V)；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

(2)槲皮素：色谱柱：Alltima C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：乙腈-0.5mol/LpH4.0醋酸缓冲液(27∶73，V/V)；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

其中，产物槲皮素的转化率计算方法为：

蜗牛酶为催化剂，以芦丁为原料定向生物合成槲皮素的反应式见下。

实施例1

A、蜗牛酶的游离酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

将芦丁溶于pH 7的缓冲液中，得到浓度为0.005g/L的芦丁底物溶液。将该底物溶液置于50mL具塞锥形瓶中，将蜗牛酶粗酶制剂按50g/L的比例加入，塞紧磨口瓶塞，于120rpm的旋转式摇床中进行酶促水解反应，反应温度40℃，反应时间0.5h。反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为92％。

B、蜗牛酶的固定化酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

用卡拉胶配制作固定化酶用的0.5％wt胶体溶液，加入50g/L的蜗牛酶粗酶粉，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化3h，制成大小均匀的方形固定化颗粒，洗涤后备用。

将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.005g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度40℃，反应时间12h，反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为82％。

实施例2

A、蜗牛酶的游离酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

将芦丁溶于pH3的缓冲液中，得到浓度为0.100g/L的芦丁底物溶液。将该底物溶液置于50mL具塞锥形瓶中，将蜗牛酶粗酶制剂按0.1g/L的比例加入，塞紧磨口瓶塞，于120rpm的旋转式摇床中进行酶促水解反应，反应温度10℃，反应时间36h。反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为22％。

B、蜗牛酶的固定化酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

用明胶配制作固定化酶用的15％wt胶体溶液，加入0.100g/L的蜗牛酶粗酶粉，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化12h，制成大小均匀的方形固定化颗粒，洗涤后备用。

将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.100g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度10℃，反应时间72h，反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为48％。

实施例3

A、蜗牛酶的游离酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

将芦丁溶于pH 9的缓冲液中，得到浓度为0.025g/L的芦丁底物溶液。将该底物溶液置于50mL具塞锥形瓶中，将蜗牛酶粗酶制剂按0.5g/L的比例加入，塞紧磨口瓶塞，于120rpm的旋转式摇床中进行酶促水解反应，反应温度70℃，反应时间0.1h。反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为23％。

B、蜗牛酶的固定化酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

用海藻酸钠配制作固定化酶用的5％wt胶体溶液，加入0.5g/L的蜗牛酶粗酶粉，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化0.5h，制成大小均匀的球状固定化颗粒，洗涤后备用。

将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.025g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度70℃，反应时间0.1h，反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为11％。

实施例4

A、蜗牛酶的游离酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

将芦丁溶于pH 6.2的缓冲液中，得到浓度为0.024g/L的芦丁底物溶液。将该底物溶液置于50mL具塞锥形瓶中，将蜗牛酶粗酶制剂按0.25g/L的比例加入，塞紧磨口瓶塞，于120rpm的旋转式摇床中进行酶促水解反应，反应温度34℃，反应时间0.5h。反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为95％。

B、蜗牛酶的固定化酶催化水解芦丁定向生物合成槲皮素：

用海藻酸钠配制作固定化酶用的2％wt胶体溶液，加入0.5g/L的蜗牛酶粗酶粉，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化3h，制成大小均匀的球状固定化颗粒，洗涤后备用。

将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.024g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度35℃，反应时间36h，反应结束，HPLC检测水解产物槲皮素的摩尔转化率为98％。

Claims

1.蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于：将蜗牛酶粗酶制剂加入浓度为0.005～0.100g/L的芦丁底物溶液中，使得溶液中蜗牛酶浓度为0.1～50g/L，pH3～9，进行酶促水解反应，反应温度10～70℃，反应时间0.1～36h，反应结束，获得水解产物槲皮素。

2.根据权利要求1所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述反应时间优选为0.1～6h。

3.蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于：配制作固定化酶用的胶体溶液，所述胶体溶液中胶体的质量浓度为0.5～15％，加入蜗牛酶粗酶粉，使得溶液中蜗牛酶的浓度为0.1～50g/L，混合均匀后，滴入交联剂溶液中固化0.5～12h，制成大小均匀的球状或方形固定化颗粒，洗涤后备用；将固定化蜗牛酶装填于柱状反应器，用泵输送浓度为0.005～0.100g/L的芦丁底物溶液经过固定床，进行酶促水解反应，反应温度10～70℃，反应时间0.1～72h，反应结束，获得水解产物槲皮素。

4.根据权利要求3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述胶体为海藻酸钠、卡拉胶或明胶。

5.根据权利要求3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述反应时间为0.5～24h。

6.根据权利要求1或3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述蜗牛酶粗酶在溶液中的浓度优选为0.5～20g/L。

7.根据权利要求1或3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述芦丁底物溶液浓度优选为0.01～0.05g/L。

8.根据权利要求1或3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述pH优选5～7。

9.根据权利要求1或3所述的蜗牛酶在定向水解芦丁生物合成槲皮素中的应用，其特征在于所述反应温度优选为20～45℃。