JP2022046487A

JP2022046487A - トリアシルグリセロールの部分的酵素加水分解

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Publication number: JP2022046487A
Application number: JP2021196980A
Authority: JP
Inventors: ポールマグフォード，; Mugford Paul; モーニカミューラー，; Mueller Monika; マーティンシュールマン，; Schurmann Martin
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2022-03-23
Also published as: CN116064263A; WO2017115322A2; BR112018013385A2; CA3009871A1; EP3397771A2; PE20181403A1; CN108884480A; US11535875B2; JP2019500042A; KR20180098386A; US20210207181A1; WO2017115322A3

Abstract

【課題】オイル中の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を精製し、かつ濃縮する方法を提供する。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１種類のＬＣ－ＰＵＦＡを含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、宿主細胞を使用する。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月３０日出願の米国仮特許出願第６２／２７２，８２９号明細書の出願日の利益を主張する。

［発明の分野］
[0002]本発明は、ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、そのポリペプチドが宿主細胞において発現されて、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する能力が付与される、宿主細胞、ならびにそのポリペプチドが宿主細胞において発現されて、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する能力が付与される、ポリペプチドを発現する宿主細胞を使用する方法に関する。その宿主細胞を用いて、長鎖多価不飽和脂肪酸が豊富なオイル組成物の商業生産に有用であるように、十分な量のこのポリペプチドを製造する。

［背景技術］
[0003]オメガ－３脂肪酸などの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）は、日常の生活および機能に不可欠である。例えば、血清トリグリセリドの低下に関する、シス－５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびシス－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのオメガ－３脂肪酸の有益な効果は、現在、十分に確立されている。これらの化合物は、他の心臓保護的利点についても知られている。実際に、アメリカ心臓協会（ＡｍｅｒｉｃａｎＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）も、オメガ－３脂肪酸が心血管および心疾患リスクを下げ得ることを報告している。ＬＣ－ＰＵＦＡの他の利点は、炎症、神経変性疾患の予防および／または治療、および認知発達に関連する利点である。オメガ－３脂肪酸などのＬＣ－ＰＵＦＡが豊富な食事は、心疾患、癌、関節炎、アレルギー、および他の慢性疾患に有益な作用を有することも示されている。

[0004]例えば、オメガ－３脂肪酸などのＬＣ－ＰＵＦＡは、海産オイル、微生物および／または藻類のオイルに由来する場合が多い。かかる供給源は通常、トリアシルグリセロールの形でＬＣ－ＰＵＦＡを含有し、他の不要な脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸）は、トリアシルグリセロール分子において目的のＬＣ－ＰＵＦＡと並んで存在する。したがって、オイル中のＬＣ－ＰＵＦＡを精製し、かつ濃縮することが一般に望まれている。

[0005]魚、微生物および／または藻類のオイルなど、オイルからＬＣ－ＰＵＦＡ濃縮物を生成する様々な方法が知られている。例えば、トリアシルグリセロールからエチルエステルへと飽和脂肪酸をエステル交換するために、リパーゼが使用されている。次いで、蒸留によって、混合物から飽和脂肪酸を除去し、不飽和エステルを時に、エステル交換してトリアシルグリセロールへと戻す。他の方法では、トリアシルグリセロールからの飽和脂肪酸をリパーゼで選択的に加水分解し、得られた遊離飽和脂肪酸は、尿素との錯体を形成することによって除去される。これらの方法によって得られたオイル中に含有されるＬＣ－ＰＵＦＡの量は、脂肪酸の量に対して一般に６０重量％以上、または７０重量％以上である。

[0006]加水分解反応で使用される場合、特に未精製および精製魚油において使用される場合、現在市販のリパーゼは、様々な程度の有効性を有することが判明している。リパーゼの選択性および反応率を向上させれば、オイルの収率が高くなり、処理の効率が高くなると考えられる。例えば、一部のリパーゼは、グリセリドからのすべての利用可能な脂肪酸を無差別に加水分解する。他のリパーゼは、脂肪酸がグリセリドから加水分解されることに対して、望ましくない選択性を示す。ＥＰＡおよびＤＨＡなどの所望のＬＣ－ＰＵＦＡをグリセリド上に残し、後の下流処理工程でこれらのＬＣ－ＰＵＦＡをより効率的かつ有効に濃縮することを可能にすることは有利であるだろう。したがって、かかる選択性および／または向上した反応率を可能にする、リパーゼの同定および単離は非常に有用であるだろう。本発明者らは、ＥＰＡおよびＤＨＡなどの目的のＬＣ－ＰＵＦＡに対してより選択的であり、かつより高い反応率を有する、リパーゼのアイソフォームを同定した。

［発明の概要］
[0007]ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、そのポリペプチドが、オイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、宿主細胞、かかる宿主細胞を使用する方法、およびかかる宿主細胞を用いて、リパーゼであるポリペプチドを生成するプロセスが本明細書において開示される。

[0008]一部の実施形態において、そのポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、そのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、そのポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。

[0009]一部の実施形態において、そのポリペプチドはリパーゼである。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、リパーゼのアイソフォームである。さらに好ましい実施形態において、ポリペプチドは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）またはゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するリパーゼのアイソフォームである。

[0010]一部の実施形態において、その宿主細胞は酵母である。好ましい実施形態において、宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

[0011]一部の実施形態において、トリアシルグリセロールは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を含む。一部の実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびそれらの混合物を含む。他の実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはＤＨＡである。更なる実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはＥＰＡである。

［本発明の説明］
[0012]添付の配列表に列挙される核酸配列および推定アミノ酸翻訳配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字省略形を用いて示されている。

[0013]添付の配列表において、配列番号１は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ１タンパク質（α－接合因子なし）のアミノ酸配列を示す：

[0014]配列番号２は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ３タンパク質（α－接合因子なし）のアミノ酸配列を示す：

[0015]配列番号３は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のゲオトリクム・カンジダ（ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍＣａｎｄｉｄａ）アイソフォームリパーゼ２タンパク質（α因子シグナルペプチドまたは８×ヒスタミンタグなし）のアミノ酸配列を示す：

［詳細な説明］
[0016]本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読めば、当業者によってより容易に理解され得る。本発明の特定の特徴は、明確にするために上記および下記に記述され、個々の実施形態の文脈において、そのサブコンビネーションを形成するように組み合わせてもよいことは理解されよう。

[0017]具体例として本明細書において確認される実施形態は、例証的であり、制限的ではないことが意図される。

[0018]以下の本明細書において、かつ特許請求の範囲において、数多くの用語が参照され、以下の意味を有すると定義されるべきである：

[0019]本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）は、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および同様な指示の使用は、本明細書において別段の指定がない限り、または文脈で明確に矛盾していない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈される。

[0020]「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」という用語は、別段の指定がない限り、制限のない用語として解釈される（つまり、「限定されないが、～を含む」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指定がない限り、単にその範囲内にあるそれぞれの値に個々に言及する簡略な方法としての役割を果たすことが意図され、それぞれの異なる値は、あたかも個々に本明細書に記載されるかのように、明細書に組み込まれる。

[0021]「任意選択の」または「任意選択的に」とは、その後に記載の事象または状況が起こり得る、または起こり得ないこと、および明細書は、その事象または状況が起こる場合および起こらない場合も包含することを意味する。

[0022]「トリアシルグリセロール」または「ＴＡＧ」という用語は、脂肪酸のグリセロールエステルを含む分子を意味するために使用される。この用語は、「トリグリセリド」（ＴＧ）と同義でも使用される。「グリセリド」は、文脈で指示される場合にモノ、ジおよび／またはトリグリセリドを意味するために使用される。

[0023]多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸のメチル末端からの最初の二重結合の位置に基づいて分類され；オメガ－３（ｎ－３）脂肪酸は、第３の炭素で第１二重結合を含有するのに対して、オメガ－６（ｎ－６）脂肪酸は、第６炭素で第１二重結合を含有する。例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、「２２：６ｎ－３」としばしば命名される、炭素２２個および二重結合６個の長さの鎖を有するオメガ－３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）である。長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）は、２０～２４個の多くの炭素原子を有し、不飽和の数は４または５である。ＰＵＦＡおよびＬＣ－ＰＵＦＡは、遊離型、エステル、またはグリセリド型である。

[配列同一性および類似性]
[0024]配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列との関係性として定義される。当技術分野において、「同一性」とは、場合により、かかる配列のストリング（ｓｔｒｉｎｇ）間のマッチによって決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列および第２ポリペプチドの配列と、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換を比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、限定されないが、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９３；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎＨｅｉｎｅ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載の方法を含む既知の方法によって容易に計算することができる。

[0025]同一性を決定する好ましい方法は、調べられる配列間で最も大きなマッチが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム方式としては、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４）），ＢｅｓｔＦｉｔ，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔａｌ，ＮＣＢＩＮＬＭＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。既知のＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。

[0026]ポリペプチド配列の比較に好ましいパラメーターは以下の：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）；比較マトリックス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍａｔｒｉｘ）：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５－１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；およびギャップ長ペナルティ：４を含む。これらのパラメーターを用いた有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）のＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐからの「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメーターは、アミノ酸比較のデフォルトパラメーターである（末端ギャップに対するペナルティなし）。

[0027]核酸の比較に好ましいパラメーターは以下の：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０，ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３を含む。核酸比較のためのデフォルトパラメーターは、上記のウィスコンシン州マディソンに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐからのギャッププログラム（Ｇａｐｐｒｏｇｒａｍ）として入手可能である。任意選択的に、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者には明らかであるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れられ得る。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換の変異配列（ｖａｒｉａｎｔ）は、開示される配列における少なくとも１つの残基が除去されており、その場所に異なる残基が挿入されている変異配列である。好ましくは、アミノ酸の変更は保存的である。天然アミノ酸それぞれに対して好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；および、ＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕへの置換である。

[0028]ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、そのポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、宿主細胞、かかる宿主細胞を使用する方法、およびリパーゼであるポリペプチドを、かかる宿主細胞を用いて製造するプロセスが、本明細書において開示される。

[0029]一実施形態において、宿主細胞が、高収率でトリグリセリド－加水分解性ポリペプチドを生成する能力を有する。これらのポリペプチドを生成する能力は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞に付与される。これらのリパーゼを生成する形質転換宿主細胞の能力は、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）またはゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）などの発現宿主からのリパーゼコード配列のトランスベクションとＡＯＸまたはＧＡＰなどのプロモーター遺伝子の組み合わせである。リパーゼは、培養上清への組換えリパーゼの分泌を可能にする、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子に融合される。α接合因子は、天然タンパク質のエクスポートで切断される。これによって、宿主細胞を破壊することなく、リパーゼを収集することも可能となる。

[0030]そのアミノ酸配列は、形質転換宿主細胞において、好ましくは排出可能な形態で発現され、次いで宿主細胞から活性型で排出されるリパーゼである。したがって、宿主細胞におけるアミノ酸配列の発現によって、宿主細胞外へ輸送された場合に、１Ｕ／ｍＬ細胞培養液を超える、好ましくは少なくとも２、３、４、５、１０、２０、４０、６０、または８０Ｕ／ｍＬ（２８℃）の発現レベルを有するリパーゼが産生される。１活性単位（Ｕ）は、標準条件（１００ｍＭＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）、０．２４ｍＭｐ－ニトロフェニルエステル、３７℃）下にて、ｐ－ニトロフェノール１μｍｏｌ／分を生成する酵素の量として定義される。リパーゼ活性、細胞培養液の量の決定、および細胞不含リパーゼの調製は、基質として酪酸ｐ－ニトロフェニル（ｐ－ＮＰＤ）を用いて、相当する試験法セクションに記載の分光光度的活性アッセイによって測定された。

[0031]そのポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、ポリペプチドを発現する宿主細胞は好ましくは、好気性発酵の能力がある宿主である。宿主細胞はさらに好ましくは、エタノール、および乳酸、酢酸もしくはギ酸などの有機酸、およびフルフラールおよびヒドロキシメチルフルフラールなどの糖分解生成物に対する高い耐性を有する。宿主細胞のこれらの特徴および活性は、宿主細胞に天然に存在するか、あるいは遺伝子修飾によって導入または修飾され得る。適切な宿主細胞は、細菌または真菌のような微生物であるが、宿主細胞として最も適しているのは、酵母または糸状菌である。酵母は本明細書において、真核微生物として定義され、単細胞形で主に成長するエウミコティナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての種（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙＭｙｃｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）を含む。酵母は、単細胞葉状体の出芽によって成長するか、または生体の分裂によって成長し得る。宿主細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリキア属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｉａ）、およびヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属する。

[0032]好ましい実施形態において、核酸構築物は、リパーゼ酵素などのポリペプチドを産生し、細胞からそれを排出する能力を宿主細胞に与える。形質転換された宿主細胞は、酵母の培養のためにデザインされた種々の培地で成長する能力を有する。したがって、本発明の形質転換宿主細胞は、プラスミドのデザインおよび培養条件に依存する特定の活性レベルにて細胞外でリパーゼを発現する。

[0033]上述のように、本発明の核酸構築物での宿主細胞の形質転換、および宿主細胞、好ましくは酵母の更なる遺伝子修飾は、当技術分野でよく知られている方法によって行うことができる。かかる方法は例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ”，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）などの標準的専門書から知られている。真菌宿主細胞を形質転換および遺伝子修飾する方法は、例えば欧州特許出願公開第０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレットおよび国際公開第００／３７６７１号パンフレットから知られている。

[0034]一部の実施形態において、核酸構築物は、リパーゼをコードし、かつ宿主細胞の形質転換に使用される、ポリヌクレオチド配列を含む。核酸構築物において、リパーゼをコードするポリヌクレオチド配列は好ましくは、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写をコントロールおよび開始するための、プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは好ましくは、リパーゼを産生し、かつ細胞からそれを排出する能力を宿主細胞に付与するのに十分に、宿主細胞においてリパーゼを発現させることができる。好ましくは、プロモーターは、宿主細胞におけるリパーゼ産生を最大にする。本発明の核酸構築物において有用なプロモーターは、構成的および誘導性天然プロモーターならびに改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プロモーターを含む。これらの特徴を有するプロモーターは、広く入手可能であり、当業者に公知である。かかるプロモーターの適切な例としては、例えば、糖分解遺伝子からの酵母プロモーター、例えば酵母ホスホフルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＴＥＦ１－α遺伝子プロモーター、ＰＨＯ９０、ＴＨ１１、およびＡＯＤプロモーターが挙げられ；かかるプロモーターについてのより詳細な内容は（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に記載されている。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４等）、およびエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。最も好ましいのは、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＤ９１２（強いメタノール誘導性ＡＯＸプロモーター）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＤ９１５（中程度に強い構成的ＧＡＰプロモーター）からのプロモーターである。構成的かつ誘導性の他のプロモーター、およびエンハンサーまたは上流活性化配列は、当業者には知られている。所望の場合には、その制御特性に影響を及ぼすように、本発明の核酸構築物において使用されるプロモーターを修飾してもよい。好ましくは、リパーゼの発現のために、核酸構築物において使用されるプロモーターは、リパーゼイソメラーゼが発現される、宿主細胞と相同している。

[0035]核酸構築物において、リパーゼをコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は好ましくは、培養上清への組換えリパーゼの分泌を可能にする、分泌因子配列に作動可能に連結され、続いて、リパーゼのエクスポートで切断される。好ましくは、分泌因子配列は、例えば、選択される酵母種など、選択される宿主細胞において作動可能である。分泌因子は時に、非酵母、真核生物遺伝子由来である場合に機能するが、因子の選択が重要ではない場合には、それは例えば、いずれかの酵母遺伝子由来であり得る。分泌因子配列はさらに好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子を含む。

[0036]任意選択的に、選択マーカーが、核酸構築物に存在し得る。本明細書で使用される、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞の選択、またはスクリーニングを可能にする、形質または表現型をコードする遺伝子を意味する。そのマーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であってもよく、それによって、適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞の中から形質転換細胞を選択することができる。適切な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、３’－О－ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が挙げられる。抗生物質耐性マーカーの使用は、倍数性宿主細胞の形質転換には最も簡便であり得るが、好ましくは、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）またはＳ．ｐｏｍｂｅＴＰＩ遺伝子（ＲｕｓｓｅｌｌＰＲ，１９８５，Ｇｅｎｅ４０：１２５－１３０に記述されている）などの非抗生物質耐性マーカーが使用される。核酸構築物で形質転換された宿主細胞は、マーカー遺伝子不含であり得る。組換えマーカー遺伝子不含の微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開第０６３５５７４号明細書に開示されており、二方向性マーカー、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３およびＬＹＳ２遺伝子の使用に基づく。代替方法としては、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β－グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能な（ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ）マーカーが、本発明の核酸構築物に組み込まれ、形質転換細胞のスクリーニングが可能となる。

[0037]本発明の核酸構築物中に存在し得る、任意選択の更なる要素としては、限定されないが、１つまたは複数のリーダー配列、エンハンサー、組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が挙げられる。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列などの自律的増殖のための配列を含み得る。適切なエピソーム核酸構築物は、例えば酵母２．ｍｕ．またはｐＫＤｌ（Ｆｌｅｅｒｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９６８－９７５）プラスミドをベースとし得る。代替方法として、核酸構築物は、好ましくは相同的組換えによる組み込みのための配列を含み得る。したがって、かかる配列は、宿主細胞のゲノムにおける組み込みのための標的部位と相同な配列であり得る。本発明の核酸構築物は、それ自体が公知の手法で提供することができ、その手法は一般に、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ”，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）など、標準的な専門書に言及されている、核酸／核酸配列の制限および連結などの技術を含む。

[0038]一実施形態において、本発明は、ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、そのポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、宿主細胞に関する。

[0039]他の実施形態において、本発明は、ポリペプチドを発現する宿主細胞を使用する方法であって、そのポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、方法に関する。

[0040]一部の実施形態において、宿主細胞は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。一部の実施形態において、宿主細胞は、配列番号１のアミノ酸配列と９０～９９％、９１～９９％、９２～９９％、９３～９９％、９４～９９％、９５～９９％、９６～９９％、９７～９９％、または９８～９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。

[0041]他の実施形態において、宿主細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。一部の実施形態において、宿主細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と９０～９９％、９１～９９％、９２～９９％、９３～９９％、９４～９９％、９５～９９％、９６～９９％、９７～９９％、または９８～９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。

[0042]他の実施形態において、宿主細胞は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。一部の実施形態において、宿主細胞は、配列番号３のアミノ酸配列と９０～９９％、９１～９９％、９２～９９％、９３～９９％、９４～９９％、９５～９９％、９６～９９％、９７～９９％、または９８～９９％の同一性を有するポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する。

[0043]一部の実施形態において、そのポリペプチドはリパーゼである。好ましい実施形態において、ポリペプチドはリパーゼのアイソフォームである。さらに好ましい実施形態において、ポリペプチドは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）またはゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するアイソフォームである。

[0044]一部の実施形態において、オイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解するポリペプチドはリパーゼである。好ましい実施形態において、オイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解するポリペプチドは、リパーゼのアイソフォームである。さらに好ましい実施形態において、オイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解するポリペプチドは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）またはゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するリパーゼのアイソフォームである。

[0045]一部の実施形態において、宿主細胞は酵母である。好ましい実施形態において、宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

[0046]一実施形態において、リパーゼは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）に由来するアイソフォームの混合物である。好ましい実施形態において、リパーゼは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）に由来するアイソフォームである。さらに好ましい実施形態において、リパーゼはカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ１、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ３、およびそれらの混合物である。一実施形態において、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。

[0047]一実施形態において、リパーゼは、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するアイソフォームの混合物である。好ましい実施形態において、リパーゼは、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）に由来するアイソフォームである。さらに好ましい実施形態において、リパーゼは、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）アイソフォームリパーゼ２である。一実施形態において、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）アイソフォームリパーゼ２は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。

[0048]一部の実施形態において、トリアシルグリセロールは、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を含む。一部の実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡは、オメガ－３脂肪酸、オメガ－６脂肪酸、およびそれらの混合物を含む。好ましい実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、γ－リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ－γ－リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、およびそれらの混合物を含む。さらに好ましい実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＥＰＡ、およびそれらの混合物を含む。更なる実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはＤＨＡである。また更なる実施形態において、ＬＣ－ＰＵＦＡはＥＰＡである。

[0049]一部の実施形態において、宿主細胞は酵母である。好ましくは、酵母は、好気性発酵することができる。一実施形態において、宿主細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である。他の実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である。

[0050]一部の実施形態において、そのオイルは、魚油などの海産オイルに由来し得る。かかるオイルは通常、飽和および不飽和脂肪酸、それらのエステルおよびグリセリドの混合物を含有するが、処理して、脂肪酸（例えば、すべての飽和、すべての不飽和、両方の混合物、または特定の鎖長もしくは特定の鎖長の範囲の脂肪酸との混合物を含有する）の特定の混合物を得ることができる。開示される化合物および方法においていずれの魚油も使用することができる。適切な魚油の例としては、限定されないが、大西洋魚油、太平洋魚油、地中海魚油、ライトプレス（ｌｉｇｈｔｐｒｅｓｓｅｄ）魚油、アルカリ処理魚油、熱処理魚油、淡茶色および濃茶色の魚油、カツオ油、ピルチャード油、マグロ油、シーバス油、ハリバ油、フウライカジキ油、バラクーダ油、タラ油、メンハーデン油、イワシ油、アンチョビ油、カラフトシシャモ油、ニシン油、タイセイヨウサバ油、サケ油およびサメ油、それらの混合物およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。非アルカリ処理魚油も適している。本明細書で使用するのに適している他の海産オイルとしては、限定されないが、イカ油、コウイカ油、タコ油、オキアミ油、アザラシ油、鯨油、それらの混合物およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。海産オイルおよび海産オイルの組み合わせは、開示の組成物において、かつそれを製造する開示の方法において使用することができる。更なるオイルとしては、藻類オイル（例えば、クリプテコディニウム・コニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）、ピシウム（Ｐｈｙｔｈｉｕｍ）などの渦鞭毛藻類由来のオイル）である微生物オイル、真菌オイル（例えば、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）由来のオイル、またはそれらの混合物）である微生物オイル、および／または植物油、それらの混合物および組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態において、オイルは粗製または未精製オイルである。

[0051]一実施形態において、リパーゼであるポリペプチドを生成するプロセスは、以下の工程：ａ）形質転換された宿主細胞を培地中で発酵させて、本明細書で定義される、リパーゼであるポリペプチドを産生および排出し、それによって、宿主細胞が発酵し、リパーゼであるポリペプチドを同時に産生および排出する工程；および任意選択的に、ｂ）リパーゼであるポリペプチドを回収する工程；を含む。その発酵プロセスは好ましくは、形質転換された宿主細胞に最適な温度で実施される。したがって、大部分の酵母または真菌宿主細胞に関して、発酵プロセスは、３８℃未満の温度で行われる。酵母または線維状真菌宿主細胞については、発酵プロセスは好ましくは、３５、３３、３０または２８℃より低い温度で、かつ２０、２２、または２５℃よりも高い温度で行われる。当業者に公知の様々な培地組成物によって、プロセス工程を向上させるために、発酵培地をさらに最適化してもよい。好ましい実施形態において、リパーゼであるポリペプチドは、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼ１、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼ３、およびゲオトリクム・カンジダ（ＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍＣａｎｄｉｄａ）リパーゼ２からなる群から選択される。

［実施例］
［試験方法］
[0052]分光光度的活性アッセイ：リパーゼの活性を決定するために、３７℃での分光光度的アッセイを用い、そのアッセイではｐ－ニトロフェニルエステルが加水分解される。形成されたｐ－ニトロフェノールによって生じる４１０ｎｍでの吸光度の増加が測定され、酵素活性と相関する。１活性単位（Ｕ）は、用いられる条件下にてｐ－ニトロフェノール１μｍｏｌ／分を生成する酵素の量として定義される。したがって、適切な希釈液中に１００ｍＭＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．５、０．２４ｍＭｐ－ニトロフェニルエステルおよびＣＦＥ３８μｌ／ｍｌを含有する反応混合物、ならびにＣＦＥの代わりにバッファーを含有するブランクを用い、吸光度の変化を５分間記録した。このΔａｂｓ／分に基づいて、容量活性（Ｕ／ｍｌ、等式１参照）およびタンパク質特異的活性（Ｕ／ｍｇ総タンパク質、等式２）を計算することができる。可溶性タンパク質画分を含有するＣＦＥ（可溶性（Ｓｏｌｕｂｌｅ））および総タンパク質を含有するＣＦＥ（総（Ｔｏｔａｌ））を測定した。最初の事例では、酪酸ｐ－ニトロフェニル（ｐＮＰＢ）を基質として使用した。

[0053]遊離脂肪酸の決定：遊離脂肪酸のパーセンテージ（％ＦＦＡ）を決定するために、Ｔｉｔｒｉｎｏ７１８での終点滴定を用いた。溶媒（トルエン／イソプロパノール／水＝５００／５００／１０）５０ｍｌをフェノールフタレイン（イソプロパノール中０．８％（ｗ／ｗ））２滴と混合し、溶液の色が１０～１５秒間ピンク色を維持するまで、０．１５ＭＫＯＨ（水５０ｍｌにＫＯＨ１０．０ｇを溶解し、エタノール９５０ｍｌで満たした）で滴定した。力価を決定するために、既知量の安息香酸をその溶液に添加し、滴定した。力価を等式３に示すように計算し、さらに計算するために、３つの独立的な力価決定値の平均を用いた。試料の測定のために、試料の既知量の油層をピンク色の溶媒に添加し、十分に混合し、滴定してピンク色に戻した。ＦＦＡのパーセンテージを等式４に示すように計算した。

[0054]ＬＣ－ＭＳによる、油相（グリセロール）中のＥＰＡおよびＤＨＡ濃度の決定：ＥＰＡおよびＤＨＡ濃度を分析するために、油層約４０ｍｇをテトラヒドロフラン２５ｍｌに溶解し、さらに１：４に希釈した。ＬＣ－ＭＳによって、かかる装置の通常のプロトコルに従って、試料を分析した。使用したカラムは、プレカラムＶａｎＧｕａｒｄを備えたＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８（５０×２．１ｍｍ、内径１．８μｍ）であった。ＤＨＡおよびＥＰＡに対してそのシステムを較正した。両方の化合物に対して較正曲線を作成した。その結果から、ＥＰＡおよびＤＨＡがはっきりと分離し、したがって、それぞれの遊離脂肪酸を正確に計算することが可能であることが分かった。

［実施例１－ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼアイソフォームの発現］
[0055]タンパク質－ＭＳシーケンシングによって、２つの市販のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、ＡｍａｎｏＡＹおよびＢｉｏＣａｔａｙｓｔｓＬｉｐｏｍｏｄ０３４におけるアイソフォームを測定した。５ＣＲアイソフォームを見つけ、両方のリパーゼにおいて同定された２つの主要なアイソフォームはＣＲＬｉｐ１およびＣＲＬｉｐ３であった。５つのアイソフォームすべての遺伝子を作成し、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ））によってコドン最適化した。培養上清への組換えリパーゼの分泌を可能にするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子遺伝子に、リパーゼ遺伝子を融合した。天然タンパク質のエクスポートでα接合因子が切断された。１つはＡＯＸプロモーター（ｐＤ９１２）を有し、もう１つはＧＡＰプロモーター（ｐＤ９１５）を有する２種類の発現ベクターを作成し、個々にそれぞれが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ヘクローニングされた。ｐＤ９１２において、対象の遺伝子は下流で、かつα因子と融合して、クローニングされ、強いメタノール誘導性ＡＯＸプロモーターの制御下にある。ｐＤ９１５において、対象の遺伝子は下流で、かつα因子と融合してクローニングされ、中程度に強い構成的ＧＡＰプロモーターの制御下にある。ｐＤ９１２およびｐＤ９１５の両方に関して、ｚｅｏｃｉｎが選択マーカーであり、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ゲノムに組み込まれると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における増殖に必要なｐＵＣ開始点は除去された。ＤＮＡ構築物のうちの１０をＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク）によって作成し、ＤＮＡ２．０によって作成された２つのベクターそれぞれで使用した。ポジティブコントロールも使用した（ＤＮＡ２．０からのｐＪ９１２＿クチナーゼ）。

［カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼアイソフォーム遺伝子を含有する、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＤ９１２およびｐＤ９１５での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換］
[0056]
ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換のために、多量のプラスミドＤＮＡが必要である。ＤＮＡ２．０によって作成されたプラスミドＤＮＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖された。コンピテントセルを作成した。得られたストックをグリセロールストックに変換し、残りの培養物を使用して、プラスミドＤＮＡを抽出した。

［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミド－ＤＮＡの抽出］
[0057]キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）からの標準プロトコル（「ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉＫｉｔを使用したプラスミドＤＮＡの精製」）を用いて、残りの培養物からのプラスミド－ＤＮＡの抽出を達成した。得られたプラスミドＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で分析し、ＤＮＡ濃度を測定した。その結果を表１に示す。

［カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼアイソフォーム遺伝子を含有するｐＤ９１２およびｐＤ９１５でのピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＰＳ９０１０の形質転換］
[0058]プラスミド直鎖化：増殖され、したがってより多い量で利用可能なプラスミドは、直鎖化しなければならなかった（直鎖状ＤＮＡは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換に必要である）。直鎖化のために、以下の制限酵素が使用された：ｐＤ９１２－構築物には、ＳａｃＩが使用され（インキュベーション温度３７℃）、ｐＤ９１５－構築物には、ＳｗａＩが使用された（インキュベーション温度２５℃）。

[0059]ＤＮＡ（Ｍｉｄｉｐｒｅｐから得られた）２０μｇに、１０×バッファー１０μｌおよび制限酵素２．５μｌを添加した。混合物を水で満たして１００μｌにした。制限酵素に適した温度でインキュベーションを２時間行った。次いで、混合物を６５℃で２０分間曝露することによって、酵素を不活性化した。混合物１μｌを０．８％アガロースゲル上で分析し、制限が成功したことが検証された。以下の供給元のマニュアルによってＱｕｉａｇｅｎＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して、得られた直鎖化ＤＮＡを精製した。精製後、ＤＮＡ濃度を測定した。その結果を表２に示す。

［ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）コンピテントセルの作成］
[0060]白金耳を使用して、グリセロールストックからのピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＰＳ９０１０細胞をＹＰＤ培地５ｍｌに接種し、３０℃および１８０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。この培養物を使用して、新鮮ＹＰＤ培地１００ｍｌをＯＤ_６０００．１５～０．２に接種し、次いで、これを３０℃および１２０ｒｐｍにてインキュベートした。ＯＤ_６００が１．３～１．５に達したら、培養物を２本の５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに満たし、５００＊ｇにて４℃で１０分間遠心した。上清をデカントし、廃棄した。氷冷の滅菌、超純水５０ｍｌにペレットを再懸濁し、５００＊ｇにて４℃で５分間遠心した。この上清もデカントし、廃棄した。再び、氷冷の滅菌、超純水５０ｍｌにペレットを再懸濁し、５００＊ｇにて４℃で５分間遠心した。この上清もデカントし、廃棄した。次いで、この細胞を氷冷の滅菌１Ｍソルビトール２０ｍｌに再懸濁し、５００＊ｇにて４℃で５分間遠心した。再び、上清をデカントし、廃棄した。次いで、細胞を最後に、１Ｍソルビトール２５０μｌに再懸濁した。

［コンピテントなピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の形質転換］
[0061]作成されたピキア（Ｐｉｃｈｉａ）コンピテント細胞を直鎖化プラスミドで形質転換し、上述のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用してその量を増大した。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）コンピテント細胞１００μｌに、直鎖化プラスミド（２～４μｇ）１０μｌを添加し、ギャップ２ｍｍの電気穿孔キュベットに懸濁液を移した。細胞を氷上で５分間インキュベートし、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦで電気穿孔処理した。この混合物に、氷冷の１Ｍソルビトール１ｍｌを添加し、混合物を３０℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を１０００＊ｇで２１℃にて５分間遠心し、上清をデカントした。上清の残りの液滴中にペレットを再懸濁した。２００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）を有するＹＰＤ培地５ｍｌにそれぞれのコロニーを白金耳で移し、２８℃および１８０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。長期間貯蔵するために、培養液１ｍｌを５０％グリセロール０．５ｍｌと混合し、室温で１５分間振とうし、－８０℃で貯蔵した。

［クローンの発現および活性の検証］
[0062]トリブチリン寒天平板アッセイおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析をすべての試料で行い、試験されたすべてのクローンがトリブチリンに対する活性を示すこと、および予想されるリパーゼバンドが確認されることを検証した。培養物の活性は、基質としてｐ－ＮＰＤを用いて分光光度的活性アッセイによって測定された。試料のタンパク質含有量は、標準手順に従ってブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬によって分析された。この結果から、ＣＲＬｉｐ１クローンがリパーゼの高レベルの発現を有することが分かった。ＣＲＬｉｐ５クローンのいずれについても、活性は検出されず、いくつかのＣＲＬｉｐ３クローンおよびＣＲＬｉｐ４クローンについては、中程度の活性が測定された。ＣＲＬｉｐ２クローンの活性は一般に非常に低い。振とうフラスコ発現には、より一定の成長条件を受け、したがってより信頼できるデータを得られるように行う必要があった。

［ＡＯＸおよびＧＡＰ構築物の振とうフラスコ発現］
[0063]ＡＯＸ－構築物の振とうフラスコ発現に関して、バッフルを備えた３００ｍｌフラスコ中のＢＭＧＹ培地２５ｍｌに、グリセロールストックを用いて接種した。この前培養物を２８℃で１１０ｒｐｍにて２４時間インキュベートした。細胞を遠心（３０００＊ｇ、５分、室温）することによって収集し、ＢＭＭＹ培地５０ｍｌに再懸濁し、バッフルおよび気泡プラグ（ｆｏａｍｐｌｕｇ）を備えた１０００ｍｌフラスコに満たした。発現のために、培養物を２８℃および１１０ｒｐｍにて９６時間インキュベートした。誘導を維持するため、メタノール２５０μｌを１日に１回添加した。９６時間後、培養物を遠心し（３０００＊ｇ、５分、４℃）、上清を別のチューブに移し、それを－２０℃で保存した。

[0064]ＧＡＰ－構築物の振とうフラスコ発現に関して、バッフルを備えた３００ｍｌフラスコ中のＹＰＤ培地２５ｍｌに、グリセロールストックを用いて接種した。この前培養物を２８℃で１１０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。細胞を遠心（３０００＊ｇ、５分、室温）することによって収集し、ＹＰＤ培地１００ｍｌに再懸濁し、バッフルおよび気泡プラグを備えた１０００ｍｌフラスコに満たした。発現のために、培養物を２８℃および１１０ｒｐｍにて９６時間インキュベートした。９６時間後、培養物を遠心し（５０００＊ｇ、１０分、４℃）、上清を別のチューブに移し、それを－２０℃で保存した。

［分光光度的活性アッセイ］
[0065]上述の分光光度的活性アッセイによって、培養物の上清の活性を測定した。基質として、ｐ－ＮＰＤ（ｐ－ニトロフェニルデカノエート）を使用した。

[0066]以下の標準手順に従ってブラッドフォード試薬によって、試料のタンパク質含有量を分析した。総タンパク質中の試料の特異的活性（Ｕ／ｍｇ）をアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｎｅｓｓｓｐ．）由来の他の市販の４種のリパーゼ（Ａｌ－１、Ａｌ－２、Ａｌ－３およびＡｌ－４）および市販のＣＲＬ製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）Ｌ１１の活性と比較した。その結果を表３に示す。

［実施例２－ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現レベルの比較］
[0067]比較のために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）におけるリパーゼアイソフォームの発現も実施した。遺伝子構築物をＤＮＡ２．０から合成ＤＮＡとしてオーダーし、ネオマイシン耐性遺伝子を保持する発現ベクターにおいてクローニングし；対象の遺伝子は、ｐＢＡＤプロモーターを介してＬ－アラビノースによって誘導される。その結果を表４に示す。

［実施例３－カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼの加水分解の実験］
[0068]魚油の加水分解について、実施例１に従って作成されたカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼアイソフォームを試験するために、ｐＨ－スタット装置で滴定なしで４０ｍｌスケールにて、３５℃での反応をセットアップした。Ａｍａｎｏから市販のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼＡＹ－３０（ＣＲＬ１１と呼ばれる）を比較用リパーゼとして使用した。ＣＲＬｉｐ２およびＣＲＬｉｐ５の活性が乏しいため、ＣＲＬｉｐ１、ＣＲＬｉｐ３およびＣＲＬｉｐ４のみを使用した。魚油濃度は５０％（ｖ／ｖ）であった。ＣＲＬｉｐ１およびＣＲＬｉｐ４については、市販のリパーゼの０．１％（ｗ／ｗ）Ｅ／Ｓに相当する、８．６Ｕ（ｐ－ＮＰＤ活性に基づく）／魚油（ｇ）を用いた。バッファーとして、５０ｍＭＫＰｉ（ｐＨ７．５）を使用した。酵素の量が少ないために、ＣＲＬｉｐ３の酵素濃度は、６．８Ｕ／魚油（ｇ）に制限され、ＣＲＬｉｐ２の酵素濃度は、０．９Ｕ（市販のリパーゼの０．０１％（ｗ／ｗ）Ｅ／Ｓに相当する）に制限された。

[0069]可能である場合には、酵素を添加する前に、ｐＨをモニターしながら、ｐＨ－スタットにおいて約３０分間、魚油をバッファーと共に２０００ｒｐｍにて攪拌した。酵素を添加することによって反応を開始した後、０時間、１時間、４時間、１８時間および２４時間の異なる時点で試料２ｍｌを採取した。これらの試料を、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の濃度およびＥＰＡおよびＤＨＡ濃度に関して分析した。油層にすべての遊離脂肪酸を取り入れるために、エマルジョンを３ＭＨＣｌで酸性化し、よく混合し、遠心して、層を分離した。必要であれば、６０℃のオーブン内で数分加熱することによって、試料を液化した。

[0070]加水分解の結果を表５および６に示し、反応の転化および選択性を例証する。反応が転化率１００％まで行われると、すべての選択性がすべての酵素によって失われると予想されるため、比較のために、転化の程度を用いて、市販の比較例ＣＲＬ１１試料の選択性をＣＲＬｉｐ１、ＣＲＬｉｐ３およびＣＲＬｉｐ４試料と比較した。したがって、反応時間ではなく、比較のためのマイルストーン（ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ）として比較の程度を用いることが有用である。反応の時間は様々な酵素アイソフォームで異なると予想され、反応の時間は、多くの様々な条件によって最適化することができるため、反応時間は当然、確実に確認されるように記録されるが、比較のためのマイルストーンとして使用されない。

［実施例４－ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ加水分解実験］
[0071]これらの実施例において、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）由来のリパーゼをコードするポリヌクレオチド配列が同定され、上記の実施例１に記載のようにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現された。Ａｍａｎｏから市販のカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）リパーゼＡＹ－３０（ＣＲＬ１１と呼ばれる）を比較用リパーゼとして使用した。

[0072]それぞれの試料（ＧＣＬｉｐ１、ＧＣＬｉｐ２およびＣＲＬ１１）について、以下のプロセスを用いた：魚油約２０ｇ、０．９５ｍｇ／ｍＬリパーゼ溶液３ｍＬ、およびＢＥＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）１２．０ｍＬを１００ｍＬフラスコに入れ、３７℃、３６０ｒｐｍにてＮ_２ガス下にて攪拌した。上述の方法で酸価をモニターすることによって、反応の進行をモニターした。遊離脂肪酸の決定。８５℃に１０分間加熱することによって、反応を止めた。混合物をブライン２５ｍＬ、水２５ｍＬで洗浄し、真空下（１トル）にてオイルを乾燥させた。グリセリドおよび脂肪酸を以下のように分離した：ヘキサン７５ｍＬおよび酢酸エチル２５ｍＬにオイル１０ｇを添加した。次いで、有機層を０．５Ｍ水酸化ナトリウム４０ｍＬとエタノール４０ｍＬの溶液で２回抽出した。次いで、上部の有機層を水で洗浄し、減圧下にて溶媒を除去し、高真空下にて乾燥させて、グリセリドを得た。次いで、下のアルカリ層を３ＭＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、ヘキサン７５ｍＬおよびクロロホルム７５ｍＬで抽出し、合わせた有機物を蒸発させて、脂肪酸層を得た。ＥＰ２．４．２９法によって、分離されたグリセリドおよび脂肪酸の脂肪酸プロファイルを決定した。結果を表７および８に示す。

[0073]ＧＣＬｉｐ２と、ＥＰＡ約２２％およびＤＨＡ１０％を含有するオイル組成物とを使用して、実験を繰り返し行った。その結果を表９および１０に示す。

好適な実施形態
１．配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、宿主細胞。
２．前記宿主細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である、実施形態１に記載の宿主細胞。
３．前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と９０～９９％の同一性を有する、実施形態１または２に記載の宿主細胞。
４．前記ポリペプチドがリパーゼである、実施形態１～３のいずれか一つに記載の宿主細胞。
５．前記ポリペプチドが、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ１である、実施形態１～４のいずれか一つに記載の宿主細胞。
６．前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態５に記載の宿主細胞。
７．前記ポリペプチドが、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ３である、実施形態１～４のいずれか一つに記載の宿主細胞。
８．前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する、実施形態７に記載の宿主細胞。
９．前記ポリペプチドが、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）アイソフォームリパーゼ２である、実施形態１～４のいずれか一つに記載の宿主細胞。
１０．前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態９に記載の宿主細胞。
１１．前記長鎖多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の宿主細胞。
１２．前記オイルが粗製または未精製オイルである、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の宿主細胞。
１３．前記オイルが海産オイルである、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の宿主細胞。
１４．配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞を使用する方法であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１種類の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を含むオイル中のトリアシルグリセロールのエステル結合を加水分解する、方法。
１５．前記宿主細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）である、実施形態１４に記載の方法。
１６．前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と９０～９９％の同一性を有する、実施形態１４または１５に記載の方法。
１７．前記ポリペプチドがリパーゼである、実施形態１４～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．前記ポリペプチドがカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ１である、実施形態１４～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記ポリペプチドがカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）アイソフォームリパーゼ３である、実施形態１４～１７のいずれか一つに記載の方法。
２１．前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する、実施形態２０に記載の方法。
２２．前記ポリペプチドが、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）アイソフォームリパーゼ２である、実施形態１４～１７のいずれか一つに記載の方法。
２３．前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびそれらの組み合わせを含む、実施形態１４～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．前記オイルが粗製または未精製オイルである、実施形態１４～２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記オイルが海産オイルである、実施形態１４～２５のいずれか一つに記載の方法。

Claims

明細書中に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。