CN107532135A - 萜类化合物的微生物生产 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够产生萜类化合物的经遗传工程改造的宿主生物体。本发明还涉及从所述经遗传工程改造的生物体获得的萜类化合物。产生的萜类化合物的实例包括类胡萝卜素、紫罗兰酮、冷杉醇和其他类异戊二烯衍生的化合物。此外，本发明涉及使用所述经遗传工程改造的生物体制备萜类化合物的方法。

Description

萜类化合物的微生物生产

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月21日提交的美国临时专利申请No.62/150,402和2015年4月21日提交的临时专利申请No.62/150,549的申请日的权益，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明提供能够产生萜类化合物的经遗传工程改造的宿主生物体。本发明还涉及从所述经遗传工程改造的生物体获得的萜类化合物。所产生的萜类化合物的实例包括类胡萝卜素、紫罗兰酮、冷杉醇和其他类异戊二烯衍生的化合物。此外，本发明涉及使用这种经遗传工程改造的生物体制备萜类化合物的方法。

发明背景

萜类化合物是一类数量众多且多种多样的天然存在的有机化学物质。它们衍生自以数千种方式组装和修饰的五碳异戊二烯单元。类胡萝卜素代表一大类萜类化合物。类胡萝卜素是由某些生物体(包括光合生物体以及一些细菌和真菌)产生的颜色从黄色到红色变化的有机色素。类胡萝卜素是植物例如胡萝卜、胡椒、西红柿和动物例如鲑鱼、龙虾和小虾以及许多鸟类中鲜艳的黄色、橙色或红色的原因。类胡萝卜素在光合作用、营养和针对光氧化损伤的保护方面起着重要作用。

大量芳香成分也衍生自萜类化合物。这些芳香成分的实例包括二萜降龙涎香醚及其前体，例如香紫苏醇和冷杉醇。降龙涎香醚是传统香料成分龙涎香的替代品。紫罗兰酮是衍生自萜类化合物的另一组芳香成分。

紫罗兰酮是在多种精油(包括玫瑰油)中发现的芳香化合物。β-紫罗兰酮是玫瑰香气的重要贡献者，并且是香水业中使用的重要香料化学物质。紫罗兰酮衍生自类胡萝卜素。

在结构上，萜类化合物是由几个异戊二烯单元的组合产生的烃。例如，类胡萝卜素是衍生自八个5-碳异戊二烯构建单元的40-碳萜类化合物。香紫苏醇和冷杉醇是衍生自四个5-碳异戊二烯构建单元的20-碳萜类化合物。

萜类化合物的生物合成途径可以分为两部分：上部类异戊二烯生物合成途径，其导致20-碳香叶基香叶基焦磷酸GGPP的形成；以及下部萜类化合物生物合成途径，其将GGPP转化为多种萜类化合物。见图1B-1D。涉及五碳单元的缩合以产生GGPP的上部类异戊二烯通路部分如图1A所示。

虽然自然界中已经鉴定出了几千种萜类化合物，但是仅有少数被工业生产用于食品色素、营养添加剂、药物和化妆品。目前，用于工业目的的大多数萜类化合物是通过化学合成来生产的。然而，一些化合物非常难以化学生成。已经尝试通过发酵制备萜类化合物，并且显示早期进展(美国专利No.7,851,199)。

已经由微生物来源生产了一些类胡萝卜素。例如，已经由E.coli和Yarrowialipolytica生产了β-胡萝卜素。已经由E.coli、Candida utilis和Yarrowia lipolytica生产了玉米黄质和虾青素。

已经鉴定出了编码萜类化合物生物合成途径的多种元件的基因。这些基因已被克隆并在多种微生物中表达。例如，已经从Yarrowia lipolytica、Mucor circinelloide和Saccharomyces cerevisiae中分离出了编码HMG-CoA还原酶和GGPP合酶的基因，并已在宿主细胞(例如E.coli和Yarrowia lipolytica)中表达。

然而，至今可用的生产萜类化合物的化学方法具有低产率并依赖于昂贵的前体。显然需要一种从便宜的前体生产较高产率的萜类化合物的方法。

发明概述

本发明涉及一种产生至少一种萜类化合物的经遗传修饰的宿主微生物，其包含编码香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子选自：(a)包含编码这样的蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)包含编码这样的蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质具有在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述蛋白质具有GGPP合酶活性；和(c)包含编码这样的蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性，其中所述蛋白质具有GGPP合酶活性。

在一些实施方式中，与不含所述多核苷酸分子的相同微生物相比，经遗传修饰的微生物具有提高的GGPP合酶活性。在一些实施方式中，与不含所述多核苷酸分子的相同微生物相比，经遗传修饰的微生物产生增加量的萜类化合物。在某些实施方式中，萜类化合物源自GGPP。在一些实施方式中，萜类化合物还可以选自：类胡萝卜素、紫罗兰酮、香紫苏醇和冷杉醇。

在一些实施方式中，经遗传修饰的微生物还可包含一种或更多种编码类异戊二烯生物合成多肽、类异戊二烯生物合成竞争性多肽和/或类胡萝卜素生物合成多肽的重组核苷酸序列。所述多肽的实例包括但不限于具有八氢番茄红素合酶活性的多肽、具有八氢番茄红素脱氢酶活性的多肽、具有番茄红素β-环化酶活性的多肽、具有番茄红素ε-环化酶活性的多肽和具有类胡萝卜素切割双加氧酶活性的多肽。

在一些实施方式中，经遗传修饰的微生物还可包含编码具有I类二萜合酶活性的多肽、具有I类二萜合酶活性的多肽和/或具有I/II类二萜合酶活性的多肽的一种或更多种重组核苷酸序列。

本发明的经遗传修饰的微生物可以是真菌或细菌。示例性微生物包括但不限于Yarrowia真菌、Saccharomyces cerevisiae和E.coli。

本发明涉及一种产生至少一种萜类化合物的方法，所述方法包括：在有效产生萜类化合物的条件下在宿主细胞中表达GGPP合酶基因，其中在所述宿主细胞中所述GGPP合酶基因包含上述重组核酸分子，以及其中产生至少一种萜类化合物。

本发明还涉及从上述经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物。

本发明还涉及包含从上述经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物的食品或饲料。

本发明还涉及包含从上述经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物的香料或化妆品。

附图简介

图1A显示了由异戊烯焦磷酸(IPP)生产香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的生物合成方案。

图1B显示了将GGPP转化成多种类胡萝卜素的生物合成方案。

图1C显示了将GGPP转化为冷杉醇和香紫苏醇的生物合成方案。

图1D显示了将GGPP转化为紫罗兰酮的生物合成方案。

图2显示了过表达来自Yarrowia lipolytica的GGS1基因或来自Mucorcircinelloides的carG基因的Yarrowia菌株中的GGPP产生的比较。

图3显示了三种Yarrowia菌株中的类胡萝卜素产生的比较：a)用来自Mucorcircinelloides的carB和carRP基因转化的一种菌株，b)用来自Mucor circinelloides的carB和carRP基因以及一个拷贝的来自Yarrowia lipolytica的GGS1基因转化的另一种菌株，和c)用来自Mucor circinelloide的carB、carRP和carG基因转化的第三种菌株。

图4显示了三种Saccharomyces cerevisiae菌株中的GGPP产生的比较：a)过表达BTS1基因(编码Ggs的S.serivisae基因)的经遗传修饰的Saccharomyces cerevisiae菌株，b)过表达来自Yarrowia lipolytica的GGS1基因的经遗传修饰的Saccharomycescerevisiae菌株，和c)过表达来自Mucor circinelloides的carG基因的经遗传修饰的Saccharomyces cerevisiae菌株。

图5显示了实验室规模发酵罐中Yarrowia lipolytica菌株ML7788和携带carG基因的相同菌株(新菌株ML15710)之间的β-胡萝卜素产生的比较。

图6显示了实验室规模发酵罐中Yarrowia lipolytica菌株ML15449和携带carG基因的相同菌株(新菌株ML15699)之间的紫罗兰酮产生的比较。

图7显示了摇动平板培养中用多个拷贝的来自Yarrowia lipolytica的GGS1基因转化的经遗传修饰的Yarrowia lipolytica菌株与用来自Mucor circinelloides的carG基因以及多个拷贝的GGS1转化的另一种Yarrowia lipolytica菌株之间的冷杉醇产生的比较。

序列表概述

使用核苷酸碱基的标准字母缩写示出了所附序列表中的核酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链，但是互补链被理解为通过对所显示的链的任何引用而被包括。在所附序列表中：

SEQ ID NO：1是编码来自Mucor circinelloides的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(carG)的DNA序列。

atgctcaactcacacaacagaaccgaagaaagatcgaccgaagacatcattttggagccttacacctacttgatatcacagcctggcaaagatatccgggcaaagttaatttcggcattcgacctgtggctgcatgtgcccaaggacgtgctgtgcgtaatcaacaagattatcggcatgttgcataatgctagtttaatgatcgacgatgtgcaggatgactctgatcttcgaagaggtgtgcctgtcgctcaccatatttatggtgtacctcagactatcaacactgcaaattatgtcatcttcttggcattgcaagaagtgatgaagctgaacatccccagcatgatgcaagtgtgcacggaagagctgatcaatctgcatcgaggccagggcatcgagctgtactggagagacagcctgacttgccccaccgaagaagagtacattgatatggtcaacaacaaaaccagcggtttattacgattggcggtgcgattaatgcaagcagcaagtgaaagtgacattgattacacaccgctcgtcaacattataggcatccatttccaggtgcgcgatgactacatgaacttgcaatccaccagctatacaaacaacaagggcttttgtgaggatctgacagagggcaagttttcatttcccatcattcatgccatcagaaaggacccttccaaccgccaactgctcaacatcatcagccagaagcccacatccattgaagtcaaaaagtatgcattggaggtgattcgcaaggcaggcagttttgaatacgtgcgcgagtttctgcgtcaaaaagaggccgagtctttgaaggaaatcaagcgtttgggtggtaatcctttgctggaaaagtacattgagaccatcagagtagaggccaccaacgac

SEQ ID NO：2是编码来自Mucor circinelloides的香叶基香叶基焦磷酸合酶(carG)的氨基酸序列。

MLNSHNRTEERSTEDIILEPYTYLISQPGKDIRAKLISAFDLWLHVPKDVLCVINKIIGMLHNASLMIDDVQDDSDLRRGVPVAHHIYGVPQTINTANYVIFLALQEVMKLNIPSMMQVCTEELINLHRGQGIELYWRDSLTCPTEEEYIDMVNNKTSGLLRLAVRLMQAASESDIDYTPLVNIIGIHFQVRDDYMNLQSTSYTNNKGFCEDLTEGKFSFPIIHAIRKDPSNRQLLNIISQKPTSIEVKKYALEVIRKAGSFEYVREFLRQKEAESLKEIKRLGGNPLLEKYIETIRVEATND

SEQ ID NO：3是编码来自Mucor circinelloides的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(carG)的DNA序列，其针对在Yarrowia lipolytica中表达而优化。

atgctcaactctcacaaccgaaccgaggagcgatccaccgaggatattattctcgagccttacacctacctcatttctcagcccggaaaggacattcgagctaagctcatttctgcctttgacctctggctgcacgttcctaaggatgttctttgcgtcatcaacaagattatcggtatgctgcacaacgcctctcttatgattgacgatgttcaggacgactctgatctccgacgaggagtccccgttgctcaccacatttacggtgtccctcagactattaacaccgctaactacgtgattttcctcgcccttcaggaggttatgaagctgaacatcccttctatgatgcaggtgtgtaccgaggagcttattaacctccaccgaggtcagggaattgagctgtactggcgagattccctcacttgtcccactgaggaggagtacattgatatggttaacaacaagacctctggcctccttcgacttgccgtccgactgatgcaggctgcttctgagtccgacatcgactacacccctctcgtcaacattatcggaattcacttccaggttcgagatgactacatgaacctccagtccacctcttacactaacaacaagggcttttgcgaggacctgaccgagggaaagttctccttccctattattcacgctattcgaaaggacccctctaaccgacagctcctgaacattatctctcagaagcccacctccattgaggttaagaagtacgctcttgaggtgatccgaaaggctggatcttttgagtacgttcgagagttccttcgacagaaggaggctgagtccctgaaggagatcaagcgacttggcggcaaccctctcctcgagaagtacattgagactattcgagtcgaggctactaacgac

定义

类胡萝卜素生成修饰：在本文中使用时，术语“类胡萝卜素生成修饰”是指调节一种或更多种本文所述的类胡萝卜素的产生的宿主生物体的修饰。例如，类胡萝卜素生成修饰可提高一种或更多种类胡萝卜素的产生水平，和/或可改变不同类胡萝卜素的相对产生水平。原则上，类胡萝卜素生成修饰可以是任何化学修饰、生理修饰、遗传修饰或其他修饰，相较于由除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的生物体产生的水平，所述修饰适当地改变宿主生物体中由该生物体产生的一种或更多种类胡萝卜素的产生。然而，在大多数实施方式中，类胡萝卜素生成修饰包括遗传修饰，通常导致一种或更多种所选择的类胡萝卜素的产生增加。在一些实施方式中，类胡萝卜素生成修饰包括至少一种化学修饰、生理修饰、遗传修饰或其他修饰；在另一些实施方式中，类胡萝卜素生成修饰包括多于一种化学修饰、生理修饰、遗传修饰或其他修饰。在使用多于一种修饰的某些方面，这些修饰可以包括化学修饰、生理修饰、遗传修饰或其他修饰的任意组合(例如，一种或更多种遗传修饰、化学修饰和/或生理修饰)。在一些实施方式中，所选择的类胡萝卜素是虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、黄体素、番茄红素、八氢番茄红素、玉米黄质和/或玉米黄质或虾青素的修饰物(例如葡糖苷、酯化的玉米黄质或虾青素)之中的一种或更多种。在一些实施方式中，所选择的类胡萝卜素是叶黄素和/或其修饰物(例如葡糖苷、酯化的叶黄素)之中的一种或更多种。在某些实施方式中，所选择的叶黄素选自虾青素、黄体素、玉米黄质、番茄红素及其修饰物。

类胡萝卜素生成多肽：在本文中使用时，术语“类胡萝卜素生成多肽”是指参与细胞中产生类胡萝卜素的过程的任何多肽，其可以包括参与除类胡萝卜素产生外的过程但其活性影响一种或更多种类胡萝卜素产生的程度或水平(例如，通过清除直接参与类胡萝卜素产生的类胡萝卜素多肽所使用的底物或反应物)的多肽。类胡萝卜素生成多肽包括类异戊二烯生物合成多肽、类胡萝卜素生物合成多肽和类异戊二烯生物合成竞争多肽，这些术语在本文中进行定义。该术语还包括可影响类胡萝卜素在脂质体中积累的程度的多肽。

类胡萝卜素：术语“类胡萝卜素”在本领域中被理解为指的是由类异戊二烯途径的中间体衍生的一类结构多样的色素。类胡萝卜素生物合成中的关键(commitment)步骤为由香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素。类胡萝卜素可以是无环或环状的，并且可以包含氧或可以不含氧，因此术语类胡萝卜素既包括胡萝卜素又包括叶黄素。总的来说，类胡萝卜素为具有形式上衍生自五碳化合物IPP的共轭多烯碳骨架的烃化合物，包括三萜(C₃₀双阿朴类胡萝卜素(diapocarotenoids))和四萜(C₄₀类胡萝卜素)，以及其氧化衍生物和例如长度为C₃₅、C₅₀、C₆₀、C₇₀、C₈₀或其它长度的其它化合物。许多类胡萝卜素具有强的吸光性质，并且其长度可在超过C₂₀₀的范围。C₃₀双阿朴类胡萝卜素通常由6个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1,6位关系而剩余非末端甲基呈1,5位关系的方式连接。在形式上，这类C₃₀类胡萝卜素可通过以下方法从具有共轭双键长中心链的无环C₃₀H₄₂结构衍生：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。C₄₀类胡萝卜素通常由八个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1,6位关系而剩余非末端甲基呈1,5位关系的方式连接。在形式上，这类C₄₀类胡萝卜素可通过以下方法从具有共轭双键长中心链的无环C₄₀H₅₆结构衍生：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。这类C₄₀类胡萝卜素还包括由碳骨架重排或通过(形式上)移除部分这种结构而产生的某些化合物。自然界中已鉴别出超过600种不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素包括但不限于：表氧化玉米黄质(antheraxanthin)、金盏花红素(adonirubin)、金盏花黄质(adonixanthin)、虾青素、角黄素、辣椒红素(capsorubrin)、β-隐黄素(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮(echinenone)、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、番茄红素、4-酮-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)、硅藻黄质(diatoxanthin)、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质(fucoxanthin)、岩藻黄醇(fucoxanthinol)、异海绵烯(isorenieratene)、β-异海绵烯、莴苣黄素(lactucaxanthin)、黄体素、番茄红素、myxobactone、新黄质(neoxanthin)、链孢红素(neurosporene)、羟基链孢红素、多甲藻素(peridinin)、八氢番茄红素、视紫红质(rhodopin)、视紫红质葡糖苷、4-酮-玉红黄质、管藻黄质(siphonaxanthin)、球形红极毛杆菌烯(spheroidene)、球形红极毛杆菌酮(spheroidenone)、螺菌黄质(spirilloxanthin)、红酵母烯(torulene)、4-酮-红酵母烯、3-羟基-4-酮-红酵母烯、尿酸醋(uriolide)、尿酸醋酸酯、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质-β-二葡糖苷、玉米黄质、紫杉紫素以及C30类胡萝卜素。此外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，其可包含羟基官能团、甲氧基官能团、氧基官能团、环氧基官能团、羧基官能团或醛官能团。另外，所包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如，脂肪酸酯)、醚(例如，糖苷)和硫酸酯衍生物(例如经酯化的叶黄素)。

类胡萝卜素生物合成多肽：术语“类胡萝卜素生物合成多肽”是指参与一种或多种类胡萝卜素的合成的任何多肽。仅举几例，这些类胡萝卜素生物合成多肽包括例如八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶(或去饱和酶)、番茄红素环化酶、类胡萝卜素酮醇酶、类胡萝卜素羟化酶、虾青素合酶、类胡萝卜素ε羟化酶、番茄红素环化酶(β和ε亚基)、类胡萝卜素葡糖基转移酶和酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶和醇乙酰转移酶的多肽。在一些情况下，单个基因可以编码具有多种类胡萝卜素生物合成多肽活性的蛋白质。本领域普通技术人员将会理解，在本公开的一些实施方式中，类胡萝卜素生物合成多肽包括影响一种或更多种其他类胡萝卜素生物合成多肽的表达和/或活性的多肽。

类异戊二烯：术语“类异戊二烯”是指经由从异戊烯焦磷酸(IPP)开始的途径衍生并通过异戊二烯单元的头尾缩合形成的任何化合物，在一个实施方式中，其长度可以为5个碳；或在另一个实施方式中，其长度可以为10个碳；或在另一个实施方式中，其长度可以为15个碳；或在另一个实施方式中，其长度可以为20个碳；或在另一个实施方式中，其长度可以为30个碳；或在另一个实施方式中，其长度可以为40个碳。

类异戊二烯生物合成竞争剂：在本文中使用时，术语“类异戊二烯生物合成竞争剂”是指在细胞中的存在或活性降低进入类胡萝卜素生物合成途径的可用香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的水平的试剂。术语“类异戊二烯生物合成竞争剂”包括多肽和非多肽(例如小分子)抑制剂。本领域普通技术人员将理解，某些不用作类异戊二烯生物合成抑制剂的竞争剂通常仍然可以用作特定类异戊二烯化合物生物合成的抑制剂。类异戊二烯生物合成竞争剂的具体实例在GGPP之前作用于类异戊二烯中间体，使得产生较少的GGPP。鲨烯合酶是根据本公开的一种类异戊二烯生物合成竞争多肽。异戊二烯基二磷酸合酶和对羟基苯甲酸酯(PHB)聚异戊二烯基转移酶也是根据本公开的另外的类异戊二烯生物合成竞争多肽。在某些实施方式中，SAGA复合物的一种或更多种多肽组分是根据本公开的类异戊二烯生物合成竞争剂。考虑到与类异戊二烯产生和/或代谢相关的已知代谢途径，本领域普通技术人员会容易地知晓各种其它具体的类异戊二烯生物合成竞争剂，包括类异戊二烯生物合成多肽。

类异戊二烯生物合成多肽：术语“类异戊二烯生物合成多肽”是指参与类异戊二烯合成的任何多肽。例如，如本文所讨论的，乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶和GGPP合酶都参与类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸途径。为了本公开的目的，这些蛋白质中的每一种也是类异戊二烯生物合成多肽。本领域普通技术人员将会理解，在本公开的一些实施方式中，类异戊二烯生物合成多肽包括影响一种或更多种其他类异戊二烯生物合成多肽(例如，一种或更多种参与类异戊二烯合成的酶)的表达和/或活性的多肽。因此，例如，为了本公开的目的，调节类异戊二烯生物合成酶表达的转录因子可以是类异戊二烯生物合成多肽。

类异戊二醛途径：术语“类异戊二烯途径”在本领域中被理解为是指产生或利用五碳代谢物异戊基焦磷酸(IPP)的代谢途径。如本文所讨论的，两种不同的途径可以产生常见的类异戊二烯前体IPP–“甲羟戊酸途径”和“非甲羟戊酸途径”。术语“类异戊二烯途径”一般足以涵盖这两种类型的途径。由IPP生物合成类异戊二烯通过若干个五碳异戊二烯亚基的聚合而发生。源自IPP的类异戊二烯代谢物具有不同的大小和化学结构，包括环状和无环分子二者。类异戊二烯代谢物包括但不限于单萜、倍半萜、二萜、甾醇和聚戊烯醇(例如类胡萝卜素)。

术语“多核苷酸”和“核酸”旨在包括单个核酸以及多个核酸，核酸分子或其片段、变体或衍生物，或构建物，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列或其片段的核苷酸序列，包括未翻译的5'和3'序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸或核酸可以由以下物质构成：单链DNA和双链DNA，作为单链区域和双链区域的混合物的DNA，单链RNA和双链RNA，以及作为单链区域和双链区域的混合物的RNA，杂交分子，其包含可以为单链区域或更典型地为双链区域或单链区域与双链区域的混合物的DNA和RNA。这些术语还包括多核苷酸或核酸的化学、酶学或代谢修饰形式。

术语“基因”是指能够被表达为特定蛋白质的核酸或其片段，其任选地包括编码序列前的调控序列(5'非编码序列)和编码序列后的调控序列(3'非编码序列)。

在本文中使用时，术语“多肽”旨在包括单数的“多肽”以及复数的“多肽”及其片段，并指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不特指产物的特定长度。因此，“多肽”的定义包括肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其它术语，并且术语“多肽”可用于代替任何这些术语或与任何这些术语互换使用。多肽可来源于天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。

在本文中使用时，“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样，带有其自身的(如果存在的话)调节序列。

在本文中使用时，“内源性”是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物体或生物体的基因组中的天然位置的天然形式。“内源性多核苷酸”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然多核苷酸。“内源性基因”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。“内源性多肽”包括在其在生物体中的天然位置的天然多肽。

在本文中使用时，“异源性”是指正常情况下不存在于宿主生物体中，而是被引入宿主生物体中的多核苷酸、基因或多肽。“异源性多核苷酸”包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式重新引入来源生物体中天然的编码区或其部分。“异源性基因”也包括以不同于相应的天然基因的形式重新引入来源生物体中的天然的编码区或其部分。例如，异源性基因可包括被再引入至天然宿主的天然编码区，其为包括非天然的调控区的嵌合基因的一部分。“异源性多肽”包括以不同于相应的天然多肽的形式被重新引入来源生物体中的天然多肽。

关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“经遗传修饰的”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。术语“经遗传修饰的”与“重组体”同义。

在本文中使用时，术语“衍生物”是指本发明所公开序列的修饰。说明性的此类修饰是与本文公开的编码序列的核酸序列有关的一个或多个碱基的替换、插入和/或缺失，其保留、轻微改变或增加本文公开的编码序列在宿主生物体中的功能。

在本文中使用时，术语“序列同一性”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

为了本发明的目的，使用在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序、优选3.0.0版本或更新版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。所使用的任选参数是空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)被用作同一性百分比，并如下计算：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

为了本发明的目的，使用在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice等人,2000,如上所述)的Needle程序、优选3.0.0版本或更新版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,如上所述)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度。所使用的任选参数是空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)被用作同一性百分比，并如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然存在的基因中分离的或被修饰以含有否则将不会在自然中存在的形式的核酸的区段或者其是合成的。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”的含义相同。

术语“控制序列”是指表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的或外来的或相对于彼此可以是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录终止信号和翻译终止信号。控制序列可以带有接头，目的是引入特异性限制性位点以促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。

术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

术语“宿主生物体”是指包含宿主细胞的单细胞生物体或多细胞生物体。

术语“变体”意指在一个或更多个(若干个)位置处包括改变(即，替换、插入和/或缺失一个或更多个(若干个)氨基酸残基)的具有酶活性的多肽。替换意指用不同氨基酸置换占用位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；插入意指在占据位置的氨基酸旁添加1-3个氨基酸。

术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或者响应于不同的环境或生理条件的表达。引起基因在多数情况下在多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未被完全限定，因此不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

在本文中使用时，术语“表达”是指来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指将mRNA翻译成多肽。

在本文中使用时，术语“过表达”是指高于相同或相关基因的内源表达的表达。如果异源基因的表达高于可比较的内源基因的表达，则该异源基因被过表达。

在本文中使用时，术语“转化”是指将核酸或片段转移到宿主生物体中，从而导致遗传上稳定的遗传。含有所转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。

在本文中使用时，术语“质粒”和“载体”是指常常携带并非细胞中心代谢的一部分的基因的染色体外元件，且通常为环状双链DNA分子形式。这类元件可以是来源于任何来源的单链或双链的DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列(线性或环状)，其中一些核苷酸序列已被连接或重组到独特的构建体，该构建体能够将所选择的基因产物的DNA序列和启动子片段连同适当的3'非翻译序列一起引入到细胞中。

在本文中使用时，术语“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。本领域技术人员公知特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成用于在宿主细胞中改善表达的基因时，期望对该基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

术语“密码子优化的”在涉及用于转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区时，是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变基因或核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物通常的密码子使用。这种优化包括用在该生物体的基因中更频繁使用的一个或更多个密码子代替至少一个、多于一个或大量的密码子。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并且例如由Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2000)；和Silhavy等人,Experiments withGene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984)；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,由Greene PublishingAssoc.和Wiley Interscience出版(1987至今)描述。

发明详述

本发明的一部分涉及具有香叶基香叶基焦磷酸合酶活性、从而可用于经遗传修饰的宿主细胞中以产生GGPP衍生的萜类化合物的多肽。在一些实施方式中，本发明在不是Mucor circinelloides的宿主细胞中提供了来自Mucor circinelloides的GGPP合酶，以相较于除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的生物体所产生的水平，过量产生GGPP衍生的萜类化合物。

GGPP合酶

为了本发明的目的，具有GGPP合酶活性的多肽是这样的多肽，其酶催化从法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基焦磷酸(GPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAP)和/或异戊基焦磷酸(IPP)合成GGPP。

在一个实施方式中，主题GGPP合酶由Mucor circinelloides的GGPP合酶基因编码。在一些实施方式中，主题核酸包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，主题核酸包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，主题核酸包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，主题核酸包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，主题核酸包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，且所述蛋白质具有GGPP合酶活性。在一些实施方式中，所述氨基酸序列相较于SEQID NO：2所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约10至约15、约15至约20、或约20至约25个保守氨基酸替换。

在一些实施方式中，主题核酸包含编码多肽的变体的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，主题核酸包含编码这样的酶的核苷酸序列，所述酶与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的酶相比，展示出一种或更多种下列性质：1)提高的酶活性；2)提高的体外和/或体内稳定性；3)提高的产物产率；4)改变的蛋白质周转速率(turnover rate)；和5)提高的酶效率(例如，提高的底物转化生成产物的效率)。

构建体

本发明还提供包含主题核酸的重组载体(“构建体”)。在一些实施方式中，主题重组载体提供主题核酸的扩增。在一些实施方式中，主题重组载体提供在真核细胞、原核细胞或无细胞转录/翻译体系中产生编码的GGPP合酶。

适用于真菌宿主细胞中的启动子包括但不限于TEF1启动子、HSP启动子、HYP启动子和ALK1启动子。

在许多实施方式中，主题重组载体包含编码GGPP合酶的核苷酸序列并且与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，主题重组载体包含编码来自Mucor circinelloides的GGPP合酶的核苷酸序列并且与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，主题重组载体包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且其与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，主题重组载体包含编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，并且所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。上述多肽具有GGPP合酶活性。

宿主细胞

本发明提供经遗传修饰的宿主细胞，例如已经用上述主题核酸或主题重组载体进行遗传修饰的宿主细胞。在许多实施方式中，主题经遗传修饰的宿主细胞是体外宿主细胞。在另一些实施方式中，主题经遗传修饰的宿主细胞是体内宿主细胞。在另一些实施方式中，主题经遗传修饰的宿主细胞是多细胞生物体的一部分。

在许多实施方式中，宿主细胞是单细胞生物，或者在培养中作为单细胞生长。在一些实施方式中，宿主细胞是真核细胞。合适的真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞和藻类细胞。

合适的真核宿主细胞包括但不限于Yarrowia、Saccharomyces、Candida、Aspergillus、Trichoderma、Fusarium、Neurospora、Crypthecodinium、Schizochytrium和Thraustochytrium等属的细胞。

在使用异源类异戊二烯生物合成多肽或类胡萝卜素生成生物合成多肽的本公开的一些实施方式中，来源生物体包括但不限于Aspergillus、Blakeslea、Botrytis、Candida、Cercospora、Cryptococcus、Cunninghamella、Fusarium(Gibberella)、Kluyveromyces、Lipomyces、Mortierella、Mucor、Neurospora、Penicillium、Phycomyces、Pichia(Hansenula)、Puccinia、Pythium、Rhodosporidium、Rhodotorula、Saccharomyces、Sclerotium、Trichoderma、Trichosporon、Xanthophyllomyces(Phaffia)和Yarrowia属的真菌。在某些实施方式中，来源生物体包括但不限于以下物种：Aspergillus terreus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Blakeslea trispora、Botrytis cinerea、Candida japonica、Candida pulcherrima、Candida revkaufi、Candida tropicalis、Candida utilis、Cercospora nicotianae、Cryptococcus curvatus、Cunninghamellaechinulata、Cunninghamella elegans、Fusarium fujikuroi(Gibberella zeae)、Kluyveromyces lactis、Lipomyces starkeyi、Lipomyces lipoferus、Mortierellaalpina、Mortierella ramanniana、Mortierella isabellina、Mortierella vinacea、Mucor circinelloides、Neurospora crassa、Phycomyces blakesleanus、Pichiapastoris、Puccinia distincta、Pythium irregulare、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula graminis、Rhodotorula mucilaginosa、Rhodotorula pinicola、Rhodotorula gracilis、Saccharomyces cerevisiae、Sclerotiumrolfsii、Trichoderma reesei、Trichosporon cutaneum、Trichosporon pullulans、Xanthophyllomyces dendrorhous(Phaffia rhodozyma)、Crypthecodinium cohnii、Schizochytrium sp.、Thraustochytrium sp.和Yarrowia lipolytica。

在一些实施方式中，宿主细胞是非植物细胞的真核细胞。在另一些实施方式中，宿主细胞是植物细胞。

在另一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。合适的原核细胞包括但不限于革兰氏阴性或阳性细菌。革兰氏阳性细菌宿主包括但不限于Bacillus、Brevibacillus、Clostridium、Geobacillus、Lactobacillus、Lactococcus、Paenibacillus和Streptomyces。革兰氏阴性细菌包括但不限于E.coli、Pseudomonas和Paracoccus。重组细菌宿主可以是任何芽孢杆菌(Bacillales)，包括但不限于Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Geobacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis和Bacillus thuringiensis。重组细菌宿主也可以是任何链霉菌(Streptomyces)，包括但不限于Streptomyces achromogenes、Streptomycesavermitilis、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseus和Streptomyceslividans。

重组细菌宿主也可以是任何副球菌(Paracoccus)，包括但不限于Paracoccusdenitrificans、Paracoccus versutus、Paracoccus carotinifaciens、Paracoccusmarcusii和Paracoccus zeaxanthinifaciens。

为了产生主题经遗传修饰的宿主细胞，使用已建立的转化技术将包含上述主题核酸或主题重组载体的主题核酸稳定地或瞬时引入亲本宿主细胞中。

在一些实施方式中，本发明涉及包含上述主题核酸或主题重组载体的经遗传修饰的宿主生物体。这种经遗传修饰的宿主生物体可以是单细胞宿主细胞或多细胞细胞的形式。

经遗传修饰的宿主细胞

在一些实施方式中，在引入上述主题核酸或主题重组载体之前，宿主细胞所具有的产生萜类化合物的能力可以是天然形式的宿主的性质或者可以是引入一种或更多种参与萜类生物合成途径的重组核酸序列的结果。

在下面的段落中，描述了示例性经遗传修饰的宿主细胞以显示可受本发明所公开的方法影响的萜类化合物生物合成途径的类型和萜类化合物产物的类型。具体地，描述了用于合成类异戊二烯、类胡萝卜素、紫罗兰酮、冷杉醇和香紫苏醇的经遗传修饰的宿主细胞。然而，这些实例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围，例如可使用本发明中描述的方法产生的萜类化合物的类型。

用于合成类异戊二烯的经遗传修饰的宿主细胞

在一些实施方式中，主题经遗传修饰的宿主细胞是在正常情况下通过类异戊二烯生物合成途径合成类异戊二烯的宿主细胞。最常见的类异戊二烯生物合成途径有时被称为“甲羟戊酸途径”。简而言之，乙酰辅酶A经由羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)而转化成甲羟戊酸。然后甲羟戊酸被磷酸化并转化为五碳化合物异戊烯焦磷酸(IPP)。IPP被异构化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)后，与额外的IPP分子进行的三个连续缩合反应生成十碳分子香叶基焦磷酸(GPP)，随后生成十五碳分子法尼基焦磷酸(FPP)，最后生成的是二十碳化合物香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。

一些生物(特别是细菌和植物)利用替代的类异戊二烯生物合成途径，其有时被称为“甲羟戊酸非依赖性途径”或“非甲羟戊酸途径”。该途径是由从丙酮酸和甘油醛-3-磷酸合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)开始的。随后DOXP经由一系列反应而转化成IPP，其异构化成为DMAPP且随后经由GPP和FPP而转化成GGPP。

己对多种生物体中类异戊二烯生物合成中所涉及的多种蛋白质进行了鉴定和表征。此外，类异戊二烯生物合成途径的各方面在整个真菌、细菌、植物和动物界都是保守的。例如，已对多种生物体和细胞中与乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶和GGPP合酶对应的多肽进行鉴别，并且将其从所述生物体和细胞中分离。

或者或另外，依照本公开可以使用展示出降低的反馈抑制性质(例如，对法尼基焦磷酸(FPP))的经修饰的甲羟戊酸激酶多肽。这种经修饰的甲羟戊酸激酶多肽可以是真核生物或原核生物来源的。例如，可以使用来自动物(包括人)、植物、藻类、真菌(包括酵母)和/或细菌的经修饰版本的甲羟戊酸激酶多肽；例如，可以使用经修饰版本的甲羟戊酸激酶多肽。

在一些实施方式中，主题经遗传修饰的宿主细胞包含一种或更多种参与类异戊二烯合成的多肽。在一些实施方式中，这样的多肽包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶和GGPP合酶。上述酶都参与类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸途径。

包含一种或更多种参与类异戊二烯合成的多肽的经遗传修饰的宿主细胞的非限制性实例可以在美国专利申请No.12/937,204中找到，该专利申请的内容全部并入本文。

在一个实施方式中，萜类化合物生物合成途径可以分为两部分：导致GGPP形成的上游类异戊二烯生物合成途径，和将GGPP转化为长链C20、C30或C40化合物的下游萜类化合物途径。

在一个实施方式中，术语“上游类异戊二烯生物合成途径”和“上游途径”是指参与GGPP合成的途径的一部分，其包括甲羟戊酸途径。

术语“下游萜类化合物生物合成途径”和“下游途径”是指用于生物合成具有IPP的共同前体的多种萜类化合物分子的途径。由一个DMAP和三个IPP部分缩合而获得的GGPP是大多数二萜类分子的四亚基前体。由本发明的方法和细胞产生的GGPP衍生物的实例包括但不限于类胡萝卜素、紫罗兰酮、冷杉醇和香紫苏醇。

用于合成类胡萝卜素的经遗传修饰的宿主细胞

在形成GGPP的那一点，类胡萝卜素生物合成途径从类异戊二烯生物合成途径中分支出来。参见图1B。类胡萝卜素生物合成中的关键步骤是由八氢番茄红素合酶(通常称为CrtB)催化的通过两分子GGPP的头对头缩合形成八氢番茄红素。一系列脱氢反应(每个反应都增加共轭双键的数量)将八氢番茄红素转化成番茄红素。途径在番茄红素产生之前和之后的各个点分支，从而可以生成多种类胡萝卜素。例如，单环化酶对番茄红素的作用生成γ-胡萝卜素；过度去饱和可产生3,4-二脱氢番茄红素。通过环化酶的作用γ-胡萝卜素被转化成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素可被加工成一些产物中的任何，包括虾青素(经由例如，海胆酮、羟基海胆酮(hydroxyechinenone)和绿蚬黄质(phoenicoxanthin))。

根据本公开，可以通过改变一种或更多种参与类胡萝卜素生物合成的蛋白质的表达或活性来调节宿主生物体中的类胡萝卜素产生。在一些实施方式中，期望利用天然产生一种或更多种类胡萝卜素的宿主细胞生物体。在一些此类情况下，重点是增加天然产生的类胡萝卜素的产生，例如通过提高一种或更多种参与该类胡萝卜素合成的蛋白质的水平和/或活性和/或通过降低一种或更多种参与竞争性生物合成途径的蛋白质水平或活性。或者或另外，在一些实施方式中，期望产生一种或更多种不是由宿主细胞天然产生的类胡萝卜素。

根据本公开的一些实施方式，期望将一种或更多种异源的类胡萝卜素生成多肽引入宿主细胞中。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以使用多种异源多肽中的任何；选择要考虑例如要提高其产生的特定类胡萝卜素。本公开不仅考虑引入异源的类胡萝卜素生成多肽，而且还考虑调节异源或内源的类胡萝卜素生成多肽的表达或活性水平。

参与类胡萝卜素生物合成的蛋白质包括但不限于八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素酮醇酶、类胡萝卜素羟化酶、虾青素合酶(在一些来源生物中发现的单一多功能酶，其通常具有酮醇酶和羟化酶活性)、类胡萝卜素ε羟化酶、番茄红素环化酶(β型和ε型)、类胡萝卜素葡糖基转移酶和酰基CoA:二酰甘油酰基转移酶。

应当理解，根据本公开内容要应用于宿主细胞的特定的类胡萝卜素生成修饰会受到期望产生何种类胡萝卜素的影响。例如，类异戊二烯生物合成多肽与大多数类胡萝卜素的产生有关。类胡萝卜素生物合成多肽也广泛相关。类胡萝卜素酮醇酶活性对于角黄素的产生特别相关，类胡萝卜素羟化酶活性用于产生黄体素和玉米黄质等。类胡萝卜素羟化酶和酮醇酶活性(和虾青素合酶)都特别适用于虾青素的产生。

包含一种或更多种参与类胡萝卜素合成的多肽的经遗传修饰的宿主细胞的非限制性实例可以在美国专利申请No.12/937,204中找到。

用于合成紫罗兰酮的经遗传修饰的宿主细胞

紫罗兰酮化合物是由类胡萝卜素前体合成的，类胡萝卜素前体本身是由类异戊二烯前体合成的。因此，导致类胡萝卜素(可由其产生紫罗兰酮化合物)产生增加的任何类胡萝卜素生成修饰可类似地导致紫罗兰酮化合物的产生增加。紫罗兰酮化合物包括β-紫罗兰酮和α-紫罗兰酮。在某些实施方式中，由类胡萝卜素前体β-胡萝卜素和/或α-胡萝卜素合成β-紫罗兰酮化合物。在另一些实施方式中，由类胡萝卜素前体ε-胡萝卜素和/或α-胡萝卜素合成α-紫罗兰酮化合物。见图1D。

根据本公开，可以通过改变一种或更多种参与紫罗兰酮化合物生物合成的蛋白质的表达或活性来调节宿主生物体中的紫罗兰酮化合物产生。在一些实施方式中，期望利用天然产生一种或更多种紫罗兰酮化合物的宿主细胞生物体。或者或另外，在一些实施方式中，期望产生一种或更多种不是由宿主细胞天然产生的紫罗兰酮化合物。

根据本公开的一些实施方式，期望将一种或更多种异源紫罗兰酮合成多肽引入宿主细胞中。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以使用多种异源多肽中的任何；选择要考虑例如要提高其产生的特定的紫罗兰酮化合物。本公开不仅考虑引入异源的紫罗兰酮合成多肽，而且还考虑调节异源紫罗兰酮合成多肽的表达或活性水平，包括例如改变组成型或诱导型表达模式。

参与紫罗兰酮生物合成的蛋白质包括但不限于番茄红素环化酶(β和ε亚基)和类胡萝卜素切割双加氧酶。

用于合成冷杉醇和香紫苏醇的经遗传修饰的宿主细胞

由GGPP的类异戊二烯前体(其是异戊二烯合成途径的产物)合成冷杉醇和香紫苏醇化合物。因此，导致GGPP(可由其产生冷杉醇或香紫苏醇化合物)产生增加的任何遗传修饰可类似地导致冷杉醇或香紫苏醇化合物的产生增加。

有人提出产生冷杉醇和香紫苏醇二者的途径涉及两个步骤。参见图1C。第一步由以下组成：通过II类二萜合酶(diTPS)的活性将类异戊二烯途径分子GGPP转化为名为λ-13-烯-8-醇二磷酸(LDPP)的常见中间体。第二步由I类diTPS催化。存在若干种类型的I类diTPS，每种都负责产生特定的终产物。例如，冷杉醇合酶(ABS)负责冷杉醇的产生，而香紫苏醇合酶(SS)则负责香紫苏醇的产生。

参与GGPP至香紫苏醇或GGPP至冷杉醇的两步转化的酶是植物特异性的，并且可以是两种独立的酶或具有两个活性位点的单一酶的形式。例如，在烟草的冷杉醇产生中，烟草的II类diTPS和烟草的I类diTPS合酶呈两种不同蛋白质分子的形式。类似地，在快乐鼠尾草的香紫苏醇产生中，快乐鼠尾草的II类diTPS和快乐鼠尾草的I类diTPS合酶也呈两种独立的蛋白质分子的形式。相比之下，在冷杉的冷杉醇产生中，I类和II类diTPS亚基二者位于一种双功能I/II类冷杉醇合酶上。因此，在冷杉中，GGPP在单一双功能I/II类冷杉醇合酶的存在下被转化为冷杉醇。

根据本公开，可以通过改变一种或更多种参与冷杉醇或香紫苏醇化合物生物合成的蛋白质的表达或活性来调节宿主生物体中的冷杉醇或香紫苏醇化合物产生。在一些实施方式中，期望利用天然产生一种或更多种冷杉醇或香紫苏醇化合物的宿主细胞生物体。或者或另外，在一些实施方式中，期望产生一种或更多种不是由宿主细胞天然产生的冷杉醇或香紫苏醇化合物。

根据本公开的一些实施方式，期望将一种或更多种异源的冷杉醇合成或香紫苏醇合成多肽引入宿主细胞中。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以使用多种异源多肽中的任何；选择要考虑例如要提高其产生的特定冷杉醇或香紫苏醇化合物。本公开不仅考虑引入异源的多肽，而且还考虑调节异源多肽的表达或活性水平，包括改变例如组成型或诱导型表达模式。

包含一种或更多种参与类胡萝卜素合成的多肽的经遗传修饰的宿主细胞的非限制性实例可以在美国专利申请No.62/089511中找到，该专利申请的内容全部并入本文。

密码子使用

在一些实施方式中，修饰用于生成主题经遗传修饰的宿主细胞的核苷酸序列，使得核苷酸序列反映特定宿主细胞的密码子偏好。例如，在一些实施方式中，针对Yarrowia密码子偏好修饰核苷酸序列。作为另一个非限制性实例，在另一些实施方式中，针对E.coli密码子偏好修饰核苷酸序列。作为另一个非限制性实例，在另一些实施方式中，针对酵母(Saccharomyces)密码子偏好修饰核苷酸序列。

萜类化合物的生产和分离

本发明提供了一种生产萜类化合物的方法。在一些实施方式中，所述方法通常涉及在合适的培养基中培养经遗传修饰的宿主细胞，其中用包含编码GGPP合酶的核苷酸序列的主题核酸遗传修饰所述宿主细胞。在一个实施方式中，用包含编码来自Mucorcircinelloides的GGPP合酶的核苷酸序列的主题核酸遗传修饰宿主细胞。在一些实施方式中，上述宿主细胞天然产生类胡萝卜素或已被工程改造以产生类胡萝卜素。在一些实施方式中，上述宿主细胞天然产生紫罗兰酮或已被工程改造以产生紫罗兰酮。在一些实施方式中，上述宿主细胞天然产生冷杉醇或已被工程改造以产生冷杉醇。在一些实施方式中，上述宿主细胞天然产生香紫苏醇或已被工程改造以产生香紫苏醇。

通常，该方法在体内进行，但也考虑了萜类化合物的体外生产。在这些实施方式中的一些中，宿主细胞是真核细胞，例如Yarrowia细胞。在另一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在这些实施方式中的一些中，宿主细胞是植物细胞。在这些实施方式中的一些中，宿主细胞是昆虫或动物细胞。

在本公开的某些实施方式中，期望在用主题核酸或主题重组载体遗传修饰的宿主细胞中积累类胡萝卜素化合物达到这样的水平(即考虑所有产生的类胡萝卜素化合物的总量或考虑特定的类胡萝卜素化合物)，所述水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过1.5倍。在一些实施方式中，用包含编码来自Mucorcircinelloides的GGPP合酶的核苷酸序列的主题核酸遗传修饰的宿主细胞中的总类胡萝卜素化合物积累水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过6倍或超过7倍。

在一些实施方式中，在上述经遗传修饰的宿主细胞中积累的特定类胡萝卜素化合物包括但不限于：表氧化玉米黄质、金盏花红素、金盏花黄质、虾青素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β,ψ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、ψ-胡萝卜素、4-酮-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、脱氧屈曲黄素、硅藻黄质、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质、岩藻黄醇、异海绵烯、β-异海绵烯、莴苣黄素、黄体素、番茄红素、myxobactone、新黄质、链孢红素、羟基链孢红素、多甲藻素、八氢番茄红素、视紫红质、视紫红质葡糖苷、4-酮-玉红黄质、管藻黄质、球形红极毛杆菌烯、球形红极毛杆菌酮、螺菌黄质、红酵母烯、4-酮-红酵母烯、3-羟基-4-酮-红酵母烯、尿酸醋、尿酸醋酸酯、紫黄质、玉米黄质-β-二葡糖苷、玉米黄质、紫杉紫素以及C30类胡萝卜素及其组合。

在本公开的某些实施方式中，期望在用包含主题核酸或主题重组载体的主题核酸遗传修饰的宿主细胞中积累紫罗兰酮化合物达到这样的水平(即考虑所有产生的紫罗兰酮化合物的总量或考虑特定的紫罗兰酮化合物)，所述水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过1.5倍。在一些实施方式中，用包含编码来自Mucor circinelloides的GGPP合酶的核苷酸序列的主题核酸遗传修饰的宿主细胞中的总类胡萝卜素化合物积累水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过6倍或超过7倍。

在一些实施方式中，在上述经遗传修饰的宿主细胞中积聚的特定紫罗兰酮化合物包括但不限于α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮。

在本公开的某些实施方式中，期望在用包含主题核酸或主题重组载体的主题核酸遗传修饰的宿主细胞中积累冷杉醇和/或香紫苏醇化合物达到这样的水平，所述水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过1.5倍。在一些实施方式中，用包含编码来自Mucor circinelloides的GGPP合酶的核苷酸序列的主题核酸遗传修饰的宿主细胞中的总冷杉醇和/或香紫苏醇化合物积累水平为除了未经受相同的修饰之外在其它方面相同的宿主细胞中的水平的超过2倍、超过3倍、超过4倍、超过5倍、超过6倍、超过7倍。

在一些具体实例中，本公开提供了经修饰的Y.lipolytica菌株，其已被工程改造以表达来自M.circinelloides的GGPP合酶多肽(由carG编码)。Y.lipolytica宿主菌株可已被工程改造以表达来自M.circinelloides的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶双功能(由carRP编码)多肽，并且还可表达来自M.circinelloides的八氢番茄红素脱氢酶(由carB编码)多肽。在一些实施方式中，本公开提供了这样的表达carG的Y.lipolytica菌株，其已被工程改造以改变来自Y.lipolytica的截短的HMG-CoA还原酶多肽和/或一种或更多种选自以下的Y.lipolytica多肽的表达和/或活性：GGPP合酶(Ggs1)、FPP合酶(Erg20)、IPP异构酶(Idi或Idi1)、HMG合酶(Erg13)、甲羟戊酸激酶(Erg12)、鲨烯合酶(Erg9)、磷酸甲羟戊酸激酶(Erg8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mvd1)、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖6磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同源物2,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Gnd1)、异柠檬酸脱氢酶、果糖1,6二磷酸酶、乙酰乙酰辅酶A硫解酶(Erg10)、ATP柠檬酸裂解酶亚基1、ATP柠檬酸裂解酶亚基2及其组合。因此，在一个实施方式中，本公开特别提供了Y.lipolytica菌株，其被遗传工程改造以增强GGPP的产生并因此引起增强的类胡萝卜素产生(和其他类异戊二烯的产生)，其中所述Y.lipolytica宿主菌株已被工程改造以产生类胡萝卜素。

在一些实施方式中，在合适的培养基(例如YPD培养液等)中培养主题经遗传修饰的宿主细胞；并用有机溶剂(例如十二烷)覆盖培养基以形成有机层。经遗传修饰的宿主细胞所产生的萜类化合物分到有机层中，可以从有机层中纯化所述萜类化合物。在一些实施方式中，其中编码萜类化合物生物合成酶的核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且在合适的时间之后，从覆盖在培养基上的有机层中分离出萜类化合物。

根据本发明的生产萜类化合物的方法可以在任何合适的发酵条件下进行。在一个实施方式中，所述方法可以以工业规模进行。

在一些实施方式中，将萜类化合物与可能存在于有机层中的其它产物分离。使用例如标准色谱技术容易地实现萜类化合物与可能存在于有机层中的其它产物的分离。

用途

根据本公开产生的类胡萝卜素化合物可用于多种应用中的任何，例如利用其生物或营养特性(例如抗氧化、抗增殖性等)和/或其色素属性。例如，根据本公开，类胡萝卜素可用于药物、食品、膳食补充剂、电光应用、动物饲料添加剂、化妆品等中。

根据本公开产生的紫罗兰酮、冷杉醇和香紫苏醇化合物可用于利用其芳香性质的应用中。例如，根据本公开内容，紫罗兰酮、冷杉醇和香紫苏醇化合物可用于化妆品、清洁剂、空气清新产品等中。

应当理解，在本公开的一些实施方式中，，由本文所述的经操纵的宿主细胞产生的类胡萝卜素化合物在宿主细胞的环境中被掺入终产品(例如食品或饲料补充剂、药物、化妆品、含染料物品等)中。例如，宿主细胞可以被冻干、冷冻干燥、冷冻或以其它方式灭活，然后可将完整细胞掺入终产物中或用作终产物。也可以在将宿主细胞掺入产物之前对其进行加工以提高生物利用度(例如通过裂解)。或者或另外，终产物可以仅掺入从整体中分离的宿主细胞的一部分(例如，按尺寸、溶解度分级的)。例如，在本公开的一些实施方式中，将脂质滴(lipid droplets)从宿主细胞中分离出来并掺入终产物中或用作终产物。在另一些实施方式中，将类胡萝卜素化合物本身或单独的类胡萝卜素化合物分离出并重新配制到终产物中。

在本公开的一些实施方式中，将一种或更多种所产生的类胡萝卜素化合物掺入食品或饲料的组分(例如食品补充剂)中。根据本公开可以掺入类胡萝卜素化合物的食品的类型没有特别限制，包括饮料例如牛奶、水、运动饮料、软饮料、能量饮料、茶、果汁和酒；糖果，例如果冻和饼干；含脂肪的食品和饮料例如乳制品；经加工的食品例如米饭和软米饭(或粥)；婴儿配方奶粉；早餐谷物等。在一些实施方式中，将一种或更多种所产生的类胡萝卜素化合物掺入膳食补充剂(例如多种维生素)中。在某些实施方式中，根据本公开产生的β-胡萝卜素包含在膳食补充剂中。在某些实施方式中，根据本公开产生的黄体素包含在膳食补充剂中。在本公开的该方面的一些实施方式中，将类胡萝卜素化合物掺入可食用脂质的小体内可是有用的，因为其可促进掺入某些含脂肪的食品中。

可以掺入根据本公开产生的类胡萝卜素化合物的饲料的实例包括例如宠物食品诸如猫食、狗食等，用于观赏鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料，用于人工饲养的动物(包括牲畜，还包括水产养殖中养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。掺入根据本公开产生的类胡萝卜素化合物的食物或饲料优选对于作为预期接受者的生物体而言是美味的。这种食物或饲料可以具有食物材料目前已知的任何物理性质(例如，固体、液体、柔软)。

在一些实施方式中，含有根据本公开产生的类胡萝卜素化合物的饲料基本上不含完整的宿主细胞。

在本公开的一些实施方式中，将一种或更多种所产生的类胡萝卜素和/或香料化合物(例如紫罗兰酮、冷杉醇和香紫苏醇)掺入化妆品中。这样的化妆品的实例包括例如皮肤化妆品(例如洗剂、乳液、霜剂等)、唇膏、防日晒化妆品、彩妆(makeup)化妆品、香料、日用品(例如，牙膏、漱口剂、防口臭剂、固体皂、液体皂、洗发剂、护发素)等。

根据本公开产生的类胡萝卜素化合物可以掺入任何含色素的产品中。它们也可以掺入作为环境指示剂的产品中，或用作检测剂的仪器(例如生物传感器)中。

提供以下实施例来阐释本发明，其不应被解释为对本发明的限制。

实施例

实施例1

构建含有来自Mucor circinelloides的GGPP合酶基因(carG基因)的载体

本公开中所构建和使用的质粒示于表1中。

表1.质粒

起始质粒是pMB6157，其含有TEF1启动子和XPR2终止子，并赋予潮霉素抗性。将克隆在5'末端侧翼是NheI且3'末端侧翼是MluI的DNA片段中的来自Mucor circinelloides的carG基因引入质粒pMB6157中以产生pMB7278。上述Mucor circinelloides carG基因已针对Yarrowia进行了密码子优化。

通过用1.0kb的Yarrowia ALK1启动子代替MB7280的TEF1启动子来构建质粒pMB7311。

通过将Yarrowia的GGS1片段引入质粒pMB6157中来构建质粒pMB6502。

通过用诺尔丝菌素抗性标记替代潮霉素抗性标记由MB6502生成质粒pMB6522。诺尔丝菌素抗性标记来源于Streptomyces noursei，被克隆在质粒pMB6200中。

质粒pMB7322是通过用来自MB6200的诺尔丝菌素抗性标记(NatR)代替质粒pMB7280中的潮霉素抗性标记而产生的。

已预先对本发明中使用的菌株进行遗传修饰以产生多种萜类化合物。

下表2中列出的菌株是实施例2-6中使用的Yarrowia lipolytica和Saccharomyces cerevisiae菌株。括号中的数字表示该基因的拷贝数：

表2.菌株

通过乙酸锂/PEG真菌转化流程方法进行所有Yarrowia转化，并酌情在YPD+100μg/ml诺尔丝菌素或YPD+100μg/ml潮霉素上选择转化体。

本文所述的所有基本分子生物学和DNA操作程序通常根据标准重组和分子克隆技术进行。

实施例2

CarG表达导致Yarrowia lipolytica中的GGPP增加

用整合性线性化DNA片段转化野生型Yarrowia lipolytica菌株ML10709，所述DNA片段含有潮霉素抗性以及用于表达编码分别来自Yarrowia lipolytica和Mucorcircinelloides的GGPP合酶的DNA的TEF1启动子和XPR2终止子。

在转化到合适的宿主中之后，将来自质粒pMB5789的HindIII/XbaI片段中的Yarrowia lipolytica GGS1基因与来自质粒pMB7280的PvuII片段中的Mucorcircinelloides carG基因进行比较。在于含5％葡萄糖的YP液体培养基中生长(通过在250rpm旋转振荡器上在30℃下利用在125ml带挡板烧瓶中的20ml培养液生长)两天后，检验单个菌落克隆分离物。立即将2ml等份的培养液以13000rpm旋转10秒，然后倾析出培养液，并向沉淀中加入1ml 60％的热的78℃乙醇与水的混合物，涡旋，并在加热的水浴中在78℃下孵育15分钟。通过离心使样品澄清，并使用反相LCMS检测GGPP。对于每个值，取至少三次技术重复的平均值。

通过HPLC-MS量化GGPP由Waters XBridge C18柱(3.5mm，2.1×50mm)和Alliance2795HPLC(Waters)组成。流动相为流速为0.3ml/min的从20mM乙酸铵和在水中的0.1％三乙胺到2mM乙酸铵20:80乙腈:水和0.1％三乙胺的20分钟梯度。质谱仪以阴离子模式运行-MS-MS母子转变为449.4mu至79.0mu，在14.1分钟洗脱GGPP。如图2所示，用Mucorcircinelloides carG基因转化的Yarrowia lipolytica菌株导致比具有过表达的天然GGS1基因的可比较的Yarrowia lipolytica菌株显著更高的GGPP产生。

实施例3

CarG表达导致Yarrowia lipolytica中的总类胡萝卜素滴度增加

使用营养标记转化野生型Yarrowia lipolytica菌株，以选择含有TEF1驱动的carB(M.circinelloides八氢番茄红素去饱和酶)和carRP(M.circinelloides八氢番茄红素合酶-番茄红素环化酶)的盒，以生成产生类胡萝卜素的Yarrowia lipolytica菌株ML13509。用来自用HindIII/XbaI切割的质粒pMB5789的TEF1驱动的Yarrowia lipolyticaGGS1基因转化ML13509，并在潮霉素板上选择。还用来自用PvuII切割的质粒pMB7280的M.circinelloides carG基因转化相同的产生β-胡萝卜素的Yarrowia lipolytica菌株ML13509。比较两种所得菌株的类胡萝卜素产生水平。

在实验中，将单个菌落克隆分离物接种到24孔摇动板中的0.8mL YPD中，并在Infors装置中以800rpm摇动在30℃下生长4天。用THF提取培养物并通过珠子击打破碎细胞，然后通过HPLC分析样品中的总类胡萝卜素。取至少8次技术重复的平均值以提供测量值。

通过HPLC法对类胡萝卜素进行定量

使用配备有Waters XBridge C18柱(3.5mm，2.1×50mm)和Thermo Basic 8保护柱(2.1×10mm)的Alliance 2795HPLC(Waters)在25℃下解析(dissolve)化合物；使用真实的类胡萝卜素样品(番茄红素和β-胡萝卜素)作为标准品。流动相和流速如下所示(溶剂A＝乙酸乙酯；溶剂B＝水；溶剂C＝甲醇；溶剂D＝乙腈)。注射体积为10μL。检测器是Waters 2996光电二极管阵列检测器。针对胡萝卜素收集的波长为475nm。分子的保留时间为475nm，包括番茄红素(3.53分钟)、γ-胡萝卜素(3.62分钟)和β-胡萝卜素(3.8分钟)。

表3.HPLC流动相梯度条件

时间	流动	％A	％B	％C	％D	曲线
							0.01	0.5	0	20	0	80	6
3	1	20	0	0	80	6
							4.5	1	80	0	20	0	6
5	0.9	0	0	100	0	6
							6	0.9	0	0	100	0	6
6.5	0.9	0	20	0	80	6
							7	0.5	0	20	0	80	6
10	0.5	0	20	0	80	11

如图3所示，与接受天然GGS1基因的转化体相比，接受Mucor circinelloidescarG基因的Yarrowia lipolytica菌株的转化体产生显著更高水平的类胡萝卜素。

实施例4

CarG表达导致Saccharomyces cerevisiae中的GGPP增加

用含有遗传霉素(G418)抗性标记(kanMX)的2微米高拷贝质粒和用于表达编码三种不同GGPP合酶之一的DNA的TEF1启动子和CYC1终止子转化野生型Saccharomycescerevisiae菌株MY278。所述三种GGPP合酶基因是：Saccharomyces cerevisiae BTS1基因(在质粒pMB7382中)、酵母密码子优化的Yarrowia lipolytica GGS1基因(在质粒pMB7381中)和酵母密码子优化的Mucor circinelloides carG基因(在质粒pMB7380中)。将三种质粒转化到宿主Saccharomyces cerevisiae细胞中。分离单个菌落并检测GGPP。

具有不同GGPP合酶的宿主细胞在250rpm旋转振荡器中在30℃下利用在125ml带挡板烧瓶中的20ml培养液生长两天后，在含有5％葡萄糖的YP培养基测定GGPP水平。从摇瓶中取出体积为2ml的培养液并立即以13K rpm旋转10秒钟。倾析出培养液，并将1ml 78℃的60％乙醇/水混合物加入管内的沉淀中，然后涡旋并在加热水浴中在78℃下孵育15分钟。通过离心使样品澄清，并使用如实施例2中所述的反相LCMS检测GGPP。取至少两次技术重复的平均值以提供测量值。

如图4所示，相较于用Yarrowia GGS1基因或Saccharomyces BTS1基因转化的Saccharomyces cerevisiae菌株，用Mucor circinelloides carG基因转化的Saccharomyces cerevisiae菌株产生显著更高水平的GGPP。

实施例5

carG表达对β-胡萝卜素产生的影响

在该实施例中，将含有Mucor circinelloides的carG基因的质粒引入已被遗传工程改造以产生β-胡萝卜素的Y.lipolytica的宿主菌株中。分析新重组宿主细胞产生的β-胡萝卜素的相对滴度。

产生β-胡萝卜素的Yarrowia菌株ML7788是菌株ML5252的UV突变体。通过下述方法构建菌株ML5252：从菌株ML350和美国专利No.7,851,199中所述的ATCC201249(参见专利的表2)开始，引入受组成型启动子控制的异源基因，并结合几代杂交。GGS1基因、erg9敲低(“erg9-4789::ura3”)和截短的HMG基因(“HMG-tr”)分别来自对应于天然GGPP合酶、鲨烯合酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的Yarrowia序列。carRP和carB基因来自Mucorcircinelloides，其分别编码双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶。

将具有潮霉素选择的质粒pMB7311(其含有Mucor circinelloides carG基因并且由ALK1启动子驱动)线性化并转化到菌株ML7788中以生成菌株ML15710。为了展示在发酵罐条件下carG表达对β-胡萝卜素产生的影响，使用在小试规模发酵罐中进行的补料分批方法使菌株生长。最初批次相培养基含有92g/L玉米油作为主要碳源。在最初批次玉米油消耗后，观察到发酵罐溶氧水平迅速上升。此时，开始进料玉米油，并控制进料添加速率以将发酵罐溶氧水平维持在饱和的20％。在图5所示的时间点取出25μL等份的样品，并如上所述提取类胡萝卜素。

如下分析β-胡萝卜素水平：将适当体积的生物质加入预先填充有0.5mm玻璃珠的2mL 裂解管(韧性微生物裂解试剂盒#VK05)中。将经调节体积的提取溶剂(含有0.01％丁基羟基甲苯(BHT)的1:1v/v庚烷/乙酸乙酯)加入到裂解管中至1mL总液体体积。将裂解管在-80℃下冷冻10分钟，然后搅拌。搅拌在中进行，速度为6500rpm，持续15秒，进行3个循环。搅拌后，将混合物以最大速度旋转1分钟，然后转移至HPLC小瓶进行分析。在整个流程中，注意避免接触氧、光、热和酸。通过HPLC对类胡萝卜素进行定量与实施例3中相同。

如图5所示，引入Mucor circinelloides carG基因使β-胡萝卜素的产生水平提高了约100％(2倍)。

实施例6

carG表达对β-紫罗兰酮产生的影响

在该实施例中，将含有M.circinelloides的GGPP合酶carG基因的载体引入产生β-紫罗兰酮的Yarrowia lipolytica宿主菌株中，并分析重组宿主细胞所产生的β-紫罗兰酮的相对滴度。

通过下述方法由菌株ML5252(见实施例1和2)构建产生β-紫罗兰酮的Yarrowia菌株ML15449：使Yarrowia ALK1和ALK2基因缺失，随后引入3个拷贝的Yarrowia密码子优化的矮牵牛CCD1基因。矮牵牛CCD1基因由TEF1启动子驱动。由ML15449通过用线性化质粒pMB731转化来生成菌株ML15699，线性化质粒pMB731含有由ALK1启动子驱动的carG基因并具有潮霉素选择。使用在小试规模发酵罐中进行的补料分批法使菌株ML15449和ML15699生长。用于生产β-紫罗兰酮的发酵方法是二相方法，其中存在的有机第二相为总初始发酵批次体积的20％。初始批次相介质含有50g/L葡萄糖作为主要碳源。在初始批次葡萄糖消耗后，观察到发酵罐溶氧水平迅速上升。此时，开始进料玉米油，并控制进料添加速率以将发酵罐溶氧水平维持在饱和的20％。在图6所示的时间点取出25μL等份的样品，并如上所述提取类胡萝卜素和β-紫罗兰酮。

如下分析β-紫罗兰酮水平：将适当体积的生物质加入到如上所述的预先填充有珠子的裂解管中。将经调节体积的提取溶剂(含有0.01％丁基羟基甲苯(BHT)的1:1v/v庚烷/乙酸乙酯)加入到裂解管中至1mL总液体体积。将裂解管在-80℃下冷冻10分钟，然后搅拌。搅拌在中进行，速度为6500rpm，持续15秒，进行3个循环。搅拌后，将混合物以最大速度旋转1分钟，然后转移至HPLC小瓶进行分析。在整个流程中，注意避免接触氧、光、热和酸。

通过HPLC对紫罗兰酮进行定量与实施例3中相同，例外是：针对β-紫罗兰酮所收集的波长为296nm，保留时间为0.58min。

如图6所示，引入Mucor circinelloides carG基因使β-紫罗兰酮的产生水平提高了超过100％(超过2倍)。

实施例7

carG表达对冷杉醇产生的影响

由菌株ML7206生成产生冷杉醇的Yarrowia菌株ML13149。菌株ML7206来源于ML5252(表2)与缺乏carRP的MATB菌株之间的杂交所产生的孢子。用Ab-CAS基因(编码来自Abies balsamea的冷杉醇合酶)和Nt-CPS2基因(编码来自Nicotiana tabacum的II类二萜合酶)二者转化菌株ML7206。Ab-CAS和Nt-CPS2基因二者都针对在Yarrowia中表达进行了密码子优化。

用质粒pMB7322(含有来自Mucor circinelloides的carG基因)、质粒pMB6532(含有来自Yarrowia lipolytica的GGS1基因)或对照质粒pMB6200(缺乏编码GGPP合酶的基因)进一步转化菌株ML13149。

使转化体在24孔板(Multitron，30℃，800RPM)中在含有20％十二烷的YPD培养基中生长4天。从摇动板孔中移出十二烷级分，并通过HPLC在C18柱上利用光电二极管阵列检测器进行分析。HPLC装置由柱温为16℃的YMC PackPro C18RS柱[零件#RS08503-1456WT150x4.6mm S3μm]组成，流动相由400mL甲醇、100mL乙醇和0.1％三氟乙酸的混合物组成并使用1.0mL/min的等度流速。相对于利用标准品的标准曲线在237nm处对冷杉醇进行定量，并在3.0分钟时洗脱。

通过HPLC对冷杉醇进行定量与实施例3中相同，例外是：针对玫瑰红素(rosafluene)所收集的波长为395nm，保留时间为0.43min。

如图7所示，含carG的菌株中冷杉醇的产生相较于过表达Yarrowia GGS1基因的在其它方面相同的生物体中所产生的水平提高了4-5倍。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 萜类化合物的微生物生产

<130> 31177-WO-PCT

<140> TBD

<141> 2016-04-20

<150> 62/150,402

<151> 2015-04-21

<150> 62/150,549

<151> 2015-04-21

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> Mucor Circinelloides

<400> 1

atgctcaact cacacaacag aaccgaagaa agatcgaccg aagacatcat tttggagcct 60

tacacctact tgatatcaca gcctggcaaa gatatccggg caaagttaat ttcggcattc 120

gacctgtggc tgcatgtgcc caaggacgtg ctgtgcgtaa tcaacaagat tatcggcatg 180

ttgcataatg ctagtttaat gatcgacgat gtgcaggatg actctgatct tcgaagaggt 240

gtgcctgtcg ctcaccatat ttatggtgta cctcagacta tcaacactgc aaattatgtc 300

atcttcttgg cattgcaaga agtgatgaag ctgaacatcc ccagcatgat gcaagtgtgc 360

acggaagagc tgatcaatct gcatcgaggc cagggcatcg agctgtactg gagagacagc 420

ctgacttgcc ccaccgaaga agagtacatt gatatggtca acaacaaaac cagcggttta 480

ttacgattgg cggtgcgatt aatgcaagca gcaagtgaaa gtgacattga ttacacaccg 540

ctcgtcaaca ttataggcat ccatttccag gtgcgcgatg actacatgaa cttgcaatcc 600

accagctata caaacaacaa gggcttttgt gaggatctga cagagggcaa gttttcattt 660

cccatcattc atgccatcag aaaggaccct tccaaccgcc aactgctcaa catcatcagc 720

cagaagccca catccattga agtcaaaaag tatgcattgg aggtgattcg caaggcaggc 780

agttttgaat acgtgcgcga gtttctgcgt caaaaagagg ccgagtcttt gaaggaaatc 840

aagcgtttgg gtggtaatcc tttgctggaa aagtacattg agaccatcag agtagaggcc 900

accaacgac 909

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> Mucor Circinelloides

<400> 2

Met Leu Asn Ser His Asn Arg Thr Glu Glu Arg Ser Thr Glu Asp Ile

1 5 10 15

Ile Leu Glu Pro Tyr Thr Tyr Leu Ile Ser Gln Pro Gly Lys Asp Ile

20 25 30

Arg Ala Lys Leu Ile Ser Ala Phe Asp Leu Trp Leu His Val Pro Lys

35 40 45

Asp Val Leu Cys Val Ile Asn Lys Ile Ile Gly Met Leu His Asn Ala

50 55 60

Ser Leu Met Ile Asp Asp Val Gln Asp Asp Ser Asp Leu Arg Arg Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Ala His His Ile Tyr Gly Val Pro Gln Thr Ile Asn Thr

85 90 95

Ala Asn Tyr Val Ile Phe Leu Ala Leu Gln Glu Val Met Lys Leu Asn

100 105 110

Ile Pro Ser Met Met Gln Val Cys Thr Glu Glu Leu Ile Asn Leu His

115 120 125

Arg Gly Gln Gly Ile Glu Leu Tyr Trp Arg Asp Ser Leu Thr Cys Pro

130 135 140

Thr Glu Glu Glu Tyr Ile Asp Met Val Asn Asn Lys Thr Ser Gly Leu

145 150 155 160

Leu Arg Leu Ala Val Arg Leu Met Gln Ala Ala Ser Glu Ser Asp Ile

165 170 175

Asp Tyr Thr Pro Leu Val Asn Ile Ile Gly Ile His Phe Gln Val Arg

180 185 190

Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Thr Ser Tyr Thr Asn Asn Lys Gly

195 200 205

Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe Pro Ile Ile His

210 215 220

Ala Ile Arg Lys Asp Pro Ser Asn Arg Gln Leu Leu Asn Ile Ile Ser

225 230 235 240

Gln Lys Pro Thr Ser Ile Glu Val Lys Lys Tyr Ala Leu Glu Val Ile

245 250 255

Arg Lys Ala Gly Ser Phe Glu Tyr Val Arg Glu Phe Leu Arg Gln Lys

260 265 270

Glu Ala Glu Ser Leu Lys Glu Ile Lys Arg Leu Gly Gly Asn Pro Leu

275 280 285

Leu Glu Lys Tyr Ile Glu Thr Ile Arg Val Glu Ala Thr Asn Asp

290 295 300

<210> 3

<211> 909

<212> DNA

<213> Mucor Circinelloides

<400> 3

atgctcaact ctcacaaccg aaccgaggag cgatccaccg aggatattat tctcgagcct 60

tacacctacc tcatttctca gcccggaaag gacattcgag ctaagctcat ttctgccttt 120

gacctctggc tgcacgttcc taaggatgtt ctttgcgtca tcaacaagat tatcggtatg 180

ctgcacaacg cctctcttat gattgacgat gttcaggacg actctgatct ccgacgagga 240

gtccccgttg ctcaccacat ttacggtgtc cctcagacta ttaacaccgc taactacgtg 300

attttcctcg cccttcagga ggttatgaag ctgaacatcc cttctatgat gcaggtgtgt 360

accgaggagc ttattaacct ccaccgaggt cagggaattg agctgtactg gcgagattcc 420

ctcacttgtc ccactgagga ggagtacatt gatatggtta acaacaagac ctctggcctc 480

cttcgacttg ccgtccgact gatgcaggct gcttctgagt ccgacatcga ctacacccct 540

ctcgtcaaca ttatcggaat tcacttccag gttcgagatg actacatgaa cctccagtcc 600

acctcttaca ctaacaacaa gggcttttgc gaggacctga ccgagggaaa gttctccttc 660

cctattattc acgctattcg aaaggacccc tctaaccgac agctcctgaa cattatctct 720

cagaagccca cctccattga ggttaagaag tacgctcttg aggtgatccg aaaggctgga 780

tcttttgagt acgttcgaga gttccttcga cagaaggagg ctgagtccct gaaggagatc 840

aagcgacttg gcggcaaccc tctcctcgag aagtacattg agactattcg agtcgaggct 900

actaacgac 909

Claims (21)

1.一种产生至少一种萜类化合物的经遗传修饰的宿主微生物，其包含编码香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子选自：

(a)包含编码蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

(b)包含编码蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质具有在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，所述蛋白质具有GGPP合酶活性；和

(c)包含编码蛋白质的多核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性，所述蛋白质具有GGPP合酶活性。

2.权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物相较于不含所述多核苷酸分子的相同微生物具有提高的GGPP合酶活性。

3.权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物相较于不含所述多核苷酸分子的相同微生物产生增加量的萜类化合物。

4.权利要求3所述的经遗传修饰的微生物，其中所述萜类化合物衍生自GGPP。

5.权利要求4所述的经遗传修饰的微生物，其中所述萜类化合物选自：类胡萝卜素、紫罗兰酮、香紫苏醇和冷杉醇。

6.权利要求4所述的经遗传修饰的微生物，其还包含一种或更多种编码类异戊二烯生物合成多肽、类异戊二烯生物合成竞争多肽和/或类胡萝卜素生物合成多肽的重组核苷酸序列。

7.权利要求4所述的经遗传修饰的微生物，其还包含一种或更多种编码以下的重组核苷酸序列：

具有八氢番茄红素合酶活性的多肽；

具有八氢番茄红素脱氢酶活性的多肽，

具有番茄红素β-环化酶活性的多肽；

具有番茄红素ε-环化酶活性的多肽；和

具有类胡萝卜素切割双加氧酶活性的多肽。

8.权利要求4所述的经遗传修饰的微生物，其还包含一种或更多种编码以下的重组核苷酸序列：

具有I类二萜合酶活性的多肽；

具有I类二萜合酶活性的多肽；和

具有I/II类二萜合酶活性的多肽。

9.权利要求1-8中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是真菌。

10.权利要求9所述的经遗传修饰的微生物，其中所述真菌是酵母。

11.权利要求10所述的经遗传修饰的微生物，其中所述酵母是Yarrowia真菌。

12.权利要求11所述的经遗传修饰的微生物，其中所述Yarrowia真菌是Yarrowialipolytica。

13.权利要求10所述的经遗传修饰的微生物，其中所述酵母是Saccharomycescerevisiae。

14.权利要求4所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是细菌。

15.权利要求12所述的经遗传修饰的微生物，其中所述细菌是E.coli。

16.一种产生至少一种萜类化合物的方法，所述方法包括：在有效产生萜类化合物的条件下在宿主细胞中表达GGPP合酶基因，其中在所述宿主细胞中，所述GGPP合酶基因包含权利要求1所述的重组核酸分子，以及其中产生至少一种萜类化合物。

17.从权利要求1至15中任一项所述的经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物。

18.权利要求17所述的萜类化合物，其中所述萜类化合物选自：类胡萝卜素、紫罗兰酮、香紫苏醇和冷杉醇。

19.一种组合物，其包含从权利要求1至15中任一项所述的经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物。

20.一种食品或饲料，其包含从权利要求1至15中任一项所述的经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物。

21.一种香料或化妆品，其包含从权利要求1至15中任一项所述的经遗传修饰的微生物获得的萜类化合物。