FI92333C - -asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiä koodaava DNA-sekvenssi ja sen käyttö nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi - Google Patents

Description

92333 α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiå koodaava DNA-sekvenssi ja sen kåytto nopeutet-tuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen raken-tamiseksi 5

Keksinto koskee a-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivi-suutta (EC 4.1.1.5.) (myohemmin α-ALDC) omaavia hiiva-kantoja, menetelmåå niiden rakentamiseksi ja menetelmåsså kåytettåviå yhdistelma-DNA-vektoreita. Keksinto koskee 10 myos tållaisten hiivakantojen kSyttoa oluen valmistukses-sa panimoprosessin nopeuttamiseksi.

Kaytossa olevaa oluen valmistusprosessia voidaan lyhentaa joko nopeuttamalla paakaymista tai varastokaymista tai 15 siirtymalla jatkuvaan kaymiseen. Oluen flavorin (maun) kypsyttamiseksi tarvittava varastokayminen on oluen valmistuksen vaiheista ajaltaan pisin (2-3 viikkoa) ja runsaasti jaåhdytettya tilaa vieva, joten sen nopeut-tamisessa saavutettava hyoty on suurempi kuin muita 20 vaiheita nopeutettaessa. Nain olien flavorin kypsymista nopeuttavan panimohiivan avulla voitaisiin paastå huomat-taviin kustannussååstoihin oluen valmistuksessa.

Oluen paåkaymisen aikana hiiva muodostaa a-asetohydrok-25 sihappoja (tt--asetomaitohappo ja α-asetohydroksivoihappo) , jotka ovat varsinaisesti aminohappojen, valiinin ja isoleusiinin, biosynteesin vålituotteita. Tuotetuista hydroksihapoista suurin osa menee aminohappojen syntee-seihin, mutta osa erittyy hiivasolun ulkopuolelle kåyvåån 30 olueen. Oluessa ne muuttuvat spontaanisti vastaaviksi diketoneiksi, diasetyyliksi ja pentaanidioniksi. Nåiden diketonien ja niiden prekursoreiden (hydroksihappojen) yhteispitoisuutta oluessa kutsutaan totaali-VDKrksi (visinaaliset diketonit). Voimakkaan flavorinsa vuoksi 35 nåistå huomattavasti merkityksellisempia ovat a-asetomai-tohappo ja diasetyyli, jonka hiiva pelkiståå entsymaat-tisesti asetoiiniksi (kuva 1). α-Asetomaitohapon spon-taania dekarboksyloitumista diasetyyliksi pidetåån koko 2 92333 prosessia rajoittavana vaiheena varasto-olosuhteissa (Godtfredsen ja Ottesen, 1982).

Oluessa maun kypsymisen mitta on pååasiassa sen diase-5 tyylipitoisuus. Diasetyyli on varsinaisesti voin aromi-aine. Sen maku ja tuoksu aistitaan jo hyvin pieninå konsentraatioina ja koetaan erittåin vastenmielisiksi oluessa. Diasetyylin makukynnysarvo pohjahlivaoluissa on 0,05 mg/1. Asetoiinin makukynnys oluessa (50 mg/1) on 10 puolestaan huomattavasti korkeampi kuin diasetyylin makukynnys.

Tietyilla bakteeriryhmilla kuten enterobakteereilla (Aerobacter, Enterobacter) seka perinteisesti elintarvi-15 keteollisuudessa kaytettavillå Lactobacillus-, Bacillus-ja Streptococcus-suvun bakteereilla on tavattu a-ALDC-entsyymi (EC 4.1.1.5.), joka dekarboksyloi a-asetomaito-hapon suoraan asetoiiniksi. Vastaavaa entsyymia ei ole loydetty bakteereja korkeammista elioistå esim. hiivoista 20 tai homeista (Godtfredsen et al., 1983).

Laboratoriokokeissa on lisåtty α-ALDC-entsyymia paakay-neeseen olueen ja todettu, etta diasetyyli ja sen pre-kursori a-asetomaitohappo poistuvat oluesta alle vuoro-25 kaudessa, jolloin oluen kypsymiseen tarvittava aika vastaavasti lyhenee (Godtfredsen ja Ottesen, 1982). a-ALDC:n avulla kypsytetyn oluen laatu ei poikennut tavanomaisella tavalla kypsytetyn oluen laadusta.

30 Nopeutettu varastokåyminen voidaan saavuttaa paitsi lisaamalla a-ALDC-entsyymia puolivalmiiseen olueen, myos eristamallå sopivasta donoriorganismista kyseistå entsyymia koodaava geeni ja siirtamallå se hiivaan. Talloin saadaan panimohiiva, joka paakaymisen aikana tuottaa 35 a-ALDC-entsyymia, joka dekarboksyloi ylimååraisen a-ase-tomaitohapon suoraan asetoiiniksi. Nain valtytaan lisa-aineiksi katsottavien entsyymivalmisteiden lisååmiselta 3 92333 olueen, mika eråiden maiden elintarvikelainsåådannon mukaan on jopa kiellettya. Kaupalliset entsyymivalmisteet ovat lisaksi yleensa epaspesifisia entsyymiseoksia ja siten itse asiassa epSpuhtaita. Sen sijaan panimohii-5 valla, johon on geeniteknisilla menetelmillM siirretty ainoastaan haluttua entsyymia koodaava geeni, saadaan aikaan puhdas prosessi.

Tåsså keksinnosså kuvataan α-ALDC-geenin eristSminen 10 bakteerista, sen karakterisointi, siirto hiivaan, ilmen-tyminen hiivassa sekS sen vaikutus panimohiivan ominai-suuksiin ja panimoprosessiin seka oluen laatuun.

Vaikka jotkut enterobakteereista eristetyt geenit hiivaan 15 siirrettyina ilmentyvåtkin sellaisenaan, esim. betalakta-maasi, ei ilmentymistaso ole yleensa riittåva ilman sopi-via hiivageeneista eristettyja geenin saatelyalueita, joihin liitettyna siirrettavS geeni saadaan ilmentymaan tehokkaammin. Toisaalta aina ei vSlttSmStta haluta mah-20 dollisimman tehokasta ilmentymistå vaan entsyymin tuoton on oltava optimaalinen kyseisen prosessin kannalta. Taman keksinnon mukaisia vektoreita ja hiivakantoja kåyttamalla påaståån panimoprosessin kannalta optimaaliseen tulok-seen.

25

Liittamalla a-ALDC-geeni hiivageenin saatelyalueeseen (promoottori ja terminaattori), joka on aktiivinen kay-misen aikana, ja siirtamalla kyseinen saatelyalue-geeni--yhdistelma (ekspressiokasetti) panimohiivaan plasmidissa 30 tai liittamalla se hiivan kromosomiin saadaan aikaan hiiva, joka itse tuottaa påakaymisen aikana a-ALDC:ta. Entsyymi jaa hiivan sytoplasmaan ja dekarboksyloi a-ase-tomaitohappoa asetoiiniksi. Talloin varastokaymistå ei enaa tarvita diasetyylin poistamiseksi, ja ellei muu 35 flavorin muodostuminen vaadi lyhytta varastokaymista voidaan siirtya paakaymisesta suoraan stabilointivaihee-seen.

4 92333

Koska panimohiiva on elintarvikemikrobi, on tårkeåM, etta hiivakromosomiin siirretåan vain α-ALDC-geeni liitettyna hiivageenin sSåtelyalueisiin ilman ylimSårSisia baktee-rista peråisin olevia DNA-jaksoja. Tåmå saadaan aikaan 5 liittåmalla geeni hiivan kromosomiin esim. kotransfor-maatiolla. Kotransformaatiossa hiiva transformoidaan kahdella erillisella DNA-molekyylilla, joista toinen on varsinainen kromosomiin siirrettava α-ALDC-geenin sisål-tava ekspressiokasetti, ja toinen hiivassa itsenSisesti 10 monistuva plasmidimolekyyli, joka sisaltaa transformant-tien selektiossa tarvittavan merkkigeenin.

Tietty osa merkkigeenin perusteella selektoiduista hii-vaklooneista on saanut myos varsinaisen siirrettåvan 15 geenin sisaltavan ekspressiokasetin, joka on siirtynyt pysyvasti hiivakromosomin osaksi. Antamalla merkkigeenin sisaltavan plasmidin poistua hiivasolusta saadaan kanta, jossa on hiivalle vierasta DNA:ta vain α-ALDC-geenin rakenneosa.

20

Tamån keksinnon mukaisessa menetelmassa nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentami-seksi siirretaån α-ALDC-entsyymia koodaava geeni taman geenin sisaltåvasta bakteerista (Aerobacter aerogenes) 25 hiivaan kayttamallå yhdistelma-DNA-tekniikkaa.

Hiiva, johon geeni siirretaan, on Saccharomyces cerevisiae -lajin panimohiiva (ex. S. carlsbergensis, ex. S. uvarum) esim. kanta VTT-A-63015.

30

Donoribakteerin a-ALDC-geeni eristetaan bakteerin kromo-somaalisesta DNAcsta kåyttaen isåntanå esim. Escherichia coli -bakteeria ja geenin emasjarjestys maaritetaån.

35 α-ALDC-geeni siirretaan hiivaan liitettyna hiivageeneista eristettyihin saatelyalueisiin, jotka ohjaavat geenin ilmentymista hiivasolussa panimo-olosuhteissa. Sopivia 5 92333 sååtelyalueita ovat mm. hiivan fosfoglyserokinaasigeenin (PGK1) promoottori- ja terminaattorialueet (Mellor et al., 1983), vastaavat alueet hiivan alkoholidehydroge-naasi (ADC1)- ja iso-l-sytokromi c-geenistå (CYC1) 5 (Cantwell et al., 1986) tai enolaasigeenistå (EN01) (Innis et al., 1985).

Keksinnon kohteena ovat siten myos nain saadut α-ALDC-geenin sisSltavåt hiivavektorit.

10

Geeni siirretaan hiivaan autonomisesti replikoituvassa plasmidissa tai integroimalla se hiivan kromosomiin esim. kotransformaatiomenetelmållå kayttaen transformanttien selektioon jotain hiivan dominanssimerkkigeenia, esim.

15 hiivan pET13.1-plasmidissa sijaitsevaa hiivan metallo-thioniinigeenia (CUP1) (Henderson et al., 1985). Domi-nanssimerkkigeenina voidaan myos kåyttSå esim. geeneja, jotka aiheuttavat resistenttiyden esim. kloramfenikolia tai antibioottia G418 kohtaan (Knowles ja Tubb, 1987).

20 Transformanttien selektion jålkeen selektioplasroidin annetaan tarpeettomana poistua integranttikannasta, jolloin hiivasoluun jaa vain kromosomin osaksi tullut a-ALDC-geeni (Penttila et al., 1987). Vastaavanlainen, vierasta DNA:ta vain a-AL£>C-geenin verran sisaltava 25 hiivakanta voidaan saada aikaan myos esim. integroimalla transformaatioon tarvittava merkkigeeni ensin hiivakro-mosomiin ja antamalla sen myohemmin poistua solusta in vivo -rekombinaatiolla (Yocum, 1986).

30 Keksinnon kohteena ovat edelleen tallaiset hiivakannat, jotka kykenevMt kaymisen aikana tuottamaan a-ALDC-ent-syymia.

Hiivakromosomissa a-ALDC-geeni ilmentyy tuottaen aktii- 35 vista entsyymia, joka muuttaa ylimaaraisen a-asetomaito-hapon paåkaymisen aikana suoraan asetoiiniksi, jolloin varastokSymista ei tarvita diasetyylin poistamiseksi.

6 92333

Geenin ilmentyminen ja aktiivisuus hiivasolussa todetaan mittaamalla α-ALDC-aktiivisuus geenin sisaltavan hiivan soluekstraktista. GLC-kromatografialla todetaan lisatysta α-asetomaitohaposta syntyvan suoraan pelkastaan asetoii-5 nia.

Uuden yhdistelma-DNA-hiivan panimo-ominaisuudet ja vai-kutus panimoprosessiin testataan VTT:n koepanimossa (a 50 1). PååkåymisestS seurataan hiivan kasvua ja flokkuloitu-10 mista, uutepitoisuuden pienenemista ja visinaalisten diketonien (VDK) muodostumista. Paakaymisen lopusta maaritetaån edellisten lisaksi alkoholipitoisuus, tar-keimmat aromiaineet, hiivasaanto ja kaymisaste. Suorite-taan lyhyt varastokayminen tai siirrytaan suoraan stabi-15 lointivaiheeseen, olut suodatetaan, pullotetaan, pasto-roidaan ja analysoidaan valmiina oluena, jolloin koulu-tettu makupaneeli arvostelee myos oluiden maun.

Seuraavassa esitetaan esimerkkina keksinnon mukaisista 20 edullisista suoritusmuodoista yksityiskohtaisesti α-ALDC-geenin eristaminen eraåsta Aerobacter aerogenes-bakteerista, geenin karakterisoiminen, cr-ALDC-geenin sisaltåvien hiivaekspressiovektoreiden rakentaminen ja geenin siirtaminen niiden avulla panimohiivaan seka 25 autonomisesti monistuvissa plasmideissa ettå hiivakromo-somiin integroimalla. On huomattava, etta geeni voidaan eristaå samoilla menetelmilla myos muista bakteereista, joilla tåmå geeni esiintyy, ja geeni voidaan siirtaa myos muihin Saccharomyces cerevisiae -lajin hiivoihin 30 poikkeamatta tåmån keksinnon piiristå.

7 92333

Lvhvt selitvs kuvista

Kuvassa 1 esitetåån a-asetomaitohapon reaktiot diasetyy-liksi ja asetoiiniksi.

5

Kuvassa 2 esitetaan A. aerogeneksen VTT-E-74023 ja jS-kosmidikloonin α-ALDC-aktiivisuus.

Kuvassa 3 esitetaan A. aerogeneksen α-ALDC-geenin emås-10 jårjestys ja sen måårittåmån entsyymin aminohappojårjestys.

Kuvassa 4 esitetåån A. aerogeneksen α-ALDC-geenin delee-tiomutageneesi ja aloituskodonin muuttaminen hiivaan 15 siirtåmistå vårten.

Kuvassa 5 esitetåån A. aerogeneksen α-ALDC-geenin sisål-tåvån hiivaplasmidivektorin pKB002 rakentaminen.

20 Kuvassa 6 esitetåån A. aerogeneksen α-ALDC-geenin sisål-tåvån hiivaplasmidivektorin pKB003 rakentaminen.

Kuvassa 7 esitetåån ADC1/a-ALDC-ekspressiokasetin rakentaminen A. aerogeneksen α-ALDC-geenin hiivakromosomiin 25 liittåmistå vårten.

• i

Kuvassa 8 esitetåån α-ALDC-geenin sisåltåvån PGK1/a-ALDC-ja ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetin siirtåminen hiivakromosomiin kotransformaatiolla.

30

Kuvassa 9 esitetåån vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdis-telmå-DNA-kantojen VTT-A-87083 ja VTT-A-87084 panimo-omi-naisuudet pååkåymisen aikana.

35 Kuvassa 10 esitetåån vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdis-telmå-DNA-kantojen VTT-A-87083 ja VTT-A-87084 VDK-yhdis-teiden muodostuminen pååkåymisen aikana.

8 92333

Kuvassa 11 esitetåån vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdistelmå-DNA-kannan VTT-A-87076 panimo-ominaisuudet pååkåymisen aikana.

5 Kuvassa 12 esitetåan vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdistelmå-DNA-kannan VTT-A-87076 VDK-yhdisteiden muo-dostuminen pååkåymisen aikana.

Kuvassa 13 esitetåan pååkåyneiden oluiden analyysit ja 10 valmiin oluen makuarvostelu.

Kavtetvt bakteeri- ia hiivakannat sekå kloonausvektorit α-ALDC-geeni eristettiin bakteerista Aerobacter aerogenes 15 VTT-E-7 4023.

A. aerogeneksesta rakennettiin kosmidipankki, jonka teossa kåytettiin kosmidivektoria p3030 (Penttilå et al., 1984) ja isåntånå bakteeria Escherichia coli HB101 (So et 20 al., 1978).

Geenin subkloonauksissa ja dideoksisekvensoinnissa kåytettiin plasmidia Bluescribe M13+ (Vector cloning systems, Kalifornia, USA), plasmidia pUC19 (Boehringer 25 Mannheim, Saksa), sekå isåntånå bakteeria E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) ja E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, USA).

Panimohiivatransformaatioissa kåytettiin isåntånå pani-30 mopohjahiivaa Saccharomyces cerevisiae VTT-A-63015 ja selektioplasmidia pET13:l (Henderson et al., 1985).

α-ALDC-geenit liitettiin hiivaekspressiovektoreihin pAAH5 (Ammerer, 1983) ja pMA91 (Mellor et al., 1983).

35 li 9 92333

Kavtetvt entswmit

Restriktioendonukleaasientsyymit toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Entsyymidigestiot suoritettiin valmis-5 tajien ohjeiden mukaisesti. T4-ligaasin toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Calf intestinal -fosfataasin ja E. coli-DNA-polymeraasi I:n Klenow-osan toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Lysotsyymientsyymin toimitti Sigma, St. Louis, USA. Zymolyaasi 60000 -entsyymin toi-10 mitti Seigaku Kogyo, Tokio, Japani. Eksonukleaasi III- ja Sl-entsyymin toimittivat Boehringer Mannheim, Saksa ja Bethesda Research Laboratories, USA.

Kavtetvt kasvatusalustat ia aubstraatit 15 E. coli -bakteerit kasvatettiin LB-alustalla. Transformantit selektoitiin L-maljoilla, joissa selektiotekijanå kaytettiin ampisilliinia 100 μg/ml. α-ALDC-geenin sisål-tavat kloonit seulottiin Voges-Proskauer (VP)-maljoilla.

20 LB-alusta: 10 g Difcon Bacto tryptonia, 5 g Difcon hii-vauutetta ja 10 g NaCl taytettiin 1 l:ksi tislatulla deionisoidulla vedella. L-maljoilla oli LB-alusta sisal-taen 2 % agaria.

25 *; VP-maljoilla oli kaupallinen MAST ID33-alusta, jonka toimitti Mast Laboratories Ltd., Merseyside,

Iso-Britannia. α-ALDC-aktiivisuusmaårityksia vårten bakteerikloonit kasvatettiin samalla VP-alustalla neste-30 viljelminå.

' Entsyymiaktiivisuusmaarityksissa substraattina kåytetyn α-asetomaitohapon diesterin (etyyliesteriasetaatti) toimitti Oxford Organic Chemicals Ltd, Brackly 35 Northamptonshire, Iso-Britannia.

Hiivatransformaatiota vårten hiivasolut kasvatettiin 10 92333 YPD-liuoksessa. Transformanttien seulonnassa kåytettiin pohja-agarina NEPRA-alustaa (Henderson et al., 1985), johon oli selektiotekijåksi lisatty 0,4 mM tai 0,6 mM CuS04:aa. Transformantit poimittiin NEP-alustoille (NEPRA 5 ilman sorbitolia), joihin oli lisatty 0,6 mM CuS04:aa. α-ALDC-aktiivisuuden måårittåmiseksi transformantit kasvatettiin YPD-liuoksessa, johon plasmidikannoille oli lisatty 0,6 mM CuS04:aa. Panimokokeita vårten hiivasolut kasvatettiin vierresokeriliuoksessa, johon plasmidikan-10 noille oli lisatty 0,6 mM CuS04:aa.

YPD-liuos: 10 g Difcon hiivauutetta, 20 g Difcon Bacto peptonia ja 20 g glukoosia taytettiin 1 l:ksi deionisoi-dulla vedellå.

15 NEPRA-alusta: 0,2 % MgS04-7H20, 0,2 % (NH4)2S04, 0,3 % KH2P04, 0,025 % CaCl2*2H20, 0,2 % Difcon hiivauutetta, 0,3 % Difcon Bacto peptonia, 4 % glukoosia, 1,2 M sorbitolia, 3 % agaria (Oxoid Purified Agar), autoklavoitiin 121°C/15 20 min ja jaahtyneeseen alustaan (50°C) lisattiin tarvittava maara erikseen steriloitua CuS04-liuosta (Henderson et al., 1985).

Vierresokeriliuos: 1 osa kasiteltya III-vierretta ja 1 25 osa 10 % sakkaroosiliuosta sekS 1 g/1 Difcon hiivauutetta .

Kavtetvt menetelmat: 30 Molekwlibiolooiset menetelmat. ellei toisin ole mainit-tu, suoritettiin kuten Maniatis et al., 1982 ovat kuvan-neet.

VP-malioien testaus suoritettiin seuraavasti: 1,8 g 35 agaroosia (Indubiose A37) ja 60 ml lamminta vetta kuu- mennettiin kunnes agaroosi suli, jaahdytettiin +60°C:seen ja lisattiin 12 ml 5 %:ista a-naftolia 2,5 N NaOHissa.

11 92333

Tata seosta pipetoitiin maljoille niin, etta pesakkeet peittyivat ja seurattiin punaisen vSrin kehittymista yhden tunnin ajan.

5 VP-reaktio suoritettiin bakteerikloonien kasvuliuoksista pipetoimalla 1 ml kasvuliuosta, 300 μΐ samana paivana valmistettua 5 %:ista α-naftolia abs. etanolissa ja 100 μΐ 40 %:ista K0H:ta. Ravisteltiin hyvin ja seurattiin reaktion kehittymista puolen tunnin ajan.

10 g-ALDC-aktiivisuusmaaritvsta (EP-hakemus 0128714) vårten bakteerikloonit kasvatettiin 10 ml:ssa VP-liuosta ilman ravistelua yli yon. Solut erotettiin kasvuliuoksesta sentrifugoimalla huoneenlammossa 4000 rpm 10 min ja 15 pestiin kerran deionisoidulla vedella. Solut resuspen-doitiin 5 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria pH 7,0 (A540 « 0,400) ja lisattiin 5 mg (E. coli) tai 10 mg (A. aerogenes) lysotsyymientsyymia, inkuboitiin 30 min 37°C:ssa, mikroskopoitiin ja sonikoitiin tarvittaessa 20 kunnes solut olivat rikki (10 x 15 s). Solujaanteet sentrifugoitiin pois ja supernatanttiin tai sen laimen-nukseen (å 5 ml) pipetoitiin 400 μΐ juuri valmistettua α-asetomaitohapon diesterin hydrolysaattia, inkuboitiin tarpeen mukaan 15, 30, 45 tai 60 min 30°C:ssa, reaktio 25 pysaytettiin lisaamallå 200 μΐ 1 N NaOH:ta ja nayte ' laitettiin jaihin. Muodostunut asetoiini maaritettiin VP-reaktiolla: 1,2 ml:n naytteeseen pipetoitiin 500 μΐ 0,3 % kreatiiniliuosta, 600 μΐ samana paivana valmistettua 5 % a-naftolia abs. etanolissa ja 300 μΐ 40 % KOH:ta. 30 Varin muodostumista seurattiin mittaamalla absorbanssi MCC540 (Multiskan spektrofotometri). Varin muodostuminen asetoiinista oli maksimissaan 20 min kuluttua. Varin muodostus diasetyylista, joka myos reagoi VP-testissa, oli maksimissaan 2 min kuluttua. Muodostuneen asetoiinin 35 maara luettiin tarvittaessa standardisuoralta. a-Aseto-maitohapon konversio suoraan asetoiiniksi todettiin myos GLC-kromatografialla (kaasukromatografia) (Pajunen et 12 92333 al., 1987).

α-Asetomaitohapon diesterin hvdrolvsaatti valmistettiin seuraavasti: Pipetoitiin 30 μΐ diesteriå, 240 μΐ deioni-5 soitua vettå ja 330 μΐ 1 N NaOH:ta, sekoitettiin ja pidettiin jaisså 15 min, minkli jalkeen lisattiin 5,4 ml deionisoitua vetta (EP-hakemus 0128714).

Geenin siirto panimohiivaan tehtiin protoplastimenetel-10 målla (Henderson et al., 1985, Penttilå et al., 1987). Hiivasolut kasvatettiin eksponentiaaliseen kasvuvaihee-seen YPD-liuoksessa (100 ml), ne pestiin kerran vedella ja kerran 1,2 M sorbitolilla ja resuspendoitiin 8 ml:aan STC-puskuria (1,2 M sorbitoli, 10 mM Tris HC1, 10 mM 15 CaCl2, pH 7,6), lisåttiin zymolyaasia (150 μg) ja inku-boitiin 20-40 min +30°C:ssa. Protoplastoitumista seurat-tiin mittaamalla absorbanssi (Klett 66) deionisoituun veteen ja sorbitoliin (1,2 M) laimennetuista (100 μΐ 5 mlraan) naytteista. Sopivasti protoplastoituneet solut 20 (veteen laimennetun naytteen absorbanssi 20-40 % sorbitoliin laimennetun naytteen absorbanssista) pestiin kolme kertaa 1,2 M sorbitolilla ja kerran STC-puskurilla ja resuspendoitiin 600 μΐ-.aan STC-puskuria. 200 μΙΐΆζη protoplastisuspensiota lisattiin DNA:ta 3-10 μq korkein-25 taan 20 μ1:η tilavuudessa. Inkuboitiin huoneenlammossa 10 min, lisattiin 2 ml TpD-puskuria (20 % PEG 6000, 10 mM Tris HC1, 10 mM CaCl2, pH 7,6) ja inkuboitiin edelleen 30 min huoneenlammossa. Protoplastit sentrifugoitiin poyta-sentrifuugilla (3000 rpm, 5 min) ja resuspendoitiin 200 30 μ1:3ίΆη TpD-puskuria ja maljattiin (å 5 μΐ) heti top-aga-rissa (å 5 ml) (NEPRA-alusta ilman kuparilisaystå) 0,4 ja/tai 0,6 mM kuparisulfaattia sisaltaville NEPRA-mal-joille (å 20 ml). Vain transformoituneet ja kupariresis-tenssigeenin (CUP1) saaneet hiivasolut kykenivåt kas-35 vamaan tallå selektioalustalla muodostaen suuria pesåk-keitå noin viikossa.

13 92333

Hiivatransformanttien α-ALDC-aktiivisuusmaaritvsta vårten hiivasolut kasvatettiin YPD-liuoksessa å 5 ml ilman ravistelua 30°C:ssa 17-20 h. Kasvuliuos sentrifugoitiin pois huoneenlammosså 3000 rpm 10 min, solut pestiin 5 kerran deionisoidulla vedella å 5 ml, pestyt solut sus-pendoitiin 1 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria pH 7,0. Suspensioon lisattiin 10 μΐ zymolyaasiliuosta (5 mg/ml), sekoitettiin, inkuboitiin 30 min 37°C:ssa ja sekoitettiin voimakkaasti, jolloin muodostuneet protoplastit rikkou-10 tuivat. NSin saatuun soluekstraktiin lisattiin 80 μΐ juuri valmistettua α-asetomaitohapon diesterin hydro-lysaattia, inkuboitiin 60 min 30°C:ssa, minka jalkeen tehtiin VP-koe: Pipetoitiin 500 μΐ 0,3 % kreatiiniliuos-ta, 600 μΐ samana paivMna valmistettua 5 % a-naftolia 15 abs. etanolissa ja 300 μΐ 40 % K0H:ta. Sekoitettiin ja seurattiin punaisen varin muodostumista 20-60 min.

Muodostuneen vårin voimakkuus mitattiin tarvittaessa Multiskan spektrofotometrillå aallonpituudella 540 nm, 20 jolloin solujaanteet sentrifugoitiin pois liuoksesta ennen mittausta.

Hiivan kokonais-DNA:n eristaminen suoritettiin seuraa-vasti: Hiivapesåke siirrostettiin 5 ml:aan YPD-liuosta ja 25 kasvatettiin stationaarivaiheeseen (16-20 h) 30°C:ssa 1 ravistellen. Solut sentrifugoitiin 5 min 5000 rpm poyta- sentrifuugissa ja resuspendoitiin 380 μ1ΐΆ&τ\ sorbitoli-liuosta (1,2 M sorbitoli - 0,1 M EDTA, pH 7,5). Lisattiin 7 μΐ zymolyaasiliuosta (5 mg/ml) ja inkuboitiin 30°C:ssa 30 30 min. Seos sentrifugoitiin 5 min 35000 rpm ja pelletti

resuspendoitiin 690 nl:aan SDS-liuosta (50 mM Tris, pH

7,5 - 1 mM EDTA - 0,1 % SDS), sekoitettiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin Eppendorf-sentrifuugissa 2 min. Super-natanttiin lisattiin 4 μΐ RNAse A:ta (5 mg/ml) (Sigma) ja 35 inkuboitiin 37°C:ssa 30 min. Liuos ekstrahoitiin kerran fenolilla ja kerran kloroformi-isoamyylialkoholilla (24:1). DNA saostettiin etanolilla ja resuspendoitiin 50 14 92333 μΙΐΆείη puskuria (50 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA) .

"Dot blot” -hvbridisaatio tehtiin seuraavasti: 10 μΐ edella esitetyllå tavalla eristettya hiivan kokonais-5 DNA:ta (tai våhemman, mikåli geeni oli plasmidivektoris-sa) keitettiin 0,3 M NaOH-liuoksessa 10 min ja jåahdy-tettiin jaisså. Liuos tehtiin 0,1 M:ksi Tris-HCl:n suh-teen (pH 7,5) ja 1 M:ksi NH4Ac:n suhteen ja imettiin vesi-imun avulla "dot blot" -laitteella 1 M NH4Ac:ssa 10 kostutetulle nitroselluloosafiltterille (Schleicher &

Schull, BA 85) hybridisaatiota ja autoradiografiaa vårten.

Panimokokeissa kavtetvt vleiset menetelmat on esitetty 15 Analytica-EBC:ssS, 1987. Oluen VDK-yhdisteiden ja aromi-aineiden maåritykset GLC-kromatografialla suoritettiin kuten Pajunen et al., 1987 ovat kuvanneet.

Esimerkki l. Aerobacter aeroaenes -bakteerin 20 a-AEPC-geenin eristaminen ia karakteri- soiminen

Bakteerista Aerobacter aerogenes VTT-E-74023 eristettiin kromosomaalinen DNA fenoliuuttomenetelmålla (Amundsen ja 25 Neville, 1979).

Kosmidipankin tekemista vårten DNA pilkottiin Sau3A-restriktioentsyymilla osittaisesti siten, etta saatiin 30-40 kb:n pituisia DNA-kappaleita, jotka liitettiin 30 BamHI-entsyymillå avattuun p3030-kosmidiin. Saadut hybri-dimolekyylit pakattiin in vitro lambda-faagipartikkelei-hin (Hohn ja Murray, 1977), joilla infektoitiin E. coli HB101. Transformantit selektoitiin ampisilliinia sisal-tavilla L-maljoilla.

Nain saadusta geenipankista etsittiin a-ALDC-geenin sisaltavat kloonit replikoimalla kosmidipankkimaljat 35

II

15 92333 VP-maljoille, jotka testattiin kuten edella on esitetty. Positiiviset pesakkeet poixnittiin alkuperåisiltå mal-joilta. /S-kosmidikloonin α-ALDC-aktiivisuus varmistettiin tekemållå entsyymiaktiivisuusmååritys soluekstraktista 5 kayttaen α-asetomaitohappoa substraattina (kuva 2).

GLC-kromatografialla todettiin lisåtystå ct-asetomaitoha-posta syntyvån suoraan asetoiinia. Diasetyyliå sen sijaan ei todettu muodostuneen koeolosuhteissa.

10 α-ALDC-aktiivisuutta ilmentåvåstå Ø-kloonista eristettiin kosmidi-DNA, josta tehtiin osittainen Sau3A-restriktio-entsyymidigestio. Saadut 2-5 kb:n mittaiset DNA-kappaleet liitettiin BamHI-entsyymillå avattuun ja alkalisella fosfataasilla kåsiteltyyn Bluescribe M13+-vektoriin.

15

Nain saatu VP-positiivinen, plasmidin pB5 sisåltava klooni eristettiin kuten alkuperåista kosmidikloonia seulottaessa. Plasmidin pB5 sisaltavasta A. aerogenes-DNArsta tehtiin kaksi deleetiosarjaa alkaen insertin 20 molenunista paistS (Henikoff, 1984). Deleetiosarjojen tekoa vårten plasmidi pB5 katkaistiin entsyymeilla SstI ja Asp718 sekS entsyymeilla Sphl ja BamHI. Deleetio-kloonien A. aerogenes-DNA:n emasjSrjestys måaritettiin dideoksimenetelmalla (Sanger et al., 1977) plasmideista 25 sekvensoimalla (Zagursky et al., 1986). Deleetiokloonien α-ALDC-aktiivisuus testattiin VP-testillS. Eras lyhyen A. aerogenes-DNA-alueen sisåltava, positiivisen VP-reaktion aiheuttava plasmidi oli deleetioklooni pMNB58. Tåmån plasmidin sisåltåmån A. aerogenes-DNA:n emåsjårjestys ja 30 sen koodaaman entsyymin aminohappojarjestys on esitetty kuvassa 3.

Plasmidin pMNB58 sisåltåmå A. aerogenes-DNA måårittåå 259 aminohapon pituista proteiinia (kuva 3). Hiivassa ilmen-35 tåmistå vårten ylimaarainen geeniå edeltavå DNA-alue (nukleotidit 50-235, kuva 3) poistettiin deleetiomutage-neesilla (Eghtedarzadeh ja Henikoff, 1986) kåyttåmållå 16 92333 oligonukleotidia "aid-loop" (kuva 4). Samalla muutettiin geenin aloituskodoni GTG (nukleotidit 235-237, kuva 3) hiivalle soveltuvaksi ATG:ksi ja aloituskodonia edeltava -3-kohdassa oleva nukleotidi G A:ksi hiivaekspression 5 tehostamiseksi. Mutagenisoimattomien DNA-molekyylien maaråM rajoitettiin pilkkomalla menetelmMsså syntetisoi-dut molekyylit Asp718-entsyymillå ennen E. coliin trans-formoimista (kuva 4) . Julkaistusta menetelmMsta (Eghteda-rzadeh ja Henikoff, 1986) poiketen Sl-entsyymia ei kay-10 tetty. E. coli -transformanteista etsittiin oikeanlaisen, deletoituneen plasmidin sisaltavat kloonit restriktioent-syymidigestioilla, ja mutageneesin onnistuminen varmis-tettiin sekvensoimalla ko. alue restriktiokartoituksen perusteella oikeanlaiselta nayttaneesta plasmidista 15 pKBlOl (kuva 4).

Esimerkki 2. Aerobacter aeroaeneksen a-ALPC-geenin sisaltavien hiivaplasmidien rakentaminen 20 Plasmidi pKBlOl (kuva 4) pilkottiin restriktioentsyy-meilla EcoRI ja Hindlll, ja 0,95 kb:n pituinen a-ALDC-geenin sisaltava fragmentti eristettiin LGT-agaroosi -geelista. Nain saatujen DNA-molekyylien paåt taytettiin tylpiksi Klenow-entsyymilla. DNA-molekyylit liitettiin 25 hiivan fosfoglyserokinaasigeenin (PGK1) promoottori- ja terminaattorialueiden valiin plasmidiin pMA91, joka oli pilkottu entsyymilla Bglll, tehty tylppapåiseksi Klenow-entsyymilla ja fosfataasikasitelty. Nain valmistetussa plasmidissa pKB007 (kuva 5) cr-ALDC-geeni on oikeassa 30 orientaatiossa PGK-promoottoriin nåhden. Noin 2,7 kb:ta pitka PGK/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin plasmidista pKB007 pilkkomalla Hindlll-entsyymilla ja erista-malla ko. DNA-pala LGT-agaroosigeelista. Fragmentti ligoitiin HindiII-entsyymilla pilkottuun, fosfataasi-35 kasiteltyyn plasmidiin pET13:l, jolloin muodostui plasmidi pKB002 (kuva 5).

92553 17 a-ALDC geenin ilmentåmiseksi hiivassa AZ?C1-promoottorin alaisena, rakennettiin ensin plasmidi pKB006 (kuva 6). Plasmidi pETl3:l pilkottiin Hindlll-entsyymillå, DNA-paat taytettiin kåyttåmållå Klenow-entsyymiå, fosfataasikasi-5 teltiin ja ligoitiin plasmidista pAAH5 BamHI-entsyymilla irrotetun 1,95 kb: tå pitkan Klenow-entsyymillå tylppapai-seksi tehdyn fragmentin kanssa, joka sisålsi hiivan ADC1 -geenin promoottorin ja terininaattorin. Tåhån plas-midiin pKB006 liitettiin Hindlll-kohtaan (pååt tåytetty 10 ja fosfataasikasitelty) ylla kuvattu EcoRI- ja Hindlll-entsyyxneilla plasmidista pKBlOl eristetty a-ALDC-geenin sisåltåva DNA-fragmentti. Nåin saadussa plasmidissa pKB003 α-ALPC-geeni on oikeassa orientaatiossa ADCl-pro-moottoriin nahden (kuva 6).

15

Esimerkki 3. DNA-konstruktioiden valmistaminen

Aerobacter aerooeneksen g-AU>C-qeenin liittamiseksi panimohiivan kromosomiin 20 Plasmidissa pKB007 (kuva 5) A. aerogeneksen a-ALDC-geeni on liitettynå hiivan PGK1-geenin promoottorin ja termi-naattorin valiin. Tama PGJCl/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin plasmidista pKB007 noin 2,7 kb:n fragment-tina, joka eristettiin LGT-agaroosigeelista. Fragmentin 25 pååt taytettiin Klenow-entsyymillå ja fragmenttia kåy-• tettiin panimohiivan kotransformaatioon (esimerkki 5).

Vastaavanlaisen ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetin valmista-miseksi hiivatransformaatiota vårten kasetti rakennettiin 30 ensin Bluescribe M13+-plasmidiin (kuva 7). Bluescribe M13+-plasmidista poistettiin Hindlll-kohta tåyttåmållå Hindlll-pååt Klenow-entsyymin avulla ja ligoimalla pååt yhteen. ADC1-promoottori ja -terminaattori eristettiin pAAH5-vektorista 1,95 kb:n pituisena BamHI-fragmenttina 35 ja ligoitiin BamHI-entsyymillå katkaistuun Bluescribe M13+ -vektoriin, josta Hindlll-kohta oli poistettu. Nåin saatu plasmidi pKB102 katkaistiin Hindlll-entsyymillå, 18 92333 pååt tåytettiin Klenow-entsyymillå, fosfataasikåsiteltiin ja ligoitiin a-ALDC-geenin sisåltåvån tylppåpåiseksi tehdyn DNA-fragmentin kanssa, joka oli eristetty plas-midista pKBlOl EcoRI-Hindlll-fragmenttina. Tasta plas-5 midis ta pKB103 (kuva 7) ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin BamHI-digestiolla, fragmentin pååt tåytettiin Klenow-entsyymillå ja fragmenttia transformoitiin panimo-hiivaan kotransformaatiolla (esimerkki 5).

10 Esimerkki 4. ct-ALDC-entswmiå tuottavien plasmidilla transformoituien panimohiivakantoien rakentaminen

Plasmidi pKB002, jossa A. aerogenes -bakteerin a-ALDC-15 geeni on liitetty hiivan PGJCl-promoottoriin (kuva 5) , ja plasmidi pKB003, jossa geeni on liitetty hiivan APCl-pro-moottoriin (kuva 6), transformoitiin panimohiivaan VTT-A-63015 protoplastimenetelmalla (ks. menetelmat).

20 Transformantit selektoitiin kuparia sisSltSvillå NEPRA- maljoilla (0,4 mM tai 0,6 mM CuS04:aH pohja-agarissa) vektoreissa olevan hiivan CUPl-geenin toiminnan perus-teella. Saatuja transformantteja kasvatettiin 0,6 mM CuS04:aa sisaltSvilla NEP-maljoilla (NEPRA ilman sorbito-25 lia). Geenin ilmentyminen panimohiivasolussa todettiin ' mittaamalla α-ALDC-aktiivisuus geenin sisaltavan panimo- hiivan soluekstraktista edella esitetylla tavalla.

Nain saatiin α-ALDC-entsyymia tuottavat, plasmidilla 30 pKB002 (PGK1-saatelyalueet) transformoidut panimohiiva-kannat VTT-A-87083 ja VTT-A-87084, seka plasmidilla « pKB003 (ADC1-saatelyalueet) transformoitu panimohiiva-kanta VTT-A-87076.

Il 9 2333 19

Esimerkki 5. α-ALDC-entswmia tuottavien panimohii- voien rakentamlnen inteqroimalla a-AT.nc-creeni hiivan kromosomiin 5 Jotta lopullinen α-ALDC-entsyymiå tuottava panimohiiva olisi mahdollisimman samankaltainen kuin låhtokanta ja sisaltaisi mahdollisimman vShan vierasta DNA:ta, hiivaan siirrettiin vain ot-ALDC-geeni hiivan PGK1- ja ADC1-gee-nien saatelyalueisiin liitettyna. Hiivan oma kromosomaa-10 linen PGK1- tai ADCl-geeni korvautuu kåytetyn menetelman seurauksena a-ALDC-geenilla homologisen rekombinaation tuloksena.

Hiivakannat rakennettiin kotransformaatiomenetelmålla 15 (kuva 8). 5 Mg:aa plasmidista pKB007 eristettyå PGJQ/a-ALPC-ekspressiokasettia (esimerkki 3) tai plasmi-dista pKB103 eristettyå ADCl/a-ALDC-ekspressiokasettia (esimerkki 3), jotka sisaltåvat A. aerogeneksen a-ALDC-geenin, transformoitiin yhdessa 5 /ig:n kanssa plasmidia 20 pET13:l protoplastimenetelmållå (Penttila et al., 1987) panimohiivaan VTT-A-63015. Transformantit selektoitiin kuparia sisaltavillå alustoilla kuten esimerkissa 4. Saaduista transformanteista eristettiin kokonais-DNA (ks. menetelmat) ja α-ALDC-geenin sisaltavat transformantit 25 seulottiin "dot blot” -hybridisaatiolla (ks. menetelmat). A. aerogenes -geenia vårten kåytettiin koettimena plasmidista pKBlOl (kuva 4) eristettyå 0,95 kb:n pituista EcoRI-Hindlll-fragmenttia. Fragmentti leimattiin radioak-tiiviseksi kayttamalla a-32P-dCTP:ta (Amersham, Englanti) 30 ja "random primer labeling -kittia" (Boehringer Mannheim, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Transformanttien tuottama α-ALDC-aktiivisuus testattiin soluekstrakteista α-asetomaitohappo substraattina (ks.

35 menetelmat).

α-ALDC-geenin saaneista, α-ALDC-aktiivisuutta tuottavista 20 92333 hiivaklooneista poistettiin selektioplasmidi pET13:1 kas-vattamalla hiivasoluja YPD-liuoksessa, johon ei lisatty kuparia. Pesåke siirrostettiin 10 ml YPD-liuosta, kasva-tettiin 1 vrk ravistellen 250 rpm 30°C:ssa, minka jalkeen 5 100 /xl:lla tåtå kasvustoa siirrostettiin uudestaan 10 ml:aa YPD-liuosta ja kasvatettiin jalleen 1 vrk. Kasvust.o maljattiin YPD-maljoille, joilla kasvaneiden erillispe-sSkkeiden kasvu testattiin 0,6 mM CuS04:åå sisaltavillå maljoilla. Testatuista pesakkeistå 2-3 prosenttia ei 10 pystynyt kasvamaan kuparimaljoilla ja oli menettanyt pET13:1-plasmidin. NSiden pesåkkeiden a-ALDC-aktiivisuus testattiin ja α-ALDC-geenin olemassaolo varmistettiin "dot blot" -hybridisaatiolla (ks. menetelmat).

15 Nain saatiin PGJCl/a-ALDC-ekspressiokasetilla transfor- moitu, A. aerogenes -bakteerin α-ALDC-geenin sisaltava ja α-ALDC-aktiivisuutta tuottava hiivakanta VTT-A-88085 seka ADC1/a-ALDC-ekspressiokasetin sisaltava, a-ALDC-aktiivi-suutta tuottava hiivakanta VTT-A-88086. Naissa kannoissa 20 α-ALDC-geeni on integroitunut hiivan kromosomiin ja hiivalle vierasta DNA:ta on vain α-ALDC-geenin verran.

Esimerkki 6. Oluen valmistus vhdistelma-DNA-kannoilla VTT—A—87083 ia VTT-A-87084 25 NEP-agarilta kutakin hiivakantaa siirrostettiin kahteen Freudenreich-pulloon, joissa oli 25 ml vierresokeriliuos-ta, kasvatettiin ravistellen 200 rpm 25°C:ssa yli yon. Kasvustot kaadettiin 5 l:n erlenmeyerpulloihin, joissa 30 oli 3 1 vierresokeriliuosta sisåltåen myos kuparia, kasvatettiin ravistellen 125 rpm 25°C:ssa 2 vrk, hiivamassan • annettiin sedimentoitua 1 vrk, kirkastunut kasvuliuos dekantoitiin pois ja sedimentoitunut hiiva sentrifugoi-tiin steriileissa, taaratuissa sentrifuugiputkissa.

35 Sentrifugoidun hiivamassan maaraksi saadettiin 125 g, jolla siirrostettiin paakayminen.

21 92333

Vierretta noudettiin panimolta ja laimennettiin keite-tylla vedella kantavierrevMkevyyteen noin 10,5 p-%.

Vierre ilmastettiin Keg-astioissa (å 50 1) steriiliksi suodatetulla paineilmalla 30 min ajan nopeudella 3 1/min.

5 Valittomåsti ilmastuksen jålkeen vierre siirrettiin suodatetulla paineilmalla teråksisiin kaymisputkiin (å 50 1) kåymiskellariin +10°C. Vierre siirrostettiin ko. hiivakannoilla mSåralla 2,5 g/1.

10 Paakaymisen låmpotila oli +10°C ja kaymistS seurattiin paivittain (3-7 vrk) maarittamSlla hiivan maårå suspen-siossa (2 ml pestya hiivasuspensiota kuivattiin taara-tuilla kellolaseilla yli yon +105°C:ssa), naennainen uutepitoisuus (ominaispainomittaus) ja VDK-yhdisteet 15 (GLC-kromatografialla vapaa diasetyyli ja pentaanidioni seka niiden prekursorit α-asetomaitohappo ja a-asetohyd-roksi-voihappo, joiden summa on totaali-VDK). Paakaymisen lopusta maaritettiin lisaksi tarkeimmat aromiaineet (GLC-kromatografia), etanoli (tislaus) ja hiivasaanto 20 (kaymisputken pohjalle sedimentoituneen hiivan sentrifu-goitu massa). KMymisaste laskettiin etanoli- ja uutepi-toisuuksien perusteella. Paakaynyt olut siirrettiin suoraan stabilointivaiheeseen (3 vrk), suodatettiin (levysuodatin + membraani), pullotettiin, pastoroitiin 25 (60eC/30 min) ja valmis olut analysoitiin uudelleen, jolloin myos makupaneeli arvosteli oluet.

Kuva 9 esittaa testattujen hiivakantojen uutepitoisuudet ja hiivojen kasvun seka flokkuloitumisen paakaymisen 30 aikana. Vertailukannan (VTT-A-63015) ja yhdistelma-DNA-kantojen (VTT-A-87083 ja VTT-A-87084) vålillå ei • todettu mitaan eroja ko. panimoarvoissa. Kuva 10 esittaa VDK-yhdisteiden muodostumisen paakaymisen aikana ilmoi-tettuna totaalimaårinå (vapaa + prekursori) diasetyyliksi 35 laskettuna. Vertailukannan maksimi totaali-VDK oli 0,346 mg/1 ja kaymisen lopussa 0,227 mg/1. Yhdistelma-DNA-kan-nat kayttåytyivat keskenSan samalla tavalla. Niiden 22 92333 VDK-yhdisteet pysyivat koko ajan samalla tasolla (totaa-li-diasetyyli 0,007 mg/1, totaalipentaanidioni 0,013 xng/1, totaali-VDK 0,020 mg/1) eivåtkå missåån vaiheessa saavuttaneet diasetyylin makukynnysarvoa 0,050 mg/1. Kuva 5 13 esittåå pååkåyneiden oluiden analyysit ja valmiin oluen makuarvostelun. Varsinaiset panimoarvot eivåt ol-leet muuttuneet yhdistelmakannoilla elkå a-ALDC:n toimin-ta hiivassa pååkåymisen aikana ollut merkitsevåsti hai-rinnyt oluen tarkeimpien aromiaineiden muodostumista.

10 Sikuna-alkoholit olivat tarkalleen samalla tasolla, mutta estereiden måårå oli hiukan alentunut. Makupaneelin ar-vostelun perusteella olut oli flavoriltaan virheetonta ja hyvaa. Valmiin oluen analyysit eivat juuri poikenneet pååkåymisen jålkeen tehdyistå analyyseista ja vastaavat 15 hyvån oluen arvoja.

Esimerkki 7. Oluen valmistus vhdistelmå-DNA-kannalla VTT-A-87076 20 Koejårjestely oli tåsmålleen sama kuin esimerkisså 6.

Kuva 11 esittåå vertailu- ja yhdistelmå-DNA-kannan VTT-A-87076 uutepitoisuudet sekå hiivojen kasvun ja flokkuloitumisen pååkåymisen aikana. Kantojen vålillå ei todettu eroja ko. panimoarvoissa. Kuva 12 esittåå 25 VDK-yhdisteiden muodostumisen pååkåymisen aikana. Ver- tailukannan maksimi totaali-VDK oli 0,354 mg/1 ja kåyroi-sen lopussa 0,213 mg/1. Myos yhdistelmå-DNA-kannalla oli todettavissa heikkoa VDK-yhdisteiden muodostumista. Pååkåymisen keskivaiheilla totaali-VDK saavutti arvon 30 0,065 mg/1 (4 vrk), mutta totaalidiasetyylin maksimiarvo oli vain 0,024 mg/1 (4 vrk). Pååkåymisen lopussa olut oli . VDK-yhdisteiden suhteen myos tåsså koesarjassa valmista siirrettåvåksi stabilointivaiheeseen ilman varastokåymis-tå. Kuva 13 esittåå pååkåyneiden oluiden analyysit.

35 Yhdistelmå-DNA-kanta VTT-A-87076 kåyttåytyi tasmålleen samalla tavalla - myos aromiaineiden muodostuksen suhteen - kuin vertailukanta. Valmis olut oli flavoriltaan erit-

II

23 92333 tain hyvaa ja myos xnuilta analyysiarvoiltaan erittain hyva.

Viiteiulkaisut 5

Ammerer, G. 1983. Expression of genes in yeast using the ADC1-promoter. Methods Enzymol. 101, 192-210.

Amundsen, S.K. ja Neville, M.E. 1979. Comparison of three 10 procedures for isolating DNA from bacteria. Microbios 24, 29-39.

Analytica-EBC 1987. 4. painos. Brauerei- und Getrånke-Rundschau, Zurich. 271 s.

15

Cantwell, B.A., Brazil, G., Murphy, N. ja McConnell, D.J. 1986. Comparison of expression of the endo-j8-l,2-l,4-glucanase gene from Bacillus subtilis in Saccharomyces cerevisiae from the CYC1 and ADHI 20 promoters. Curr. Genet. 11, 65-70.

Eghtedarzadeh, M.K. ja Henikoff, S. 1986. Use of oligonucleotides to generate large deletions. Nucleic Acids Res. 14, 5115.

25 EP-hakemusjulkaisu 0128714 α-acetolactate decarboxylase enzyme and preparation thereof. Novo Industri A/S.

Godtfredsen, S.E., Lorck, H. ja Sigsgaard, P. 1983. On 30 the occurrence of α-acetolactate decarboxylases among microorganisms. Carlsberg Res. Commun. 48, 239-247.

Godtfredsen, S.E. ja Ottesen, M. 1982. Maturation of beer with α-acetolactate decarboxylase. Carlsberg Res. Commun.

35 47, 93-102.

Henderson, R.C.A., Cox, B.S. ja Tubb, R. 1985. The 24 92333 transformation of brewing yeasts with a plasmid containing the gene for copper resistance. Curr. Genet.

9, 133-138.

5 Henikoff, S. 1984. Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing. Gene 28, 351-359.

Hohn, B. ja Murray, K. 1977. Packaging recombinant DNA 10 molecules into bacteriophage particles in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3259-3263.

Innis, M.A., Holland, M.J., McCabe, P.C., Cole, G.E., Wittman, V.P., Tal, R., Watt, K.W.K., Gelfand, D.H., 15 Holland, J.P. ja Meade, J.H. 1985. Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae. Science 228, 21-26.

20 Knowles, J.K.C. ja Tubb, R. 1987. Recombinant DNA: Gene transfer and expression techniques with industrial yeast strains. EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki 1986, Monograph XII, 169-185.

25 Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. 1982.

*: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring

Harbor, USA. 545 s.

Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., 30 Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T., Kingsman, A.J. ja Kingsman, S.M. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene 24, 1-14.

35 Pajunen, E., Måkinen, V. ja Gisler, R. 1987. Secondary fermentation with immobilized yeast. Proc. 21st EBC Congress, Madrid 1987, 441-448.

25 92333

Penttilå, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. ja Knowles, J.K.C. 1984. Cloning of Aspergillus niger genes in yeast. Expression of the gene coding Aspergillus beta-glucosidase. Mol. Gen. Genet. 114, 494-499.

5

Penttila, M.E., Suihko, M.-L., Lehtinen, U., Nikkola, M. ja Knowles, J.K.C. 1987. Construction of brewer's yeasts secreting fungal endo-jf?-glucanase. Curr. Genet. 12, 413-420.

10

Sanger, F., Niclen, S. ja Coulson, A.R. 1977.

DNA-sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.

15 So, M., Boyer, H., Betlach, M. ja Fallow, S. 1978.

Molecular cloning of an Escherichia coli plasmid determinant that encodes for the production of heat-stable enterotoxin. J. Bacteriol. 128, 463.

20 Yanisch-Perron, c., Vieira, J. ja Messing. J. 1985.

Improved Ml3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors.

Gene 33, 103-119.

25 Yocum, R.R. 1986. Genetic engineering of industrial yeasts. Proceedings Bio Expo 86, Butterworth, Stoneham MA, 171-180.

Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. ja Lomax, N.

30 1986. Rapid and easy sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene Anal.

Techn. 2, 89-94.

Claims (11)

1. 92333 1. α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta (ct-ALDC) (EC 4.1.1.5) oinaavaa entsyymiS koodaava eristetty ja 5 puhdistettu DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, etta se koodaa seuraavaa polypeptidia ATGAATCATTATCCTGAATGCACCTGCCAGGAGAGCCTGTGCGAAACCGTACGCGGC 10 MetAsnHi sTyrProGluCysThrCysGInGluSerLeuCysGluThrVa1ArgGly TTCTCCGCCCACCACCCTGATAGCGTTATCTATCAGACCTCTCTGATGAGCGCGCTG PheSerAlaHisHisProAspSerVallleTyrGlnThrSerLeuMetSerAlaLeu

   15 CTGAGCGGGGTCTATGAGGGTAGCACCACCATCGCCGACCTGCTGACCCACGGCGAC LeuSerGlyValTyrGluGlySerThrThrlleAlaAspLeuLeuThrHisGlyAsp TTCGGTCTCGGCACCTTTAACGAACTCGATGGCGAACTGATTGCCTTTAGCAGCGAG PheGlyLeuGlyThrPheAsnGluLeuAspGlyGluLeuIleAlaPheSerSerGlu 20 GTCTACCAGCTGCGCGCTGACGGCAGCGCGCGTAAAGCCCGGGCGGATCAAAAAACG ValTyrGlnLeuArgAlaAspGlySerAlaArgLysAlaArgAlaAspGlnLysThr CCCTTCGCGGTGATGACCTGGTTCAGACCGCAGTACCGTAAAACCTTTGACCACCCG 25 ProPheAlaValMetThrTrpPheArgProGlnTyrArgLysThrPheAspHisPro GTCAGCCGCCAGCAGCTGCACGACGTTATCGACCAGCAAATCCCCTCCGATAACCTG ValSerArgGlnGlnLeuHisAspVallleAspGlnGlnlleProSerAspAsnLeu
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, t u n - n e t t u siitå, etta se on eristetty bakteerikannasta Aerobacter aerogenes VTT-E-74023.
3. 3. Hiivavektori, tunnettu siitå, etta se sisål-10 tåå α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymia koodaavan, patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin liitettyna panimo-olosuhteissa toiiniviin hiivageenin saa-telyalueisiin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi ekspressoi-tuu naiden saatelyalueiden alaisena. 15

   3. TTCTGCGCCCTGCATATTGATGGTCACTTTCGCCACGCCCACACCCGCACCGTGCCG PheCysAlaLeuHisIleAspGlyHisPheArgHisAlaHisThrArgThrValPro CGGCAGACGCCGCCCTATCGGGCGATGACCGACGTGCTCGATGACCAGCCGGTTTTC ArgGlnThrProProTyrArgAlaMetThrAspValLeuAspAspGlnProValPhe 35 CGCTTCAACCAGCGCAAGGGGACGCTGGTCGGCTTTCGCACCCCGCAGCATATGCAG ArgPheAsnGlnArgLysGlyThrLeuValGlyPheArgThrProGlnHisMetGln GGCCTTAACGTTGCCGGCTACCACGAGCACTTTATTACCGACGATCGCCAGGGCGGC 40 GlyLeuAsnValAlaGlyTyrHisGluHisPhelleThrAspAspArgGlnGlyGly GGCCATCTGCTGGACTACCAGCTCGATAGCGGCGTGCTGACCTTCGGCGAGATCCAC GlyHisLeuLeuAspTyrGlnLeuAspSerGlyValLeuThrPheGlyGluIleHis

   45 AAGCTGATGATTGACCTCCCGGCCGACAGCGCTTTCCTGCAGGCCGACCTGCATCCT LysLeuMetlleAspLeuProAlaAspSerAlaPheLeuGlnAlaAspLeuHisPro GA CAAT CT CGATGCCGCTATTCGTGCGGTAGAAAAC AspAsnLeuAspAlaAlalleArgAlaValGluAsn 50 92333 ja etta se siirrettynå panimohiivaan ja ekspressoituna siina panimokåymisen aikana nopeuttaa oluen valmistus-prosessia.
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivavektori, tunnettu siita, etta sååtelyalueet, joiden alaisuuteen DNA-sekvenssi on liitetty, ovat hiivan alkoholidehydro-genaasigeenin ADC1 tai hiivan fosfoglyserokinaasigeenin

   20 PGK1 proraoottorialueita ja mahdollisesti myos terminaat-torialueita.
5. 5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen hiivavektori, tunnettu siitM, ettå se on plasmidi pKB002 tai 25 pKB003, joiden rakenne on esitetty kuvissa 5 ja 6.
6. 6. Ekspressiokasetti, tunnettu siita, etta se sisaltaa patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin, 30 joka koodaa α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymia sellaisenaan tai liitettyna patenttivaatimuk-sessa 3 tai 4 maariteltyihin hiivageenin saatelyaluei-siin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi ekspressoituu naiden saatelyalueiden alaisena. 35
7. 7. Saccharomyces cerevisiae -panimohiivakanta, tunnettu siita, etta se sisaltaa patenttivaatimuksen 1 92333 mukaisen DNA-sekvenssin, joka koodaa a-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiå ja ettå se on valmistetta-vissa transformoimalla siihen jokin patenttivaatimusten 3-5 mukaisista hiivavektoreista autonomisesti replikoitu-5 vana plasmidina tai integroimalla sen kromosomiin patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressiokasetti, ja ettå se kykenee panimokåymisen aikana tuottamaan a-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiå.
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hiivakanta, tun- n e t t u siitå, ettå se on Saccharomyces cerevisiae VTT-A-87083, VTT-A-87084, VTT-A-88085, VTT-A-88086 tai VTT-A-87076.
9. 9. Menetelma uusien panimohiivakantojen rakentamiseksi, tunnettu siita, etta (a) eristetåan sopivasta donoriorganismista, esi-merkiksi Aerobacter aerogenes -bakteerista patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, 20 joka koodaa α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiå, (b) rakennetaan patenttivaatimusten 3-5 mukainen hiivavektori tai patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressiokasetti kayttaen mainittua DNA- 25 sekvenssiå, (c) siirretåån tama vektori tai ekspressiokasetti autonomisesti monistuvana tai kromosomiin integroimalla Saccharomyces cerevisiae -lajin panimohiivaan. 30
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå hiiva, johon mainittu DNA-sekvenssi siirretaan, on panimohiivakanta Saccharomyces cerevisiae VTT-A-63015. 35
11. 11. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisten panimohiivakantojen kaytto menetelmåsså oluen valmistamiseksi. 29 92333