FI92333B - -asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiä koodaava DNA-sekvenssi ja sen käyttö nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi - Google Patents

Description

92333 α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiä koodaava DNA-sekvenssi ja sen käyttö nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi 5

Keksintö koskee a-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivi-suutta (EC 4.1.1.5.) (myöhemmin α-ALDC) omaavia hiiva-kantoja, menetelmää niiden rakentamiseksi ja menetelmässä käytettäviä yhdistelmä-DNA-vektoreita. Keksintö koskee 10 myös tällaisten hiivakantojen käyttöä oluen valmistuksessa panimoprosessin nopeuttamiseksi.

Käytössä olevaa oluen valmistusprosessia voidaan lyhentää joko nopeuttamalla pääkäymistä tai varastokäymistä tai 15 siirtymällä jatkuvaan käymiseen. Oluen flavorin (maun) kypsyitämiseksi tarvittava varastokäyminen on oluen valmistuksen vaiheista ajaltaan pisin (2-3 viikkoa) ja runsaasti jäähdytettyä tilaa vievä, joten sen nopeuttamisessa saavutettava hyöty on suurempi kuin muita 20 vaiheita nopeutettaessa. Näin ollen flavorin kypsymistä nopeuttavan panimohiivan avulla voitaisiin päästä huomattaviin kustannussäästöihin oluen valmistuksessa.

Oluen pääkäymisen aikana hiiva muodostaa a-asetohydrok-25 sihappoja (α-asetomaitohappo ja α-asetohydroksivoihappo), jotka ovat varsinaisesti aminohappojen, valiinin ja isoleusiinin, biosynteesin välituotteita. Tuotetuista hydroksihapoista suurin osa menee aminohappojen syntee-seihin, mutta osa erittyy hiivasolun ulkopuolelle käyvään 30 olueen. Oluessa ne muuttuvat spontaanisti vastaaviksi diketoneiksi, diasetyyliksi ja pentaanidioniksi. Näiden diketonien ja niiden prekursoreiden (hydroksihappojen) yhteispitoisuutta oluessa kutsutaan totaali-VDKrksi (visinaaliset diketonit). Voimakkaan flavorinsa vuoksi 35 näistä huomattavasti merkityksellisempiä ovat a-asetomai-tohappo ja diasetyyli, jonka hiiva pelkistää entsymaattisesti asetoiiniksi (kuva 1). α-Asetomaitohapon spontaania dekarboksyloitumista diasetyyliksi pidetään koko 2 92333 prosessia rajoittavana vaiheena varasto-olosuhteissa (Godtfredsen ja Ottesen, 1982).

Oluessa maun kypsymisen mitta on pääasiassa sen diase-5 tyylipitoisuus. Diasetyyli on varsinaisesti voin aromiaine. Sen maku ja tuoksu aistitaan jo hyvin pieninä konsentraatioina ja koetaan erittäin vastenmielisiksi oluessa. Diasetyylin makukynnysarvo pöhjahiivaoluissa on 0,05 mg/1. Asetoiinin makukynnys oluessa (50 mg/1) on 10 puolestaan huomattavasti korkeampi kuin diasetyylin makukynnys.

Tietyillä bakteeriryhmillä kuten enterobakteereilla (Aerobacter, Enterobacter) sekä perinteisesti elintarvi-15 keteollisuudessa käytettävillä Lactobacillus-, Bacillus-ja Streptococcus-suvun bakteereilla on tavattu a-ALDC-entsyymi (EC 4.1.1.5.), joka dekarboksyloi cr-asetomaito-hapon suoraan asetoiiniksi. Vastaavaa entsyymiä ei ole löydetty bakteereja korkeammista eliöistä esim. hiivoista 20 tai homeista (Godtfredsen et ai., 1983).

Laboratoriokokeissa on lisätty α-ALDC-entsyymiä pääkäy-neeseen olueen ja todettu, että diasetyyli ja sen pre-kursori α-asetomaitohappo poistuvat oluesta alle vuoro-25 kaudessa, jolloin oluen kypsymiseen tarvittava aika vastaavasti lyhenee (Godtfredsen ja Ottesen, 1982). α-ALDC:n avulla kypsytetyn oluen laatu ei poikennut tavanomaisella tavalla kypsytetyn oluen laadusta.

30 Nopeutettu varastokäyminen voidaan saavuttaa paitsi lisäämällä α-ALDC-entsyymiä puolivalmiiseen olueen, myös eristämällä sopivasta donoriorganismista kyseistä entsyymiä koodaava geeni ja siirtämällä se hiivaan. Tällöin saadaan panimohiiva, joka pääkäymisen aikana tuottaa 35 α-ALDC-entsyymiä, joka dekarboksyloi ylimääräisen a-ase-tomaitohapon suoraan asetoiiniksi. Näin vältytään lisäaineiksi katsottavien entsyymivalmisteiden lisäämiseltä 3 92333 olueen, mikä eräiden maiden elintarvikelainsäädännön mukaan on jopa kiellettyä. Kaupalliset entsyymivalmisteet ovat lisäksi yleensä epäspesifisiä entsyymiseoksia ja siten itse asiassa epäpuhtaita. Sen sijaan panimohii-5 valla, johon on geeniteknisillä menetelmillä siirretty ainoastaan haluttua entsyymiä koodaava geeni, saadaan aikaan puhdas prosessi.

Tässä keksinnössä kuvataan α-ALDC-geenin eristäminen 10 bakteerista, sen karakterisointi, siirto hiivaan, ilmentyminen hiivassa sekä sen vaikutus panimohiivan ominaisuuksiin ja panimoprosessiin sekä oluen laatuun.

Vaikka jotkut enterobakteereista eristetyt geenit hiivaan 15 siirrettyinä ilmentyvätkin sellaisenaan, esim. betalakta-maasi, ei ilmentymistaso ole yleensä riittävä ilman sopivia hiivageeneistä eristettyjä geenin säätelyalueita, joihin liitettynä siirrettävä geeni saadaan ilmentymään tehokkaammin. Toisaalta aina ei välttämättä haluta mah-20 dollisimman tehokasta ilmentymistä vaan entsyymin tuoton on oltava optimaalinen kyseisen prosessin kannalta. Tämän keksinnön mukaisia vektoreita ja hiivakantoja käyttämällä päästään panimoprosessin kannalta optimaaliseen tulokseen.

25

Liittämällä a-ALDC-geeni hiivageenin säätelyalueeseen (promoottori ja terminaattori), joka on aktiivinen käymisen aikana, ja siirtämällä kyseinen säätelyalue-geeni--yhdistelmä (ekspressiokasetti) panimohiivaan plasmidissa 30 tai liittämällä se hiivan kromosomiin saadaan aikaan hiiva, joka itse tuottaa pääkäymisen aikana a-ALDC:tä. Entsyymi jää hiivan sytoplasmaan ja dekarboksyloi a-ase-tomaitohappoa asetoiiniksi. Tällöin varastokäymistä ei enää tarvita diasetyylin poistamiseksi, ja ellei muu 35 flavorin muodostuminen vaadi lyhyttä varastokäymistä voidaan siirtyä pääkäymisestä suoraan stabilointivaihee-seen.

4 92333

Koska panimohiiva on elintarvikemikrobi, on tärkeää, että hiivakromosomiin siirretään vain α-ALDC-geeni liitettynä hiivageenin säätelyalueisiin ilman ylimääräisiä bakteerista peräisin olevia DNA-jaksoja. Tämä saadaan aikaan 5 liittämällä geeni hiivan kromosomiin esim. kotransfor-maatiolla. Kotransformaatiossa hiiva transformoidaan kahdella erillisellä DNA-molekyylillä, joista toinen on varsinainen kromosomiin siirrettävä α-ALDC-geenin sisältävä ekspressiokasetti, ja toinen hiivassa itsenäisesti 10 monistuva plasmidimolekyyli, joka sisältää transformant-tien selektiossa tarvittavan merkkigeenin.

Tietty osa merkkigeenin perusteella selektoiduista hii-vaklooneista on saanut myös varsinaisen siirrettävän 15 geenin sisältävän ekspressiokasetin, joka on siirtynyt pysyvästi hiivakromosomin osaksi. Antamalla merkkigeenin sisältävän plasmidin poistua hiivasolusta saadaan kanta, jossa on hiivalle vierasta DNA:ta vain a-ALDC-geenin rakenneosa.

20 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi siirretään α-ALDC-entsyymiä koodaava geeni tämän geenin sisältävästä bakteerista (Aerobacter aerogenes) 25 hiivaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa.

Hiiva, johon geeni siirretään, on Saccharomyces cerevisiae -lajin panimohiiva (ex. S. carlsbergensis, ex.

S. uvarum) esim. kanta VTT-A-63015.

30

Donoribakteerin α-ALDC-geeni eristetään bakteerin kromo-somaalisesta DNAcsta käyttäen isäntänä esim. Escherichia coli -bakteeria ja geenin emäsjärjestys määritetään.

35 α-ALDC-geeni siirretään hiivaan liitettynä hiivageeneistä eristettyihin säätelyalueisiin, jotka ohjaavat geenin ilmentymistä hiivasolussa panimo-olosuhteissa. Sopivia 5 92333 säätelyalueita ovat mm. hiivan fosfoglyserokinaasigeenin (PGK1) promoottori- ja terminaattorialueet (Mellor et ai., 1983), vastaavat alueet hiivan alkoholidehydroge-naasi (ADC1)- ja iso-l-sytokromi c-geenistä (CYC1) 5 (Cantwell et ai., 1986) tai enolaasigeenistä (EN01) (Innis et ai., 1985).

Keksinnön kohteena ovat siten myös näin saadut α-ALDC-geenin sisältävät hiivavektorit.

10

Geeni siirretään hiivaan autonomisesti replikoituvassa plasmidissa tai integroimalla se hiivan kromosomiin esim. kotransformaatiomenetelmällä käyttäen transformanttien selektioon jotain hiivan dominanssimerkkigeeniä, esim.

15 hiivan pET13.1-plasmidissa sijaitsevaa hiivan metallo-thioniinigeeniä (CUP1) (Henderson et ai., 1985). Domi-nanssimerkkigeeninä voidaan myös käyttää esim. geenejä, jotka aiheuttavat resistenttiyden esim. kloramfenikolia tai antibioottia G418 kohtaan (Knowles ja Tubb, 1987).

20 Transformanttien selektion jälkeen selektioplasroidin annetaan tarpeettomana poistua integranttikannasta, jolloin hiivasoluun jää vain kromosomin osaksi tullut a-ALDC-geeni (Penttilä et ai., 1987). Vastaavanlainen, vierasta DNA:ta vain a-ALDC-geenin verran sisältävä 25 hiivakanta voidaan saada aikaan myös esim. integroimalla transformaatioon tarvittava merkkigeeni ensin hiivakromosomiin ja antamalla sen myöhemmin poistua solusta in vivo -rekombinaatiolla (Yocum, 1986).

30 Keksinnön kohteena ovat edelleen tällaiset hiivakannat, jotka kykenevät käymisen aikana tuottamaan a-ALDC-ent-syymiä.

Hiivakromosomissa a-ALDC-geeni ilmentyy tuottaen aktii- 35 vista entsyymiä, joka muuttaa ylimääräisen a-asetomaito-hapon pääkäymisen aikana suoraan asetoiiniksi, jolloin varastokäymistä ei tarvita diasetyylin poistamiseksi.

6 92333

Geenin ilmentyminen ja aktiivisuus hiivasolussa todetaan mittaamalla α-ALDC-aktiivisuus geenin sisältävän hiivan soluekstraktista. GLC-kromatografiällä todetaan lisätystä α-asetomaitohaposta syntyvän suoraan pelkästään asetoii-5 nia.

Uuden yhdistelmä-DNA-hiivan panimo-ominaisuudet ja vaikutus panimoprosessiin testataan VTT:n koepanimossa (ä 50 1). Pääkäymisestä seurataan hiivan kasvua ja flokkuloitu-10 mistä, uutepitoisuuden pienenemistä ja visinaalisten diketonien (VDK) muodostumista. Pääkäymisen lopusta määritetään edellisten lisäksi alkoholipitoisuus, tärkeimmät aromiaineet, hiivasaanto ja käymisaste. Suoritetaan lyhyt varastokäyminen tai siirrytään suoraan stabi-15 lointivaiheeseen, olut suodatetaan, pullotetaan, pastöroidaan ja analysoidaan valmiina oluena, jolloin koulutettu makupaneeli arvostelee myös oluiden maun.

Seuraavassa esitetään esimerkkinä keksinnön mukaisista 20 edullisista suoritusmuodoista yksityiskohtaisesti α-ALDC-geenin eristäminen eräästä Aerobacter aerogenes-bakteerista, geenin karakterisoiminen, cr-ALDC-geenin sisältävien hiivaekspressiovektoreiden rakentaminen ja geenin siirtäminen niiden avulla panimohiivaan sekä 25 autonomisesti monistuvissa plasmideissa että hiivakromosomiin integroimalla. On huomattava, että geeni voidaan eristää samoilla menetelmillä myös muista bakteereista, joilla tämä geeni esiintyy, ja geeni voidaan siirtää myös muihin Saccharomyces cerevisiae -lajin hiivoihin 30 poikkeamatta tämän keksinnön piiristä.

7 92333

Lyhyt selitys kuvista

Kuvassa 1 esitetään a-asetomaitohapon reaktiot diasetyy-liksi ja asetoiiniksi.

5

Kuvassa 2 esitetään A. aerogeneksen VTT-E-74023 ja jS-kosmidikloonin α-ALDC-aktiivisuus.

Kuvassa 3 esitetään A. aerogeneksen α-ALDC-geenin emäs-10 järjestys ja sen määrittämän entsyymin aminohappojärjestys.

Kuvassa 4 esitetään A. aerogeneksen α-ALDC-geenin delee-tiomutageneesi ja aloituskodonin muuttaminen hiivaan 15 siirtämistä varten.

Kuvassa 5 esitetään A. aerogeneksen α-ALDC-geenin sisältävän hiivaplasmidivektorin pKB002 rakentaminen.

20 Kuvassa 6 esitetään A. aerogeneksen α-ALDC-geenin sisältävän hiivaplasmidivektorin pKB003 rakentaminen.

Kuvassa 7 esitetään ADC1/a-ALDC-ekspressiokasetin rakentaminen A. aerogreneksen α-ALDC-geenin hiivakromosomiin 25 liittämistä varten.

• I

Kuvassa 8 esitetään α-ALDC-geenin sisältävän PGKl/a-ALDC-ja ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetin siirtäminen hiivakromosomiin kotransformaatiolla.

30

Kuvassa 9 esitetään vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdis-telmä-DNA-kantojen VTT-A-87083 ja VTT-A-87084 panimo-ominaisuudet pääkäymisen aikana.

35 Kuvassa 10 esitetään vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdis-telmä-DNA-kantojen VTT-A-87083 ja VTT-A-87084 VDK-yhdis-teiden muodostuminen pääkäymisen aikana.

8 92333

Kuvassa 11 esitetään vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdistelmä-DNA-kannan VTT-A-87076 panimo-ominaisuudet pääkäymisen aikana.

5 Kuvassa 12 esitetään vertailukannan VTT-A-63015 ja yhdistelmä-DNA-kannan VTT-A-87076 VDK-yhdisteiden muodostuminen pääkäymisen aikana.

Kuvassa 13 esitetään pääkäyneiden oluiden analyysit ja 10 valmiin oluen makuarvostelu.

Käytetyt bakteeri- ia hiivakannat sekä kloonausvektorit α-ALDC-geeni eristettiin bakteerista Aerobacter aerogenes 15 VTT-E-7 4023.

A. aerogeneksesta rakennettiin kosmidipankki, jonka teossa käytettiin kosmidivektoria p3030 (Penttilä et ai., 1984) ja isäntänä bakteeria Escherichia coli HB101 (So et 20 ai., 1978).

Geenin subkloonauksissa ja dideoksisekvensoinnissa käytettiin plasmidia Bluescribe M13+ (Vector cloning systems, Kalifornia, USA), plasmidia pUC19 (Boehringer 25 Mannheim, Saksa), sekä isäntänä bakteeria E. coli JM109 (Yanisch-Perron et ai., 1985) ja E. coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, USA).

Panimohiivatransformaatioissa käytettiin isäntänä pani-30 mopohjahiivaa Saccharomyces cerevisiae VTT-A-63015 ja selektioplasmidia pET13:l (Henderson et ai., 1985).

α-ALDC-geenit liitettiin hiivaekspressiovektoreihin pAAH5 (Ammerer, 1983) ja pMA91 (Mellor et ai., 1983).

35 li 9 92333 Kävtetvt entsyymit

Restriktioendonukleaasientsyymit toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Entsyymiäigestiot suoritettiin valmis-5 tajien ohjeiden mukaisesti. T4-ligaasin toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Calf intestinal -fosfataasin ja E. coli-DNA-polymeraasi I:n Klenow-osan toimitti Boehringer Mannheim, Saksa. Lysotsyymientsyymin toimitti Sigma, St. Louis, USA. Zymolyaasi 60000 -entsyymin toi-10 mitti Seigaku Kogyo, Tokio, Japani. Eksonukleaasi III- ja Sl-entsyymin toimittivat Boehringer Mannheim, Saksa ja Bethesda Research Laboratories, USA.

Kävtetvt kasvatusalustat ia substraatit 15 E. coli -bakteerit kasvatettiin LB-alustalla. Transfor-mantit selektoitiin L-maljoilla, joissa selektiotekijänä käytettiin ampisilliinia 100 μg/ml. α-ALDC-geenin sisältävät kloonit seulottiin Voges-Proskauer (VP)-maljoilla.

20 LB-alusta: 10 g Difcon Bacto tryptonia, 5 g Difcon hii-vauutetta ja 10 g NaCl täytettiin 1 l:ksi tislatulla deionisoidulla vedellä. L-maljoilla oli LB-alusta sisältäen 2 % agaria.

25 *; VP-maljoilla oli kaupallinen MAST ID33-alusta, jonka toimitti Mast Laboratories Ltd., Merseyside,

Iso-Britannia. α-ALDC-aktiivisuusmäärityksiä varten bakteerikloonit kasvatettiin samalla VP-alustalla neste-30 viljelminä.

' Entsyymiaktiivisuusmäärityksissä substraattina käytetyn α-asetomaitohapon diesterin (etyyliesteriasetaatti) toimitti Oxford Organic Chemicals Ltd, Brackly 35 Northamptonshire, Iso-Britannia.

Hiivatransformaatiota varten hiivasolut kasvatettiin 10 92333 YPD-liuoksessa. Transformanttien seulonnassa käytettiin pohja-agarina NEPRA-alustaa (Henderson et ai., 1985), johon oli selektiotekijäksi lisätty 0,4 mM tai 0,6 mM CuS04:ää. Transformantit poimittiin NEP-alustoille (NEPRA 5 ilman sorbitolia), joihin oli lisätty 0,6 mM CuS04:ää. α-ALDC-aktiivisuuden määrittämiseksi transformantit kasvatettiin YPD-liuoksessa, johon plasmidikannoille oli lisätty 0,6 mM CuS04:ää. Panimokokeita varten hiivasolut kasvatettiin vierresokeriliuoksessa, johon plasmidikan-10 noille oli lisätty 0,6 mM CuS04:ää.

YPD-liuos: 10 g Difcon hiivauutetta, 20 g Difcon Bacto peptonia ja 20 g glukoosia täytettiin 1 l:ksi deionisoi-dulla vedellä.

15 NEPRA-alusta: 0,2 % MgS04-7H20, 0,2 % (NH4)2S04, 0,3 % KH2P04, 0,025 % CaCl2*2H20, 0,2 % Difcon hiivauutetta, 0,3 % Difcon Bacto peptonia, 4 % glukoosia, 1,2 M sorbitolia, 3 % agaria (Oxoid Purified Agar), autoklavoitiin 121°C/15 20 min ja jäähtyneeseen alustaan (50°C) lisättiin tarvittava määrä erikseen steriloitua CuS04-liuosta (Henderson et ai., 1985).

Vierresokeriliuos: 1 osa käsiteltyä III-vierrettä ja 1 25 osa 10 % sakkaroosiliuosta sekä 1 g/1 Difcon hiivauutetta .

Käytetyt menetelmät; 30 Molekyylibiologiset menetelmät, ellei toisin ole mainittu, suoritettiin kuten Maniatis et ai., 1982 ovat kuvanneet .

VP-malioien testaus suoritettiin seuraavasti: 1,8 g 35 agaroosia (Indubiose A37) ja 60 ml lämmintä vettä kuumennettiin kunnes agaroosi suli, jäähdytettiin +60°C:seen ja lisättiin 12 ml 5 %:ista a-naftolia 2,5 N NaOHissa.

11 92333 Tätä seosta pipetoitiin maljoille niin, että pesäkkeet peittyivät ja seurattiin punaisen värin kehittymistä yhden tunnin ajan.

5 VP-reaktio suoritettiin bakteerikloonien kasvuliuoksista pipetoimalla 1 ml kasvuliuosta, 300 μΐ samana päivänä valmistettua 5 %:ista a-naftolia abs. etanolissa ja 100 μΐ 40 %:ista K0H:ta. Ravisteltiin hyvin ja seurattiin reaktion kehittymistä puolen tunnin ajan.

10 α-ALDC-aktiivisuusmääritvstä (EP-hakemus 0128714) varten bakteerikloonit kasvatettiin 10 ml:ssä VP-liuosta ilman ravistelua yli yön. Solut erotettiin kasvuliuoksesta sentrifugoimalla huoneenlämmössä 4000 rpm 10 min ja 15 pestiin kerran deionisoidulla vedellä. Solut resuspen-doitiin 5 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria pH 7,0 (A540 « 0,400) ja lisättiin 5 mg (E. coli) tai 10 mg (A. aerogenes) lysotsyymientsyymiä, inkuboitiin 30 min 37°C:ssa, mikroskopoitiin ja sonikoitiin tarvittaessa 20 kunnes solut olivat rikki (10 x 15 s). Solujäänteet sentrifugoitiin pois ja supernatanttiin tai sen laimennukseen (ä 5 ml) pipetoitiin 400 μΐ juuri valmistettua α-asetomaitohapon diesterin hydrolysaattia, inkuboitiin tarpeen mukaan 15, 30, 45 tai 60 min 30°C:ssa, reaktio 25 pysäytettiin lisäämällä 200 μΐ 1 N NaOH:ta ja näyte ' laitettiin jäihin. Muodostunut asetoiini määritettiin VP-reaktiolla: 1,2 ml:n näytteeseen pipetoitiin 500 μΐ 0,3 % kreatiiniliuosta, 600 μΐ samana päivänä valmistettua 5 % α-naftolia abs. etanolissa ja 300 μΐ 40 % KOH:ta. 30 Värin muodostumista seurattiin mittaamalla absorbanssi MCC540 (Multiskan spektrofotometri). Värin muodostuminen asetoiinista oli maksimissaan 20 min kuluttua. Värin muodostus diasetyylistä, joka myös reagoi VP-testissä, oli maksimissaan 2 min kuluttua. Muodostuneen asetoiinin 35 määrä luettiin tarvittaessa standardisuoralta. a-Aseto-maitohapon konversio suoraan asetoiiniksi todettiin myös GLC-kromatografiällä (kaasukromatografia) (Pajunen et 12 92333 ai., 1987).

α-Asetomaitohapon diesterin hvdrolvsaatti valmistettiin seuraavasti: Pipetoitiin 30 μΐ diesteriä, 240 μΐ deioni-5 soitua vettä ja 330 μΐ 1 N NaOH:ta, sekoitettiin ja pidettiin jäissä 15 min, minkä jälkeen lisättiin 5,4 ml deionisoitua vettä (EP-hakemus 0128714).

Geenin siirto panimohiivaan tehtiin protoplastimenetel-10 mällä (Henderson et ai., 1985, Penttilä et ai., 1987). Hiivasolut kasvatettiin eksponentiaaliseen kasvuvaiheeseen YPD-liuoksessa (100 ml), ne pestiin kerran vedellä ja kerran 1,2 M sorbitolilla ja resuspendoitiin 8 ml:aan STC-puskuria (1,2 M sorbitoli, 10 mM Tris HC1, 10 mM 15 CaCl2, pH 7,6), lisättiin zymolyaasia (150 μg) ja inku-boitiin 20-40 min +30°C:ssa. Protoplastoitumista seurattiin mittaamalla absorbanssi (Klett 66) deionisoituun veteen ja sorbitoliin (1,2 M) laimennetuista (100 μΐ 5 ml:aan) näytteistä. Sopivasti protoplastoituneet solut 20 (veteen laimennetun näytteen absorbanssi 20-40 % sorbitoliin laimennetun näytteen absorbanssista) pestiin kolme kertaa 1,2 M sorbitolilla ja kerran STC-puskurilla ja resuspendoitiin 600 μΐ-.aan STC-puskuria. 200 μΙΐΆζη protoplastisuspensiota lisättiin DNA:ta 3-10 μq korkein-25 taan 20 μ1:η tilavuudessa. Inkuboitiin huoneenlämmössä 10 min, lisättiin 2 ml TpD-puskuria (20 % PEG 6000, 10 mM Tris HC1, 10 mM CaCl2, pH 7,6) ja inkuboitiin edelleen 30 min huoneenlämmössä. Protoplastit sentrifugoitiin pöytä-sentrifuugilla (3000 rpm, 5 min) ja resuspendoitiin 200 30 μ1:3ίΆη TpD-puskuria ja maljättiin (ä 5 μΐ) heti top-aga-rissa (ä 5 ml) (NEPRA-alusta ilman kuparilisäystä) 0,4 ja/tai 0,6 mM kuparisulfaattia sisältäville NEPRA-mal-joille (ä 20 ml). Vain transformoituneet ja kupariresis-tenssigeenin (CUP1) saaneet hiivasolut kykenivät kas-35 vamaan tällä selektioalustalla muodostaen suuria pesäkkeitä noin viikossa.

13 92333

Hiivatransformanttien α-ALDC-aktiivisuusmääritvstä varten hiivasolut kasvatettiin YPD-liuoksessa ä 5 ml ilman ravistelua 30°C:ssa 17-20 h. Kasvuliuos sentrifugoitiin pois huoneenlämmössä 3000 rpm 10 min, solut pestiin 5 kerran deionisoidulla vedellä ä 5 ml, pestyt solut sus-pendoitiin 1 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria pH 7,0. Suspensioon lisättiin 10 μΐ zymolyaasiliuosta (5 mg/ml), sekoitettiin, inkuboitiin 30 min 37°C:ssa ja sekoitettiin voimakkaasti, jolloin muodostuneet protoplastit rikkou-10 tuivat. Näin saatuun soluekstraktiin lisättiin 80 μΐ juuri valmistettua α-asetomaitohapon diesterin hydro-lysaattia, inkuboitiin 60 min 30°C:ssa, minkä jälkeen tehtiin VP-koe: Pipetoitiin 500 μΐ 0,3 % kreatiiniliuos-ta, 600 μΐ samana päivänä valmistettua 5 % α-naftolia 15 abs. etanolissa ja 300 μΐ 40 % K0H:ta. Sekoitettiin ja seurattiin punaisen värin muodostumista 20-60 min.

Muodostuneen värin voimakkuus mitattiin tarvittaessa Multiskan spektrofotometrillä aallonpituudella 540 nm, 20 jolloin solujäänteet sentrifugoitiin pois liuoksesta ennen mittausta.

Hiivan kokonais-DNA:n eristäminen suoritettiin seuraavasti: Hiivapesäke siirrostettiin 5 ml:aan YPD-liuosta ja 25 kasvatettiin stationäärivaiheeseen (16-20 h) 30°C:ssa 1 ravistellen. Solut sentrifugoitiin 5 min 5000 rpm pöytä- sentrifuugissa ja resuspendoitiin 380 μ1ΐΆ&τ\ sorbitoli-liuosta (1,2 M sorbitoli - 0,1 M EDTA, pH 7,5). Lisättiin 7 μΐ zymolyaasiliuosta (5 mg/ml) ja inkuboitiin 30°C:ssa 30 30 min. Seos sentrifugoitiin 5 min 35000 rpm ja pelletti resuspendoitiin 690 pl:aan SDS-liuosta (50 mM Tris, pH 7,5 - 1 mM EDTA - 0,1 % SDS), sekoitettiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin Eppendorf-sentrifuugissa 2 min. Super-natanttiin lisättiin 4 μΐ RNAse A:ta (5 mg/ml) (Sigma) ja 35 inkuboitiin 37°C:ssa 30 min. Liuos ekstrahoitiin kerran fenolilla ja kerran kloroformi-isoamyylialkoholilla (24:1). DNA saostettiin etanolilla ja resuspendoitiin 50 14 92333 μΙΐΆείη puskuria (50 mM Tris pH 7,5 - 1 mM EDTA) .

"Dot blot” -hybridisaatio tehtiin seuraavasti: 10 μΐ edellä esitetyllä tavalla eristettyä hiivan kokonais-5 DNA:ta (tai vähemmän, mikäli geeni oli plasmidivektoris-sa) keitettiin 0,3 M NaOH-liuoksessa 10 min ja jäähdytettiin jäissä. Liuos tehtiin 0,1 M:ksi Tris-HCl:n suhteen (pH 7,5) ja 1 M:ksi NH4Ac:n suhteen ja imettiin vesi-imun avulla "dot blot" -laitteella 1 M NH4Ac:ssa 10 kostutetulle nitroselluloosafiltterille (Schleicher &

Schull, BA 85) hybridisaatiota ja autoradiografiaa varten.

Panimokokeissa käytetyt yleiset menetelmät on esitetty 15 Analytica-EBC:ssä, 1987. Oluen VDK-yhdisteiden ja aromiaineiden määritykset GLC-kromatografiällä suoritettiin kuten Pajunen et ai., 1987 ovat kuvanneet.

Esimerkki l. Aerobacter aeroaenes -bakteerin 20 a-ALPC-geenin eristäminen ia karakteri soiminen

Bakteerista Aerobacter aerogenes VTT-E-74023 eristettiin kromosomaalinen DNA fenoliuuttomenetelmällä (Amundsen ja 25 Neville, 1979).

Kosmidipankin tekemistä varten DNA pilkottiin Sau3A-restriktioentsyymillä osittaisesti siten, että saatiin 30-40 kb:n pituisia DNA-kappaleita, jotka liitettiin 30 BamHI-entsyymillä avattuun p3030-kosmidiin. Saadut hybri-dimolekyylit pakattiin in vitro lambda-faagipartikkelei-hin (Hohn ja Murray, 1977), joilla infektoitiin E. coli HB101. Transformantit selektoitiin ampisilliinia sisältävillä L-maljoilla.

Näin saadusta geenipankista etsittiin a-ALDC-geenin sisältävät kloonit replikoimalla kosmidipankkimaljät

II

35 15 92333 VP-maljoille, jotka testattiin kuten edellä on esitetty. Positiiviset pesäkkeet poimittiin alkuperäisiltä maljoilta. /S-kosmidikloonin α-ALDC-aktiivisuus varmistettiin tekemällä entsyymiaktiivisuusmääritys soluekstraktista 5 käyttäen α-asetomaitohappoa substraattina (kuva 2).

GLC-kromatografiällä todettiin lisätystä ct-asetomaitoha-posta syntyvän suoraan asetoiinia. Diasetyyliä sen sijaan ei todettu muodostuneen koeolosuhteissa.

10 α-ALDC-aktiivisuutta ilmentävästä 0-kloonista eristettiin kosmidi-DNA, josta tehtiin osittainen Sau3A-restriktio-entsyymidigestio. Saadut 2-5 kb:n mittaiset DNA-kappaleet liitettiin BamHI-entsyymillä avattuun ja alkalisella fosfataasilla käsiteltyyn Bluescribe M13+-vektoriin.

15 Näin saatu VP-positiivinen, plasmidin pB5 sisältävä klooni eristettiin kuten alkuperäistä kosmidikloonia seulottaessa. Plasmidin pB5 sisältävästä A. aerogenes-DNArsta tehtiin kaksi deleetiosarjaa alkaen insertin 20 molemmista päistä (Henikoff, 1984). Deleetiosarjojen tekoa varten plasmidi pB5 katkaistiin entsyymeillä SstI ja Asp718 sekä entsyymeillä Sphl ja BamHI. Deleetio-kloonien A. aerogenes-DNA:n emäsjärjestys määritettiin dideoksimenetelmällä (Sanger et ai., 1977) plasmideista 25 sekvensoimalla (Zagursky et ai., 1986). Deleetiokloonien a-ALDC-aktiivisuus testattiin VP-testillä. Eräs lyhyen A. aerogenes-DNA-alueen sisältävä, positiivisen VP-reaktion aiheuttava plasmidi oli deleetioklooni pMNB58. Tämän plasmidin sisältämän A. aerogenes-DNA:n emäsjärjestys ja 30 sen koodaaman entsyymin aminohappojärjestys on esitetty kuvassa 3.

Plasmidin pMNB58 sisältämä A. aerogenes-DNA määrittää 259 aminohapon pituista proteiinia (kuva 3). Hiivassa ilmen-35 tämistä varten ylimääräinen geeniä edeltävä DNA-alue (nukleotidit 50-235, kuva 3) poistettiin deleetiomutage-neesilla (Eghtedarzadeh ja Henikoff, 1986) käyttämällä 16 92333 oligonukleotidia "aid-loop" (kuva 4). Samalla muutettiin geenin aloituskodoni GTG (nukleotidit 235-237, kuva 3) hiivalle soveltuvaksi ATG:ksi ja aloituskodonia edeltävä -3-kohdassa oleva nukleotidi G A:ksi hiivaekspression 5 tehostamiseksi. Mutagenisoimattomien DNA-molekyylien määrää rajoitettiin pilkkomalla menetelmässä syntetisoidut molekyylit Asp718-entsyymillä ennen E. coliin transformoimista (kuva 4). Julkaistusta menetelmästä (Eghteda-rzadeh ja Henikoff, 1986) poiketen Sl-entsyymiä ei käy-10 tetty. E. coli -transformanteista etsittiin oikeanlaisen, deletoituneen plasmidin sisältävät kloonit restriktioent-syymidigestioilla, ja mutageneesin onnistuminen varmistettiin sekvensoimalla ko. alue restriktiokartoituksen perusteella oikeanlaiselta näyttäneestä plasmidista 15 pKBlOl (kuva 4).

Esimerkki 2. Aerobacter aeroaeneksen a-ALPC-geenin sisältävien hiivaplasmidien rakentaminen 20 Plasmidi pKBlOl (kuva 4) pilkottiin restriktioentsyy-meillä EcoRI ja Hindlll, ja 0,95 kb:n pituinen a-ALDC-geenin sisältävä fragmentti eristettiin LGT-agaroosi -geelistä. Näin saatujen DNA-molekyylien päät täytettiin tylpiksi Klenow-entsyymillä. DNA-molekyylit liitettiin 25 hiivan fosfoglyserokinaasigeenin (PGK1) promoottori- ja terminaattorialueiden väliin plasmidiin pMA91, joka oli pilkottu entsyymillä Bglll, tehty tylppäpäiseksi Klenow-entsyymillä ja fosfataasikäsitelty. Näin valmistetussa plasmidissa pKB007 (kuva 5) cr-ALDC-geeni on oikeassa 3 0 orientaatiossa PGiC-promoottoriin nähden. Noin 2,7 kb:tä pitkä PGJC/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin plasmidista pKB007 pilkkomalla Hindlll-entsyymillä ja eristämällä ko. DNA-pala LGT-agaroosigeelistä. Fragmentti ligoitiin HindiII-entsyymillä pilkottuun, fosfataasi-35 käsiteltyyn plasmidiin pET13:l, jolloin muodostui plasmidi pKB002 (kuva 5).

92553 17 a-ALDC geenin ilmentämiseksi hiivassa ADC1-promoottorin alaisena, rakennettiin ensin plasroidi pKB006 (kuva 6). Plasmidi pETl3:l pilkottiin HindiII-entsyymillä, DNA-päät täytettiin käyttämällä Klenow-entsyymiä, fosfataasikäsi-5 teltiin ja ligoitiin plasmidista pAAH5 BamHI-entsyymillä irrotetun 1,95 kb:tä pitkän Klenow-entsyymillä tylppäpäiseksi tehdyn fragmentin kanssa, joka sisälsi hiivan ADC1-geenin promoottorin ja terminaattorin. Tähän plas-midiin pKB006 liitettiin HindiII-kohtaan (päät täytetty 10 ja fosfataasikäsitelty) yllä kuvattu EcoRI- ja Hindlll-entsyymeillä plasmidista pKBlOl eristetty a-ALDC-geenin sisältävä DNA-fragmentti. Näin saadussa plasmidissa pKB003 α-ALDC-geeni on oikeassa orientaatiossa ADCl-pro-moottoriin nähden (kuva 6).

15

Esimerkki 3. DNA-konstruktjoiden valmistaminen

Aerobacter aerooeneksen a-ALDC-geenin liittämiseksi panimohiivan kromosomiin 20 Plasmidissa pKB007 (kuva 5) A. aerogeneksen a-ALDC-geeni on liitettynä hiivan PGK1-geenin promoottorin ja terminaattorin väliin. Tämä PGJCl/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin plasmidista pKB007 noin 2,7 kb:n fragmenttina, joka eristettiin LGT-agaroosigeelistä. Fragmentin 25 päät täytettiin Klenov-entsyymillä ja fragmenttia käy-• tettiin panimohiivan kotransformaatioon (esimerkki 5).

Vastaavanlaisen ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetin valmistamiseksi hiivatransformaatiota varten kasetti rakennettiin 30 ensin Bluescribe M13+-plasmidiin (kuva 7). Bluescribe M13+-plasmidista poistettiin Hindlll-kohta täyttämällä Hindlll-päät Klenow-entsyymin avulla ja ligoimalla päät yhteen. ADC1-promoottori ja -terminaattori eristettiin pAAH5-vektorista 1,95 kb:n pituisena BamHI-fragmenttina 35 ja ligoitiin BamHI-entsyymillä katkaistuun Bluescribe M13+ -vektoriin, josta Hindlll-kohta oli poistettu. Näin saatu plasmidi pKB102 katkaistiin Hindlll-entsyymillä, 18 92333 päät täytettiin Klenow-entsyymillä, fosfataasikäsiteltiin ja ligoitiin a-ALDC-geenin sisältävän tylppäpäiseksi tehdyn DNA-fragmentin kanssa, joka oli eristetty plas-midista pKBlOl EcoRI-Hindlll-fragmenttina. Tästä plas-5 midis ta pKB103 (kuva 7) ADCl/a-ALDC-ekspressiokasetti irrotettiin BamHI-digestiolla, fragmentin päät täytettiin Klenow-entsyymillä ja fragmenttia transformoitiin panimo-hiivaan kotransformaatiolla (esimerkki 5).

10 Esimerkki 4. a-ALDC-entsvvmiä tuottavien plasmidilla transformoitujen panimohiivakantoien rakentaminen

Plasmidi pKB002, jossa A. aerogenes -bakteerin cl-ALDC-15 geeni on liitetty hiivan PGK1-promoottoriin (kuva 5), ja plasmidi pKB003, jossa geeni on liitetty hiivan ADCl-promoottoriin (kuva 6), transformoitiin panimohiivaan VTT-A-63015 protoplastimenetelmällä (ks. menetelmät).

20 Transformantit selektoitiin kuparia sisältävillä NEPRA- maljoilla (0,4 mM tai 0,6 mM CuS04:ää pohja-agarissa) vektoreissa olevan hiivan CUPl-geenin toiminnan perusteella. Saatuja transformantteja kasvatettiin 0,6 mM CuS04:ää sisältävillä NEP-maljoilla (NEPRA ilman sorbito-25 lia). Geenin ilmentyminen panimohiivasolussa todettiin ' mittaamalla α-ALDC-aktiivisuus geenin sisältävän panimo- hiivan soluekstraktista edellä esitetyllä tavalla.

Näin saatiin α-ALDC-entsyymiä tuottavat, plasmidilla 30 pKB002 (PGK1-säätelyalueet) transformoidut panimohiiva-kannat VTT-A-87083 ja VTT-A-87084, sekä plasmidilla « pKB003 (ADCl-säätelyalueet) transformoitu panimohiiva-kanta VTT-A-87076.

Il 19 92333

Esimerkki 5. α-ALDC-entsvvmiä tuottavien panimohii- voien rakentaminen integroimalle a-AT.nc-creeni hiivan kromosomiin 5 Jotta lopullinen α-ALDC-entsyymiä tuottava panimohiiva olisi mahdollisimman samankaltainen kuin lähtökanta ja sisältäisi mahdollisimman vähän vierasta DNA:ta, hiivaan siirrettiin vain ot-ALDC-geeni hiivan PGK1- ja ADC1-geenien säätelyalueisiin liitettynä. Hiivan oma kromosomaa-10 linen PGK1- tai ADC1-geeni korvautuu käytetyn menetelmän seurauksena α-ALDC-geenillä homologisen rekombinaation tuloksena.

Hiivakannat rakennettiin kotransformaatiomenetelmällä 15 (kuva 8). 5 Mg:aa plasmidista pKB007 eristettyä PGJQ/a-ALDC-ekspressiokasettia (esimerkki 3) tai plasmidista pKB103 eristettyä ADCl/a-ALDC-ekspressiokasettia (esimerkki 3), jotka sisältävät A. aerogeneksen ct-ALDC-geenin, transformoitiin yhdessä 5 /ig:n kanssa plasmidia 20 pET13:l protoplastimenetelmällä (Penttilä et ai., 1987) panimohiivaan VTT-A-63015. Transformantit selektoitiin kuparia sisältävillä alustoilla kuten esimerkissä 4. Saaduista transformanteista eristettiin kokonais-DNA (ks. menetelmät) ja α-ALDC-geenin sisältävät transformantit 25 seulottiin "dot blot” -hybridisaatiolla (ks. menetelmät). A. aerogenes -geeniä varten käytettiin koettimena plasmidista pKBlOl (kuva 4) eristettyä 0,95 kb:n pituista EcoRI-Hindlll-fragmenttia. Fragmentti leimattiin radioaktiiviseksi käyttämällä a-32P-dCTP:tä (Amersham, Englanti) 30 ja "random primer labeling -kittiä" (Boehringer Mannheim, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Transformanttien tuottama α-ALDC-aktiivisuus testattiin soluekstrakteista α-asetomaitohappo substraattina (ks.

35 menetelmät).

α-ALDC-geenin saaneista, a-ALDC-aktiivisuutta tuottavista 20 92333 hiivaklooneista poistettiin selektioplasmidi pET13:1 kasvattamalla hiivasoluja YPD-liuoksessa, johon ei lisätty kuparia. Pesäke siirrostettiin 10 ml YPD-liuosta, kasvatettiin 1 vrk ravistellen 250 rpm 30°C:ssa, minkä jälkeen 5 100 /xl: 11a tätä kasvustoa siirrostettiin uudestaan 10 ml:aa YPD-liuosta ja kasvatettiin jälleen 1 vrk. Kasvusto maljattiin YPD-maljoille, joilla kasvaneiden erillispe-säkkeiden kasvu testattiin 0,6 mM CuS04:ää sisältävillä maljoilla. Testatuista pesäkkeistä 2-3 prosenttia ei 10 pystynyt kasvamaan kuparimaljoilla ja oli menettänyt pET13:1-plasmidin. Näiden pesäkkeiden a-ALDC-aktiivisuus testattiin ja α-ALDC-geenin olemassaolo varmistettiin "dot blot" -hybridisaatiolla (ks. menetelmät).

15 Näin saatiin PGKl/a-ALDC-ekspressiokasetilla transformoitu, A. aerogenes -bakteerin α-ALDC-geenin sisältävä ja α-ALDC-aktiivisuutta tuottava hiivakanta VTT-A-88085 sekä ADC1/a-ALDC-ekspressiokasetin sisältävä, a-ALDC-aktiivi-suutta tuottava hiivakanta VTT-A-88086. Näissä kannoissa 20 α-ALDC-geeni on integroitunut hiivan kromosomiin ja hiivalle vierasta DNA:ta on vain cr-ALDC-geenin verran.

Esimerkki 6. Oluen valmistus vhdistelmä-DNA-kannoilla VTT—A—87083 ia VTT-A-87084 25 NEP-agarilta kutakin hiivakantaa siirrostettiin kahteen Freudenreich-pulloon, joissa oli 25 ml vierresokeriliuos-ta, kasvatettiin ravistellen 200 rpm 25°C:ssa yli yön. Kasvustot kaadettiin 5 l:n erlenmeyerpulloihin, joissa 30 oli 3 1 vierresokeriliuosta sisältäen myös kuparia, kasvatettiin ravistellen 125 rpm 25°C:ssa 2 vrk, hiivamassan • annettiin sedimentoitua 1 vrk, kirkastunut kasvuliuos dekantoitiin pois ja sedimentoitunut hiiva sentrifugoi-tiin steriileissä, taaratuissa sentrifuugiputkissa.

35 Sentrifugoidun hiivamassan määräksi säädettiin 125 g, jolla siirrostettiin pääkäyminen.

21 92333

Vierrettä noudettiin panimolta ja laimennettiin keitetyllä vedellä kantavierreväkevyyteen noin 10,5 p-%.

Vierre ilmastettiin Keg-astioissa (ä 50 1) steriiliksi suodatetulla paineilmalla 30 min ajan nopeudella 3 1/min.

5 Välittömästi ilmastuksen jälkeen vierre siirrettiin suodatetulla paineilmalla teräksisiin käymisputkiin (ä 50 1) käymiskellariin +10°C. Vierre siirrostettiin ko. hiivakannoilla määrällä 2,5 g/1.

10 Pääkäymisen lämpötila oli +10°C ja käymistä seurattiin päivittäin (3-7 vrk) määrittämällä hiivan määrä suspensiossa (2 ml pestyä hiivasuspensiota kuivattiin taara-tuilla kellolaseilla yli yön +105°C:ssa), näennäinen uutepitoisuus (ominaispainomittaus) ja VDK-yhdisteet 15 (GLC-kromatografiällä vapaa diasetyyli ja pentaanidioni sekä niiden prekursorit α-asetomaitohappo ja a-asetohyd-roksi-voihappo, joiden summa on totaali-VDK). Pääkäymisen lopusta määritettiin lisäksi tärkeimmät aromiaineet (GLC-kromatografia), etanoli (tislaus) ja hiivasaanto 20 (käymisputken pohjalle sedimentoituneen hiivan sentrifu-goitu massa). Käymisaste laskettiin etanoli- ja uutepi-toisuuksien perusteella. Pääkäynyt olut siirrettiin suoraan stabilointivaiheeseen (3 vrk), suodatettiin (levysuodatin + membraani), pullotettiin, pastöroitiin 25 (60°C/30 min) ja valmis olut analysoitiin uudelleen, jolloin myös makupaneeli arvosteli oluet.

Kuva 9 esittää testattujen hiivakantojen uutepitoisuudet ja hiivojen kasvun sekä flokkuloitumisen pääkäymisen 30 aikana. Vertailukannan (VTT-A-63015) ja yhdistelmä-DNA-kantojen (VTT-A-87083 ja VTT-A-87084) välillä ei . todettu mitään eroja ko. panimoarvoissa. Kuva 10 esittää VDK-yhdisteiden muodostumisen pääkäymisen aikana ilmoitettuna totaalimäärinä (vapaa + prekursori) diasetyyliksi 35 laskettuna. Vertailukannan maksimi totaali-VDK oli 0,346 mg/1 ja käymisen lopussa 0,227 mg/1. Yhdistelmä-DNA-kan-nat käyttäytyivät keskenään samalla tavalla. Niiden 22 92333 VDK-yhdisteet pysyivat koko ajan samalla tasolla (totaa-li-diasetyyli 0,007 mg/1, totaalipentaanidioni 0,013 xng/1, totaali-VDK 0,020 mg/1) eivätkä missään vaiheessa saavuttaneet diasetyylin makukynnysarvoa 0,050 mg/1. Kuva 5 13 esittää pääkäyneiden oluiden analyysit ja valmiin oluen makuarvostelun. Varsinaiset panimoarvot eivät olleet muuttuneet yhdistelmäkannoilla eikä a-ALDC:n toiminta hiivassa pääkäymisen aikana ollut merkitsevästi häirinnyt oluen tärkeimpien aromiaineiden muodostumista.

10 Sikuna-alkoholit olivat tarkalleen samalla tasolla, mutta estereiden määrä oli hiukan alentunut. Makupaneelin arvostelun perusteella olut oli flavoriltaan virheetöntä ja hyvää. Valmiin oluen analyysit eivät juuri poikenneet pääkäymisen jälkeen tehdyistä analyyseistä ja vastaavat 15 hyvän oluen arvoja.

Esimerkki 7. Oluen valmistus vhdistelmä-DNA-kannalla VTT—A—87 07 6 20 Koejärjestely oli täsmälleen sama kuin esimerkissä 6.

Kuva 11 esittää vertailu- ja yhdistelmä-DNA-kannan VTT-A-87076 uutepitoisuudet sekä hiivojen kasvun ja flokkuloitumisen pääkäymisen aikana. Kantojen välillä ei todettu eroja ko. panimoarvoissa. Kuva 12 esittää 25 VDK-yhdisteiden muodostumisen pääkäymisen aikana. Ver- tailukannan maksimi totaali-VDK oli 0,354 mg/1 ja käymisen lopussa 0,213 mg/1. Myös yhdistelmä-DNA-kannalla oli todettavissa heikkoa VDK-yhdisteiden muodostumista. Pääkäymisen keskivaiheilla totaali-VDK saavutti arvon 30 0,065 mg/1 (4 vrk), mutta totaalidiasetyylin maksimiarvo oli vain 0,024 mg/1 (4 vrk). Pääkäymisen lopussa olut oli . VDK-yhdisteiden suhteen myös tässä koesarjassa valmista siirrettäväksi stabilointivaiheeseen ilman varastokäymis-tä. Kuva 13 esittää pääkäyneiden oluiden analyysit.

35 Yhdistelmä-DNA-kanta VTT-A-87076 käyttäytyi täsmälleen samalla tavalla - myös aromiaineiden muodostuksen suhteen - kuin vertailukanta. Valmis olut oli flavoriltaan erit-

II

23 92333 täin hyvää ja myös muilta analyysiarvoiltaan erittäin hyvä.

Viiteiulkaisut 5

Ammerer, G. 1983. Expression of genes in yeast using the ADC1-promoter. Methods Enzymol. 101, 192-210.

Amundsen, S.K. ja Neville, M.E. 1979. Comparison of three 10 procedures for isolating DNA from bacteria. Microbios 24, 29-39.

Analytica-EBC 1987. 4. painos. Brauerei- und Getränke-Rundschau, Zurich. 271 s.

15

Cantwell, B.A., Brazil, G., Murphy, N. ja McConnell, D.J. 1986. Comparison of expression of the endo-j8-l,2-l,4-glucanase gene from Bacillus subtilis in Saccharomyces cerevisiae from the CYC1 and ADHI 20 promoters. Curr. Genet. 11, 65-70.

Eghtedarzadeh, M.K. ja Henikoff, S. 1986. Use of oligonucleotides to generate large deletions. Nucleic Acids Res. 14, 5115.

25 EP-hakemusjulkaisu 0128714 α-acetolactate decarboxylase enzyme and preparation thereof. Novo Industri A/S.

Godtfredsen, S.E., Lorck, H. ja Sigsgaard, P. 1983. On 30 the occurrence of α-acetolactate decarboxylases among microorganisms. Carlsberg Res. Commun. 48, 239-247.

Godtfredsen, S.E. ja Ottesen, M. 1982. Maturation of beer with α-acetolactate decarboxylase. Carlsberg Res. Commun.

35 47, 93-102.

Henderson, R.C.A., Cox, B.S. ja Tubb, R. 1985. The 24 92333 transformation of brewing yeasts with a plasmid containing the gene for copper resistance. Curr. Genet.

9, 133-138.

5 Henikoff, S. 1984. Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing. Gene 28, 351-359.

Hohn, B. ja Murray, K. 1977. Packaging recombinant DNA 10 molecules into bacteriophage particles in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3259-3263.

Innis, M.A., Holland, M.J., McCabe, P.C., Cole, G.E., Wittman, V.P., Tai, R., Watt, K.W.K., Gelfand, D.H., 15 Holland, J.P. ja Meade, J.H. 1985. Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae. Science 228, 21-26.

20 Knowles, J.K.C. ja Tubb, R. 1987. Recombinant DNA: Gene transfer and expression techniques with industrial yeast strains. EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki 1986, Monograph XII, 169-185.

25 Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J. 1982.

*: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring

Harbor, USA. 545 s.

Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., 30 Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T., Kingsman, A.J. ja Kingsman, S.M. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene 24, 1-14.

35 Pajunen, E., Mäkinen, V. ja Gisler, R. 1987. Secondary fermentation with immobilized yeast. Proc. 21st EBC Congress, Madrid 1987, 441-448.

25 92333

Penttilä, M.E., Nevalainen, K.M.H., Raynal, A. ja Knowles, J.K.C. 1984. Cloning of Aspergillus niger genes in yeast. Expression of the gene coding Aspergillus beta-glucosidase. Mol. Gen. Genet. 114, 494-499.

5

Penttilä, M.E., Suihko, M.-L., Lehtinen, U., Nikkola, M. ja Knowles, J.K.C. 1987. Construction of brewer's yeasts secreting fungal endo-jf?-glucanase. Curr. Genet. 12, 413-420.

10

Sanger, F., Nielen, S. ja Coulson, A.R. 1977.

DNA-sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.

15 So, M., Boyer, H., Betlach, M. ja Fallow, S. 1978.

Molecular cloning of an Escherichia coli plasmid determinant that encodes for the production of heat-stable enterotoxin. J. Bacteriol. 128, 463.

20 Yanisch-Perron, c., Vieira, J. ja Messing. J. 1985.

Improved Ml3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors.

Gene 33, 103-119.

25 Yocum, R.R. 1986. Genetic engineering of industrial yeasts. Proceedings Bio Expo 86, Butterworth, Stoneham MA, 171-180.

Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. ja Lomax, N.

30 1986. Rapid and easy sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene Anal.

Techn. 2, 89-94.

Claims (11)

1. 92333 1. α-asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta (ct-ALDC) (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä koodaava eristetty ja 5 puhdistettu DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa seuraavaa polypeptidiä ATGAATCATTATCCTGAATGCACCTGCCAGGAGAGCCTGTGCGAAACCGTACGCGGC 10 MetAsnHi sTyrProGluCysThrCysGInGluSerLeuCysGluThrVa1ArgGly TTCTCCGCCCACCACCCTGATAGCGTTATCTATCAGACCTCTCTGATGAGCGCGCTG PheSerAlaHisHisProAspSerVallleTyrGlnThrSerLeuMetSerAlaLeu

   15 CTGAGCGGGGTCTATGAGGGTAGCACCACCATCGCCGACCTGCTGACCCACGGCGAC LeuSerGlyValTyrGluGlySerThrThrlleAlaAspLeuLeuThrHisGlyAsp TTCGGTCTCGGCACCTTTAACGAACTCGATGGCGAACTGATTGCCTTTAGCAGCGAG PheGlyLeuGlyThrPheAsnGluLeuAspGlyGluLeuIleAlaPheSerSerGlu 20 GTCTACCAGCTGCGCGCTGACGGCAGCGCGCGTAAAGCCCGGGCGGATCAAAAAACG ValTyrGlnLeuArgAlaAspGlySerAlaArgLysAlaArgAlaAspGlnLysThr CCCTTCGCGGTGATGACCTGGTTCAGACCGCAGTACCGTAAAACCTTTGACCACCCG 25 ProPheAlaValMetThrTrpPheArgProGlnTyrArgLysThrPheAspHisPro GTCAGCCGCCAGCAGCTGCACGACGTTATCGACCAGCAAATCCCCTCCGATAACCTG ValSerArgGlnGlnLeuHisAspVallleAspGlnGlnlleProSerAspAsnLeu
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tun nettu siitä, että se on eristetty bakteerikannasta Aerobacter aerogenes VTT-E-74023.
3. 3. Kiivavektori, tunnettu siitä, että se sisäl-10 tää α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä koodaavan, patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin liitettynä panimo-olosuhteissa toimiviin hiivageenin säätelyalueisiin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi ekspressoi-tuu näiden säätelyalueiden alaisena. 15

   3. TTCTGCGCCCTGCATATTGATGGTCACTTTCGCCACGCCCACACCCGCACCGTGCCG PheCysAlaLeuHisIleAspGlyHisPheArgHisAlaHisThrArgThrValPro CGGCAGACGCCGCCCTATCGGGCGATGACCGACGTGCTCGATGACCAGCCGGTTTTC ArgGlnThrProProTyrArgAlaMetThrAspValLeuAspAspGlnProValPhe 35 CGCTTCAACCAGCGCAAGGGGACGCTGGTCGGCTTTCGCACCCCGCAGCATATGCAG ArgPheAsnGlnArgLysGlyThrLeuValGlyPheArgThrProGlnHisMetGln GGCCTTAACGTTGCCGGCTACCACGAGCACTTTATTACCGACGATCGCCAGGGCGGC 40 GlyLeuAsnValAlaGlyTyrHisGluHisPhelleThrAspAspArgGlnGlyGly GGCCATCTGCTGGACTACCAGCTCGATAGCGGCGTGCTGACCTTCGGCGAGATCCAC GlyHisLeuLeuAspTyrGlnLeuAspSerGlyValLeuThrPheGlyGluIleHis

   45 AAGCTGATGATTGACCTCCCGGCCGACAGCGCTTTCCTGCAGGCCGACCTGCATCCT LysLeuMetlleAspLeuProAlaAspSerAlaPheLeuGlnAlaAspLeuHisPro GA CAAT CT CGATGCCGCTATTCGTGCGGTAGAAAAC AspAsnLeuAspAlaAlalleArgAlaValGluAsn 50 92333 ja että se siirrettynä panimohiivaan ja ekspressoituna siinä panimokäymisen aikana nopeuttaa oluen valmistusprosessia.
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivavektori, tunnettu siitä, että säätelyalueet, joiden alaisuuteen DNA-sekvenssi on liitetty, ovat hiivan alkoholidehydro-genaasigeenin ADC1 tai hiivan fosfoglyserokinaasigeenin

   20 PGK1 promoottorialueita ja mahdollisesti myös terminaat-torialueita.
5. 5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen hiivavektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi pKB002 tai 25 pKB003, joiden rakenne on esitetty kuvissa 5 ja 6.
6. 6. Ekspressiokasetti, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin, 30 joka koodaa α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä sellaisenaan tai liitettynä patenttivaatimuksessa 3 tai 4 määriteltyihin hiivageenin säätelyalueisiin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi ekspressoituu näiden säätelyalueiden alaisena. 35
7. 7. Saccharomyces cerevisiae -panimohiivakanta, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 92333 mukaisen DNA-sekvenssin, joka koodaa a-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä ja että se on valmistettavissa transformoimalla siihen jokin patenttivaatimusten 3-5 mukaisista hiivavektoreista autonomisesti replikoitu-5 vana plasmidina tai integroimalla sen kromosomiin patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressiokasetti, ja että se kykenee panimokäymisen aikana tuottamaan a-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä.
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen hiivakanta, tun nettu siitä, että se on Saccharomyces cerevisiae VTT-A-87083, VTT-A-87084, VTT-A-88085, VTT-A-88086 tai VTT-A-87076.
9. 9. Menetelmä uusien panimohiivakantojen rakentamiseksi, tunnettu siitä, että (a) eristetään sopivasta donoriorganismista, esimerkiksi Aerobacter aerogenes -bakteerista patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, 20 joka koodaa α-ALDC-aktiivisuutta (EC 4.1.1.5) omaavaa entsyymiä, (b) rakennetaan patenttivaatimusten 3-5 mukainen hiivavektori tai patenttivaatimuksen 6 mukainen ekspressiokasetti käyttäen mainittua DNA- 25 sekvenssiä, (c) siirretään tämä vektori tai ekspressiokasetti autonomisesti monistuvana tai kromosomiin integroimalla Saccharomyces cerevisiae -lajin panimohiivaan. 30
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva, johon mainittu DNA-sekvenssi siirretään, on panimohiivakanta Saccharomyces cerevisiae VTT-A-63015. 35
11. 11. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisten panimohiivakantojen käyttö menetelmässä oluen valmistamiseksi. 29 92333