JPH03219874A - リボザイムの新規合成系 - Google Patents
リボザイムの新規合成系Info
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- JPH03219874A JPH03219874A JP1329831A JP32983189A JPH03219874A JP H03219874 A JPH03219874 A JP H03219874A JP 1329831 A JP1329831 A JP 1329831A JP 32983189 A JP32983189 A JP 32983189A JP H03219874 A JPH03219874 A JP H03219874A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はリボザイムの新規合成系に関するものである。
従来、すべての酵素はタンパク質から構成されていると
確信されていたが、１９８１年に酵素活性を有するＲＮ
Ａ分子、すなわちリボザイムが発見され、従来の酵素に
関する概念は打ち破られた。
確信されていたが、１９８１年に酵素活性を有するＲＮ
Ａ分子、すなわちリボザイムが発見され、従来の酵素に
関する概念は打ち破られた。
この画期的発見はコロラド大学のＴ、Ｃｅｃｈ教授らに
よってもたらされ、原生動物のテトラヒメラのリポソー
ムＲＮＡ （ｒ ＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を借
りずに、遺伝情報伝達上不必要なイントロン（ＩＶＳ）
をセルフスプライシングにより取り除くことを証明した
（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ、３０８． ｐ、８２０８２５
（１９８４））。
よってもたらされ、原生動物のテトラヒメラのリポソー
ムＲＮＡ （ｒ ＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を借
りずに、遺伝情報伝達上不必要なイントロン（ＩＶＳ）
をセルフスプライシングにより取り除くことを証明した
（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ、３０８． ｐ、８２０８２５
（１９８４））。
その後、ホスホジエステル結合をセルフスプライシング
するような触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と発見さ
れているほか、他のＲＮＡ分子を切断するリボザイムも
見い出されている。
するような触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と発見さ
れているほか、他のＲＮＡ分子を切断するリボザイムも
見い出されている。
）
このような中で、最近、Ｊ、Ｈａｓｅｌｏｆｆと−ル。
Ｇｅｒｌａｃｈは、数種の植物ウィルスのリボザイムの
間で共通に保持されている塩基配列に着目し、わずか２
４塩基で触媒活性部位を構成する人工リポザイムの構築
に成功している（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ、３３４． ｐ
。
間で共通に保持されている塩基配列に着目し、わずか２
４塩基で触媒活性部位を構成する人工リポザイムの構築
に成功している（Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ、３３４． ｐ
。
５８５−５９１ （１９８８））。
第１図はこの人工リポザイムのデザインを示すもので、
この人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子の塩基配
列を認識して塩基対を形成するパインディングサイトＣ
と、２４個の特定の塩基配列を有する触媒活性部位Ｂか
ら構成されており、５ｕｂｓｔｒａｔｅとして示された
基質ＲＮＡのＡ （ＧＵＣ）部分に隣接する位置でＲＮ
Ａの切断を行う（図中、矢印で示す）。
この人工リボザイムは、基質となるＲＮＡ分子の塩基配
列を認識して塩基対を形成するパインディングサイトＣ
と、２４個の特定の塩基配列を有する触媒活性部位Ｂか
ら構成されており、５ｕｂｓｔｒａｔｅとして示された
基質ＲＮＡのＡ （ＧＵＣ）部分に隣接する位置でＲＮ
Ａの切断を行う（図中、矢印で示す）。
なお、このＡ部分のＲＮＡ配列は、ＧＵＣのみでなく、
他の配列に変更することも可能である。
他の配列に変更することも可能である。
そして、このＪ、Ｈａｓｅｌｏｆｆ等の人工リボザイム
の構築において使用した手法は、上記のリボザイムのデ
ザインに基づいてリボザイムＲＮＡと相補塩基配列を有
し、リポザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成してプ
ラスミドに挿入し、さらにこの組み換えプラスミドを形
質転換して得られたクローンを制限酵素で切断して、リ
ボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得、これを鋳
型として１ｎｖｉｔｒｏで転写して人工リボザイムを得
るもので、この実施においてはバインデイグサイトの塩
基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、この３種の
リボザイムがクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置で切断す
ることを明らかにしている。
の構築において使用した手法は、上記のリボザイムのデ
ザインに基づいてリボザイムＲＮＡと相補塩基配列を有
し、リポザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成してプ
ラスミドに挿入し、さらにこの組み換えプラスミドを形
質転換して得られたクローンを制限酵素で切断して、リ
ボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を得、これを鋳
型として１ｎｖｉｔｒｏで転写して人工リボザイムを得
るもので、この実施においてはバインデイグサイトの塩
基配列が異なる３種のリボザイムを合成し、この３種の
リボザイムがクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼに対応するｍＲＮＡを各々異なる位置で切断す
ることを明らかにしている。
しかしながら、上記のような従来のりポザイムの製造法
においては、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳
型として、リボザイムＲＮＡに転写する際に、該ＤＮＡ
により組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断して
から転写するという余分の手間を要するものであった。
においては、リボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを鋳
型として、リボザイムＲＮＡに転写する際に、該ＤＮＡ
により組み換えられたプラスミドを制限酵素で切断して
から転写するという余分の手間を要するものであった。
この理由は、リボザイムにおいては、基質ＲＮＡの切断
部位を認識するために必要となるパインディングサイト
と触媒活性部位以外の余分な塩基配列を有する場合、そ
の余分な塩基配列が基質ＲＮＡの切断部位以外の相補的
な塩基配列と塩基対を形成してしまう場合があり、この
ため基質特異性が低下してしまう、これを防止するには
、該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてリ
ボザイムに転写する際に５′末端側と３′末端側におけ
る余分な塩基配列が転写されないようにすることが必要
となる。
部位を認識するために必要となるパインディングサイト
と触媒活性部位以外の余分な塩基配列を有する場合、そ
の余分な塩基配列が基質ＲＮＡの切断部位以外の相補的
な塩基配列と塩基対を形成してしまう場合があり、この
ため基質特異性が低下してしまう、これを防止するには
、該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片を鋳型としてリ
ボザイムに転写する際に５′末端側と３′末端側におけ
る余分な塩基配列が転写されないようにすることが必要
となる。
５′末端側は、プロモータのすぐ下流に上記ＤＮＡを連
結させることによっても解決することができるが、３′
末端側はリボザイムの転写において未だユニバーサルな
ターミネータが見い出されていないので、従来法におい
ては、３′末端側の処理に際して制限酵素を使用するい
わゆるランオフ法を採らざるを得なかったものである（
第２図参照）。
結させることによっても解決することができるが、３′
末端側はリボザイムの転写において未だユニバーサルな
ターミネータが見い出されていないので、従来法におい
ては、３′末端側の処理に際して制限酵素を使用するい
わゆるランオフ法を採らざるを得なかったものである（
第２図参照）。
しかし、このような従来の制限酵素を使用する方法にお
いては、制限酵素を使用するという余分の手間に加えて
、転写において切断された線状のＤＮＡを使用するため
、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、リポザイムを合成することも
可能であるが、生体内において、リボザイムＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ断片を含む組み換えベクターを保持、増
殖せしめつつリボザイムを産生させることはできず、例
えば動。
いては、制限酵素を使用するという余分の手間に加えて
、転写において切断された線状のＤＮＡを使用するため
、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、リポザイムを合成することも
可能であるが、生体内において、リボザイムＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ断片を含む組み換えベクターを保持、増
殖せしめつつリボザイムを産生させることはできず、例
えば動。
植物の生体中に保持しつつ病原性ウィルス由来のｍＲＮ
Ａを切断し、無害化することは困難であった。
Ａを切断し、無害化することは困難であった。
本発明の課題は、上記のような制限酵素による切断を行
わずに、リポザイムＲＮＡをコードするＤＮＡにより組
み換えられた環状のベクターをそのまま鋳型として余分
な塩基配列を有しないリポザイムを転写することができ
、かつ生体内においても該組み換えベクターを保持増殖
させながらリポザイムを産生できるリボザイムの新規な
合成系を提供しようとするものである。
わずに、リポザイムＲＮＡをコードするＤＮＡにより組
み換えられた環状のベクターをそのまま鋳型として余分
な塩基配列を有しないリポザイムを転写することができ
、かつ生体内においても該組み換えベクターを保持増殖
させながらリポザイムを産生できるリボザイムの新規な
合成系を提供しようとするものである。
本発明者等は、鋭意研究の結果、組み換えベクターの構
築において、リボザイムＲＮＡをコードする領域を含む
第１のＤＮＡ配列の下流側に、リポザイムＲＮＡをコー
ドし、かつ転写された第１リボザイムＲＮＡの３′末端
側をセルフプロセシングにより切断し得る第２のＤＮＡ
配列を付加せしめることにより、上記課題を解決し得る
ことを見い出し、本発明を完成するに至ったものである
。
築において、リボザイムＲＮＡをコードする領域を含む
第１のＤＮＡ配列の下流側に、リポザイムＲＮＡをコー
ドし、かつ転写された第１リボザイムＲＮＡの３′末端
側をセルフプロセシングにより切断し得る第２のＤＮＡ
配列を付加せしめることにより、上記課題を解決し得る
ことを見い出し、本発明を完成するに至ったものである
。
すなわち、本発明は、
１、リボザイムＲＮＡをコードする領域を含む第１のＤ
ＮＡ配列の下流側に、転写されるリポザイムＲＮＡの３
′末端側をセルフプロセシングにより切断するリボザイ
ムＲＮＡをコードする領域を含む第２のＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ断片。
ＮＡ配列の下流側に、転写されるリポザイムＲＮＡの３
′末端側をセルフプロセシングにより切断するリボザイ
ムＲＮＡをコードする領域を含む第２のＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ断片。
２、下記のＤＮＡ配列を含む上記ｌ記載のＤＮＡ断片。
す■
（但し、式中、星印は形成された塩基対を表す。）３、
第１のＤＮＡ配列の上流側にプロモータ配列を有する上
記ｌ又は２記載のＤＮＡ断片。
第１のＤＮＡ配列の上流側にプロモータ配列を有する上
記ｌ又は２記載のＤＮＡ断片。
４、上記１〜３のいずれか記載のＤＮＡ断片により組み
換えられた組み換えベクター ５、上記４記載の組み換えベクターを鋳型としてＲＮＡ
に転写することを特徴とする３′末端側がセルフプロセ
シングされたリボザイムの製造方法。
換えられた組み換えベクター ５、上記４記載の組み換えベクターを鋳型としてＲＮＡ
に転写することを特徴とする３′末端側がセルフプロセ
シングされたリボザイムの製造方法。
６、転写が生体内で行われる上記５の製造方法。
７、上記５又は６記載の製造方法により得られたリボザ
イム。
イム。
８゜次のＲＮＡ配列を有する上記６記載のリボザイム。
（但し、式中、星印は形成された塩基対を表す。）に関
するものである。
するものである。
以下、本発明を更に詳述する。
本発明における組み換えベクターの構築において挿入さ
れるＤＮＡ断片中の上記リポザイムＲＮＡをコードする
領域を含む第１のＤＮＡ配列は、リボザイムＲＮＡと相
補の塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位
をコードする部分と、その両端の該リボザイムＲＮＡの
基質ＲＮＡの切断部位を認識するパインディングサイト
をコードする部分を含む。
れるＤＮＡ断片中の上記リポザイムＲＮＡをコードする
領域を含む第１のＤＮＡ配列は、リボザイムＲＮＡと相
補の塩基配列を有し、リボザイムＲＮＡの触媒活性部位
をコードする部分と、その両端の該リボザイムＲＮＡの
基質ＲＮＡの切断部位を認識するパインディングサイト
をコードする部分を含む。
また、同じく挿入されるＤＮＡ断片中において、上記第
１のＤＮＡ配列の下流側に位置する第２のＤＮＡ配列は
、前記第１のＤＮＡ配列に基づき転写されたリボザイム
ＲＮＡの３′末端側を切断するためのものでリボザイム
ＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分とその両端の基
質ＲＮＡの（第１のリボザイムの３′末端）切断部位を
認識するパインディングサイトをコードする部分より成
る。この５′上流側にさらに転写されたＲＮＡが、セル
フプロセシングされる切断部位をコードするＤＮＡ配列
を有するが、この配列は第１のリボザイムの３′末端の
パインディングサイトを含む領域もしくは第３図のよう
にパインディングサイトを含まないｅＪＪｊ！の配列で
も良い。
１のＤＮＡ配列の下流側に位置する第２のＤＮＡ配列は
、前記第１のＤＮＡ配列に基づき転写されたリボザイム
ＲＮＡの３′末端側を切断するためのものでリボザイム
ＲＮＡの触媒活性部位をコードする部分とその両端の基
質ＲＮＡの（第１のリボザイムの３′末端）切断部位を
認識するパインディングサイトをコードする部分より成
る。この５′上流側にさらに転写されたＲＮＡが、セル
フプロセシングされる切断部位をコードするＤＮＡ配列
を有するが、この配列は第１のリボザイムの３′末端の
パインディングサイトを含む領域もしくは第３図のよう
にパインディングサイトを含まないｅＪＪｊ！の配列で
も良い。
そして、本発明において、この組み換えベクターを用い
てリボザイムを製造する場合は、該組み換えベクターを
試験管内あるいは酵母、カビ、植物、動物等の生体中に
保持せしめてリボザイムの転写を行う。
てリボザイムを製造する場合は、該組み換えベクターを
試験管内あるいは酵母、カビ、植物、動物等の生体中に
保持せしめてリボザイムの転写を行う。
転写されたリボザイムの３′末端はセルフプロセシング
により切断されて余分な塩基配列は付加されない、また
は第３図の構築の場合は第６図に示す通り、分子内で塩
基対を形成し、基質認識には影響を与えない。
により切断されて余分な塩基配列は付加されない、また
は第３図の構築の場合は第６図に示す通り、分子内で塩
基対を形成し、基質認識には影響を与えない。
以上の点を第３．４．６図に基づき更に具体的に説明す
る。
る。
例えば第３図は、酵母の凝集性に関する遺伝子由来ｍＲ
ＮＡ （以下、ＳＦＬ ｌという。）を切断し得る本発
明の組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ ８４５９の構造を
表すものであり、第４図に示す６本のオリゴヌクレオチ
ドを常法により化学合成した後、それぞれの５′末端を
リン酸化して結合し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔ■で切断した
プラスミドｐＵｃ１１９に連結して調製したものである
。
ＮＡ （以下、ＳＦＬ ｌという。）を切断し得る本発
明の組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ ８４５９の構造を
表すものであり、第４図に示す６本のオリゴヌクレオチ
ドを常法により化学合成した後、それぞれの５′末端を
リン酸化して結合し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔ■で切断した
プラスミドｐＵｃ１１９に連結して調製したものである
。
該プラスミドは、Ｔ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モータの下流側にＳＦＬ １の切断部位を認識するパイ
ンディングサイトをコードする部分とループ状の触媒活
性部位をコードする部分からなるリポザイムＲＮＡに対
する第１のＤＮＡ部分を有しており、更にその下流側に
おいて転写されたＲＮＡがセルフプロセシングにより切
断される切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ ５ｉｔｅ） よ
、この切断を行うループ状の触媒活性部位及び上記セル
フプロセシングの切断部位を認識するパインディングサ
イトからなるリボザイムＲＮＡをコードする第２のＤＮ
Ａ配列を有している。そして、上記パインディングサイ
トをコードするＤＮＡ配列は、切断部位置前にある一つ
の塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係に
あり塩基対を形成する。
モータの下流側にＳＦＬ １の切断部位を認識するパイ
ンディングサイトをコードする部分とループ状の触媒活
性部位をコードする部分からなるリポザイムＲＮＡに対
する第１のＤＮＡ部分を有しており、更にその下流側に
おいて転写されたＲＮＡがセルフプロセシングにより切
断される切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ ５ｉｔｅ） よ
、この切断を行うループ状の触媒活性部位及び上記セル
フプロセシングの切断部位を認識するパインディングサ
イトからなるリボザイムＲＮＡをコードする第２のＤＮ
Ａ配列を有している。そして、上記パインディングサイ
トをコードするＤＮＡ配列は、切断部位置前にある一つ
の塩基部分を除いてその両側の塩基配列と相補の関係に
あり塩基対を形成する。
該プラスミドは、転写をＴ、プロモータの下流＋１から
始め、ＳＦＬ ｌ用のリボザイム部分及びその下流側の
塩基配列部分を順次ＲＮＡに転写していくが、転写され
たＲＮＡは前記した切断部位においてセルフプロセシン
グされることにより、以後の余分な塩基配列は得られる
リボザイムには付加されない。
始め、ＳＦＬ ｌ用のリボザイム部分及びその下流側の
塩基配列部分を順次ＲＮＡに転写していくが、転写され
たＲＮＡは前記した切断部位においてセルフプロセシン
グされることにより、以後の余分な塩基配列は得られる
リボザイムには付加されない。
したがって、この第３図の組み換えプラスミドを鋳型と
して転写することにより得られるリポザイムＲＮＡは第
６図の塩基配列を有するものとなる。このリボザイムＲ
ＮＡは３′末端側に相補の塩基配列を有し、塩基対を形
成してヘアピン構造となっており、このため生体内にお
けるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有
するものである。
して転写することにより得られるリポザイムＲＮＡは第
６図の塩基配列を有するものとなる。このリボザイムＲ
ＮＡは３′末端側に相補の塩基配列を有し、塩基対を形
成してヘアピン構造となっており、このため生体内にお
けるエキソヌクレアーゼによる分解に対し、安定性を有
するものである。
この第３図の組み換えプラスミドの構築においては、製
造するりポザイムとして５ＦＬ４切断用のリボザイム、
プロモータとしてＴ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モータ及びベクターとしてｐＵｃ１１９を用いているが
、本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
造するりポザイムとして５ＦＬ４切断用のリボザイム、
プロモータとしてＴ、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モータ及びベクターとしてｐＵｃ１１９を用いているが
、本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
例えば、製造するリボザイムは切断しようとするＲＮＡ
の塩基配列に応じてバインデイグサイトをコードするＤ
ＮＡ配列を適宜変更することにより、種々のＲＮＡの切
断に適用可能であることはいうまでもなく、また、プロ
モータも例えばＳＦ３、ＧＡＬ ７等種々のものを使用
でき、さらに組み換えるベクターについても本発明の組
み換えベクターは、特に環状のままでも、リポザイムＲ
ＮＡに転写できるため種々の生体中においても充分機能
を有するものであって、リポザイム機能を発揮させよう
とする生体例えば植物、動物等の種類に応じて適当なベ
クターを選択すればよいものである。
の塩基配列に応じてバインデイグサイトをコードするＤ
ＮＡ配列を適宜変更することにより、種々のＲＮＡの切
断に適用可能であることはいうまでもなく、また、プロ
モータも例えばＳＦ３、ＧＡＬ ７等種々のものを使用
でき、さらに組み換えるベクターについても本発明の組
み換えベクターは、特に環状のままでも、リポザイムＲ
ＮＡに転写できるため種々の生体中においても充分機能
を有するものであって、リポザイム機能を発揮させよう
とする生体例えば植物、動物等の種類に応じて適当なベ
クターを選択すればよいものである。
本発明の前記第１及び第２のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
断片を含む組み換えベクターは、環状のままでも制限酵
素を用いることなく余分な塩基配列が付加されていない
リボザイムを製造することが可能なものであり、従来の
ように制限酵素を用いる場合に比べて簡便な操作でリポ
ザイムの製造を行うことができるほか、特に試験管内の
みでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持
増殖せしめながら、リポザイムの産生を図ることができ
、また、特に本発明により、得られる例えば第６図のよ
うなリボザイムは、３′末端側が塩基対の形成によりヘ
アピン構造となっており、これにより、生体中のエキソ
ヌクレーアゼに対し、極めで安定なものである。したが
って、本発明は、例えば、ウィルス耐性植物の創出ある
いはエイズ等に対する新規ウィルス剤の開発に大いに寄
与するものである。
断片を含む組み換えベクターは、環状のままでも制限酵
素を用いることなく余分な塩基配列が付加されていない
リボザイムを製造することが可能なものであり、従来の
ように制限酵素を用いる場合に比べて簡便な操作でリポ
ザイムの製造を行うことができるほか、特に試験管内の
みでなく、生体内においても該組み換えベクターを保持
増殖せしめながら、リポザイムの産生を図ることができ
、また、特に本発明により、得られる例えば第６図のよ
うなリボザイムは、３′末端側が塩基対の形成によりヘ
アピン構造となっており、これにより、生体中のエキソ
ヌクレーアゼに対し、極めで安定なものである。したが
って、本発明は、例えば、ウィルス耐性植物の創出ある
いはエイズ等に対する新規ウィルス剤の開発に大いに寄
与するものである。
以下に実施例を示す。
（１）組み換えベクターの構築
第４図に示した６本のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
機（アプライドバイオシステム社製３８０Ａ）を用いて
合成し、ＯＰＣカラムにより精製した。
機（アプライドバイオシステム社製３８０Ａ）を用いて
合成し、ＯＰＣカラムにより精製した。
この精製オリゴヌクレオチド２５０ｐｍｏｌに反応試薬
（１０×キナーゼバツフアー（２５０１ＩＩＭトリス塩
酸バッファー、 ｐＨ７，６，１００ｍＭ＄ＴＴ、
１００ｍＭ ＭｇＣｈ）の１０μｌ、０゜１ｍＭ ＡＴ
Ｐの２５μｌ Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユ
ニツト／μｌ）の２μ！及び水１００ｕｌを加え、３７
°Ｃで５０分間反応させてオリゴヌクレオチドをリン酸
化し、その後、６５°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活
させた。
（１０×キナーゼバツフアー（２５０１ＩＩＭトリス塩
酸バッファー、 ｐＨ７，６，１００ｍＭ＄ＴＴ、
１００ｍＭ ＭｇＣｈ）の１０μｌ、０゜１ｍＭ ＡＴ
Ｐの２５μｌ Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユ
ニツト／μｌ）の２μ！及び水１００ｕｌを加え、３７
°Ｃで５０分間反応させてオリゴヌクレオチドをリン酸
化し、その後、６５°Ｃで１５分間加熱して酵素を失活
させた。
得られた５′リン酸化されたオリゴヌクレオチド溶液５
０μｌに同様の方法で得られた相手方の相補的なオリゴ
ヌクレオチドの溶液５０μｌを混合し、（例えば、第４
図（７）ＦＷＩとＲＶＩ、又は四２とＲＶ２、又は四３
とＲＶ３）、９５°ｃで２分保ち、その後、徐々に温度
を下げて室温に戻した。このアニールされた断片の各３
．３μｌをＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで前もって切断してお
いたｐＵｃ１１９ベクターに林等の方法（１） Ｈａｙ
ａｓｈｉ、に、、 ＮａｋａｚａｗａＪ、＋ ｌ５ｈｉ
ｚａｋｉ、Ｙ。
０μｌに同様の方法で得られた相手方の相補的なオリゴ
ヌクレオチドの溶液５０μｌを混合し、（例えば、第４
図（７）ＦＷＩとＲＶＩ、又は四２とＲＶ２、又は四３
とＲＶ３）、９５°ｃで２分保ち、その後、徐々に温度
を下げて室温に戻した。このアニールされた断片の各３
．３μｌをＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで前もって切断してお
いたｐＵｃ１１９ベクターに林等の方法（１） Ｈａｙ
ａｓｈｉ、に、、 ＮａｋａｚａｗａＪ、＋ ｌ５ｈｉ
ｚａｋｉ、Ｙ。
ａｎｄ ０ｂａｙａｓｈｉ、＾、 （１９８５） Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
１３、３２６１−３２７１ 、２） Ｈａｙａｓｈｉ、
に、、 Ｎａｋａｚａｗａ、Ｍ、。
に、、 Ｎａｋａｚａｗａ、Ｍ、。
Ｔｓｈｉｚａｋｉ、Ｙ、＋旧ｒａｏｋａ、Ｎ、 ａｎｄ
０ｂａｙａｓｈｉ、Ａ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３．７９７９−７９９２
）で連結した。
０ｂａｙａｓｈｉ、Ａ、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３．７９７９−７９９２
）で連結した。
この溶液を用いてＭＶ１１Ｂ４株を形質転換し、コロニ
ーを形成させた後プラスミドを取り出し、挿入されたり
ボブイム断片中のＢａｍＨＩサイトを利用してボジチブ
なりローンを選択した。また、塩基配列はＤＮＡシーケ
ンサ−（アプライドバイオシステム社製３７０Ａ）を用
いて確認した。
ーを形成させた後プラスミドを取り出し、挿入されたり
ボブイム断片中のＢａｍＨＩサイトを利用してボジチブ
なりローンを選択した。また、塩基配列はＤＮＡシーケ
ンサ−（アプライドバイオシステム社製３７０Ａ）を用
いて確認した。
（２）リボザイムの製造
鋳型Ｄ Ｎ Ａ （ｐＧＥＮＥ ８４５９又はｐＡＭ１
９ｓＦＬ ｌΔＣ；ｌμｇ／μｌ ） ２．５μｌ及び
Ｔ、ＲＮＡポリメラーゼ（２０ユニツト／μＩり ０．
６５μｌを転写用反応液（５×転写用バツフアー（２０
０ｍＭ ）リス塩酸バッファー、 ｐＨ７，５： ３
０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ ； １０ｍＭスパーミゾイン、
０．０５％ボビン・セラム・アルブミン）２μ！１０．
２ ＭＤＴＴ １．２５μｌ 、 ＮＴＰ混合液（ＵＴ
Ｐ、 ＡＴＰ、 ＣＴＰ。
９ｓＦＬ ｌΔＣ；ｌμｇ／μｌ ） ２．５μｌ及び
Ｔ、ＲＮＡポリメラーゼ（２０ユニツト／μＩり ０．
６５μｌを転写用反応液（５×転写用バツフアー（２０
０ｍＭ ）リス塩酸バッファー、 ｐＨ７，５： ３
０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ ； １０ｍＭスパーミゾイン、
０．０５％ボビン・セラム・アルブミン）２μ！１０．
２ ＭＤＴＴ １．２５μｌ 、 ＮＴＰ混合液（ＵＴ
Ｐ、 ＡＴＰ、 ＣＴＰ。
ＧＴＰそれぞれ５００μＭ） ２．５μｆ、 ＨＰＲ
Ｉ リボヌクレアーゼ阻害剤（２０ユニツト／μｆ）
１．２５μ！、（ｔｘ −”Ｐ 〕ＣＴＰ （２０μＣ
３／ μｍ 、 〜８００（ｊ ／ｍｍｏｌ）０．５ｕ
１ ） ２５ｕ １に加え、３７°Ｃで２時間保持し
て、ＲＮＡの転写を行った。その結果を第５図の電気泳
動図に示す。
Ｉ リボヌクレアーゼ阻害剤（２０ユニツト／μｆ）
１．２５μ！、（ｔｘ −”Ｐ 〕ＣＴＰ （２０μＣ
３／ μｍ 、 〜８００（ｊ ／ｍｍｏｌ）０．５ｕ
１ ） ２５ｕ １に加え、３７°Ｃで２時間保持し
て、ＲＮＡの転写を行った。その結果を第５図の電気泳
動図に示す。
第５図において、囚は、鋳型ＤＮＡとして環状のｐＧＥ
ＮＥ ８４５９を用いた場合を、■は、鋳型ＤＮＡとし
てＰｓｔｌにより切断した線状ｐＧＥＮＥ ８４５９を
用いた場合を、０は、鋳型ＤＮＡとしてＥｃｏＲＩによ
り切断したｐＧＥＮＥ ８４５９を用いた場合をそれぞ
れ示し、０の場合は、ＳＦＬ １遺伝子を含むＰｓｔｌ
が線状になったＩ）ＡＭ１９ＳＦＬΔＣを鋳型として用
い、上記の方法でラベル化されたＳＦＬ １のｍＲＮＡ
を作成し、■で得られた転写産物と等量混合し、さらに
３７℃で２時間反応させたものである。
ＮＥ ８４５９を用いた場合を、■は、鋳型ＤＮＡとし
てＰｓｔｌにより切断した線状ｐＧＥＮＥ ８４５９を
用いた場合を、０は、鋳型ＤＮＡとしてＥｃｏＲＩによ
り切断したｐＧＥＮＥ ８４５９を用いた場合をそれぞ
れ示し、０の場合は、ＳＦＬ １遺伝子を含むＰｓｔｌ
が線状になったＩ）ＡＭ１９ＳＦＬΔＣを鋳型として用
い、上記の方法でラベル化されたＳＦＬ １のｍＲＮＡ
を作成し、■で得られた転写産物と等量混合し、さらに
３７℃で２時間反応させたものである。
上記Ａ−Ｄの各手段により得られた各転写産物は３２Ｐ
でラベル化し、２５％ホルムアミド、７％尿素を含む８
％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。約５０塩
基から１３０塩基までの領域を第５図に示す。
でラベル化し、２５％ホルムアミド、７％尿素を含む８
％ポリアクリルアミドゲルを用いて解析した。約５０塩
基から１３０塩基までの領域を第５図に示す。
第５図の結果に明らかなように、
Ａ、環状のｐＧＥＮＥ ８４５９を鋳型とした場合、５
８塩基で構成されるＳＦＬ ｌ用すボザイムが放出され
た。
８塩基で構成されるＳＦＬ ｌ用すボザイムが放出され
た。
これは３′端処理用のリボザイムが効率良く作用したた
めである。
めである。
Ｂ、３′端処理用リボザイムのすぐ下流にあるＰｓｔＩ
サイトを切断した線状ｐＧＥＮＥ ８４９５を鋳型とし
た場合、佐百穐基のラン・オフ転写産物がまず産生され
、ＳＦＬ ｌ用すボザイムの３′端が切断されて二本の
バンドが検出された（５８塩基と５１塩基）。
サイトを切断した線状ｐＧＥＮＥ ８４９５を鋳型とし
た場合、佐百穐基のラン・オフ転写産物がまず産生され
、ＳＦＬ ｌ用すボザイムの３′端が切断されて二本の
バンドが検出された（５８塩基と５１塩基）。
Ｃ，Ｔ、プロモータのすぐ上流にあるＥｃｏＲＩサイト
を利用して線状ｐＧＥＮＥ ８４５９を作成し鋳型とし
た場合、への場合と同じ結果となった。
を利用して線状ｐＧＥＮＥ ８４５９を作成し鋳型とし
た場合、への場合と同じ結果となった。
Ｄ、Ｔ、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＳＦＬ １遺伝子
の転写産物を作成し、その後、Ｂの転写産物と混ぜた場
合においては、ＳＦＬ Ｉ用すボザイムがうまく作用す
ると７６塩基のＳＦＬ １転写産物が切り出されるよう
に結合部位を設計したものであり、実際予想どおり７６
塩基の断片が確認できた。
の転写産物を作成し、その後、Ｂの転写産物と混ぜた場
合においては、ＳＦＬ Ｉ用すボザイムがうまく作用す
ると７６塩基のＳＦＬ １転写産物が切り出されるよう
に結合部位を設計したものであり、実際予想どおり７６
塩基の断片が確認できた。
第１図は、Ｊ、Ｈａｓｅｌｏｆｆ等が示した人工リポザ
イムのデザインを示す。 第２図は、従来のリボザイム転写手段を示す模式図であ
る。 第３図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９の構造を示す図である。 第４図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９の構築手法を示す図である。 第５図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９を転写して得られた各種転写産物の電気泳
動図である。 第６図は、本発明の組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ８４
５９を転写して得られたリボザイムの塩基配列を示す図
である。 第２図 プロモータ ジーン ランオフ （５８ｎ士） Ａ ４ｉ％ （５１ｎ士）
イムのデザインを示す。 第２図は、従来のリボザイム転写手段を示す模式図であ
る。 第３図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９の構造を示す図である。 第４図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９の構築手法を示す図である。 第５図は、本発明における組み換えプラスミドｐＧＥＮ
Ｅ ８４５９を転写して得られた各種転写産物の電気泳
動図である。 第６図は、本発明の組み換えプラスミドｐＧＥＮＥ８４
５９を転写して得られたリボザイムの塩基配列を示す図
である。 第２図 プロモータ ジーン ランオフ （５８ｎ士） Ａ ４ｉ％ （５１ｎ士）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、リボザイムＲＮＡをコードする領域を含む第１のＤ
ＮＡ配列の下流側に、転写されるリボザイムＲＮＡの３
′末端側をセルフプロセシングにより切断するリボザイ
ムＲＮＡをコードする領域を含む第２のＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ断片。 ２、下記のＤＮＡ配列を含む請求項１記載のＤＮＡ断片
。 【遺伝子配列があります】 （但し、式中、星印は形成された塩基対を表す。）３、
第１のＤＮＡ配列の上流側にプロモータ配列を有する請
求項１又は２記載のＤＮＡ断片。 ４、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡ断片により組
み換えられた組み換えベクター。５、請求項４記載の組
み換えベクターを鋳型としてＲＮＡに転写することを特
徴とする３′末端側がセルフプロセシングされたリボザ
イムの製造方法。 ６、転写が生体内で行われる請求項５の製造方法。 ７、請求項５又は６記載の製造方法により得られたリボ
ザイム。 ８、次のＲＮＡ配列を有する請求項６記載のリボザイム
。 【遺伝子配列があります】 （但し、式中、星印は形成された塩基対を表す。）
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| JP1329831A JP2507895B2 (ja) | 1989-12-19 | 1989-12-19 | リボザイムの新規合成系 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192151A (ja) * | 1990-11-02 | 1993-08-03 | Agency Of Ind Science & Technol | リボザイムを用いた新規ｒｎａ転写システム |
| WO2007097093A1 (ja) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Suntory Limited | 分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| WO2007097095A1 (ja) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Suntory Limited | 芳香族アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| WO2007097094A1 (ja) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5631148A (en) * | 1994-04-22 | 1997-05-20 | Chiron Corporation | Ribozymes with product ejection by strand displacement |
| NO953680D0 (no) * | 1995-09-18 | 1995-09-18 | Hans Prydz | Cellesyklusenzymer |
| US5824519A (en) * | 1995-11-08 | 1998-10-20 | Medical University Of South Carolina | Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes |
| US20030125280A1 (en) * | 1996-12-03 | 2003-07-03 | Medical University Of South Carolina | Tissue specific and target RNA-specific ribozymes as antimicrobial therapeutics against microbial pathogens |
| US6355415B1 (en) * | 1997-09-29 | 2002-03-12 | Ohio University | Compositions and methods for the use of ribozymes to determine gene function |
| CA2331782A1 (en) * | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and target rna-specific ribozymes |
| EP1169480A4 (en) * | 1999-04-14 | 2005-02-02 | Musc Found For Res Dev | TISSUE-SPECIFIC AND PATHOGENIC TOXIC SUBSTANCES AND RIBOZYMES |
| US6271359B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-08-07 | Musc Foundation For Research Development | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes |
| US8568766B2 (en) | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
| AU9684601A (en) | 2000-10-12 | 2002-04-22 | Univ Rochester | Compositions that inhibit proliferation of cancer cells |
| CA2436519A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | The Penn State Research Foundation | Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents |
| KR20100094569A (ko) | 2002-02-06 | 2010-08-26 | 비코르 테크놀로지스 인코포레이티드 | 경색방지 분자 |
| WO2003093452A2 (en) * | 2002-02-26 | 2003-11-13 | University Of Utah Research Foundation | Variants of nedd4l associated with hypertension and viral budding |
| US20050287648A1 (en) | 2002-08-05 | 2005-12-29 | University Of Rochester | Protein Transducing Domain/Deaminase Chimeric Proteins, Related Compounds, and Uses Thereof |
| BRPI0606791A2 (pt) | 2005-02-02 | 2010-02-09 | Uab Research Foundation | métodos de reverter ou prevenir a resistência de uma célula a um agonista do receptor da morte, de triar uma célula quanto a um biomarcador da resistência a um agonista do receptor da morte, de monitorar a resistência a um agonista do receptor da morte em um indivìduo, de induzir seletivamente a apoptose em uma célula alvo expressando um receptor da morte, de tratar de um indivìduo com cáncer, de tratar de um indivìduo com uma doença inflamatória ou autoimune, de bloquear a ligação da proteìna contendo card a um receptor da morte em uma célula, de bloquear a associação de um iap com o receptor da morte e de triar um modulador de uma proteìna contendo card, composição, ácido nucleico isolado, vetor, célula, e, polipeptìdeo isolado |
| WO2006099875A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Genmab A/S | Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma |
| US7476733B2 (en) | 2005-03-25 | 2009-01-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Development of a real-time PCR assay for detection of pneumococcal DNA and diagnosis of pneumococccal disease |
| WO2007044607A2 (en) * | 2005-10-06 | 2007-04-19 | Emthrax, Llc | Methods and compositions relating to anthrax spore glycoproteins as vaccines |
| US8093369B2 (en) * | 2005-10-11 | 2012-01-10 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Ltd. | Compositions for silencing the expression of VDAC1 and uses thereof |
| EP2392647A1 (en) | 2005-10-14 | 2011-12-07 | MUSC Foundation For Research Development | Targeting PAX2 for the induction of DEFB1-mediated tumor immunity and cancer therapy |
| US8080534B2 (en) | 2005-10-14 | 2011-12-20 | Phigenix, Inc | Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer |
| US20100190689A1 (en) | 2006-09-21 | 2010-07-29 | University Of Rochester | Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic distrophy |
| US9279127B2 (en) * | 2006-11-01 | 2016-03-08 | The Medical Research Fund At The Tel-Aviv Sourasky Medical Center | Adipocyte-specific constructs and methods for inhibiting platelet-type 12 lipoxygenase expression |
| EP2104516B1 (en) | 2006-11-01 | 2015-01-07 | University of Rochester | Methods and compositions related to the structure and function of apobec3g |
| BRPI0720038A2 (pt) | 2006-12-11 | 2013-12-24 | Univ Utah Res Found | Métodos para inibir a permeabilidade vascular em tecido, para triar ou avaliar um agente que inibe a permeabilidade vascular, para tratar ou prevenir a síndrome da angústia respiratória, a retinopatia de prematuridade, a retinopatia diabética e a degeneração macular úmida em um indivíduo, para tratar indivíduos com sugestões repulsivas ou miméticos e para promover a angiogênese em um tecido, polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado, e, vetor |
| US9422363B2 (en) | 2007-08-28 | 2016-08-23 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein E mimicking polypeptides and methods of use |
| CA2697957A1 (en) | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein e mimicking polypeptides and methods of use |
| EP2268664B1 (en) * | 2007-12-03 | 2017-05-24 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Doc1 compositions and methods for treating cancer |
| US20090233993A1 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-17 | Burnham Institute For Medical Research | Compositions and methods for inhibiting gsk3 activity and uses thereof |
| EP2288922B1 (en) | 2008-05-08 | 2016-08-17 | University of Utah Research Foundation | Sensory receptors for chronic fatigue and pain and uses thereof |
| WO2010065617A1 (en) | 2008-12-02 | 2010-06-10 | University Of Utah Research Foundation | Pde1 as a target therapeutic in heart disease |
| WO2011031974A1 (en) | 2009-09-10 | 2011-03-17 | Southern Research Institute | Acridine analogs in the treatment of gliomas |
| US20110207789A1 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Ye Fang | Methods related to casein kinase ii (ck2) inhibitors and the use of purinosome-disrupting ck2 inhibitors for anti-cancer therapy agents |
| WO2014170892A1 (en) | 2013-04-15 | 2014-10-23 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Inhibition of rip kinases for treating lysosomal storage diseases |
| CN107074923B (zh) | 2014-07-31 | 2021-08-03 | Uab研究基金会 | Apoe模拟肽及对清除血浆胆固醇的较高效力 |
| EP3496736A4 (en) | 2016-08-03 | 2020-05-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | THERAPEUTICS AGAINST TLR9 |
| US12016314B2 (en) | 2017-09-08 | 2024-06-25 | Ohio State Innovation Foundation | MicroRNA inhibitor therapy in systemic lupus erythematosus |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03130080A (ja) * | 1989-03-16 | 1991-06-03 | Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh | Ｒｎａの機能を阻害するための遺伝子単位 |
-
1989
- 1989-12-19 JP JP1329831A patent/JP2507895B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-24 US US08/111,444 patent/US5436330A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03130080A (ja) * | 1989-03-16 | 1991-06-03 | Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh | Ｒｎａの機能を阻害するための遺伝子単位 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192151A (ja) * | 1990-11-02 | 1993-08-03 | Agency Of Ind Science & Technol | リボザイムを用いた新規ｒｎａ転写システム |
| WO2007097094A1 (ja) * | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | アシルCoA：エタノールO-アシルトランスフェラーゼ/エステラーゼ遺伝子及びその用途 |
| WO2007097093A1 (ja) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Suntory Limited | 分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| WO2007097095A1 (ja) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Suntory Limited | 芳香族アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 |
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