CN101248175A - 磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因及其用途 - Google Patents

磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因及其用途，特别是涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、用该酵母制造的酒精饮料、以及所述饮料的制造方法等。更具体而言，本发明涉及通过控制酿造酵母的磷酸腺苷酰硫酸还原酶Met16p的编码基因MET16、特别是啤酒酵母的特征性non－ScMET16基因的表达量来控制有助于产品香味稳定化的亚硫酸盐的生成能力的酵母，以及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

Description

磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因及其用途
技术领域
本发明涉及磷酸腺苷酰硫酸还原酶(phosphoadenylyl sulfate reductase)基因及其用途，特别是涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、用该酵母制造的酒精饮料、以及制造所述饮料方法等。更具体而言，本发明涉及通过控制酿造酵母的磷酸腺苷酰硫酸还原酶Met16p的编码基因MET16特别是啤酒酵母的特征性non-ScMET16基因的表达量，来控制有助于产品香味稳定化的亚硫酸盐的生成能力的酵母、使用该酵母的酒精饮料制造方法等。
背景技术
已知亚硫酸盐是抗氧化作用强的化合物，作为抗氧剂在食品、饮料、医药品等领域被广泛使用[例如日本特开平06-040907号公报(专利文献1)、日本特开2000-093096号公报(专利文献2)等]。在酒精饮料中，亚硫酸盐也被作为抗氧剂利用，例如，在需长期陈酿的葡萄酒中，因在其品质保持上发挥重要作用，所以日本国内经厚生劳动省批准，允许添加到残留浓度350ppm以下。而且，还已知在啤酒酿造中保质期随产品中含有的亚硫酸盐浓度而变化，强化该物质对香味稳定性等方面非常重要。
使产品中的亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但这种情况需作为食品添加剂处理，在商品开发的自由度、消费者对食品添加剂的不良印象等方面均成为问题。
但是，酵母能生物合成自身生命活动所必须的含硫化合物，亚硫酸盐作为其中间代谢产物而被生成。即，通过利用酵母的这种能力，无需从外部添加即可使产品中的亚硫酸盐量增加。
作为在酿造工序中提高发酵液中的亚硫酸盐浓度的方法，包括1)过程控制法和2)酵母育种法。过程控制法，是指由于酿造中亚硫酸盐的生成与初期供氧量成反比，所以降低向发酵液的供氧量，使亚硫酸盐的生成量增加的同时抑制其氧化的方法。
另一方面，酵母育种法利用基因操作技术。在酵母的硫代谢中，亚硫酸盐是含硫氨基酸和含硫维生素生物合成的中间体，从细胞外摄取的硫酸根离子经三步反应被还原后生成亚硫酸盐。
这里，MET3基因是编码催化第1反应的酶的基因，MET14基因是编码催化第2反应的酶的基因，MET16是编码催化第3反应的酶的基因。Korch等进行了如下尝试：通过使上述MET3、MET14基因的表达量增加来提高酵母亚硫酸盐生成能力，并证实MET14更有效(C.Korch et al.，Proc.Eur.Brew.Conv.Conger.，Lisbon，201-208，1991：非专利文献1)。Donalies等构建了MET16基因高表达酵母，但生成的亚硫酸盐浓度无论在使用合成培养基还是麦汁的情况下均无增加(Donalies and Stahl，Yeast，19，475-484，2002：非专利文献2)。Hansen等进行了如下尝试：通过破坏编码亚硫酸盐根离子还原酶的MET10基因，防止生成的亚硫酸盐根离子还原，以增加亚硫酸盐生成量(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996：非专利文献3)。
另外，藤村等进行了如下尝试：通过提高酵母的编码亚硫酸盐根离子排出泵的SSU1基因中特别是啤酒酵母特有的nonScSSU1基因的表达量，以促进菌体内生成的亚硫酸盐向菌体外排出，使啤酒中的亚硫酸盐浓度增加(藤村等，2003年度日本农艺化学会年度大会要旨集，159，2003：非专利文献4。日语原文：「藤村ら、2003年度日本農芸化学会年次大会要旨集、159、2003」)。
[非专利文献1]C.Korch et al.，Proc.Eur.Brew.Conv.Conger.，Lisbon，201-208，1991
[非专利文献2]Donalies and Stahl，Yeast，19，475-484，2002
[非专利文献3]J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996
[非专利文献4]藤村等，2003年度日本农艺化学会年度大会要旨集，159，2003。日语原文：「藤村ら、2003年度日本農芸化学会年次大会要旨集、159、2003」。
[专利文献1]日本特开平06-040907号公报
[专利文献2]日本特开2000-093096号公报
发明内容
然而，需要能提高酵母产生的亚硫酸盐量从而使通过酵母生产的酒精饮料的保质期和香味稳定性优异的新方法和新材料。如上所述，使产品中的亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加非酵母生产的亚硫酸盐，但近年来，消费者更热衷于无食品添加剂和使用天然材料，希望最低限度地使用食品添加剂。因此，希望利用酵母自身的生命活动，不从外部添加亚硫酸盐即可达到对香味稳定性有效的亚硫酸盐浓度。但是，上述过程控制法由于氧不足导致酵母的增殖速度下降，有时引起发酵延迟、品质下降，因此并不实用。
另外，据报道，利用基因操作技术的酵母育种得到了达到亲株10倍以上的亚硫酸盐浓度的结果(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但另一方面，也出现了发酵延迟、不受欢迎的香味成分即乙醛及1-丙醇增加，因此作为实用酵母还存在问题。由此，期望能有既不影响发酵速度和产品质量又能生产充分量的亚硫酸盐的酵母的育种方法。
本发明者为了解决上述课题不断潜心研究，结果从啤酒酵母中成功地鉴定并分离出编码比已知蛋白质更有效的磷酸腺苷酰硫酸还原酶的基因。且通过将所得基因导入酵母并使其表达而制备了转化酵母，确认了亚硫酸盐生成量的增加，从而完成了本发明。
即，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达得到调节的转化酵母、通过使用该基因的表达得到调节的酵母来控制产品中的亚硫酸盐生成量的方法等。具体而言，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其是选自下述(a)～(f)构成的组中的多核苷酸：
(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；
(c)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列60％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的核苷酸序列的核苷酸互补的核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及
(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其是选自下述(g)～(i)构成的组中的多核苷酸：
(g)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列经过1～10个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质；
(h)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质；以及
(i)多核苷酸，其与序列号1的核苷酸序列或与序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸的核苷酸序列在高严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。
(3)上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸。
(4)上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)多核苷酸，其是选自下述(j)～(m)构成的组的多核苷酸，
(j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA；
(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；
(l)多核苷酸，其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物的活性的RNA；以及
(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA。
(7)蛋白质，其是由上述(1)～(5)任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
(8)载体，其是含有上述(1)～(5)任一项所述的多核苷酸的载体。
(8a)上述(8)所述的载体，其含有包含以下(x)～(z)的构成要素的表达盒：
(x)在酵母细胞内可转录的启动子；
(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(1)～(5)任一项所述的多核苷酸；以及
(z)与RNA分子的转录终止以及多聚腺苷化作用有关的在酵母起作用的信号。
(9)载体，其是含有上述(6)所述的多核苷酸的载体。
(10)酵母，其是导入了上述(8)或(9)所述的载体的酵母。
(11)上述(10)所述的酵母，其通过导入上述(8)所述的载体，增强亚硫酸盐生成能力。
(12)酵母，其通过导入上述(9)所述的载体，或通过破坏与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表达。
(13)上述(10)所述的酵母，其通过增加上述(7)所述的蛋白质的表达量，提高亚硫酸盐生成能力。
(14)酒精饮料制造方法，其使用上述(10)～(13)任一项所述的酵母。
(15)上述(14)所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
(16)上述(14)所述的酒精饮料制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。
(17)酒精饮料，其是用上述(14)～(16)任一项所述的方法制造的酒精饮料。
(18)评价方法，其用根据具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。
(18a)通过上述(18)所述的方法来筛选亚硫酸盐生成能力高或低的酵母的方法。
(18b)用通过上述(18a)所述的方法筛选的酵母来制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。
(19)评价方法，其通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量，来评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。
(19a)选择亚硫酸盐生成能力强的酵母的方法，其用上述(19)所述的方法，评价被测酵母，选择磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量高的酵母。
(19b)用通过上述(19a)所述的方法选择的酵母来制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。
(20)酵母的选择方法，其包括培养被测酵母；对上述(7)所述的蛋白质进行定量或对具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量进行测定；选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述蛋白质的生成量或上述基因的表达量的被测酵母。
(21)上述(20)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被测酵母；对具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因在各酵母中的表达量进行测定；选择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被测酵母。
(22)上述(20)所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被测酵母；对各酵母中上述(7)所述的蛋白质进行定量；选择与标准酵母相比该蛋白质的量多或少的被测酵母。
(23)酒精饮料制造方法，其包括：用上述(10)～(13)任一项所述的酵母或通过上述(20)～(22)任一项所述的方法选择的酵母中的任一酵母进行以酒精饮料制造为目的的发酵，并调节亚硫酸盐生成能力。
根据使用本发明的具有可操作地连接到载体上的磷酸腺苷酰硫酸还原酶多核苷酸的转化酵母的酒精饮料的制造方法，能增加产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐含量，因而能够制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。
附图说明
图1表示啤酒酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。
图2表示啤酒酿造试验中糖消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w％)。
图3表示啤酒酿造试验中酵母中的nonScMET16基因的表达行为。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测到的信号辉度。
图4表示使用底部酵母及其转化体的酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示0D660值。
图5表示使用下面酵母及其转化体的啤酒酿造试验中糖消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w％)。
图6表示使用下面酵母及其转化体的啤酒试验酿造结束时醪液中的亚硫酸盐浓度。
图7表示使用上面酵母及其转化体的酿造试验中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660值。
图8表示使用顶部酵母及其转化体的啤酒酿造试验中糖消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w％)。
图9表示使用上面酵母及其转化体的啤酒酿造试验结束时醪液中的亚硫酸盐浓度。
具体实施方式
已知的使亚硫酸盐根离子排出泵的表达量增加的方法，由于菌体内不积累剩余的亚硫酸盐，因而能保持良好的发酵速度，但菌体内亚硫酸盐的生物合成反应可能成为限速步骤。因此认为通过强化作为起始物质的硫酸根离子向亚硫酸盐的还原途径，可以更高效地生成亚硫酸盐。
本发明者基于这种构想不断研究，根据用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息，分离并鉴定出啤酒酵母特有的编码磷酸腺苷酰硫酸还原酶的nonScMET16基因。该核苷酸序列如序列号1所示。另外，由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号2所示。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。
作为本发明对象的多核苷酸，不限于来自上述啤酒酵母的编码磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的多核苷酸，还包含编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能同等的蛋白质，例如，可为(c)由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。
此种蛋白质可包括由序列号2的氨基酸序列经过例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～1 8个、1～1 7个、1～16个、1～1 5个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个氨基酸)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个氨基酸残基缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的数量，一般越小越好。另外，此种蛋白质可包括(d)具有与序列号2的氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好
关于磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性，例如可通过Thomas等的方法(J BiolChem.1990 Sep 15；265(26)：15518-24.)来测定。
另外，本发明也包含(e)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸在严谨条件下，与序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有如下多核苷酸，该多核苷酸在严谨条件下，与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸。
这里，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”，指以序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸或编码序列号2的氨基酸序列的DNA的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸，例如DNA。杂交的方法可以利用例如MolecularCloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997等中记载的方法。
本说明书中所述的“严谨条件”可以是低严谨条件、中严谨条件以及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。上述条件中，温度越高，越能高效地获得具有高同源性的多核苷酸，例如DNA。但是，影响杂交严谨性的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员可通过适当选择这些因素来实现同样的严谨性。
另外，在杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos DirectLabelling Reagents[安玛西亚法玛西亚(Amersham Pharmacia)公司制]。此时，根据试剂盒中附带的操作方法，与已标记的探针一同保温过夜后，将膜在55℃的条件下用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤后，可检测出杂交后的DNA。
其他可杂交的DNA，可通过例如FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的DNA具有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上同一性的多核苷酸。
另外，关于氨基酸序列、核苷酸序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；procNatl Acad Sci USA 90：5873，1993)来确定。开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。用BLASTN分析核苷酸序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。
此外，本发明的多核苷酸包含(j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA；(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；(l)多核苷酸，其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物的活性的RNA；以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA。这些多核苷酸被整合进载体，进而可在导入了该载体的转化细胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，在希望抑制上述DNA表达的情况下优选利用这些多核苷酸。
本说明书中，“编码具有与DNA的转录产物互补的核苷酸序列的RNA的多核苷酸”，指所谓的反义DNA。反义技术作为抑制特定内源性基因的表达的方法而公知，各种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp.319-347，1993等。日语原文：「平島ぉょび井上：新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(日本生化学会編，束京化学同人)」]。反义DNA的序列，优选为与内源性基因或其一部分互补的序列，但只要能有效地抑制基因的表达，也可以不完全互补。转录的RNA相对于靶基因的转录产物优选具有90％以上、进一步优选具有95％以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，进一步优选为500个碱基以上。
本说明书中，“编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，指用于通过RNA干扰(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。“RNAi”指将具有与靶基因序列同一或类似序列的双链RNA导入细胞内，导入的外源基因及内源性靶基因的表达均受到抑制的现象。这里使用的RNA包括例如21～25个核苷酸长的产生RNA干涉的双链RNA，例如，dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)或shRNA(短发卡RNA)。此种RNA可通过脂质体等运载系统运载至所需位点局部，也可以使用生成上述双链RNA的载体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等已在许多文献中公开(参照日本特表2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，407：6802，319-20，2002 Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002 Apr.30；NatureBiotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002 May 15等)。
本说明书中，“编码具有特异性切割DNA转录产物的活性的RNA的多核苷酸”一般指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物，抑制该基因的功能。关于核酶的设计，可参照各种公知文献(例如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBS Lett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature 323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；Protein Eng 3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；Biochem Biophys Res Commun 186：1271，1992等)。另外，“编码通过共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，指通过“共抑制”抑制靶DNA的功能的核苷酸。
本说明书中，“共抑制”是指通过在细胞中由转化导入具有与内源性靶基因同一或类似序列的基因，从而使导入的外源基因及内源性靶基因的表达均受到抑制的现象。关于具有共抑制作用的多核苷酸的设计，可参照各种公知文献(例如，参照Smyth DR：Curr.Biol.7：R793，1997，Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。
2.本发明的蛋白质
本发明还提供由上述多核苷酸(a)～(f)中任一多核苷酸编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。
作为此种蛋白质，可列举由序列号2的氨基酸序列经过上述数量的氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。另外，此种蛋白质包括具有与序列号2的氨基酸序列有约60％以上、优选约70％以上、进一步优选约80％以上、更优选约90％以上、最优选约95％以上同源性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。
这类蛋白质可用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中记载的定点诱变法获得。
本发明的蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中的任意1个或多个氨基酸序列的位置上缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸残基，2种以上的缺失、取代、插入及附加中也可同时发生。
以下，例示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。
本发明的蛋白质也可以用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。另外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、珀金埃尔默(Perkin Elmer)、法玛西亚(Pharmacia)公司、ProteinTechnology Instruments公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作公司等制造的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母
其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸或上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒含有：(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸；以及(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用有关的在酵母中起作用的信号。本发明中，在后述的酒精饮料(例如，啤酒)酿造中，使上述本发明的蛋白质高表达时，将这些多核苷酸针对该启动子正向导入，以促进上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。另外，在后述的酒精饮料(例如，啤酒)酿造中，抑制上述本发明的蛋白质表达时，将这些多核苷酸针对该启动子反向导入，以抑制上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可在载体中可表达地导入上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。且在本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)，可抑制上述DNA的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过向参与靶基因的基因产物表达的区域，例如编码区域、启动子区域的内部附加或缺失一个或多个碱基，或使这些区域整体缺失来进行。这种基因破坏的手法，可参照公知的文献(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本特开平6-253826号公报等)。
作为导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)，作为YIp型载体，已知有YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)，并可容易地获得。
用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时又不影响醪液中的氨基酸、糖、高级醇或酯的浓度，则可以是任意的组合。例如，可利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知的方法即可容易地获得。
作为转化时使用的选择标记，由于酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以可利用遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marinet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述构建的载体被导入宿主酵母。作为宿主酵母，可列举能用于酿造的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可列举酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，或Saccharomyces cerevisiaeNBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。此外，还可以使用威士忌酵母，例如酿酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本酿造协会的1号、3号和4号等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本酿造协会的用7号和9号等清酒酵母，但不限于此。本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
作为酵母的转化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A ColdSpring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法，但不限于此。
更具体而言，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养至OD600nm的值为1～6。将此培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃下静置约60分钟后，与将导入的DNA(约1～20μg)一同在约30℃下静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度为约20％～50％。在约30℃下，静置约30分钟后，将此细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤，置于规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃下静置约60分钟。之后，将其移植到含有作为选择标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。
此外，关于通常的克隆技术，可参照《分子克隆第3版》、“Methods inYeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本发明的酒精饮料的制造方法及由该制造方法制得的酒精饮料
将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒精饮料的酵母中，通过使用该酵母，可制造所需的且亚硫酸盐含量增加、香味增加了的酒精饮料。另外，也可使用通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母。作为制造对象的酒精饮料包括例如啤酒、发泡酒等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等，并不限于此。
制造这些酒精饮料时，除了使用本发明中得到的酿造酵母代替亲株外，可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往方法完全相同，不会因制造亚硫酸盐含量增加的酒精饮料而增加成本。即，本发明可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出香味稳定性等优异的酒精饮料。
另外，使用该基因为高表达的酵母时，培养基中的硫酸根离子被高效摄入，所以，即使使用硫源缺乏的原料，例如制造啤酒时使用麦芽比率低的麦芽汁时，也可以实现良好的酵母增殖和酒精发酵。
另外，使用含硫氨基酸合成体系的合成功能过强的酵母时，有时会大量生成、积累以该途径的中间代谢物硫化氢为代表的、酒精饮料中不受欢迎的具有异味的含硫化合物类。对于这种酵母，通过抑制或破坏该基因的功能，抑制硫酸盐作为起始原料的摄入，可以制造出减少了异味的酒精饮料。
5.本发明的酵母的评价方法
本发明涉及用根据具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针来评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力的方法。这种评价方法的一般方法已公知，例如，在WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。
首先，制备被测酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以得到的基因组为对象，使用根据磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的核苷酸序列(优选ORF序列)设计的引物或探针，检测被测酵母的基因组中是否存在该基因或该基因的特异性序列。引物或探针的设计可用公知的方法来进行。
基因或特异性序列的检测可使用公知的方法来进行。例如，将含有特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有该核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，测定扩增物的有无、扩增物的分子量大小等。用于引物的多核苷酸的核苷酸数通常为10bp以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间部分的碱基数通常以300～2000bp为宜。
PCR法的反应条件不受特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃，退火温度：40～60℃，延伸温度：60～75℃，循环数：10次以上等条件。所得反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。通过该方法，根据扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测并评价该酵母的亚硫酸盐生成能力。且通过分析扩增物的核苷酸序列，可进一步更加准确地预测和/或评价上述能力。
本发明也可以通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量，评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。此时，通过培养被测酵母，对磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的产物mRNA或蛋白质进行定量即可。mRNA或蛋白质的定量可用公知的手法来进行。例如，mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量，例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
而且，通过培养被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量，选择与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述基因表达量的酵母，可选择出适于酿造所需酒精饮料的酵母。另外，也可以培养标准酵母及被测酵母，测定各酵母中上述基因的表达量，比较标准酵母和被测酵母的上述基因的表达量，从而选择出所需的酵母。具体而言，例如可通过培养标准酵母及被测酵母，测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表达的菌株，从而选择出适于酒精饮料酿造的酵母。
或者，可以通过培养被测酵母，选择亚硫酸盐生成能力强的酵母，从而选择出适于酿造所需酒精饮料的被测酵母。
上述情况下，作为被测酵母或标准酵母，例如可使用导入了上述本发明的载体的酵母、实施了人工突变处理的酵母、发生了自发突变的酵母等。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(例如，参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等。日语原文：「大嶋泰治編著、生物化学実験法39、酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一」)。
另外，关于可作为标准酵母、被测酵母使用的酵母包括可用于酿造的任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体可为酵母属(Saccharomyces)等酵母(例如S.pastorianus、S.cerevisiae和S.carlsbergensis)。在本发明中，可使用：啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。此外，也可以使用威士忌酵母，例如酿酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本酿造协会的1号、3号和4号等葡萄酒酵母；清酒酵母，例如日本酿造协会的7号和9号等清酒酵母，但不限于此。本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母。标准酵母、被测酵母可从上述酵母组中以任意组合选择。
实施例
下面，通过实施例详细说明本发明的内容，但本发明不限于以下的实施例。
[实施例1]
磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因(nonScMET16)的克隆
用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索后，发现了啤酒酵母特有的新型磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因nonScMET16(序列号1)。根据得到的核苷酸序列信息，分别设计了用于扩增全长基因的引物nonScMET16_for(序列号3)/nonScMET16_rv(序列号4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株的染色体DNA为模板进行PCR，获得含有nonScMET16全长基因的DNA片段(约0.8kb)。
将按上述操作得到的nonScMET16基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体[英杰(Invitrogen)公司制造]。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析nonScMET16基因的核苷酸序列，并证实了核苷酸序列。
[实施例2]
啤酒试酿中的nonScMET16基因表达分析
用啤酒酵母巴斯德酵母W34/70株进行啤酒试酿，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列进行检测。
麦芽汁浸出物浓度    12.69％
麦芽汁体积          70L
麦芽汁中溶解氧浓度  8.6ppm
发酵温度            15℃
酵母添加量          12.8×106cells/mL
对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2)的经时变化。与此同时，对酵母菌体进行采样，将制备好的mRNA用生物素标记，在啤酒酵母DNA微阵列上杂交。用基因芯片操作系统(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，昂飞(Affymetrix)公司制造)进行信号检测。nonScMET16基因的表达模式如图3所示。结果证实：nonScMET16基因在一般的啤酒发酵中表达。
[实施例3]
nonScMET16基因高表达株的制作
从实施例1中所述的质粒nonScMET16/pCR2.1-TOPO，通过限制酶SacI及NotI处理，制备含有nonScMET16基因的约0.8kb的DNA片段。将其与经限制酶SacI及NotI处理的pUP3GLP2连接，构建nonScMET16组成型表达载体pUP-nonScMET16。酵母表达载体pUP3GLP2是在同源重组位点含有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因URA3的YIp型(染色体整合型)载体，导入的基因在甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因TDH3的启动子和终止子的控制下组成型表达。作为酵母中的选择标记，在半乳糖激酶基因GAL1的启动子和终止子的控制下整合抗药性基因YAP1，从而在含有半乳糖的培养基中被诱导表达。另外，还包含作为大肠杆菌中的选择标记的氨苄青霉素抗性基因Ampr。
使用通过上述方法制作的组成型表达载体，用日本特开平07-303475中记载的方法，转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株。首先，若生成的亚硫酸盐在菌体内积累，则酵母自身受到亚硫酸盐引起的损害，无法正确评价nonScMET16基因的效果，因此用日本特开2004-283169中记载的方法获得编码亚硫酸盐排出泵的nonScSSU1基因高表达株。然后，将其作为亲株进行转化，以得到nonScMET16基因高表达株，在含有浅蓝菌素1.0mg/L的YPGal平板培养基(1％酵母膏、2％多聚蛋白胨、2％半乳糖、2％琼脂)上选择浅蓝菌素抗性株。对顶层酵母TF_ALE株也按同样的顺序进行操作，得到nonScSSU1高表达株，将其作为亲株构建nonScMET16高表达株。
通过RT-PCR确认组成型表达。用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)，按照试剂盒中附带的操作手册提取总RNA。nonScMET16特异性引物采用nonScMET16_F(序列号5)/nonScMET16_rv(序列号4)，内部标准采用丙酮酸脱氢酶基因PDA1的特异性引物即PDA1_for51(序列号6)/PDA1_730rv(序列号7)。将PCR产物用0.8％琼脂糖电泳后，用溴化乙锭溶液染色，将nonScMET16基因的信号值用PDA1基因的信号值标准化。筛选该值与亲株相比显示出2倍以上表达量的2株作为nonScMET16高表达株。
[实施例4]
啤酒试验酿造中的亚硫酸盐生成量分析
在下述条件下，用亲株和实施例3中获得的nonScMET16高表达株(2株)进行发酵试验。
麦芽汁浸出物浓度    13％
麦芽汁体积          1L
麦芽汁中溶解氧浓度  约8ppm
在34/70株实验区，发酵温度为15℃，酵母添加量为6g/L。在TF_ALE株实验区，发酵温度为25℃，酵母添加量为3.75g/L。
对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的经时变化。关于发酵结束时的亚硫酸盐浓度的定量，通过在酸性条件下利用蒸馏将亚硫酸盐收集到过氧化氢水中，然后用碱滴定来进行[(财)日本酿造协会  改订BCOJ啤酒分析法]，算出2株高表达株的平均值。34/70株实验区的结果如图4、图5及图6所示，TF_ALE实验区的结果如图7、图8及图9所示。
由图6可知，发酵结束时的亚硫酸盐生成量，亲株为25ppm，而nonScMET16高表达株为30ppm。另外，对于顶层酵母，亲株为4ppm，而高表达株为5ppm(图9)。上述结果表明，无论是顶层酵母还是底层酵母，由于nonScMET16高表达，亚硫酸盐生成量均增大约20％。而且此时，亲株与组成型表达株之间在增殖速度及浸出物消耗速度上无差异。
由上述结果可知，本发明中公开的通过使啤酒酵母特有的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因组成型表达而使亚硫酸盐的生成能力强化的酵母，能在不改变发酵工序、发酵时间的情况下特异性增加作为啤酒抗氧剂起作用的亚硫酸盐的生成量。从而可以制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。
[实施例5]
使用低硫源麦芽汁的啤酒酿造试验
用实施例3中制作的高表达载体转化Saccharomyces pastorianusW34/70株，分别获得Sc和non-ScMET16(单独)高表达株。然后，调制麦芽比率为24％的麦芽汁作为低硫源麦芽汁，在下述条件下，用亲株和得到的高表达株进行啤酒酿造试验。
麦芽汁浸出物浓度    13％
麦芽汁体积          2L
麦芽汁中溶解氧浓度  约8ppm
发酵温度            15℃恒定
酵母添加量          10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁
对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的经时变化。
[实施例6]
MET16基因的破坏
按照文献(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，以含有抗药性标记的质粒(pFA6a(G418r)或pAG25(nat1))为模板进行PCR，制作MET16基因破坏用片段。
用制作的基因破坏用片段转化W34/70株或孢子克隆W34/70-2株。转化采用日本特开平07-303475中记载的方法进行，选择试剂的浓度分别为遗传霉素300mg/L，诺尔丝菌素(50mg/L)。
[实施例7]
啤酒酿造试验中的含硫化合物生成量的分析
在下述条件下，用亲株及实施例6中获得的破坏株进行啤酒酿造试验。
麦芽汁浸出物浓度    13％
麦芽汁体积          2L
麦芽汁中溶解氧浓度  约8ppm
发酵温度            15℃恒定
酵母添加量          10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁
对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(OD660)、糖消耗量的经时变化。用顶空气相色谱法进行醪液中的含硫化合物类的分析。
工业实用性
根据本发明的酒精饮料制造方法，由于产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐的含量增加，从而可以制造香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料。另外，本发明的酵母可以高效地还原作为硫源的硫酸根离子，生物合成增殖所需的含硫化合物，因此即使使用含硫氨基酸含量低的原料、例如发泡酒麦芽汁的情况下也可以进行良好的酒精发酵。此外，即使对于具有异味的含硫化合物类的生成量高的酵母，也可以通过抑制该基因的表达来制造香味良好的酒精饮料。
本申请主张日本专利申请第2005-231192号(2005年8月9日申请)的优先权的利益，通过引用将该申请所记载的全部内容包括在本申请内。另外，其他所有引用文献的全部内容也包括在本申请内。
序列表
<110>三得利株式会社(Suntory Limited)
<120>磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因及其用途(Phosphoadenylyl sulfate reductase gene
and its use)
<130>PCT06-0070
<150>JP2005-231192
<151>2005-08-09
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>786
<212>DNA
<213>酵母(yeast)
<400>1
atgaaaagtt accatttgaa caatgacatt attgtcacac aggaacagtt agatcattgg     60
aacgaacaat tagccaagtt ggaaacggca caagagatta tcgaatggtc gctagtggct    120
ttcccacacc ttttccaaac cactgcgttt ggactgacag gtttggtcac catcgacatg    180
ctgtcgaaac tatccgggaa atactatatg ccggaattat tatttataga cactttgcac    240
catttcccac agactttaac actgaaggat acaatcgagc aaaagtatta tcagccccag    300
aagcaaacta tccatgttta taagccagat ggatgcgtct cagaggcgga atttgcctcg    360
aagtacggtg atttcctatg ggagaaagac gacgataagt acgactattt ggctaaagta    420
gaacctgcgc accgtgctta caaagaactg cgcgtaagtg ccgtcttcac aggcagaaga    480
aagtcgcagg gttctgctcg ctctcagttg tcgcttattg aaattgacga gcttaacggg    540
atcttgaaga taaatccatt gattaattgg acattcgagc aagttaaaca atatatagat    600
gcaaacaatg taccatacaa tgagcttttg gatctcgggt atagatccgt tggtgattac    660
cattccacac aacctgtaaa ggaaggtgaa gatgaaagag caggaaggtg gaagggcaag    720
acaaagactg agtgtggaat tcacgaagcc agtagattcg cccaatttct aaaacaagac    780
gcctag                                                               786
<210>2
<211>261
<212>PRT
<213>酵母(yeast)
<400>2
Met Lys Ser Tyr His Leu Asn Asn Asp Ile Ile Val Thr Gln Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Asp His Trp Asn Glu Gln Leu Ala Lys Leu Glu Thr Ala Gln Glu
            20                  25                  30
Ile Ile Glu Trp Ser Leu Val Ala Phe Pro His Leu Phe Gln Thr Thr
        35                  40                  45
Ala Phe Gly Leu Thr Gly Leu Val Thr Ile Asp Met Leu Ser Lys Leu
    50                  55                  60
Ser Gly Lys Tyr Tyr Met Pro Glu Leu Leu Phe Ile Asp Thr Leu His
65                  70                  75                  80
His Phe Pro Gln Thr Leu Thr Leu Lys Asp Thr Ile Glu Gln Lys Tyr
                85                  90                  95
Tyr Gln Pro Gln Lys Gln Thr Ile His Val Tyr Lys Pro Asp Gly Cys
            100                 105                 110
Val Ser Glu Ala Glu Phe Ala Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Leu Trp Glu
        115                 120                 125
Lys Asp Asp Asp Lys Tyr Asp Tyr Leu Ala Lys Val Glu Pro Ala His
    130                 135                 140
Arg Ala Tyr Lys Glu Leu Arg Val Ser Ala Val Phe Thr Gly Arg Arg
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gln Gly Ser Ala Arg Ser Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ile Asp
                165                 170                 175
Glu Leu Asn Gly Ile Leu Lys Ile Asn Pro Leu Ile Asn Trp Thr Phe
            180                 185                 190
Glu Gln Val Lys Gln Tyr Ile Asp Ala Asn Asn Val Pro Tyr Asn Glu
        195                 200                 205
Leu Leu Asp Leu Gly Tyr Arg Ser Val Gly Asp Tyr His Ser Thr Gln
    210                 215                 220
Pro Val Lys Glu Gly Glu Asp Glu Arg Ala Gly Arg Trp Lys Gly Lys
225                 230                 235                 240
Thr Lys Thr Glu Cys Gly Ile His Glu Ala Ser Arg Phe Ala Gln Phe
                245                 250                 255
Leu Lys Gln Asp Ala
            260
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>引物(primer)
<400>3
ccagaaataa agtggtaaag g     21
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>引物(primer)
<400>4
gtatatagtg tactctatct agg   23
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物(primer)
<400>5
caaagtcatt gcggatgtca       20
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>引物(primer)
<400>6
ggaaaccaca tttgtgcc         18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>引物(primer)
<400>7
gattagaggc accatcac         18

Claims (23)

1. 多核苷酸，其是选自下述(a)～(f)构成的组中的多核苷酸：
(a)多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；
(c)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸；以及
(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质的多核苷酸。
2. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其是选自下述(g)～(i)构成的组中的多核苷酸，
(g)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列经过1～10个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加后的氨基酸序列组成且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质；
(h)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质；以及
(i)多核苷酸，其与序列号1的核苷酸序列或与序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，且编码具有磷酸腺苷酰硫酸还原酶活性的蛋白质。
3. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸。
4. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
5. 根据权利要求1～4任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
6. 多核苷酸，其是选自下述(j)～(m)构成的组中的多核苷酸，
(j)多核苷酸，其编码具有与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA；
(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA；
(1)多核苷酸，其编码具有特异性切割权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录产物的活性的RNA；以及
(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA。
7. 蛋白质，其是由权利要求1～5任一项所述的多核苷酸所编码的蛋白质。
8. 载体，其是含有权利要求1～5任一项所述的多核苷酸的载体。
9. 载体，其是含有权利要求6所述的多核苷酸的载体。
10. 酵母，其含有权利要求8或9所述的载体。
11. 根据权利要求10所述的酵母，其通过导入权利要求8所述的载体增强亚硫酸盐生成能力。
12. 酵母，其通过导入权利要求9所述的载体，或通过破坏与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制权利要求5所述多核苷酸(DNA)的表达。
13. 根据权利要求10所述的酵母，其通过增加权利要求7所述的蛋白质的表达量，提高亚硫酸盐生成能力。
14. 酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求10～13任一项所述的酵母。
15. 根据权利要求14所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。
16. 根据权利要求14所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。
17. 酒精饮料，其是用权利要求14～16任一项所述的方法制造的酒精饮料。
18. 评价方法，其包括使用根据具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的核苷酸序列设计的引物或探针，评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。
19. 评价方法，其包括：培养被测酵母，以及测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量，来评价被测酵母的亚硫酸盐生成能力。
20. 酵母的选择方法，其包括：培养被测酵母，对权利要求7所述的蛋白质进行定量或测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因的表达量，以及选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的上述蛋白质的生成量或上述基因的表达量的被测酵母。
21. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被测酵母；测定具有序列号1的核苷酸序列的磷酸腺苷酰硫酸还原酶基因在各酵母中的表达量；以及选择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被测酵母。
22. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其包括培养标准酵母和被测酵母；对各酵母中权利要求7所述的蛋白质进行定量；以及选择与标准酵母相比该蛋白质的量增多或减少的被测酵母。
23. 酒精饮料的制造方法，其包括：用权利要求10～13任一项所述的酵母或通过权利要求20～22任一项所述的方法选择的酵母中的任一酵母进行以酒精饮料制造为目的的发酵，并调节亚硫酸盐的生成量。
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Applicant before: Suntory Ltd.

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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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