CN101189338A

CN101189338A - 硫酸根离子转运蛋白基因及其用途

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Publication number: CN101189338A
Application number: CNA2006800199682A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2026-06-16
Also published as: US20090053358A1; WO2006135110A1; JP2008546371A; EP1891098B1; EP1891098A1; AU2006258437B2; JP4918504B2; CN101189338B; AU2006258437A1; CA2612304A1; KR20080027245A; DK1891098T3

Abstract

本发明涉及硫酸根离子转运蛋白基因及其用途，特别涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过提高编码酿造酵母硫酸根离子转运蛋白Sul2p的基因SUL2、特别是啤酒酵母中特征性的non－ScSUL2基因的表达量，从而提高对产品香味稳定化起作用的亚硫酸盐生成能力的酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。

Description

硫酸根离子转运蛋白基因及其用途

技术领域

本发明涉及硫酸根离子转运蛋白基因及其用途，特别涉及制造香味稳定性优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。更具体地说，本发明涉及通过控制编码酿造酵母的硫酸根离子转运蛋白Sul2p的基因SUL2、特别是啤酒酵母中特征性的non-ScSUL2基因的表达量，从而控制对产品香味稳定化起作用的亚硫酸盐生成能力的酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。

背景技术

亚硫酸盐作为抗氧化作用强的化合物而为人所知，作为抗氧化剂在食品、饮料、医药品等领域中广泛应用(例如日本特开平06-040907号公报、日本特开2000-093096号公报等)。酒精饮料中亚硫酸盐也被作为抗氧化剂利用，例如，由于对需长时间陈酿的葡萄酒的质量保证起重要作用，所以，日本国内厚生劳动省许可添加到残留浓度为350ppm以下。已知在啤酒酿造中，保质期的变化依赖于产品中含有的亚硫酸盐浓度，所以增加此物质的含量在香味稳定性等方面非常重要。

使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但此时亚硫酸盐会被作为食品添加剂对待，在商品开发的自由度及消费者对食品添加剂所存在的负面印象等上会成为问题。

酵母在自身生命活动中可生物合成必需的含硫化合物，亚硫酸盐作为其中间代谢产物被生成。因此，通过利用酵母的这种能力，可不由外部添加亚硫酸盐而使产品中亚硫酸盐的含量增加。

使酿造过程中发酵液中的亚硫酸盐浓度上升的方法有1)通过过程控制的方法和2)通过酵母育种的方法。通过过程控制的方法，是指因酿造过程中亚硫酸盐的生成与初期供氧量成反比，所以减少向发酵液中的供氧量，可使亚硫酸盐的生成量增加，同时抑制其氧化。

而通过酵母育种的方法是利用基因操作技术的方法。酵母硫代谢中的亚硫酸盐是生物合成含硫氨基酸、含硫维生素的中间体。从细胞外吸收的硫酸根离子经3步反应，亚硫酸盐被还原、生成。

在此，MET3基因是编码催化第1反应的酶的基因，MET14基因是编码催化第2反应的酶的基因。C.Korch等进行了通过使上述2个基因的表达量增加来提高酵母的亚硫酸盐生成能力的尝试，并证明MET14更有效(C.Korch et al.，Proc.Eur.Brew.Conv.Conger.，Lisbon，201-208，1991：非专利文献1)。另外，J.Hansen等进行了通过破坏编码亚硫酸盐根离子还原酶的MET10基因，防止生成的亚硫酸盐根离子还原，从而使亚硫酸盐生成量增加的尝试(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996：非专利文献2)。

并且，藤村等进行了如下尝试，即通过提高编码酵母的亚硫酸盐根离子排出泵的SSU1基因中、特别是啤酒酵母中特有的non-ScSSU1基因的表达量，从而促进菌体内生成的亚硫酸盐向菌体外排出，使啤酒中亚硫酸盐浓度增加(藤村等、2003年度日本农艺化学会年次大会要旨集、159、2003：非专利文献3)。

发明内容

尽管如此，为了改良酵母酿造的酒精饮料的保质期和香味稳定性，需要新的方法和原料来提高酵母生成的亚硫酸盐的量。如上所述，使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加外源的或非酵母产生的亚硫酸盐，但近年来，消费者更热衷于希望最低量地使用食品添加剂，即不添加食品添加剂而是使用天然原料。因此，急需不通过由外部添加亚硫酸盐而成功地达到对香味稳定性有效的亚硫酸盐浓度。但是，上述通过过程控制的方法由于供氧不足会降低酵母的增殖速度，引起发酵延迟及品质下降，所以未必实用。

另外，有文献报道了利用基因操作技术进行的酵母育种中，主要以与从硫酸根离子向亚硫酸盐根离子的还原反应有关的基因组作为目标，其中有达到亲株10倍以上的亚硫酸盐浓度的结果(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)。但另一方面，也出现了发酵延迟、不受欢迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加，所以作为实用酵母还存在着问题。因此，非常希望能有既不影响发酵速度和产品质量，又能生产充分量的亚硫酸盐的酵母的育种方法。

本发明者为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定、分离了编码比已知蛋白质更奏效的硫酸根离子转运蛋白的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转基因酵母，确认了亚硫酸盐生成量的增加，从而完成了本发明。

即本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型硫酸根离子转运蛋白基因、该基因编码的蛋白质、该基因表达得到调节的转化酵母、通过使用该基因表达得到调节的酵母控制产品中亚硫酸盐生成量的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。

(1)多核苷酸，其选自以下(a)～(f)组成的组：

(a)多核苷酸，其含有由序列号：1中记载的核苷酸序列组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2中记载的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其含有编码由序列号：2中记载的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成的、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)多核苷酸，其含有与序列号：1中记载的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(f)多核苷酸，其含有与编码序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其选自以下(g)～(i)组成的组：

(g)多核苷酸，其编码序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质，或编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后组成的氨基酸序列，其中所述的蛋白质具有硫酸根离子转运蛋白活性；

(h)多核苷酸，其编码具有与序列号：2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；及

(i)多核苷酸，其与序列号：1的核苷酸序列组成的多核苷酸或序列号：1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其为由序列号：1中记载的核苷酸序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其编码由序列号：2中记载的氨基酸序列组成的蛋白质。

(5)上述(1)所述的多核苷酸，其是DNA。

(6) 多核苷酸，其是选自下述(j)～(m)中所述的多核苷酸：

(j)编码与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA的多核苷酸；

(k)编码通过RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；

(l)编码具有特异性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；以及

(m)编码通过共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。

(7)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。

(8)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(8a)上述(8)中所述的载体，其含有具有以下(a)～(c)组成要素的表达盒：

(a)在酵母细胞内可转录的启动子；

(b)上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向相连接；以及

(c)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

(9)酵母，其中导入了上述(8)中所述的载体。

(10)上述(9)中所述的酵母，其通过导入上述(8)中所述的载体增强亚硫酸盐的生成能力。

(11)酵母，其通过导入上述(8)中所述的载体或通过破坏与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)有关的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)的表达。

(12)上述(9)中所述的酵母，其通过使上述(7)中所述蛋白质的表达量增加，提高亚硫酸盐生成能力。

(13)酒精饮料的制造方法，其使用上述(9)～(12)中任一项所述的酵母。

(14)上述(13)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

(15)上述(13)中所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。

(16)酒精饮料，其用上述(13)～(15)中任一项所述的方法制造。

(17)评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的核苷酸序列而设计的引物或探针。

(17a)根据上述(17)中所述的方法，筛选亚硫酸盐生成能力强的酵母的方法。

(17b)使用通过上述(17a)中所述方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(18)评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括：培养被检酵母；和测定具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量。

(18a)筛选亚硫酸盐生成能力强的酵母的方法，其包括：根据上述(18)中所述的方法评价被检酵母；和筛选硫酸根离子转运蛋白基因的表达量高的酵母。

(18b)使用通过上述(18a)中所述方法筛选的酵母制造酒精饮料(例如啤酒)的方法。

(19)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对上述(7)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量；和选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的所述蛋白质生成量或所述基因表达量的被检酵母。

(20)上述(19)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1的核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因在各酵母中的表达量；选择与标准酵母相比，该基因为高表达或低表达的被检酵母。

(21)上述(19)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中的上述(7)中所述的蛋白质进行定量；选择与标准酵母相比，该蛋白质的量较多或较少的被检酵母。

(22)酒精饮料的制造方法，其包括：使用上述(9)～(12)中任一项所述的酵母或使用通过上述(19)～(21)中任一项所述的方法选择的酵母，进行用于酒精饮料制造的发酵；和调节亚硫酸盐含量。

根据使用本发明转化酵母的酒精饮料的制造方法，因其可使产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐含量增大，所以可制造出香味稳定性优异、保质期更长的酒精饮料，其中所述的转化酵母是通过使用可操作地连接于载体上的亚硫酸根离子转运蛋白多核苷酸而进行转化的。

附图说明

图1表示使用SUL2基因高表达株的啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示0D660值。

图2表示使用SUL2基因高表达株的啤酒试验酿造中糖消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3表示啤酒试验酿造终止时醪液中的亚硫酸盐浓度。

具体实施方式

在以往公知的增强亚硫酸根离子排出泵的表达量的方法中，由于菌体内不积累剩余的亚硫酸盐，所以可保持良好的发酵速度，但基质硫酸根离子的吸收有可能成为限速因素。因此认为通过使酵母吸收硫酸根离子的能力增大，可更高效地生成亚硫酸盐。本发明者基于此种设想，不断研究，基于用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息，分离、鉴定了编码啤酒酵母特有的硫酸根离子转运蛋白的non-ScSUL2基因。该基因的核苷酸序列如序列号：1所示。由此基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列号：2所示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号：1中记载的碱基序列组成的多核苷酸；及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2中记载的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。所述多核苷酸为DNA或RNA。

作为本发明对象的多核苷酸，不只限于编码来自上述啤酒酵母的硫酸根离子转运蛋白的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能同等的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号：2中记载的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。

此种蛋白质，可为由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1～数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基的氨基酸序列组成，且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，一般越少越好。此种蛋白质可例举为(d)具有与序列号：2氨基酸序列有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上同一性的氨基酸序列，且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越好。

硫酸根离子转运蛋白活性，例如可通过Cherest等的方法(Genetics，145：627-635，1997)中所述的方法测定。

另外，本发明也包含：(e)多核苷酸，其含有与序列号：1中记载的碱基序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号：2中记载的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列的互补多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。

本文中所述的“在严谨条件下杂交的多核苷酸”，是指以序列号：1中记载的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸或编码序列号：2中记载的氨基酸序列的DNA的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的核苷酸，例如DNA。杂交方法，例如可利用MolecularCloning 3^rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1987-1997等中所述的方法。

本说明书中所述的“严谨条件”可为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件下，温度越高，越能期待高效地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严谨性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适当选择这些因素，可实现同样的严谨性。

且杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents[Amersham Pharmacia公司制]。此时，根据试剂盒中附带的实验方法(protocol)，与标记了的探针一同孵育过夜后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤，之后可检测杂交后的DNA。

此外可杂交的DNA，可为通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，与编码序列号2中记载的氨基酸序列的DNA具有约60％以上、约70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上同一性的多核苷酸。

氨基酸序列和核苷酸序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)决定。基于BLAST算法的BLASTN、BLASTX的程序已经被开发出来了(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析核苷酸序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。且使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

并且，本发明的多核苷酸包含(j)编码具有与上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物互补的核苷酸序列的RNA的多核苷酸；(k)编码通过RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；(l)编码具有特异性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；及(m)编码通过共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。这些多核苷酸整合进载体，进而可在导入了其载体的转化细胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，这些多核苷酸可适用于优选抑制上述DNA表达的场合。

本说明书中，“编码具有DNA转录产物的互补核苷酸序列的RNA的多核苷酸”，是指所谓的反义DNA。反义技术作为抑制特定的内源性基因表达的方法而公知，且在各种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上：新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp.3 19-347，1993等]。反义DNA的序列，优选全部或部分与内源性基因互补，但只要能有效抑制基因的表达，即使不完全互补也可以。转录的RNA与靶基因的转录产物优选具有90％以上，进一步优选具有95％以上的互补性。反义DNA的长度，至少为15个碱基以上，优选100个碱基以上，进一步优选500个碱基以上。

本说明书中，“编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指用于通过RNA干扰(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。“RNAi”是指将具有与靶基因序列同一或类似序列的双链RNA导入细胞内时，导入的外源基因及内源性靶基因的表达均受到抑制的现象。此处使用的RNA，例如可为产生RNA干扰的21～25碱基长度的双链RNA，例如，dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(short hairpin RNA)。此种RNA可通过脂质体等的传递系统传递至所需位点局部，或者可以使用生成上述双链RNA的载体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制备方法、使用方法等已由许多文献公开(参照日本特表2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，407：6802，319-20，2002 Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，55 15-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：9，6047-6052，2002 Apr.30；NatureBiotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，30：10，e46，2002 May 15等)。

本说明书中，“编码具有特异性切割DNA转录产物活性的RNA的多核苷酸”一般是指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物，阻断其基因的功能。核酶的设计可参照各种公知文献(例如参照FEBS Lett.228：228，1988；FEBS Lett.239：285，1988；Nucl.Acids.Res.17：7059，1989；Nature 323：349，1986；Nucl.Acids.Res.19：6751，1991；ProteinEng 3：733，1990；Nucl.Acids Res.19：3875，1991；Nucl.Acids Res.19：5125，1991；Biochem Biophys Res Commun 186：1271，1992等)。且“编码通过共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸”，是指通过“共抑制”阻断靶DNA功能的核苷酸。

本说明书中，“共抑制”是指细胞中通过由转化导入与内源性靶基因具有同一或类似序列的基因，而使导入的外源基因及内源性靶基因的表达均受到抑制的现象。具有共抑制作用的多核苷酸的设计可参照种种公知文献(例如，参照Smyth DR：Curr.Biol.7：R793，1997、Martienssen R：Curr.Biol.6：810，1996等)。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(f)中任一多核苷酸编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号：2中记载的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成，且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。

此种蛋白质，可例举为由序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述数量的氨基酸残基的氨基酸序列组成，且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。且此种蛋白质，可例举为具有与序列号：2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质。

此种蛋白质，可使用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明的蛋白质氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中任意且1个或多个氨基酸序列的位置上缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸残基，缺失、取代、插入及添加中的2种以上也可同时发生。以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基于酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸(O-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexylalanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamicacid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(PerkinElmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所公司等制造的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转基因酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。本发明的载体通常含有一个表达盒，该表达盒含有(a)在酵母细胞内可转录的启动子；(b)与该启动子以正义方向或反义方向连接的上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸；以及(c)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的在酵母中起作用的信号。本发明中，下述的酒精饮料(例如，啤酒)酿造中，要使上述本发明的蛋白质高表达时，则将这些多核苷酸以启动子的正义方向导入，以促进上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。在下述的酒精饮料(例如，啤酒)酿造中，要抑制上述本发明的蛋白质表达时，则将这些多核苷酸针以启动子的反义方向导入，以抑制上述(a)～(i)中任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。需要抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可在载体中可表达地导入上述(j)～(m)中任一项所述的多核苷酸。且在本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)，可抑制上述DNA的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过向参与靶基因中基因产物表达的区域，例如编码区域、启动子区域等的内部添加或缺失一个或多个碱基或使这些区域的全体缺失来进行。此种基因破坏的手法，可参照公知的文献(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本特开平6-253826号公报等)。

导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体中的YEp24(J.R.Broachet al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USP，76，1035，1979)，上述载体均已为人所知，并可容易地获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起作用，同时对醪液中的氨基酸浓度、糖浓度、高级醇或酯浓度没有影响，可任意组合。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBOJ.，1，603(1982)中有详细记载，通过已知方法即可容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418^r)、抗铜基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别为猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)等。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母，为可用于酿造的任意酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可使用如酵母属(Saccharomyces)的酵母。在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70等，卡氏酵母(Saccharomycescarl sbergensis)NCYC453、NCYC456等，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。还可以使用威士忌酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本酿造协会的葡萄酒用1号、3号、4号等；清酒酵母，例如日本酿造协会的清酒用7号、9号等，但不限于此。本发明中，优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。

酵母的转化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用电穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生质球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸锂法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培养，使OD600nm的值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃下静置约60分钟后，与将导入的DNA(约1～20μg)一同在约30℃下静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃下静置约30分钟后，将此细胞在约42℃下加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入预定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30℃下静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基中，获得转化体。

此外，关于一般性的克隆技术，可参照《分子克隆第3版》、“Methods inYeast Genitics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒精饮料的制造方法及由该制造方法获得的酒精饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒精饮料的酵母中，通过使用该酵母，可制造所需要的且亚硫酸盐含量增加、香味增加了的酒精饮料。且通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母也可同样使用。作为制造对象的酒精饮料并不限于此，例如可为啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等。

制造上述酒精饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往方法完全相同，不会因制造亚硫酸盐含量增加的酒精饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设施、不增加成本的情况下，制造出香味稳定性等优异的酒精饮料。

并且，因所述基因高表达的酵母高效吸收培养基中的硫酸根离子，所以，即使使用硫源缺乏的原料，例如制造啤酒时使用麦芽比率低的麦芽汁时，也可进行良好的酵母增殖和酒精发酵。

对于含硫氨基酸合成体系的合成过强的酵母，有时会大量生成、积累以该途径的中间代谢物硫化氢为代表的、成为酒精饮料中不受欢迎的不愉快香味的含硫化合物类。对于此种酵母，通过抑制或破坏该基因的功能，抑制作为起始物质的硫酸根离子的吸收，从而可制造出减少了不愉快香味的酒精饮料。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的核苷酸序列所设计的引物或探针，评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法。使用引物或探针的评价方法的一般手法为公知，例如，在WO 01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中有记载。以下，就此评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因组为对象，使用根据硫酸根离子转运蛋白基因的核苷酸序列(优选ORF序列)所设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的手法进行。

基因或特异性序列的检测可使用公知的手法进行。例如，将含有特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸作为引物之一使用，另一个引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间部分的碱基数通常以300～2000bp为宜。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃，退火温度：40～60℃，延伸温度：60～75℃，循环数：10次以上等的条件。所得到的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价该酵母的亚硫酸盐生成能力。且通过分析扩增物的核苷酸序列，可进一步更正确地预测、评价上述性能。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量，评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力。且硫酸根离子转运蛋白基因表达量的测定，可通过培养被检酵母，对硫酸根离子转运蛋白基因的转录产物mRNA或蛋白质定量来进行。mRNA或蛋白质的定量可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1994-2003)。

而且，通过培养被检酵母，测定具有序列号：1碱基序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量，选择与目的亚硫酸盐生成能力相应的所述基因表达量的酵母，从而可选择适合酿造所需酒精饮料的酵母。也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中所述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的所述基因的表达量，以选择所需的酵母。具体地说，例如，可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：l碱基序列的硫酸根离子转运蛋白基因在各酵母中的表达量，选择与标准酵母相比该基因为高表达的菌株，来选择适合酒精饮料酿造的酵母。

或者可通过培养被检酵母，选择亚硫酸盐生成能力强的酵母，以选择适合酿造所需酒精饮料的被检酵母。

此时，被检酵母或标准酵母例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，甲磺酸乙酯(EMS：Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法(例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p 67-75、学会出版中心等)。

且可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，可例举酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等，卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456等，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。还可使用威士忌酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCYC90等；葡萄酒酵母，例如日本酿造协会的葡萄酒用1号、3号、4号等；清酒酵母，例如日本酿造协会的清酒用7号、9号等，但不限于此。本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母中以任意组合选择。

实施例

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：SUL2基因的克隆

使用日本特开2004-283169中所述的比较数据库检索的结果，发现了啤酒酵母基因组中的2种新SUL2基因。基于与SGD(酵母基因组数据库；http://www.yeastgenome.org/)中公开的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SUL2基因的核苷酸序列的同源性，将同源性高(99％)的新发现基因定义为ScSUL2，同源性低(80％)的基因定义为non-ScSUL2。基于所得到的碱基序列信息，设计用于扩增各自全长基因的引物，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得含有ScSUL2或non-ScSUL2全长基因的DNA片段(均为约2.7kb)。ScSUL2基因的扩增使用引物ScSUL2_for(序列号：3)/ScSUL2_rv(序列号：4)，non-ScSUL2基因的扩增使用non-ScSUL2_for(序列号：5)/non-ScSUL2_rv(序列号：6)。

将如上所述获得的ScSUL2及non-ScSUL2基因片段，通过TA克隆插入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司制)。将ScSUL2及non-ScSUL2基因的碱基序列用Sanger的方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)进行分析，确认碱基序列无误后，将载体分别命名为TOPO/ScSUL2及TOPO/non-ScSUL2。

实施例2：SUL2基因的组成性表达

由实施例1中所述的质粒TOPO/ScSUL2通过限制酶SacI及NotI处理，制备含有ScSUL2基因的约2.7kb的DNA片段。使其与用限制酶SacI及NotI处理后的pUP3GLP2连接，构建ScSUL2组成性表达载体pUP-ScSUL2。并用与此相同的方式构建non-ScSUL2组成性表达载体pUP-non-ScSUL2。酵母表达载体pUP3GLP2，是作为同源重组位点含有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因URA3的YIp型(染色体整合型)载体，被导入的基因通过3-磷酸甘油醛脱氢酶基因TDH3的启动子/终止子而组成性表达。作为酵母中的选择性标记，抗药性基因YAP1在半乳糖激酶基因GAL1的启动子/终止子的控制下被引入，并在含有半乳糖的培养基中诱导表达。且作为大肠杆菌中的选择性标记，包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的组成性表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株。首先，当生成的亚硫酸盐在菌体内积累时，由于酵母自身受到亚硫酸盐的伤害而不能正确评价SUL2基因的作用，所以，使用日本特开2004-283169中所述的方法，获得编码亚硫酸盐排出泵的non-ScSSU1基因高表达株，作为TF010。其次，以TF010为宿主，进行为获得Sc SUL2或non-ScSUL2基因高表达株的转化，并在含有浅蓝菌素1.0mg/L的YPGal平板培养基(1％酵母浸膏、2％多聚蛋白胨、2％半乳糖、2％琼脂)中选择浅蓝菌素抗性株。

通过RT-PCR进行组成性表达的确认。总RNA的提取使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制)，根据试剂盒中附带的使用说明进行。ScSUL2特异性引物使用ScSUL2_F2(序列号：7)/Sc SUL2_R3(序列号：8)，non-ScSUL2特异性引物使用non-ScSUL2_F2(序列号：9)/non-Sc SUL2_R3(序列号：10)，内部标准使用丙酮酸脱氢酶基因PDA1的特异性引物PDA1_for51(序列号：11)/PDA1_730rv(序列号：12)。将PCR产物用0.8％琼脂糖电泳展开后，用溴化乙锭溶液染色，并将各自的SUL2基因的信号值用PDA1基因的信号值标准化。将此值与亲株TF010比较，把表达量为2倍以上的菌株作为Sc SUL2或non-ScSUL2高表达株，分别选择各2个克隆。

实施例3：啤酒试验酿造中亚硫酸盐生成量的解析

使用亲株TF010以及实施例2中获得的ScSUL2高表达株(2株)、non-ScSUL2高表达株(2株)，采用以下条件进行发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度 13％

麦芽汁容量 800mL

麦芽汁溶解氧浓度约8ppm

发酵温度 15℃恒定

酵母投入量 5g湿酵母菌体/800mL麦芽汁提取物

对发酵醪液经时取样，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的经时变化，分别用图1、图2表示。发酵终止时亚硫酸盐浓度的定量，是在酸性条件下，通过蒸馏将亚硫酸盐收集于过氧化氢溶液中后，用碱滴定来进行[(财)日本酿造协会改订BCOJ啤酒分析法]，用图3表示。结果均用2株的平均值表示。

发酵终止时的亚硫酸盐生成量，相对于亲株TF010的8ppm，ScSUL2高表达株为10ppm，non-ScSUL2高表达株为18ppm，可见，由于non-ScSUL2高表达，亚硫酸盐生成量显著增大。且此时，亲株与组成性表达株之间在增殖速度及浸出物消耗速度上均无差别。

综上所述，通过使本发明中公开的啤酒酵母特有的硫酸根离子转运蛋白组成性表达而使亚硫酸盐生成能力得到强化的酵母，可以在不改变发酵工序、发酵时间的情况下，使作为啤酒等酒精饮料的抗氧化剂起作用的亚硫酸盐的生成量特异性增加。由此，可制造出香味稳定性优异且保质期更长(质量优良)的酒精饮料。

实施例4：使用低硫源麦芽汁的啤酒试验酿造

使用由实施例2制备的高表达载体转化SaccharomycespastorianusW34/70株，分别获得ScSUL2及non-ScSUL2(单独)高表达株。然后，制备麦芽比率为24％的麦芽汁作为低硫源麦芽汁，使用亲株及所得到的高表达株，在以下条件下进行啤酒试验酿造。

麦芽汁浸出物浓度 13％

麦芽汁容量 2L

麦芽汁溶解氧浓度约8ppm

发酵温度 15℃恒定

酵母投入量 10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁

对发酵醪液经时取样，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的经时变化。

实施例5：SUL2基因的破坏

按照文献[Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999)]的方法，以含有抗药性标记的质粒[pFA6a(G418r)，或pAG25(natl)]为模板，通过PCR，制备用于破坏SUL2基因的片段。

用所制备的用于破坏基因的片段转化W34/70株或孢子克隆株W34/70-2株。转化用日本特开平07-303475中所述的方法进行，用于的选择药剂的浓度分别为氨基糖苷类抗生素300mg/L、诺尔丝菌素(nourseothricin)50mg/L。

实施例6：啤酒试验酿造中的含硫化合物生成量的解析

使用亲株及在实施例5中得到的破坏株，在以下条件进行啤酒试验酿造。

麦芽汁浸出物浓度 13％

麦芽汁容量 2L

麦芽汁溶解氧浓度约8ppm

发酵温度 15℃恒定

酵母投入量 10.5g湿酵母菌体/2L麦芽汁

对发酵醪液经时取样，分析酵母增殖量(0D660)、糖消耗量的经时变化。醪液中含硫化合物类的分析使用顶空气相色谱法进行。

根据本发明的酒精饮料制造方法，因产品中具有抗氧化作用的亚硫酸盐的含量增加，所以可制造出香味稳定性优异且保质期更长的酒精饮料。而且本发明的酵母可更高效地吸收作为硫源的硫酸根离子，所以，即使是含硫氨基酸含量低的原料，例如发泡酒(happoushu)麦芽汁，也可进行良好的酒精发酵。此外，对于成为不愉快香味的含硫化合物类的生成量高的酵母，通过抑制该基因的表达，可制造出香味优异的酒精饮料。

本申请要求日本专利申请2005-177821(2005年6月17日提交)的权益，将其以引用的方式纳入本文，以用于各种目的。本文中所引用的其它文献，也均以引用的方式纳入本文，以用于各种目的。

序列表

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>硫酸离子转运蛋白基因及其用途(sulfate ion tranporter gene and its use)

<130>P050104

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2685

<212>DNA

<213>酵母(yeast)

<400>1

atgccaaggg aaacacattc gagtatcgaa gaagaggtgg aaatccccga ttttcaagat 60

agcgcaacag ttcctgatct tgatgactta gagctggagt acgaccaata caaaaataat 120

gaaaacaatg gtcccttcaa cgataatgat ctggaaagca attccgttgc caaccacaac 180

acggtgagca attcgaaggg cattaatggc tcgaaggtcg agtattttaa cgcttcggat 240

atctcgttgt atgacaattc tgtttcgcag ttcgaagaat ctactgtgtc gttcaaagat 300

tactacgacc atagtatacg ttctcatctt actttgaaag gtgctagcga ttatcttaaa 360

agcgtctttc caatcattaa ctggttgcca cactataacg ttagttggtt tattgcagat 420

ctgatcgcgg gtatcactat cggctgtgtt cttgtgccac aatccatgtc gtatgcgcaa 480

gtcgccacat tgcctgcaca gtacgggctg tactcttcat ttattggtgc ctatgcctat 540

gcgttttttg caacctccaa ggatgtttgt attggacccg tcgccgtcat gtccttacag 600

accgccaaag ttattgcaga tgtcacatcc agatacccag aaggtgacac taccattacg 660

ggtcccatca tcgccacgac attggcgtta ttgtgtggga ttatttctgc tgctgttggt 720

ttcttacgtt tggggttcct tgtcgaattc atttctttaa atgctgtcgc tgggtttatg 780

accgggtctg cctttaacat tttgtggggc caagtgccag ctcttatggg gtacaacaaa 840

ttggtcaata caagagtcgc cacttataag atcgtgatag actctttgaa acatttaccg 900

gacactacac tggatgctgt gtttggactt atcccacttt tcattcttta cacttggaaa 960

tggtggtgtg gtacatatgg tccaaagttg aatgacagat tcaattctaa aaggccaaga 1020

ttacacaaga ttgtcaaatg gacatatttc tacgcacagg cttctagaaa tggtattatt 1080

atcattgtat tcacttgtat tgcttgggcc atcacaagag gcaaatctgc agctgacaga 1140

ccaatcagtg tcctgggatc cgttccatcc ggtttgaaag aggtcggtgt cttccatgtt 1200

ccacccggac tgatgtctaa attgggtcca aatctgcctg cttctattat cgtcttgcta 1260

ttagagcata ttgctatttc caaatcattc ggtagagtta acgattacaa agttgtccct 1320

gatcaagaat taattgctat tggtgtttcg aacttattag gtaccttctt taatgcctat 1380

ccagccactg gttccttctc gagatctgct ttgaaggcta aatgtaatgt tcgtacccca 1440

ctatctggtt tattttcagg ttcttgtgtg cttttagcat tatactgttt aactggcgca 1500

ttcttttaca ttccaaaggc cacattatcg gctgttatca tccacgcagt gtctgatctt 1560

ctggcctcct accaaacaac ctggaatttc tggaaaatga acccactgga cttcgtctgt 1620

ttcattgtta cagtcttgat cacggtcttt tcctccattg aaaatggtat ttatttcgct 1680

atgtgctggt catgtgcaat cttcatactt aaagtggcat tcccagctgg taaattcttg 1740

ggtcgtgtcg aaatcgccga agttactgat gcttatgtca gagctgattc ggacagtgtt 1800

agcttcacat ctgaaaacaa caatcgtatt ttaacattgg aagaagatac tactgatggt 1860

gaaaaggagg ggcgtaccgg ttatataatt aactcctcta aaaaactaga cacaaaagtc 1920

caaacgaagg gtttcgaatc cccatcccct tcaattggcc aaccaagaat aaagtatcac 1980

accaaatggc taccattcga ccacaaatac acaagagaat taaacccgga tgtccagatt 2040

ctcccacctc cagatggtgt cctcgtttac aggctatccg atagttacac gtatatcaat 2100

tgttcaagac actatgatat tataatagac cgagtcaaga aggtaacgag acgtggtcaa 2160

ctaattcgcc acaggaaaaa atccgaccgc ccttggaacg atcctggtcc atgggaacca 2220

cctactttct ttaagaattt gaaattctgg aagaaaaagg aaacggatat cgagcctgcc 2280

gaaaatgctg ccaacaaccc aactgatgct gaccgagatg atagaccatt actaaaaatc 2340

gtgtgtttgg atttctcgca agtggcgcaa acagatgcca ctgctcttca gtcactggtt 2400

gacctaagga aagtcatcaa ccaatatgct gatagacaag ttgaattcca tttcgttggt 2460

atcatttcat catgggtgaa gagaggtttg attagtagag gttttggtac tctaaacgaa 2520

gaatatagtg atgaatccat tgttgccggt catacaagtt atcacgtcgc aagagtacct 2580

caaaacaaag aaaccccagg caaatatagc gtttacactg tttcaggtac aaacttacct 2640

ttcttccata tagatattcc agactttgct aaatgggaca tttag 2685

<210>2

<211>894

<212>PRT

<213>酵母(yeast)

<400>2

Met Pro Arg Glu Thr His Ser Ser Ile Glu Glu Glu Val Glu Ile Pro

1 5 10 15

Asp Phe Gln Asp Ser Ala Thr Val Pro Asp Leu Asp Asp Leu Glu Leu

20 25 30

Glu Tyr Asp Gln Tyr Lys Asn Asn Glu Asn Asn Gly Pro Phe Asn Asp

35 40 45

Asn Asp Leu Glu Ser Asn Ser Val Ala Asn His Asn Thr Val Ser Asn

50 55 60

Ser Lys Gly Ile Asn Gly Ser Lys Val Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asp

65 70 75 80

Ile Ser Leu Tyr Asp Asn Ser Val Ser Gln Phe Glu Glu Ser Thr Val

85 90 95

Ser Phe Lys Asp Tyr Tyr Asp His Ser Ile Arg Ser His Leu Thr Leu

100 105 110

Lys Gly Ala Ser Asp Tyr Leu Lys Ser Val Phe Pro Ile Ile Asn Trp

115 120 125

Leu Pro His Tyr Asn Val Ser Trp Phe Ile Ala Asp Leu Ile Ala Gly

130 135 140

Ile Thr Ile Gly Cys Val Leu Val Pro Gln Ser Met Ser Tyr Ala Gln

145 150 155 160

Val Ala Thr Leu Pro Ala Gln Tyr Gly Leu Tyr Ser Ser Phe Ile Gly

165 170 175

Ala Tyr Ala Tyr Ala Phe Phe Ala Thr Ser Lys Asp Val Cys Ile Gly

180 185 190

Pro Val Ala Val Met Ser Leu Gln Thr Ala Lys Val Ile Ala Asp Val

195 200 205

Thr Ser Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Thr Thr Ile Thr Gly Pro Ile Ile

210 215 220

Ala Thr Thr Leu Ala Leu Leu Cys Gly Ile Ile Ser Ala Ala Val Gly

225 230 235 240

Phe Leu Arg Leu Gly Phe Leu Val Glu Phe Ile Ser Leu Asn Ala Val

245 250 255

Ala Gly Phe Met Thr Gly Ser Ala Phe Asn Ile Leu Trp Gly Gln Val

260 265 270

Pro Ala Leu Met Gly Tyr Asn Lys Leu Val Asn Thr Arg Val Ala Thr

275 280 285

Tyr Lys Ile Val Ile Asp Ser Leu Lys His Leu Pro Asp Thr Thr Leu

290 295 300

Asp Ala Val Phe Gly Leu Ile Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Trp Lys

305 310 315 320

Trp Trp Cys Gly Thr Tyr Gly Pro Lys Leu Asn Asp Arg Phe Asn Ser

325 330 335

Lys Arg Pro Arg Leu His Lys Ile Val Lys Trp Thr Tyr Phe Tyr Ala

340 345 350

Gln Ala Ser Arg Asn Gly Ile Ile Ile Ile Val Phe Thr Cys Ile Ala

355 360 365

Trp Ala Ile Thr Arg Gly Lys Ser Ala Ala Asp Arg Pro Ile Ser Val

370 375 380

Leu Gly Ser Val Pro Ser Gly Leu Lys Glu Val Gly Val Phe His Val

385 390 395 400

Pro Pro Gly Leu Met Ser Lys Leu Gly Pro Asn Leu Pro Ala Ser Ile

405 410 415

Ile Val Leu Leu Leu Glu His Ile Ala Ile Ser Lys Ser Phe Gly Arg

420 425 430

Val Asn Asp Tyr Lys Val Val Pro Asp Gln Glu Leu Ile Ala Ile Gly

435 440 445

Val Ser Asn Leu Leu Gly Thr Phe Phe Asn Ala Tyr Pro Ala Thr Gly

450 455 460

Ser Phe Ser Arg Ser Ala Leu Lys Ala Lys Cys Asn Val Arg Thr Pro

465 470 475 480

Leu Ser Gly Leu Phe Ser Gly Ser Cys Val Leu Leu Ala Leu Tyr Cys

485 490 495

Leu Thr Gly Ala Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Ser Ala Val

500 505 510

Ile Ile His Ala Val Ser Asp Leu Leu Ala Ser Tyr Gln Thr Thr Trp

515 520 525

Asn Phe Trp Lys Met Asn Pro Leu Asp Phe Val Cys Phe Ile Val Thr

530 535 540

Val Leu Ile Thr Val Phe Ser Ser Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Phe Ala

545 550 555 560

Met Cys Trp Ser Cys Ala Ile Phe Ile Leu Lys Val Ala Phe Pro Ala

565 570 575

Gly Lys Phe Leu Gly Arg Val Glu Ile Ala Glu Val Thr Asp Ala Tyr

580 585 590

Val Arg Ala Asp Ser Asp Ser Val Ser Phe Thr Ser Glu Asn Asn Asn

595 600 605

Arg Ile Leu Thr Leu Glu Glu Asp Thr Thr Asp Gly Glu Lys Glu Gly

610 615 620

Arg Thr Gly Tyr Ile Ile Asn Ser Ser Lys Lys Leu Asp Thr Lys Val

625 630 635 640

Gln Thr Lys Gly Phe Glu Ser Pro Ser Pro Ser Ile Gly Gln Pro Arg

645 650 655

Ile Lys Tyr His Thr Lys Trp Leu Pro Phe Asp His Lys Tyr Thr Arg

660 665 670

Glu Leu Asn Pro Asp Val Gln Ile Leu Pro Pro Pro Asp Gly Val Leu

675 680 685

Val Tyr Arg Leu Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Ile Asn Cys Ser Arg His

690 695 700

Tyr Asp Ile Ile Ile Asp Arg Val Lys Lys Val Thr Arg Arg Gly Gln

705 710 715 720

Leu Ile Arg His Arg Lys Lys Ser Asp Arg Pro Trp Asn Asp Pro Gly

725 730 735

Pro Trp Glu Pro Pro Thr Phe Phe Lys Asn Leu Lys Phe Trp Lys Lys

740 745 750

Lys Glu Thr Asp Ile Glu Pro Ala Glu Asn Ala Ala Asn Asn Pro Thr

755 760 765

Asp Ala Asp Arg Asp Asp Arg Pro Leu Leu Lys Ile Val Cys Leu Asp

770 775 780

Phe Ser Gln Val Ala Gln Thr Asp Ala Thr Ala Leu Gln Ser Leu Val

785 790 795 800

Asp Leu Arg Lys Val Ile Asn Gln Tyr Ala Asp Arg Gln Val Glu Phe

805 810 815

His Phe Val Gly Ile Ile Ser Ser Trp Val Lys Arg Gly Leu Ile Ser

820 825 830

Arg Gly Phe Gly Thr Leu Asn Glu Glu Tyr Ser Asp Glu Ser Ile Val

835 840 845

Ala Gly His Thr Ser Tyr His Val Ala Arg Val Pro Gln Asn Lys Glu

850 855 860

Thr Pro Gly Lys Tyr Ser Val Tyr Thr Val Ser Gly Thr Asn Leu Pro

865 870 875 880

Phe Phe His Ile Asp Ile Pro Asp Phe Ala Lys Trp Asp Ile

885 890

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>3

aagatatgtc cagggaaggt t 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>4

ttgcatgtcc at tgtaaatg c 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>5

tagttatgcc aagggaaaca c 21

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>6

gatttataaa tatgttgtaa ggtg 24

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>7

caaagtcat t gcggatgtca 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>8

gacgtaagca tcagtaactt c 21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>9

caaagttatt gcagatgtca c 21

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>10

gacataagca tcagtaactt cg 22

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>11

ggaaaccaca tttgtgcc 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)

<400>12

gattagaggc accatcac 18

Claims

1.多核苷酸，其选自以下(a)～(f)组成的组：

(a)多核苷酸，其含有由序列号：1的核苷酸序列组成的多核苷酸；

(b)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(c)多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；

(e)多核苷酸，其含有与序列号：1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及

2.权利要求1所述的多核苷酸，其选自以下(a)～(c)组成的组：

(a)多核苷酸，其编码序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质，或编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1～10个氨基酸后组成的氨基酸序列，且其中所述蛋白质具有硫酸根离子转运蛋白活性；

(b)多核苷酸，其编码具有与序列号：2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列、且具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；及

(c)多核苷酸，其与序列号：1的核苷酸序列或序列号：1的核苷酸序列的互补核苷酸序列在严谨条件下杂交、且编码具有硫酸根离子转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。

3.权利要求1所述的多核苷酸，其为由序列号：1的核苷酸序列组成的多核苷酸。

4.权利要求1所述的多核苷酸，其编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质。

5.权利要求1所述的多核苷酸，其是DNA。

6.多核苷酸，其是选自以下(j)～(m)中所述的多核苷酸：

(j)编码与权利要求5中所述多核苷酸(DNA)的转录产物互补的核苷酸序列的RNA的多核苷酸；

(k)编码通过RNAi作用抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸；

(l)编码具有特异性切割权利要求5中所述多核苷酸(DNA)转录产物活性的RNA的多核苷酸；以及

(m)编码通过共抑制作用抑制权利要求5中所述多核苷酸(DNA)表达的RNA的多核苷酸。

7.蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码。

8.载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。

9.酵母，其中含有权利要求8中所述的载体。

10.权利要求9所述的酵母，其中所述酵母表达多核苷酸编码的蛋白质，且所述蛋白质的表达增加了酵母的亚硫酸盐。。

11.酵母，其通过导入权利要求8中所述的载体或通过破坏与权利要求5中所述多核苷酸(DNA)有关的基因而抑制该酵母中权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的表达。

12.表达权利要求7所述蛋白质的酵母，其中所述蛋白质的表达增加了酵母的亚硫酸盐的产生。

13.酒精饮料的制造方法，其包括在制造酒精饮料的条件下培养权利要求9～12中任一项所述的酵母。

14.权利要求13所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是麦芽饮料。

15.权利要求13所述的酒精饮料的制造方法，其酿造的酒精饮料是葡萄酒。

16.酒精饮料，其用权利要求13～15中任一项所述的方法制造。

17.评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的核苷酸序列而设计的引物或探针。

18.评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括：培养被检酵母；和测定具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量。

19.酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对权利要求7中所述的蛋白质进行定量，或测定具有序列号：1核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因的表达量；和选择具有与目的亚硫酸盐生成能力相应的所述蛋白质生成量或所述基因表达量的被检酵母。

20.权利要求19所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1的核苷酸序列的硫酸根离子转运蛋白基因在各酵母中的表达量；和选择与标准酵母相比，该基因为高表达或低表达的被检酵母。

21.权利要求19所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中的权利要求7中所述的蛋白质进行定量；和选择与标准酵母相比，该蛋白质的量较多或较少的被检酵母。

22.酒精饮料的制造方法，其包括：使用权利要求9～12中任一项所述的酵母或使用通过权利要求19～21中任一项所述的方法选择的酵母进行用于酒精饮料制造的发酵；以及调节亚硫酸盐的产量。