CN101024833A

CN101024833A - 编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途

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Publication number: CN101024833A
Application number: CNA2006101635144A
Authority: CN
Inventors: 中尾嘉宏; 儿玉由纪子; 下永朋子; 大村文彦
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-08-29
Anticipated expiration: 2026-11-29
Also published as: KR20070121828A; JP2008530980A; US20090041889A1; DK1871790T3; AU2006338867B2; AU2006338867A1; EP1871790B1; CA2604276A1; EP1871790A1; JP4460007B2; CN101024833B; KR20100019535A; WO2007097088A1; KR100953291B1

Abstract

本发明涉及编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明涉及通过提高编码具有降低酿造酵母的连二酮或双乙酰活性的蛋白质Mmf1p的基因MMF1、特别是啤酒酵母中特征性的nonScMMF1基因或ScMMF1基因的表达量，增强了产品香味的酵母及使用该酵母的酒饮料制造方法等。

Description

编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途

技术领域

本发明涉及编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒饮料(alcoholic beverages)的酿造酵母、使用该酵母制造的酒饮料及其生产所述酒饮料的方法等。更具体地说，本发明涉及通过提高编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质Mmflp的基因MMF1，特别是啤酒酵母中特征性的nonScMMF1基因或ScMMF1基因的表达量，来降低影响产品香味的连二酮类，特别是双乙酰生产量的酵母及使用该酵母的酒饮料制造方法。

背景技术

酒饮料的香味成份中，双乙酰(以下为DA)味是啤酒、清酒及葡萄酒等酿造的酒饮料中具有代表性的不良味道之一。DA味(在啤酒中表现为馊饭味或黄油味，清酒中表现为使人想吐的味)是以DA为主的连二酮类(以下为VDK)在产品中以阈值以上浓度存在时所产生的，啤酒中的阈值为0.1ppm[Joumal of the Institute of Brewing、76、486(1970)]。

酒饮料中的VDK大致分为DA和2，3-戊二酮(以下为PD)。DA和PD分别以缬氨酸及异亮氨酸生物合成体系的中间产物α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸为前体物质，通过酵母不参与的非酶促反应而生成。

由以上可知，VDK(DA及PD)及其前体物质α-乙酰羟基酸类(α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸)均可成为可带给产品DA味的物质，培养出能减低这些物质的酵母，不仅可使酒饮料的生产质量控制容易进行，还可扩展新商品的开发。

清酒制造中，例如日本特开2001-204457公报中报道的方法，其通过使用米-麦芽-酵母的培养物来抑制DA的生成，该培养物中含有低浓度的作为α-乙酰羟基酸类前体物质的丙酮酸。啤酒制造中，虽有报道使用缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母减少VDK生成量，但由于营养缺陷型菌株生长迟缓、发酵延迟，所以未能达到实用化。日本特开2002-291465号公报中公开的方法是，获得对这些支链氨基酸的类似物具有敏感性的突变株，从中选拔DA累积较少的株。在Journal of American Society of Brewing Chemists，Proceeding，81-84(1987)中报道了调节来自实验室设计的基因工程酵母的ILV5基因的表达量。在European Brewery Convention，Proceedings of the 21st EBC congress，Madrid，553-560(1987)中同样报道了调节基因工程酵母的ILV3基因的表达量。此时ILV5基因编码的乙酰羟基酸还原异构酶的酶活性增加了5-7倍，VDK生成量减少到40％左右。

而ILV3基因编码的二羟酸脱水酶的酶活性虽增加了5-6倍，但VDK生成量无显著的减少。上述2个报道均使用了合成培养基，而对于实际啤酒酿造的影响未与分析。另外，Villa等在Journal of American Society of BrewingChemists，53：49-53(1995)中报道，与正常的啤酒酵母在实际啤酒酿制相比，通过ILV5基因、ILV3基因或者ILV5和ILV3的基因产物的质粒扩增，使VDK生成量分别减少了70％、40％、60％。

Dulieu等在European Brewery Convention，Proceedings of the 26th EBCcongress，Maastricht，455-460(1997)中虽提出了通过使用α-乙酰乳酸脱羧酶使DA的前体物质α-乙酰乳酸迅速转换成3-羟基-2-丁酮的方法，但由于α-乙酰乳酸脱羧酶仅能通过DNA重组技术制得，因此日本的税制上规定在发酵过程中的发酵液内不能添加该酶。日本特开平2-265488号公报及日本特开平7-171号公报均报道了使用编码α-乙酰乳酸脱羧酶的DNA链的基因工程酵母。

发明内容

基于上述情况，有必要开发一种方法来生产香味优异的酒饮料，所述方法利用编码能减少VDK(连二酮)味，特别是DA味的蛋白质的基因以及该蛋白质来培育具有降低VDK能力的酵母菌来实现的。酒饮料。

本发明的发明人为解决上述课题进行了不断的研究，并从啤酒酵母中成功地鉴定、分离出了编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因。而且制备了将所得到的基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认降低了啤酒中VDK浓度，特别是DA浓度，从而完成了本发明。

即本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的编码能降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因、该基因编码的蛋白质、该基因表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因表达受到调控的酵母控制产品中的VDK浓度，特别是DA浓度的方法等。具体地说，本发明提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母生产酒饮料的方法等。

(1)多核苷酸，其选自由以下(a)～(f)组成的群组：

(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；

(b)含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(c)含有编码由序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(d)含有编码具有与序列号：2的氨基酸序列有60％或60％以上同一性的氨基酸序列且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；

(e)含有与序列号：1的互补核苷酸在严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及

(f)含有与编码序列号：2的多核苷酸序列互补的多核苷酸在严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其选自由以下(g)～(i)组成的群组：

(g)编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质或编码序列号：2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质且所述蛋白质具有降低连二酮或双乙酰的活性的多核苷酸；

(h)编码具有与序列号：2的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(i)与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸或与序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸。

(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

(5)上述(1)～(4)中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。

(6)蛋白质，其由上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸编码。

(7)载体，其含有上述(1)～(5)中任一项所述的多核苷酸。

(8)载体，其含有选自由以下(j)～(1)组成的群组中的多核苷酸：

(j)编码由序列号：4的氨基酸序列或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸；

(k)编码与序列号：4的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸；以及

(1)与序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸或序列号：3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸。

(8a)上述(7)中所述的载体，其含有包括以下(x)～(z)组成要素的表达盒：

(x)在酵母细胞内可转录的启动子；

(y)上述(1)～(5)中任意一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向结合；以及

(z)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。

(9)酵母，其中导入了上述(7)或(8)中所述的载体。

(10)上述(9)中所述的酵母，其通过导入上述(7)或(8)中所述的载体，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

(11)上述(10)中所述的酵母，其通过使上述(6)中所述的蛋白质的表达量增加，降低总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

(12)酒饮料的制造方法，其包括培养上述(9)～(11)中任一项所述的酵母。

(13)上述(12)中所述的酒饮料的制造方法，其中所酿造的酒饮料是麦芽饮料。

(14)上述(12)中所述的酒饮料的制造方法，其中所酿造的酒饮料是葡萄酒。

(15)酒饮料，其用上述(12)～(14)中任一项所述的方法制造。

(16)评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的碱基序列而设计的引物或探针。

(16a)利用上述(16)中所述的方法选择降低了总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的酵母的方法。

(16b)使用上述(16a)中所述的方法选择的酵母制造酒饮料(例如啤酒)的方法。

(17)评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量。

(17a)选择具有降低总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的酵母的方法，其包括使用上述(17)中所述的方法评价被检酵母；以及选择编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因表达量高的酵母选择。

(17b)使用上述(17a)中所述的方法选择的酵母制造酒饮料(例如啤酒)的方法。

(18)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对上述(6)中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量；根据目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力选择具有所述蛋白质的生成量或所述基因表达量的被检酵母。

(18a)酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；测定总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力；选择具有目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的被检酵母。

(19)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；以及选择该基因表达量比标准酵母高的被检酵母。

(20)上述(18)中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中上述(6)所述的蛋白质定量；以及选择该蛋白质含量高于标准酵母的被检酵母。

(21)酒饮料的制造方法，其包括：使用上述(9)～(11)中任意一项所述的酵母或通过上述(18)～(20)中任意一项所述方法选择的酵母进行用于酒饮料制造的发酵；以及调节总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。

使用本发明的酒饮料制造法，可使产品中不良味道的VDK，特别是DA的生产量降低，所以可容易地制造出香味优异的酒饮料。

附图说明

图1是啤酒试验酿造中酵母生长经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示660nm处的光密度(OD660)。

图2是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图3是啤酒试验酿造中酵母的nonScMMF1基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图4是使用nonScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中酵母生长经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660。

图5是使用nonScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图6是使用nonScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中发酵液的VDK浓度(发酵结束时)的示意图。

图7是啤酒试验酿造中酵母生长经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660。

图8是啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图9是啤酒试验酿造中酵母的ScMMF1基因表达变动的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示检测出的信号辉度。

图10是使用ScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中酵母生长经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示OD660。

图11是使用ScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中浸出物消耗量经时变化的示意图。横坐标表示发酵时间，纵坐标表示表观浸出物浓度(w/w％)。

图12是使用ScMMF1高表达株的啤酒试验酿造中发酵液的VDK浓度(发酵结束时)的示意图。

具体实施方式

本发明的发明人以用日本特开2004-283169中公开的方法解读的啤酒酵母基因组信息为基础，分离、鉴定了啤酒酵母中特有的编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的nonScMMF1基因及ScMMF1基因。上述基因的碱基序列分别如序列号：1和序列号：3所示。由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如序列号：2和序列号：4所示。

1.本发明的多核苷酸

首先，本发明提供(a)包含序列号：1或序列号：3的碱基序列的多核苷酸；以及(b)包含编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。

本发明所述的多核苷酸，不只限于来自上述啤酒酵母的编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸，还包含编码与此蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能相同的蛋白质，例如，可例举为(c)由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。

此种蛋白质，可为由序列号：2或序列号：4氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个(1至数个)、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个氨基酸残基的氨基酸序列组成的，且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，一般优选较小的数量。此种蛋白质可例举为(d)具有与序列号：2或序列号：4的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或者99.9％或以上的同一性的氨基酸序列，且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。上述同一性的数值一般越大越好。

降低连二酮或双乙酰的活性，例如可根据Drews等的方法(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)，通过测定、比较发酵液中的总VDK(DA及PD)浓度进行评价。

另外，本发明也包含(e)含有与序列号：1或序列号：3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有与编码由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

此处的在严格条件下杂交的多核苷酸，是指以序列号：1或序列号：3碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分、或编码序列号：2或序列号：4氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southem杂交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。杂交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons 1987-1997等中所述的方法。

本说明书中所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，温度越高，越能高效地获得具有较高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现同样的严格条件。

杂交中使用市售的试剂盒时，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记了的探针进行一夜温育后，将膜在55℃的条件下，用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗涤缓冲液洗涤，之后可检测杂交后的多核苷酸(例如DNA)。

其它可杂交的多核苷酸包括与编码序列号：2或序列号：4的氨基酸序列的多核苷酸有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的多核苷酸，上述同一性例如是通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数(default parameter)所计算得。

氨基酸序列或碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)而确定。开发了基于BLAST算法、被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et al：J.Mol.Biol.215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为score＝100、wordlength＝12。且使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序的默认参数。

2.本发明的蛋白质

本发明也提供由上述多核苷酸(a)～(1)中任一个编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质，是由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的，且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。

此种蛋白质，例如可例举为由序列号：2或序列号：4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了上述数量的氨基酸残基的氨基酸序列组成的，且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。且此种蛋白质，可例举为含有与序列号：2或序列号：4的氨基酸序列具有如上所述同源性的氨基酸序列，且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质。此种蛋白质，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定点诱变法获得。

本发明的蛋白质氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1个以上的氨基酸残基，是指在同一序列中任意的1个或多个氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加了1个或多个氨基酸残基之意，2种或2种以上类型的缺失、取代、插入及添加中的也可同时发生。

以下，举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、环己基丙氨酸(cyclohexylalanine)；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、Shimazu公司制的肽合成仪进行化学合成。

3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母

其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a)～(1)中所述的任-多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常如下构成，其含有(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正义方向或反义方向结合的、上述(a)～(1)中任一项所述的多核苷酸(例如DNA)；以及(z)含有与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号作为构成因子的表达盒。

导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，YEp型载体的YEp24(J.R.Broachet al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型载体的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型载体的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均为已知，且易获得。

用于调节酵母中基因表达的启动子/终止子可任意组合，前提是所述组合能在酿造用酵母中起作用，同时对发酵液中的成分，例如氨基酸和浸出物的浓度没有影响。例如可利用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有详细的记载，并且可通过已知方法很容易地获得。

因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以，转化时使用的选择性标记例如可利用氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)或浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别见Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)。

如上所述构建的载体被导入宿主酵母。宿主酵母为可用于酿造的任意的酵母，例如可为啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，虽可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用的啤酒酵母例如为Saccharomyces pastorianus W34/70、Saccharomyces carlsbergensisNCYC453或NCYC456、或Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。还可使用例如日本协会的葡萄酒用1号、、3号、4号等的葡萄酒酵母，以及例如日本协会的清酒用7号和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。

酵母的转化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用电穿孔法(Meth.Enzym.，194，p182(1990))、原生质球法(Spheroplast法)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology，153，p163(1983)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p1929(1978)”中所述的方法、Methods in yeastgenetics，2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual中所述的方法等实施，但不限于此。

更具体地说，将宿主酵母置于标准酵母营养培养基[例如YEPD培养基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等]中培养，使OD600nm值为1～6。将此培养酵母离心分离后收集、洗涤，用浓度约为1～2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约30℃条件下静置约60分钟后，与导入的DNA(约1～20μg)同时在约30℃条件下再静置约60分钟。加入聚乙二醇，优选加入约4,000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20％～50％。在约30℃下静置约30分钟后，将此细胞在约42℃条件下加热处理约5分钟。优选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤后，放入预定量的新鲜标准酵母营养培养基中，并在约30℃下静置约60分钟。之后，接种到含有作为选择性标记使用的抗生素或其类似物的标准琼脂培养基中，获得转化体。

其他有关一般性的克隆技术可参照(《Molecular Cloning(分子克隆)》第3版)、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。

4.本发明的酒饮料制造方法及根据其制法获得的酒饮料

将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒饮料的酵母中，并可通过使用其酵母，制造所需要的且减少了VDK、特别是DA浓度的、香味优异的酒饮料。也可使用通过下述本发明的酵母评价方法选择的酵母。作为制造对象的酒饮料包括但并不限于此，例如可为啤酒、发泡酒(happoushu)等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等。

制造上述酒饮料时，除使用本发明中所得到的酿造酵母代替亲株以外，可利用公知的方法。由于原料、制造设备、生产质量控制等可与常规方法完全相同，所以不会因制造浓度降低了的VDK、特别是DA的酒饮料而增加成本。即根据本发明，可在使用已有设备、不增加成本的情况下，制造出香味优异的酒饮料。

5.本发明的酵母的评价方法

本发明涉及使用根据具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因碱基序列而设计的引物或探针评价被检酵母的总VDK或总双乙酰生产能力的方法。此种评价方法的一般方法为公知，例如，在WO 01/040514号公报和日本特开平8-205900号公报等中有记载。以下，就此评价方法进行简单说明。

首先，制备被检酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。使用根据编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因碱基序列(优选ORF序列)而设计的引物或探针，测定被检酵母的基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可使用公知的方法进行。

基因或特异性序列的检测可使用公知的方法进行。例如，将包含特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或包含其碱基序列的互补碱基序列的一部分或全部多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的一部分或全部多核苷酸，通过PCR法扩增酵母的核酸，并测定扩增物的有无、扩增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的碱基数通常为10bp或以上，优选为15～25bp。且夹在两引物间的碱基数，通常为300～2000bp较适当。

PCR法的反应条件无特别限定，例如，可使用变性温度：90～95℃、退火温度：40～60℃、延伸温度：60～75℃、循环数：10次或以上等的条件。所得到的反应生成物可使用琼脂糖凝胶等的电泳法等分离，以测定扩增产物的分子量。根据此方法，通过扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大小，来预测、评价其酵母的VDK生产能力。且可通过分析扩增物的碱基序列，更进一步准确地预测、评价上述性能。

本发明中，可通过培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量，评价被检酵母的VDK或双乙酰的生产能力。编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因表达量的测定，可通过培养被检酵母，对编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的转录产物mRNA或蛋白质定量来进行。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1994-2003)。

而且，可通过测定培养被检酵母时所得到的发酵液中的VDK浓度，预测其被检酵母中上述基因的表达量。

而且，可培养被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量，选择其基因表达量与连二酮或双乙酰的目标总产量相应的酵母，借此来选择适合酿造所需酒饮料的酵母。也可培养标准酵母及被检酵母，测定各酵母中所述基因的表达量，比较标准酵母和被检酵母的所述基因的表达量，借此来选择所需的酵母。具体地说，例如可通过培养标准酵母及被检酵母，测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量，选择该基因的表达高于标准酵母的菌株，来选择适合酿造所需酒饮料的酵母。

或者可通过培养被检酵母，选择连二酮或双乙酰的生产总量较低的酵母，来选择适合酿造所需酒饮料的被检酵母。

此时，被检酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明载体的酵母、高表达本发明的上述基因的酵母、含有高表达的本发明蛋白质的酵母、实施了突变处理的酵母、自发突变的酵母等。可用例如Drews等的方法(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)，通过测定、比较发酵液中的总VDK(DA及PD)浓度来评价降低连二酮或双乙酰的活性。突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等的物理方法，通过EMS(Ethylmethane sulfonate)、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)等药剂处理的化学方法等的任何方法进行，例如，参照大岛泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等(大嵨泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一など)。

可作为标准酵母、被检酵母使用的酵母，为酿造时可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵母等。具体地说，可例举为酵母属(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomyces carlsbergensis)，在本发明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、或NCYC456等，Saccharomyces cerevisiaeNBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且还可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；例如日本协会的葡萄酒用1号、3号和4号等的葡萄酒酵母；例如日本协会的酵母、清酒用7号和9号等的清酒酵母，但不限于此。本发明中，啤酒酵母例如可优选使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。标准酵母、被检酵母可从上述酵母群中以任意组合选择。

实施例

以下，通过实施例详细叙述本发明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：编码具有降低连二酮或双乙酰活件的蛋白质的新型基因 (nonScMMF1)的克隆

使用日本特开2004-283169号公报中记载的比较数据库的检索结果，发现了啤酒酵母中特有的编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的新型基因nonScMMF1(序列号：1)。以所得到的碱基序列信息为基础，分别设计用于扩增各自全长基因的引物nonScMMF1_F(序列号：5)/nonScMMF1_R(序列号：6)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株(有时可简写为“W34/70株”)的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有nonScMMF1全长基因的DNA片段。

将如上所述得到的nonScMMF1基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体[Invitrogen公司制]。将nonScMMF1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例2：啤酒试验酿造中nonScMMF1基因表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列检测。

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁容量 70L

麦芽汁溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母投入量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图1)和表观浸出物浓度(图2)的经时变化。与此同时对酵母菌体取样以用于制备mRNA，对所制备mRNA进行生物素标记，使其与啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChipOperating System[GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制]进行。nonScMMF1基因表达模式如(图3)所示。由此结果，可确认通常的啤酒发酵中nonScMMF1基因进行了表达。

实施例3：nonScMMF1高表达株的制备

将实施例1中所述的nonScMMF1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot连接，从而构建了nonScMMF1高表达载体nonScMMF1/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1的启动子高表达。酵母中的选择性标记包含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的nonScMMF1高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体，作为nonScMMF1高表达株。

实施例4：啤酒试验酿造中VDK生成量的解析

使用亲株及用实施例3得到的nonScMMF1高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度 11.85％

麦芽汁容量 2L

麦芽汁溶解氧浓度 8ppm

发酵温度 15℃，恒定

酵母投入量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(OD660)(图4)和浸出物消耗量的经时变化(图5)。使VDK(DA及PD)与羟胺反应，其生成的乙二肟衍生物与二价铁离子反应生成络合物，通过测定此络合物的吸光度，对发酵液中总VDA进行定量(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)。此时，通过先将前体物质α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸预先用气体洗涤法(氧化脱羧法)分别转换为DA和PD，来定量含有上述物质的总VDK量。

如图6所示，通过使用nonScMMF1高表达株，使发酵结束时的总VDK浓度减少了约90％，大大低于啤酒中的阈值0.1ppm。且此时，亲株与高表达株之间的酵母增殖量及浸出物消耗未呈现出显著的差异。

实施例5：编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因(ScMMF1) 的克隆

使用日本特开2004-283169中记载的比较数据库的检索结果，发现了啤酒酵母中特有的编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因ScMMF1(序列号：3)。以所得到的碱基序列信息为基础，设计用于扩增各自全长基因的引物ScMMF1_F(序列号：7)/ScMMF1_R(序列号：8)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan34/70株的染色体DNA为模板，通过PCR，获得了含有ScMMF1全长基因的DNA片段。

将如上所述得到的ScMMF1基因片段通过TA克隆插入到pCR2.1-TOPO载体[Invitrogen公司制]。将ScMMF1基因的碱基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214：1215，1981)进行分析，以确认碱基序列。

实施例6：啤酒试验酿造中ScMMF1基因的表达分析

使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus34/70株进行啤酒试验酿造，将从发酵中的啤酒酵母菌体中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微阵列进行检测。

麦芽汁浸出物浓度 12.69％

麦芽汁容量 70L

麦芽汁溶解氧浓度 8.6ppm

发酵温度 15℃

酵母投入量 12.8×10⁶cells/mL

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(图7)和表观浸出物浓度(图8)的经时变化。同时对酵母菌体取样以制备mRNA，对制备后的mRNA进行生物素标记，使其在啤酒酵母DNA微阵列杂交。信号检测使用GeneChipOperating System[GCOS；GeneChip Operating Software1.0，AFFYMETRIX公司制]进行。ScMMF1基因表达模式如(图9)所示。由此结果可确认在通常的啤酒发酵中ScMMF1基因进行了表达。

实施例7：ScMMF1高表达株的制备

将实施例5中所述的ScMMF1/pCR2.1-TOPO用限制性内切酶SacI及NotI酶切，制备包含蛋白质编码区域全长的DNA片段。使此片段与用限制性内切酶SacI及NotI处理的pYCGPYNot连接，由此构建了ScMMF1高表达载体ScMMF1/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因通过丙酮酸激酶基因PYK1启动子进行高表达。酵母中的选择性标记包含氨基糖苷类抗生素(Geneticin)抗性基因G418^r，大肠杆菌中的选择性标记包含氨苄青霉素抗性基因Amp^r。

使用由上述方法制备的ScMMF1高表达载体，用日本特开平07-303475中所述的方法转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner34/70株。用含有氨基糖苷类抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培养基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)选择转化体，作为ScMMF1高表达株。

实施例8：啤酒试验酿造中VDK生成量的解析

使用亲株及用实施例7得到的ScMMF1高表达株，通过以下条件进行了发酵试验。

麦芽汁浸出物浓度 11.85％

麦芽汁容量 2L

麦芽汁溶解氧浓度 8ppm

发酵温度 15℃，恒定

酵母投入量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁

对发酵液经时取样，观察酵母增殖量(OD660)(图10)和浸出物消耗量的经时变化(图11)。使VDK(DA及PD)与羟胺反应，其生成的乙二肟衍生物与二价铁离子反应生成络合物，通过测定此络合物的吸光度，对发酵液中总VDA进行定量(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)。此时，通过将前体物质α-乙酰乳酸及α-乙酰羟基丁酸预先用气体洗涤法(氧化脱羧法)分别转换为DA、PD，来定量含有上述物质的总VDK量。

如图12所示，通过使用ScMMF1高表达株，使发酵结束时的总VDK浓度减少了约65％，该浓度大大低于啤酒中的阈值0.1ppm。且此时，亲株与高表达株之间的酵母增殖量及浸出物消耗未呈现出显著的差异。

根据本发明的酒饮料制造法，可降低产品中引起不良味道的VDK，特别是DA的生成量，从而容易地制造出香味优异的酒饮料。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(Suntory Limited)

<120>编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因及其用途(Gene encoding aprotein with reduction activity of vicinal diketone(s)and use thereof)

<130>PCT

<150>JP2006-48957

<151>2006-02-24

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>438

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>1

atgtttctaa gaaattccgt tttgagaacc accccaatct tgaaaagggg tttgacaaca 60

ttgaccccgg tcagcaccaa actggcacca cctgctgccg cctcttattc ccaggccatg 120

aaggcgaaca acttcgtcta cgtgtctggt caaatcccat ataccgcaga aaacaagcct 180

gttcaaggtt ctatctctga caaggcggaa caagttttcc aaaacgtcaa gaacatcttg 240

gctgaaagca actcgtcttt gaacagcgtt gtcaaagtca acgttttctt agctgatatg 300

aaaaactttg ctgaattcaa ttcagtgtat gccaaacact tccacaccca caagcctgca 360

agatcatgcg tcggtgttgc ttctttgcca ttgaacgttg atttggaaat ggaagtcatt 420

gctgttgaaa agaattga 438

<210>2

<211>145

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>2

Met Phe Leu Arg Asn Ser Val Leu Arg Thr Thr Pro Ile Leu Lys Arg

1 5 10 15

Gly Leu Thr Thr Leu Thr Pro Val Ser Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ala

20 25 30

Ala Ala Ser Tyr Ser Gln Ala Met Lys Ala Asn Asn Phe Val Tyr Val

35 40 45

Ser Gly Gln Ile Pro Tyr Thr Ala Glu Asn Lys Pro Val Gln Gly Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Lys Ala Glu Gln Val Phe Gln Asn Val Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80

Ala Glu Ser Asn Ser Ser Leu Asn Ser Val Val Lys Val Asn Val Phe

85 90 95

Leu Ala Asp Met Lys Asn Phe Ala Glu Phe Asn Ser Val Tyr Ala Lys

100 105 110

His Phe His Thr His Lys Pro Ala Arg Ser Cys Val Gly Val Ala Ser

115 120 125

Leu Pro Leu Asn Val Asp Leu Glu Met Glu Val Ile Ala Val Glu Lys

130 135 140

Asn

145

<210>3

<211>438

<212>DNA

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>3

atgtttttaa gaaattccgt tttgagaaca gcaccagtct tgaggagggg tataacaaca 60

ttgactccgg tcagcaccaa gttggcccca cccgctgccg cctcttactc ccaagctatg 120

aaggccaaca attttgtgta cgtgtctggt caaatccctt atactccaga taacaagcct 180

gttcaaggtt ctatctctga gaaggccgaa caagtttttc aaaacgttaa gaatatctta 240

gcagaaagta attcttcttt agacaatata gtcaaagtca acgtattctt ggctgacatg 300

aaaaactttg ccgaattcaa ctctgtatac gccaagcact tccacaccca taagcctgca 360

agatcctgtg ttggtgttgc ttccttacct ttgaatgttg atttagaaat ggaagttatc 420

gctgttgaaa agaattga 438

<210>4

<211>145

<212>PRT

<213>酵母属(Saccharomyces sp.)

<400>4

Met Phe Leu Arg Asn Ser Val Leu Arg Thr Ala Pro Val Leu Arg Arg

1 5 10 15

Gly Ile Thr Thr Leu Thr Pro Val Ser Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ala

20 25 30

Ala Ala Ser Tyr Ser Gln Ala Met Lys Ala Ash Asn Phe Val Tyr Val

35 40 45

Ser Gly Gln Ile Pro Tyr Thr Pro Asp Asn Lys Pro Val Gln Gly Ser

50 55 60

Ile Ser Glu Lys Ala Glu Gln Val Phe Gln Asn Val Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80

Ala Glu Ser Asn Ser Ser Leu Asp Asn Ile Val Lys Val Asn Val Phe

85 90 95

Leu Ala Asp Met Lys Asn Phe Ala Glu Phe Asn Ser Val Tyr Ala Lys

100 105 110

His Phe His Thr His Lys Pro Ala Arg Ser Cys Val Gly Val Ala Ser

115 120 125

Leu Pro Leu Asn Val Asp Leu Glu Met Glu Val Ile Ala Val Glu Lys

130 135 140

Asn

145

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>5

gagctcatag cggccatgtt tctaagaaat tccgttttga 40

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>6

ggatcctatg cggccgctgt tttatatacg ctaaagattt gc 42

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>7

gagctcatag cggccatgtt tttaagaaat tccgttttga 40

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(Primer)

<400>8

ggatcctatg cggccgctaa aatcttatat acgctaaaga at 42

Claims

1.多核苷酸，其选自由以下(a)～(f)组成的群组：

(a)含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；

(f)含有与编码序列号：2的多核苷酸序列的互补多核苷酸在严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其选自由以下(g)～(i)组成的群组：

(i)与序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸或与序列号：1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号：1的碱基序列组成的多核苷酸。

4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号：2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。

6.蛋白质，其由权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸编码。

7.载体，其含有权利要求1～5中任一项所述的多核苷酸。

8.载体，其含有选自由以下(j)～(l)组成的群组中的多核苷酸：

(j)编码由序列号：4的氨基酸序列或序列号；4的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10个氨基酸的氨基酸序列组成的且具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸；

(l)与序列号：3的碱基序列组成的多核苷酸或序列号：3的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严格条件下杂交且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的多核苷酸。

9.酵母，其中导入了上述权利要求7或8中所述的载体。

10.根据权利要求9中所述的酵母，其通过导入权利要求7或8中所述的载体，降低连二酮的生产能力或双乙酰的生产能力。

11.根据权利要求10中所述的酵母，其通过使上述权利要求6中所述的蛋白质的表达量增加，降低连二酮的生产能力或双乙酰的生产能力。

12.酒饮料的制造方法，其包括培养权利要求9～11中任一项所述的酵母。

13.根据权利要求12中所述的酒饮料的制造方法，其中所酿造的酒饮料是麦芽饮料。

14.根据权利要求12中所述的酒饮料的制造方法，其中所酿造的酒饮料是葡萄酒。

15.酒饮料，其用上述权利要求12～14中任一项所述的方法制造。

16.评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括使用根据具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的碱基序列而设计的引物或探针。

17.评价被检酵母的总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力的方法，其包括：培养被检酵母；以及测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量。

18.酵母的选择方法，其包括：培养被检酵母；对权利要求6中所述的蛋白质定量或测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因的表达量；根据目标总连二酮生产能力或总双乙酰生产能力选择具有所述蛋白质的生成量或所述基因表达量的被检酵母。

19.根据权利要求18中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；测定具有序列号：1或序列号：3的碱基序列、且编码具有降低连二酮或双乙酰活性的蛋白质的基因在各酵母中的表达量；以及选择该基因表达量比标准酵母高的被检酵母。

20.根据权利要求18中所述的酵母的选择方法，其包括：培养标准酵母及被检酵母；对各酵母中权利要求6所述的蛋白质定量；以及选择该蛋白质含量高于标准酵母的被检酵母。

21.酒饮料的制造方法，其包括：使用权利要求9～11中任意一项所述的酵母或通过权利要求18～20中任意一项所述方法选择的酵母进行用于酒饮料制造的发酵；以及调节总连二酮的生产能力或总双乙酰的生产能力。