KR20070121828A

KR20070121828A - 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을엔코딩하는 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20070121828A
Application number: KR1020077025910A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가; 후미히코 오무라
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2007-12-27
Also published as: KR100953291B1; EP1871790A1; AU2006338867B2; CN101024833B; KR20100019535A; CN101024833A; CA2604276A1; EP1871790B1; JP4460007B2; AU2006338867A1; JP2008530980A; US20090041889A1; WO2007097088A1; DK1871790T3

Abstract

본 발명은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자 및 그의 용도, 특히 우수한 풍미의 알코올성 음료 제조를 위한 그의 용도, 상기 효모로 제조된 알코올성 음료, 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 생성물에서의 상한 맛을 초래하는, 이웃자리 디케톤(류), 특히 디아세틸의 제조 능력이, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질 (Mmf1p) 을 엔코딩하는 MMF1 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScMMF1 유전자 또는 ScMMF1 유전자의 발현 수준을 확대하여 감소되는 효모, 및 상기 효모로 알코올성 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자 및 그의 용도 {GENE ENCODING PROTEIN WITH VICINAL DIKETONE OR DIACETYL-REDUCING ACTIVITY AND USE THEREOF}

이하 "DA" 로 칭하는 디아세틸의 맛은 알코올성 음료의 풍미-부여 물질 중 맥주, 사케 및 포도주 등과 같은 양조 알코올성 음료에서 상한 맛을 나타낸다. 맥주에서 "버터 맛" 또는 "땀 맛", 사케에서 구역질을 일으키는 맛을 의미하는 "츠와리-카" 로도 칭하는 DA 는 이하 "VDK" 로도 칭하는 이웃자리 디케톤(류), 주로 DA 가 생성물 내에서 특정 임계 수준을 초과할 때 존재한다. 임계 수준은 맥주 에서 0.1 ppm (백만분율) 이다 (Journal of the Institure of Brewing, 76, 486 (1979)).

VDK 는 알코올성 음료에서 크게 DA 및 2,3-펜탄디온 (이하 "PD" 로 칭함) 으로 나눌 수 있다. DA 및 PD 는 발린 및 이소루신의 생합성에서 각각이 중간체인, 전구체로서 α-아세토락트산 및 α-아세토히드록시부티르산의 비효모성 반응 (효모가 관계되지 않음) 에 의해 형성된다.

상기 정보에 따라, VDK (즉, DA 및 PD) 및 그의 전구체 α-아세토히드록시산 (즉, α-아세토락트산 및 α-아세토히드록시부티르산) 은 생성물에 DA 풍미를 부여할 수 있는 화합물로 생각된다. 따라서, 상기 화합물을 꾸준히 감소시키는 효모의 양조는 알코올성 음료의 제조 제어를 용이하게 하며, 새로운 생성물의 개발 능력을 확장시킨다.

예를 들어, 사케의 제조에서 아세토히드록시산의 전구체인, 낮은 수준의 피루브산을 포함하는 쌀-맥아-효모 배양물을 사용하여 DA 의 제조를 억제하는 방법, 일본 특허 출원 공개 번호 제 2001-204457 호. VDK 의 제조가 맥주 제조 중 발린, 루신 및 이소루신 영양요구성 효모에서 감소하는 것 또한 보고되었다. 그러나, 영양요구성 균주가 지연된 성장/발효를 나타내는 경향이 있기 때문에 상기 효모는 실제로 사용이 되지 않는다. 일본 특허 출원 공개 번호 제 2002-291465 호는 상술된 분지형 아미노산의 유사체에 민감성인 변형 균주를 수득하고, 변형 균주로부터 DA 저-축척 균주를 선택하는 방법을 개시한다. ILV5 유전자의 발현양이 조절되는 실험실-설계된 효모로부터 유도된 유전공학설계된 효모가 [Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84 (1987)] 에 보고되어 있으며, ILV3 유전자의 발현양이 조절되는 유전공학설계된 효모가 또한 [European Brewery Convention, Proceeding of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560 (1987)] 에 보고되어 있다. ILV5 유전자에 의해 엔코딩된 아세토히드록시산 환원이성화효소 (reductoisomerase) 의 효소 활성은 5 내지 7-배 증가하였고, VDK 의 제조량은 이러한 경우 약 40% 로 감소한다.

또한, ILV3 에 의해 엔코딩되는 디히드록시산 탈수효소의 효소적 활성은 5 내지 6 배 증가한다. 반대로, VDK 의 제조량의 현저한 증가는 관찰되지 않았다. 그러나, 합성 매질이 사용된 상술된 2 개의 보고에서 실제 맥주 양조에 대한 임의의 영향이 분석된다. 한편, Villa 등은 양조 효모에서 ILV5, ILV3 또는 직렬 ILV5 + ILV3 의 유전자 생성물의 플라즈미드 확장이 실제 맥주 양조시 보통 양조 효모의 것과 비교하여 각각 70, 40 및 60% 의 VDK 감소를 초래하였음을 [Journal of American Society of Brewing Chemists, 53; 49-53 (1995)] 에 보고하였다.

또한, Dulieu 등은 α-아세토락테이트 디카르복실라제를 사용하여 DA 의 전구체로 소용되는 α-아세토락트산을 빠르게 아세토인으로 전환시키는 방법을 [European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460 (1997)] 에 제안하였다. 그러나, α-아세토락테이트 디카르복실라제는 재조합 DNA 기법을 이용하여서만 제조되는 효소이며, 이에따라 상기 효소의 사용은 일본에서 소비자의 부정적 이미지 때문에 용인되지 않는다. α- 아세토락테이트 디카르복실라제를 엔코딩하는 DNA 가닥을 사용한 유전공학설계된 효모는 일본 특허 출원 공개 번호 제 H2-265488 호 및 제 H07-171 호에 보고되어 있다.

상술된 상황 하에서, VDK류 (이웃자리 디케톤류), 특히 DA (디아세틸) 및 단백질의 냄새를 감소시킬 수 있는 단백질을 엔코딩하는 유전자를 이용하여 낮은 VDK-제조 능력을 갖는 효모를 양조함에 의한, 우수한 풍미의 알코올성 음료 제조 방법 개발에 대한 요구가 있다.

상술된 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 집약적인 연구를 하였으며, 결과로서 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자를 동정 및 단리하는데 성공하였다. 또한, 수득된 유전자 형질전환 및 발현된 효모가 제조되어 VDK 농도, 특히 DA 농도의 감소를 확인함으로써 본 발명을 완결하였다.

본 발명은 라거 양조 효모에 특이적으로 존재하는 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성 (이웃자리 디케톤(류) 또는 디아세틸 감소 활성) 을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자, 상기 유전자를 엔코딩하는 단백질, 상기 유전자의 발현이 제어되는 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 제어되는 효모를 사용하여 생성물 내 VDK 의 수준, 특히 DA 의 수준을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용하여 알코올성 음료를 제조하는 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(e) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가진 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하거나, 또는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서, 이의 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되며, 상기 단백질이 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는다);

(h) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과 90% 이상의 일치성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 에 혼성화하거나, SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, SEQ ID NO:1 으로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, SEQ ID NO:2 로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

(8) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터:

(j) SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하거나, 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서 이의 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되며, 상기 단백질은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는다);

(k) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가지며, SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열과 90% 이상의 일치성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(l) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하며, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:3 에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.

(8a) 상기 (7) 에 있어서, 하기 구성요소를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드; 및

(z) RNA 분자에서 전사 종결 및 폴리아데닐화에 대해 효모에서 작용할 수 있는 신호.

(9) 상기 (7) 또는 (8) 에 따른 벡터가 도입된 효모.

(10) 상기 (9) 에 있어서, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력이 상기 (7) 또는 (8) 의 벡터를 도입하여 감소되는 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력이 상기 (6) 의 단백질의 발현 수준을 증가시켜 감소되는 효모.

(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나의 효모 배양을 포함하는 알코올성 음료 제조 방법.

(13) 상기 (12) 에 있어서, 양조된 알코올성 음료가 맥아 음료인, 알코올성 음료 제조 방법.

(14) 상기 (12) 에 있어서, 양조된 알코올성 음료가 포도주인 알코올성 음료 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 알코올성 음료.

(16) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 대한 시험 효모 평가 방법.

(16a) 상기 (16) 에 기술된 방법을 사용하여 낮은 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력을 갖는 효모를 선택하는 방법.

(16b) 상기 (16a) 에서의 방법으로 선택된 효모를 사용하여 알코올성 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(17) 시험 효모를 배양하고, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준 측정을 포함하는, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 대한 시험 효모를 평가하는 방법.

(17a) 상기 (17) 에 기술된 방법에 의해 시험 효모를 평가하고 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 높은 발현 수준을 갖는 효모를 선택하는 것을 포함하는, 낮은 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력을 갖는 효모 선택 방법.

(17b) 상기 (17a) 에서의 방법으로 선택되는 효모를 사용하여 알코올성 음료 (예를 들어, 맥주) 를 제조하는 방법.

(18) 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 시험 효모를 배양함; (6) 에 따른 단백질을 정량화하거나 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 목표 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선택함.

(18a) 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 시험 효모를 배양함; 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력을 측정함; 및 목표 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력을 갖는 시험 효모를 선택함.

(19) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에서보다 높게 발현되는 유전자를 갖는 시험 효모를 선택함.

(20) 상기 (18) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (6) 에 따른 단백질을 정량함; 및 참조 효모에서보다 큰 양으로 상기 단백질을 갖는 시험 효모를 선택함.

(21) 하기를 포함하는 알코올성 음료 제조 방법: 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선택되는 효모를 사용하여 알코올성 음료를 제조하기 위한 발효를 수행함; 및 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력을 조절함.

본 발명의 알코올성 음료 제조 방법에 따라, 생성물에서의 상한 맛을 초해하는 VDK, 특히 DA 의 제조량의 감소 때문에 우수한 풍미의 알코올성 음료가 쉽게 제조될 수 있다.

도 1 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 심험시의 효모 내의 비-ScMMF1 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 4 는 비-ScMMF1 고도 발현된 균주를 사용한, 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 비-ScMMF1-고도 발현된 균주를 사용한, 맥주 발효 시험시 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 6 은 비-ScMMF1-고도 발현 균주를 사용한, 맥주 발효 시험 동안 발효액 중 (발효의 완결시) VDK 농도를 나타낸다.

도 7 은 맥주 발효 시험시 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 8 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 9 는 맥주 발효 시험시 효모에서 ScMMF1 유전자의 발현 작용을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 밝기를 나타낸다.

도 10 은 ScMMF1-고도 발현된 균주를 사용한, 맥주 발효 시험시 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 11 은 ScMMF1-고도 발현된 균주를 사용한, 맥주 발효 시험시 시간에 따른 추출물 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 12 는 ScMMF1-고도 발현된 균주를 사용한, 맥주 발효 시험 동안 (발효의 완결시) 발효액의 VDK 농도를 나타낸다.

본 발명을 수행하기 위한 최적의 양식

본 발명자들은 일본 특허 출원 공개 번호 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 유전체 정보에 기초하여 라거 양조 효모에 유일한 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 비-ScMMF1 유전자 및 ScMMF1 유전자를 단리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3 으로 나타난다. 추가적으로, 상기 유전자의 각각에 의해 엔코딩되는 단백질의 아미노산 서열의 각각은, 각각 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 로 나타난다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열의 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 목표 폴리뉴클레오티드는 라거 양조 효모로부터 유도된 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 상기 단백질와 동등한 기능을 갖는 단백질을 엔코딩하는 기타 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 동등한 기능의 단백질은, 예를 들어, (c) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가지며, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열의 단백질을 포함한다.

상기 단백질은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 몇 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2 개 또는 1 개의 그의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 단백질을 포함한다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 바람직하게 더욱 작다. 또한, 상기 단백질은 (d) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가지며, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이 상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 일반적으로, % 일치성은 바람직하게는 더욱 높다.

이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성은 예를 들어 [Drews, et al., Mon. fur Brau., 34, 1966] 의 방법에 의해 평가될 수 있으며, 여기서 총 VDK (DA 및 PD) 농도가 발효액 중 측정되고 비교되었다.

추가적으로, 본 발명은 또한 (e) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가진 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 고찰한다.

여기서, "엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드" 란, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로서 사용하여 콜로니 혼성화 기 술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의의 것일 수 있다. "낮은 엄격성 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용한 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다 (Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc . Natl Acad . Sci . USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다 (Altschul SF 등, J. Mol . Biol . 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 임의의 상기 폴리펩티드 (a) 내지 (l) 에 의해 엔코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열의 아미노산 1 개 또는 수 개가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 포함한다.

상기 단백질은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열의 상기 언급된 수가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 포함한다. 또한, 상기 단백질은 상술된 바와 같이, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가지며, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 추가적으로 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 또는 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 일치성을 갖는 것을 포함한다.

상기 단백질은 예를 들어, [Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, Nuc. Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13: 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985)] 에 기술된 지정부위 돌연변이유별을 이용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일 아미노산 서열 내의 하나 이상의 위치에서 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가됨을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 발생할 수 있다.

이하, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거하였다. 동일군 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 상기 군은 하기에 제공된다:

A 군: 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부타노산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B 군: 아스파라트산, 글루탐산, 이소아스파라트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산; C 군: 아스파라긴, 글루타민; D 군: 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E 군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F 군: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 G 군: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 으로부터 이용가능한 펩티드 합성제가 또한 화학적 합성을 위해 사용될 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 그 벡터로 형질전환된 효모

본 발명은 상술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (l) 에 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드 (예컨대 DNA) 를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 구성요소로서, (x) 효모 세포 내에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 센스 또는 안티센스 방향으로 프로모터에 연결된 상기 임의의 (a) 내지 (l) 에 기술된 폴리뉴클레오티드 (예컨대 DNA); 및 (z) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화와 관련하여 효모 내 에서 작용하는 신호를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

효모 내에 도입되는 벡터는 다중복제본 유형 (YEp 유형), 단일 복제본 유형 (YCp) 유형, 또는 염색체 혼입 유형 (YIp 유형) 중 어느 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 유형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose et al., Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 유형 벡터로 알려져 있고, YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 유형 벡터로 알려져 있으며, 이들 모두는 쉽게 이용가능하다.

효모 내에서 유전자 발현을 조절하기 위한 프로모터/터미네이터는 양조 효모에서 작용하고, 발효액 중 추출물 및 아미노산과 같은 구성 요소의 농도에 영향을 미치지 않는 한, 어떠한 조합일 수도 있다. 예를 들어, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디히드로게나아제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터가 사용될 수 있다. 상기 유전자는 이전에 클로닝되었고, 예를 들어 [M. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 기술되었고, 공지된 방법에 의해 쉽게 이용가능하다.

영양요구성 마커가 양조 효모를 위한 형질전환시 선택 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신-내성 유전자 (G418r), 구리-내성 유전자 (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌-내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각 Junji Inokoshi et al.. Biochemistry, 64, 660, 1992; 및 Hussain et al.. Gene, 101: 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 를 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로마이세스 세레비시에이 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 바람직하게 사용할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth . Enzym ., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 항생물질 등이 선별 마커로서 함유된 표준 아가 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 3rd], 및 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알코올성 음료 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 알코올성 음료

상술된 본 발명의 벡터는 목표 알코올성 생성물 양조에 적합한 효모에 도입된다. 상기 효모는 요망되는 알코올성 음료의 VDK, 특히 DA 의 수준을 감소시 키기 위해 사용되고, 향상된 풍미를 갖는 알코올성 음료를 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선택될 효모 또한 사용될 수 있다. 목표 알코올성 음료는, 예를 들어 맥주, 발포성 알코올음료 (happoushu) 예컨대 맥주맛 음료, 포도주, 위스키, 사케 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 재료, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 감소된 수준의 VDK, 특히 DA 의 알콜성 음료의 제조 비용이 증가될 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 기존의 설비를 사용하여 비용 증가 없이 향상된 풍미의 알코올성 음료를 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 프로브를 사용함에 의한, 총 이웃자리 디케톤 제조 능력 또는 총 디아세틸 제조 능력에 대한 시험 효모 평가 방법에 관한 것이다. 상기 평가 방법을 위한 일반적인 기법은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기술되어 있다. 상기 평가 방법은 하기에 기술된다.

첫째로, 시험 효모의 유전체가 제조된다. 이러한 제조를 위해, 임의의 공지된 방법 예컨대 헤레포드 방법 또는 포타슘 아세테이트 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 프로브를 사용하여, 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재가 수득된 시험 효모 유전체에서 결정된다. 프라이머 또는 프로브가 공지된 기법에 따라 설계될 수 있다.

유전자 또는 특이적 서열의 검출은 공지된 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측 정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 효모의 총 이웃자리 디케톤 제조 능력 또는 총 디아세틸 제조 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 그의 특성을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 총 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸 제조 능력을 평가한다. 이 경우, 상기 시험 효모를 배양한 후, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

추가적으로, 시험 효모를 배양하고 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 본 발명의 유전자의 발현 수준을 측정하여 목적하는 총 이웃자리 디케톤 제조 능력 또는 총 디아세틸 제조 능력에 따라 유전자 발현 수준을 선택함으로써, 목적하는 알코올성 음료 양조에 유리한 효모를 선택한다. 추가적으로, 참조 효모 및 시험 효모는 각각의 효모 내의 유전자 발현 수준을 측정 및 비교 하도록 배양하여, 유리한 시험 효모를 선택할 수 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 유전자가 더 많이 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 총 이웃자리 디케톤 제조 능력 또는 총 디아세틸 제조 능력이 더욱 낮은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 상술된 본 발명의 유전자의 발현이 확대된 효모, 본 발명의 단백질의 발현이 확대된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성은, 예를 들어, Drews 등 (Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966) 의 방법에 의해 평가될 수 있으며, 여기서 총 VDK (DA 및 PD) 농도는 발효액 중 측정되고 비교된다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다 (예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다 (예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비시에이 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카 로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비시에 이 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비시에이 NCYC90 과 같은 위스키 효모, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸 -감소 활성을 갖는 단백질을 엔코 딩하는 유전자 (비- ScMMF1 ) 의 클로닝

일본 특허 출원 공개 번호 제 2004-283169 호에 기술된 비교 데이터베이스를 이용한 검색 결과로서, 라거 양조 효모로부터 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 엔코딩하는 특이적 신규 유전자 (비-ScMMF1 유전자; SEQ ID NO:1) 가 발견되었다. 수득된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 비-ScMMF1_F (SEQ ID NO:5) 및 비-ScMMF1_R (SEQ ID NO:6) 프라이머를 설계하여 각각 전장 유전자를 설계하였다. 비-ScMMF1 의 전장 유전자를 포함한 DNA 절편을 수득하기 위해 주형으로서, 유전체 서열분석 균주 사카로마이세스 파스토리아누스 웨이헨스테판 (Saccharomyces pastorianus Weihenstephan) 34/70 균주 (이하 종종 "W34/70 균주" 로 칭함) 의 유전체 DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다.

상기-수득된 비-ScMMF1 유전자 절편은 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen Corporation 제조) 로 삽입하였다. 비-ScMMF1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 생거 방법 (F. Sanger, Science. 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발현 동안 비- ScMMF1 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출된 mRNA 를 효모 DNA 마이크로어레이에 의해 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효 액체의 샘플링은 시간에 따라 수행하였고, 효모 성장량 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화가 관찰되었다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여 mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 바이오틴으로 라벨링하고 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 신호는 GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 를 사용하여 검출하였다. 비-ScMMF1 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 결과로서, 비-ScMMF1 유전자가 일반 맥주 발효 중 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 3: 비- ScMMF1 유전자-고도 발현 균주의 제조

실시예 1 에서 기술된 비-ScMMF1/pCR2.1-TOPO 는 제한 효소 SacI 및 NotI 을 사용하여, 단백질-엔코딩 부위의 전체 길이를 포함하는 DNA 절편을 제조하도록 소화시켰다. 상기 절편은 제한 효소 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 라이게이션(ligate)시켜, 비-ScMMF1 고도 발현 벡터인 비-ScMMF1/pYCGPYNot 을 구축하였다. pYCGPYNot 은 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 파이루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도로 발현된다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 은 효모 내에 선택 마거로 포함되고, 암피실린-내성 유전자 Amp^r 은 에셔리샤 콜라이 (Escherichia coli) 내의 선택 마커로 포함된다.

상기 방법에 의해 제조된 비-ScMMF1 고도 발현 벡터를 사용하여, 일본 특허 출원 공개 번호 제 H7-303475 에 기술된 방법에 의해 사카로마이세스 파스토리아누 스 웨이헨스테파너 34/70 균주를 형질전환시켰다. 형질전환체를 300 mg/L 의 제네티신을 포함하는 YPD 플레이트 배양액 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스, 2% 아가) 중 선택하고, 비-ScMMF1-고도 발현 균주로 칭하였다.

실시예 4: 맥주 발효 동안 제조된 VDK 의 양의 분석

하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하기 위해 모균주 및 실시예 3 에서 수득된 비-ScMMF1-고도 발현 균주를 사용하였다.

맥아즙 추출물 농도 11.85%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 불변

효모 주입율 5 g 습윤 효모균 개체/L 맥아즙

발효액을 시간에 따라 샘플링하여 시간에 따른 세포 성장 (OD660) (도 4) 및 추출물 소비량 (도 5) 을 관찰하였다. 발효액 중 총 VDK 의 정량은 VDK (DA 및 PD) 를 히드록실아민과 반응시켜 수행하여, 글리옥심 유도체를 생성한 후, 수득되는 글리옥심 유도체와 2가 제2철 이온의 반응으로부터 형성된 복합체의 흡광도를 측정하였다 (Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1996). 전구체 α-아세토락트산 및 α-아세토히드록시부티르산을 기체 세척 방법 (산화 디카르복실화 방법) 에 의해 각각 DA 및 PD 로 사전에 전환하여, 그를 포함하는 총 VDK 를 정량하였다.

도 6 에 나타난 바와 같이, 비-ScMMF1-고도 발현 균주의 사용은 총 VDK 농도를 약 90% 감소시킴에 따라, 농도는 맥주에서의 임계치인 0.1 ppm 보다 휠씬 낮다. 또한, 본 실험에서 세포 성장 및 추출물 소비량에서의 모균주 및 고도 발현 균주 간의 현저한 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 5: 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸 -감소 활성을 갖는 단백질을 엔코 딩하는 유전자 ( ScMMF1 ) 의 클로닝

일본 특허 출원 공개 번호 제 2004-283169 호에 기술된 비교 데이터베이스를 이용한 검색 결과로서, 라거 양조 효모로부터 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 엔코딩하는 특이적 신규 유전자 (비-ScMMF1 유전자; SEQ ID NO:3) 가 발견되었다. 수득된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, ScMMF1_F (SEQ ID NO:7) 및 ScMMF1_R (SEQ ID NO:8) 프라이머를 설계하여 각각 전장 유전자를 설계하였다. ScMMF1 의 전장 유전자를 포함한 DNA 절편을 수득하기 위해 주형으로서, 유전체 서열분석 균주 사카로마이세스 파스토리아누스 웨이헨스테판 (Saccharomyces pastorianus Weihenstephan) 34/70 균주의 유전체 DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다.

상기-수득된 ScMMF1 유전자 절편은 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen Corporation 제조) 로 삽입하였다. 비-ScMMF1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 생거 방법 (F. Sanger, Science. 214: 1215, 1981) 에 따라 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 6: 맥주 발효 동안 ScMMF1 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출된 mRNA 를 효모 DNA 마이 크로어레이에 의해 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효 액체의 샘플링은 시간에 따라 수행하였고, 효모 성장량 (도 7) 및 겉보기 추출물 농도 (도 8) 의 시간에 따른 변화가 관찰되었다. 동시에, 효모 세포를 샘플링하여 mRNA 를 제조하고, 제조된 mRNA 를 바이오틴으로 라벨링하고 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 신호는 GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co.) 를 사용하여 검출하였다. 비-ScMMF1 유전자의 발현 패턴은 도 9 에 나타나 있다. 결과로서, ScMMF1 유전자가 일반 맥주 양조 중 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 7: ScMMF1 -고도 발현 균주의 제조

실시예 5 에서 기술된 ScMMF1/pCR2.1-TOPO 는 제한 효소 SacI 및 NotI 을 사용하여, 단백질-엔코딩 부위의 전체 길이를 포함하는 DNA 절편을 제조하도록 소화시켰다. 상기 절편은 제한 효소 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 라이게이션시켜, ScMMF1 고도 발현 벡터인 비-ScMMF1/pYCGPYNot 을 구축하였다. pYCGPYNot 은 YCp-유형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 파이루베이트 키 나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도로 발현된다. 제네티신-내성 유전자 G418^r 은 효모 내에 선택 마커로 포함되고, 암피실린-내성 유전자 Amp^r 은 에셔리샤 콜라이 내의 선택 마커로 포함된다.

상기 방법에 의해 제조된 ScMMF1 고도 발현 벡터를 사용하여, 일본 특허 출원 공개 번호 제 H7-303475 에 기술된 방법에 의해 사카로마이세스 파스토리아누스 웨이헨스테파너 34/70 균주를 형질전환시켰다. 형질전환체를 300 mg/L 의 제네티신을 포함하는 YPD 플레이트 배양액 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 글루코스, 2% 아가) 중 선택하였다.

실시예 8: 맥주 발효 동안 제조되는 VDK 의 양의 분석

하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하기 위해 실시예 7 에서 수득된 모균주 및 ScMMF1-고도 발현 균주를 사용하였다.

맥아즙 추출물 농도 11.85%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 불변

효모 주입율 5 g 습윤 효모균 개체/L 맥아즙

발효액을 시간에 따라 샘플링하여 시간에 따른 세포 성장 (OD660) (도 10) 및 추출물 소비량 (도 11) 을 관찰하였다. 발효액 중 총 VDK 의 정량은 VDK (DA 및 PD) 를 히드록실아민과 반응시켜 수행하여, 글리옥심 유도체를 생성한 후, 수득되는 글리옥심 유도체와 2가 제2철 이온의 반응으로부터 형성된 복합체의 흡광도를 측정하였다 (Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1996). 전구체 α-아세토락트산 및 α-아세토히드록시부티르산을 기체 세척 방법 (산화 디카르복실화 방법) 에 의해 각각 DA 및 PD 로 사전에 전환하여, 그를 포함하는 총 VDK 를 정량하였다.

도 12 에 나타난 바와 같이, ScMMF1-고도 발현 균주의 사용은 총 VDK 농도를 약 65% 감소시킴에 따라, 농도는 맥주에서의 임계치인 0.1 ppm 보다 휠씬 낮다. 또한, 본 실험에서 세포 성장 및 추출물 소비량에서의 모균주 및 고도 발현 균주 간의 현저한 차이가 관찰되지 않았다.

본 발명의 알코올성 음료 제조 방법에 따라, 생성물 내의 상한맛을 초래하는 VDK, 특히 DA 의 제조량의 감소때문에 우수한 풍미의 알코올성 음료가 쉽게 제조될 수 있다.

<110> Suntory Limited <120> Gene encoding protein with vicinal diketone or diacetyl-reducing activity and use thereof <130> G07-0105 <140> PCT/JP2006/323865 <141> 2006-11-21 <150> JP2006-48957 <151> 2006-02-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 438 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atgtttctaa gaaattccgt tttgagaacc accccaatct tgaaaagggg tttgacaaca 60 ttgaccccgg tcagcaccaa actggcacca cctgctgccg cctcttattc ccaggccatg 120 aaggcgaaca acttcgtcta cgtgtctggt caaatcccat ataccgcaga aaacaagcct 180 gttcaaggtt ctatctctga caaggcggaa caagttttcc aaaacgtcaa gaacatcttg 240 gctgaaagca actcgtcttt gaacagcgtt gtcaaagtca acgttttctt agctgatatg 300 aaaaactttg ctgaattcaa ttcagtgtat gccaaacact tccacaccca caagcctgca 360 agatcatgcg tcggtgttgc ttctttgcca ttgaacgttg atttggaaat ggaagtcatt 420 gctgttgaaa agaattga 438 <210> 2 <211> 145 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Phe Leu Arg Asn Ser Val Leu Arg Thr Thr Pro Ile Leu Lys Arg 1 5 10 15 Gly Leu Thr Thr Leu Thr Pro Val Ser Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ala 20 25 30 Ala Ala Ser Tyr Ser Gln Ala Met Lys Ala Asn Asn Phe Val Tyr Val 35 40 45 Ser Gly Gln Ile Pro Tyr Thr Ala Glu Asn Lys Pro Val Gln Gly Ser 50 55 60 Ile Ser Asp Lys Ala Glu Gln Val Phe Gln Asn Val Lys Asn Ile Leu 65 70 75 80 Ala Glu Ser Asn Ser Ser Leu Asn Ser Val Val Lys Val Asn Val Phe 85 90 95 Leu Ala Asp Met Lys Asn Phe Ala Glu Phe Asn Ser Val Tyr Ala Lys 100 105 110 His Phe His Thr His Lys Pro Ala Arg Ser Cys Val Gly Val Ala Ser 115 120 125 Leu Pro Leu Asn Val Asp Leu Glu Met Glu Val Ile Ala Val Glu Lys 130 135 140 Asn 145 <210> 3 <211> 438 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 3 atgtttttaa gaaattccgt tttgagaaca gcaccagtct tgaggagggg tataacaaca 60 ttgactccgg tcagcaccaa gttggcccca cccgctgccg cctcttactc ccaagctatg 120 aaggccaaca attttgtgta cgtgtctggt caaatccctt atactccaga taacaagcct 180 gttcaaggtt ctatctctga gaaggccgaa caagtttttc aaaacgttaa gaatatctta 240 gcagaaagta attcttcttt agacaatata gtcaaagtca acgtattctt ggctgacatg 300 aaaaactttg ccgaattcaa ctctgtatac gccaagcact tccacaccca taagcctgca 360 agatcctgtg ttggtgttgc ttccttacct ttgaatgttg atttagaaat ggaagttatc 420 gctgttgaaa agaattga 438 <210> 4 <211> 145 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 4 Met Phe Leu Arg Asn Ser Val Leu Arg Thr Ala Pro Val Leu Arg Arg 1 5 10 15 Gly Ile Thr Thr Leu Thr Pro Val Ser Thr Lys Leu Ala Pro Pro Ala 20 25 30 Ala Ala Ser Tyr Ser Gln Ala Met Lys Ala Asn Asn Phe Val Tyr Val 35 40 45 Ser Gly Gln Ile Pro Tyr Thr Pro Asp Asn Lys Pro Val Gln Gly Ser 50 55 60 Ile Ser Glu Lys Ala Glu Gln Val Phe Gln Asn Val Lys Asn Ile Leu 65 70 75 80 Ala Glu Ser Asn Ser Ser Leu Asp Asn Ile Val Lys Val Asn Val Phe 85 90 95 Leu Ala Asp Met Lys Asn Phe Ala Glu Phe Asn Ser Val Tyr Ala Lys 100 105 110 His Phe His Thr His Lys Pro Ala Arg Ser Cys Val Gly Val Ala Ser 115 120 125 Leu Pro Leu Asn Val Asp Leu Glu Met Glu Val Ile Ala Val Glu Lys 130 135 140 Asn 145 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gagctcatag cggccatgtt tctaagaaat tccgttttga 40 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcctatg cggccgctgt tttatatacg ctaaagattt gc 42 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gagctcatag cggccatgtt tttaagaaat tccgttttga 40 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatcctatg cggccgctaa aatcttatat acgctaaaga at 42

Claims

하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(e) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가진 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴 리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하거나, 또는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서, 이의 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되며, 상기 단백질이 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는다);

(h) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열과 90% 이상의 일치성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 에 혼성화하거나, SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:1 으로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2 로 이루어진 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터:

(j) SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 엔코딩하거나, 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서 이의 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되며, 상기 단백질은 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는다);

(k) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 가지며, SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열과 90% 이상의 일치성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(l) 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하며, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:3 에 혼성화하거나, 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.
제 7 항 또는 제 8 항에 따른 벡터가 도입된 효모.
제 9 항에 있어서, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력이 제 7 항 또는 제 8 항의 벡터를 도입하여 감소되는 효모.
제 10 항에 있어서, 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력이 제 6 항의 단백질의 발현 수준을 증가시켜 감소되는 효모.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 효모 배양을 포함하는 알코올성 음료 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 양조된 알코올성 음료가 맥아 음료인, 알코올성 음료 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 양조된 알코올성 음료가 포도주인, 알코올성 음료 제조 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 알코올성 음료.
이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 포함하는, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 대한 시험 효모 평가 방법.
하기를 포함하는, 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 대한 시험 효모 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는 효모 선택 방법: 시험 효모를 배양함; 제 6 항에 따른 단백질을 정량화하거나 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 목표 총 이웃자리 디케톤 또는 총 디아세틸-제조 능력에 따라 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선택함.
제 18 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 이웃자리 디케톤 또는 디아세틸-감소 능력을 갖는 단백질을 엔코딩하며, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에서보다 고도로 발현되는 유전자를 갖는 시험 효모를 선택함.
제 18 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모 선택 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 6 항에 따른 단백질을 정량함; 및 상기 단백질을 참조 효모에서보다 많은 양으로 갖는 시험 효모를 선택함.
하기를 포함하는 알코올성 음료 제조 방법: 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선택되는 효모를 사용하여 알코올성 음료를 제조하기 위한 발효를 수행함; 및 총 이웃자리 디케톤 또는 총-디아세틸-제조 능력을 조절함.