JPH08205900A - 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法 - Google Patents
酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法Info
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- JPH08205900A JPH08205900A JP7015453A JP1545395A JPH08205900A JP H08205900 A JPH08205900 A JP H08205900A JP 7015453 A JP7015453 A JP 7015453A JP 1545395 A JP1545395 A JP 1545395A JP H08205900 A JPH08205900 A JP H08205900A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、酵母の凝集性の判定に使用できる
DNA 分子および該DNA 分子を利用して酵母の凝集性を判
定する方法に関する。 【効果】 本発明により、判定対象の酵母が実験室酵
母タイプの凝集性を持っているか、ビール酵母タイプの
凝集性を持っているか、あるいは凝集性が無く浮遊性で
あるのかを簡単な方法で迅速に測定できることが可能と
なる。
DNA 分子および該DNA 分子を利用して酵母の凝集性を判
定する方法に関する。 【効果】 本発明により、判定対象の酵母が実験室酵
母タイプの凝集性を持っているか、ビール酵母タイプの
凝集性を持っているか、あるいは凝集性が無く浮遊性で
あるのかを簡単な方法で迅速に測定できることが可能と
なる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母の凝集性の判定に
使用できるDNA 分子および該DNA 分子を利用して酵母の
凝集性を判定する方法に関する。
使用できるDNA 分子および該DNA 分子を利用して酵母の
凝集性を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、遺伝解析などの実験用途で使用
される酵母（実験室酵母）で観察される凝集性（実験室
酵母タイプの凝集性）は強く、マンノースという単糖が
溶液中に存在すると阻害されて分散する性質を持つ。実
験室酵母の凝集性は非常に強く、増殖中常に観察され、
培養初期の段階でも培養液から容易に沈降して分離する
現象が観察される。一方、ビール酵母で問題とされる凝
集性のタイプ（ビール酵母タイプの凝集性）は、通常は
弱く、マンノースの他にグルコース、マルトース、スク
ロースといった麦汁中に豊富に含まれる糖類で阻害され
るために、実験室酵母とは性質を異にする。
される酵母（実験室酵母）で観察される凝集性（実験室
酵母タイプの凝集性）は強く、マンノースという単糖が
溶液中に存在すると阻害されて分散する性質を持つ。実
験室酵母の凝集性は非常に強く、増殖中常に観察され、
培養初期の段階でも培養液から容易に沈降して分離する
現象が観察される。一方、ビール酵母で問題とされる凝
集性のタイプ（ビール酵母タイプの凝集性）は、通常は
弱く、マンノースの他にグルコース、マルトース、スク
ロースといった麦汁中に豊富に含まれる糖類で阻害され
るために、実験室酵母とは性質を異にする。
【０００３】ビール酵母は製品ビールの香味等を決定す
る大きな要因の一つであるため、優秀な酵母を選抜、あ
るいは育種することはビール生産者の課題となってい
る。ドイツを中心に日本、その他の各国でラガータイプ
のビールが広く製造されているが、これに使用される酵
母は、発酵が終了に近づくと酵母が凝集して発酵液の底
に沈降する特性を持ち、特に下面酵母と呼ばれている。
ビール醸造では、発酵が終了して沈降した酵母を回収し
て、さらに次回の発酵へ繰り返して使用するという製造
上の特徴があるために、下面酵母のこの発酵後期に沈降
する性質は、ビール醸造にとって大きな意味を持つ。な
ぜならば、凝集性が無い株は発酵後期になっても浮遊し
たままで、酵母をビールから取り除くために遠心分離な
どの操作が必要になるからである。しかし、反対に浮遊
性の高い株は麦汁中の糖を最後まで消費する性質がある
ので、醗酵不良が起きることが分かっている麦芽のロッ
トに対して利用する場合等には有用である。従って、酵
母を目的に応じて使い分けるために、評価する酵母菌株
が、実験室酵母タイプの凝集性を持っているか、ビール
酵母タイプの凝集性を持っているか、あるいは凝集性が
無く浮遊性であるのかを判定することは重要である。
る大きな要因の一つであるため、優秀な酵母を選抜、あ
るいは育種することはビール生産者の課題となってい
る。ドイツを中心に日本、その他の各国でラガータイプ
のビールが広く製造されているが、これに使用される酵
母は、発酵が終了に近づくと酵母が凝集して発酵液の底
に沈降する特性を持ち、特に下面酵母と呼ばれている。
ビール醸造では、発酵が終了して沈降した酵母を回収し
て、さらに次回の発酵へ繰り返して使用するという製造
上の特徴があるために、下面酵母のこの発酵後期に沈降
する性質は、ビール醸造にとって大きな意味を持つ。な
ぜならば、凝集性が無い株は発酵後期になっても浮遊し
たままで、酵母をビールから取り除くために遠心分離な
どの操作が必要になるからである。しかし、反対に浮遊
性の高い株は麦汁中の糖を最後まで消費する性質がある
ので、醗酵不良が起きることが分かっている麦芽のロッ
トに対して利用する場合等には有用である。従って、酵
母を目的に応じて使い分けるために、評価する酵母菌株
が、実験室酵母タイプの凝集性を持っているか、ビール
酵母タイプの凝集性を持っているか、あるいは凝集性が
無く浮遊性であるのかを判定することは重要である。
【０００４】しかし、実際の製造現場を模して凝集性を
判定するには手間もかかるし、また、凝集性の微妙な違
いを評価することも困難であった。従って、古くから多
くの研究者によって凝集性の簡易評価方法が提案されて
きた。その多くは凝集促進物質であるCaイオンを酵母と
共存させることによって短期に凝集を起こさせてその度
合いを測定するものである。しかしながら、この方法は
非常に強い凝集性を有する実験室酵母であれば評価可能
であるが、ビール製造に実際使用する酵母における弱い
凝集性（ビール酵母タイプの凝集性）を判定する際には
沈降は見られず、評価方法としての機能を果たさなかっ
た。また、多数の菌株を扱うには操作が煩雑である点で
問題があった。
判定するには手間もかかるし、また、凝集性の微妙な違
いを評価することも困難であった。従って、古くから多
くの研究者によって凝集性の簡易評価方法が提案されて
きた。その多くは凝集促進物質であるCaイオンを酵母と
共存させることによって短期に凝集を起こさせてその度
合いを測定するものである。しかしながら、この方法は
非常に強い凝集性を有する実験室酵母であれば評価可能
であるが、ビール製造に実際使用する酵母における弱い
凝集性（ビール酵母タイプの凝集性）を判定する際には
沈降は見られず、評価方法としての機能を果たさなかっ
た。また、多数の菌株を扱うには操作が煩雑である点で
問題があった。
【０００５】一方、酵母の凝集性を遺伝子の面から解明
しようとする試みが行われている。この研究の結果、実
験室酵母からFLO1遺伝子がクローニングされ、その塩基
配列も明らかにされている [Yeast, 9, 1-10, (199
3)〕。しかし、上述のように、ビール酵母タイプの凝集
性は、実験室酵母タイプの凝集性とは性質を異にするも
のであり、この実験室酵母由来のFLO1遺伝子の有無によ
って、ビール酵母タイプの凝集性を判定することは困難
であった。
しようとする試みが行われている。この研究の結果、実
験室酵母からFLO1遺伝子がクローニングされ、その塩基
配列も明らかにされている [Yeast, 9, 1-10, (199
3)〕。しかし、上述のように、ビール酵母タイプの凝集
性は、実験室酵母タイプの凝集性とは性質を異にするも
のであり、この実験室酵母由来のFLO1遺伝子の有無によ
って、ビール酵母タイプの凝集性を判定することは困難
であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、酵母
の凝集性、とりわけ微弱で観察しづらいビール酵母タイ
プの凝集性の判定を可能にするためのDNA 分子を提供す
ることである。また、本発明の別の課題は酵母の凝集性
を簡便に多量の菌株について再現性良く判定する方法を
提供することである。
の凝集性、とりわけ微弱で観察しづらいビール酵母タイ
プの凝集性の判定を可能にするためのDNA 分子を提供す
ることである。また、本発明の別の課題は酵母の凝集性
を簡便に多量の菌株について再現性良く判定する方法を
提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ビール酵母
の凝集性遺伝子（以下、Lg-FLO1 とする。）の塩基配列
の一部を明らかにした。そしてすでに報告されているFL
O1遺伝子との相同性の検討を行い、ビール酵母由来Lg-F
LO1 特有の配列部分を明らかにし、酵母のゲノム中にこ
の塩基配列が存在するかしないかを判定することで、ビ
ール酵母タイプの凝集性の有無が判定できることを見い
だし、本発明を完成するに至った。
の凝集性遺伝子（以下、Lg-FLO1 とする。）の塩基配列
の一部を明らかにした。そしてすでに報告されているFL
O1遺伝子との相同性の検討を行い、ビール酵母由来Lg-F
LO1 特有の配列部分を明らかにし、酵母のゲノム中にこ
の塩基配列が存在するかしないかを判定することで、ビ
ール酵母タイプの凝集性の有無が判定できることを見い
だし、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、酵母の凝集性を有す
る酵母に特有な配列番号１に示される塩基配列またはそ
の相補配列の一部または全部を含む酵母の凝集性判定用
DNA分子を提供する。本発明はまた、前記のDNA 分子を
利用することにより酵母の凝集性を判定する方法を提供
する。
る酵母に特有な配列番号１に示される塩基配列またはそ
の相補配列の一部または全部を含む酵母の凝集性判定用
DNA分子を提供する。本発明はまた、前記のDNA 分子を
利用することにより酵母の凝集性を判定する方法を提供
する。
【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。本発明の
酵母の凝集性判定用DNA 分子は、配列番号１（ないしは
図１〜２）に示される塩基配列またはその相補配列の一
部または全部を含むものである。ここで「DNA 分子」と
は、２個以上のヌクレオチドを含む分子をいうものであ
る。配列番号１はLg-FLO1 の塩基配列の一部を示してお
り、図３〜４は実験室酵母FLO1遺伝子の対応部分を示し
たものである [Yeast, 10, 211-225, (1994)] 。これら
遺伝子間の相同性を比較することにより、配列番号１に
示したビール酵母Lg-FLO1 遺伝子特異の塩基配列部分を
特定した（この部分を以下、特異部分という。図１〜２
に示される塩基配列で下線が引いてある）。
酵母の凝集性判定用DNA 分子は、配列番号１（ないしは
図１〜２）に示される塩基配列またはその相補配列の一
部または全部を含むものである。ここで「DNA 分子」と
は、２個以上のヌクレオチドを含む分子をいうものであ
る。配列番号１はLg-FLO1 の塩基配列の一部を示してお
り、図３〜４は実験室酵母FLO1遺伝子の対応部分を示し
たものである [Yeast, 10, 211-225, (1994)] 。これら
遺伝子間の相同性を比較することにより、配列番号１に
示したビール酵母Lg-FLO1 遺伝子特異の塩基配列部分を
特定した（この部分を以下、特異部分という。図１〜２
に示される塩基配列で下線が引いてある）。
【００１０】従って、判定対象の酵母のゲノム上の塩基
配列に特異部分があるかないかを検出できれば、ビール
酵母タイプの凝集性の有無が判定できると考えられた。
この特異部分の検出方法は、従来知られているいずれの
方法も取り得る。例えば (1)特異部分の塩基配列に対し
て相補的な塩基配列を含むDNA 分子を放射性元素、蛍光
色素等で標識した後、これをプローブとして判定対象の
酵母の核酸とハイブリダイズさせるハイブリダイゼイシ
ョン法、 (2)特異部分の一部または全部を含むDNA 分子
またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むDN
A 分子を一つのプライマーとして用い、もう一方のプラ
イマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の
一部または全部を含むDNA 分子またはその塩基配列に対
して相補的塩基配列を含むDNA 分子を用いて、酵母の核
酸を増幅し、増幅物の有無を確認する方法、および (3)
特異部分より上流の塩基配列の一部または全部を含むDN
A 分子またはその塩基配列に対して相補的塩基配列を含
むDNA 分子を一つのプライマーとして用い、もう一方の
プライマーとして特異部分より下流の塩基配列の一部ま
たは全部を含むDNA 分子またはその塩基配列に対して相
補的塩基配列を含むDNA 分子を用いて、酵母の核酸を増
幅し、増幅物の分子量の大きさを測定する方法が考えら
れる。
配列に特異部分があるかないかを検出できれば、ビール
酵母タイプの凝集性の有無が判定できると考えられた。
この特異部分の検出方法は、従来知られているいずれの
方法も取り得る。例えば (1)特異部分の塩基配列に対し
て相補的な塩基配列を含むDNA 分子を放射性元素、蛍光
色素等で標識した後、これをプローブとして判定対象の
酵母の核酸とハイブリダイズさせるハイブリダイゼイシ
ョン法、 (2)特異部分の一部または全部を含むDNA 分子
またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むDN
A 分子を一つのプライマーとして用い、もう一方のプラ
イマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の
一部または全部を含むDNA 分子またはその塩基配列に対
して相補的塩基配列を含むDNA 分子を用いて、酵母の核
酸を増幅し、増幅物の有無を確認する方法、および (3)
特異部分より上流の塩基配列の一部または全部を含むDN
A 分子またはその塩基配列に対して相補的塩基配列を含
むDNA 分子を一つのプライマーとして用い、もう一方の
プライマーとして特異部分より下流の塩基配列の一部ま
たは全部を含むDNA 分子またはその塩基配列に対して相
補的塩基配列を含むDNA 分子を用いて、酵母の核酸を増
幅し、増幅物の分子量の大きさを測定する方法が考えら
れる。
【００１１】このうち、検出感度の面で (2)と (3)が優
れており、さらに (2)では特異部分と同じ塩基配列がな
いと増幅物が全く検出されないので実験ミスとの区別が
できない為に対照が必要であるのに対し、 (3)は増幅物
の異なる分子量のバンドが検出されるのでその問題で防
止できる。よって、多数の試料を扱い、精製が不十分な
ゲノムで増幅工程をおこなう可能性のある、酵母菌のス
クリーニングなどの際には (3)が最も優れている。
れており、さらに (2)では特異部分と同じ塩基配列がな
いと増幅物が全く検出されないので実験ミスとの区別が
できない為に対照が必要であるのに対し、 (3)は増幅物
の異なる分子量のバンドが検出されるのでその問題で防
止できる。よって、多数の試料を扱い、精製が不十分な
ゲノムで増幅工程をおこなう可能性のある、酵母菌のス
クリーニングなどの際には (3)が最も優れている。
【００１２】(2) および (3)でプライマーに使用するDN
A 分子の塩基数は、10bp程度必要であり、高い検出感度
を得るためには約15〜25bpであることが好ましい。ま
た、挟み込む部分の塩基数は約300 〜2000bpが適当であ
る。
A 分子の塩基数は、10bp程度必要であり、高い検出感度
を得るためには約15〜25bpであることが好ましい。ま
た、挟み込む部分の塩基数は約300 〜2000bpが適当であ
る。
【００１３】(3) のプライマーの具体例としては図５に
示される各プライマー対を含むDNA分子が挙げられる。
これらのプライマーには、後述のように制限酵素認識部
位が付与されている。上記のようなDNA 分子は、公知の
方法に従い、化学合成によって作製することができる。
示される各プライマー対を含むDNA分子が挙げられる。
これらのプライマーには、後述のように制限酵素認識部
位が付与されている。上記のようなDNA 分子は、公知の
方法に従い、化学合成によって作製することができる。
【００１４】以下に、本発明の検出方法の一例について
説明するが、この方法は上記 (3)で述べた方法、つまり
特異部分を含むDNA 分子またはその塩基配列に対して相
補的な塩基配列を含むDNA 分子を増幅し、その増幅物の
分子量の大きさによってビール酵母タイプの凝集性の有
無を判定する方法に関するものである。
説明するが、この方法は上記 (3)で述べた方法、つまり
特異部分を含むDNA 分子またはその塩基配列に対して相
補的な塩基配列を含むDNA 分子を増幅し、その増幅物の
分子量の大きさによってビール酵母タイプの凝集性の有
無を判定する方法に関するものである。
【００１５】まず、判定対象となる酵母のゲノムを調整
する。調整方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、
公知の如何なる方法も使用可能である〔例えば蛋白質核
酸酵素，35, 2523-2541 (1990)〕。
する。調整方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、
公知の如何なる方法も使用可能である〔例えば蛋白質核
酸酵素，35, 2523-2541 (1990)〕。
【００１６】このゲノムを対象にして、特異部分より上
流の塩基配列の一部あるいは全部を含むDNA 分子または
その塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むDNA 分子
からなるプライマーと、特異部分より下流の塩基配列の
一部あるいは全部を含むDNA分子またはその塩基配列に
対して相補的な塩基配列を含むDNA 分子からなるプライ
マーを用いてPCR 法によって核酸の増幅をおこなう。こ
のとき、各プライマーには増幅物をクローニングするこ
とを考えて制限酵素認識部位を付与することが可能であ
る。また、増幅させる特異部分は少なくても一箇所を含
むものでよく、複数の特異部分を含むものでもよい。
流の塩基配列の一部あるいは全部を含むDNA 分子または
その塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むDNA 分子
からなるプライマーと、特異部分より下流の塩基配列の
一部あるいは全部を含むDNA分子またはその塩基配列に
対して相補的な塩基配列を含むDNA 分子からなるプライ
マーを用いてPCR 法によって核酸の増幅をおこなう。こ
のとき、各プライマーには増幅物をクローニングするこ
とを考えて制限酵素認識部位を付与することが可能であ
る。また、増幅させる特異部分は少なくても一箇所を含
むものでよく、複数の特異部分を含むものでもよい。
【００１７】PCR 法に用いるDNA ポリメラーゼは95℃の
耐熱性を有するものであればその起源は問わない。PCR
法の反応条件としては変性温度は90〜95℃、アニーリン
グ温度は40〜60℃、伸長温度は70〜75℃、サイクル数は
10回以上が好ましいが、これに限らず通常PCR 法に使用
できる条件であればよい。
耐熱性を有するものであればその起源は問わない。PCR
法の反応条件としては変性温度は90〜95℃、アニーリン
グ温度は40〜60℃、伸長温度は70〜75℃、サイクル数は
10回以上が好ましいが、これに限らず通常PCR 法に使用
できる条件であればよい。
【００１８】得られた反応生成物はアガロースゲルなど
を用いた電気泳動法等の検出方法により分離され、増幅
産物の分子量が測定できる。この方法により、増幅産物
の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかに
よって、その酵母がビール酵母タイプの凝集性を有する
か否かの判定を行う。
を用いた電気泳動法等の検出方法により分離され、増幅
産物の分子量が測定できる。この方法により、増幅産物
の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかに
よって、その酵母がビール酵母タイプの凝集性を有する
か否かの判定を行う。
【００１９】
【発明の効果】本発明により、判定対象の酵母が実験室
酵母タイプの凝集性を持っているか、ビール酵母タイプ
の凝集性を持っているか、あるいは凝集性が無く浮遊性
であるのかを簡単な方法で迅速に測定できることが可能
となる。
酵母タイプの凝集性を持っているか、ビール酵母タイプ
の凝集性を持っているか、あるいは凝集性が無く浮遊性
であるのかを簡単な方法で迅速に測定できることが可能
となる。
【００２０】
【実施例】次に本発明を実施例を用いて具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 酵母凝集性判定用DNA の取得および塩基
配列の決定 （１）ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子の探索 ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子を探索する目的
で、以下の実験を実施した。凝集性ビール酵母、KI084
株から、Stewartの方法 [J.Inst.Brew., 93, 216-219,
(1987)]によって胞子を形成させ、染色体数の減少した
株（以降、このような株を減数体と呼ぶ）を作成した。
得られた減数体の内、６株に関して、表１に記載した培
地を用いて20℃で静置条件下で48時間培養した。培養後
の細胞は遠心にて集菌し、0.1M EDTAで2回洗浄後、滅菌
水で2回洗浄し、滅菌水に再懸濁した。この細胞の凝集
性判定を以下の方法によって行なった。すなわち、最終
OD600=2.0となるように、凝集測定用緩衝液（50mM 酢酸
ナトリウム、0.1% 塩化カルシウム、pH4.6）に懸濁し、
室温で30分間置いた後、20秒間激しく攪拌し、さらに5
分間静置した後、目視によって凝集、非凝集の別を判定
した。この結果、供試した６株の減数体は、２株の非凝
集性株と４株の凝集性株に分類された。
るが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 酵母凝集性判定用DNA の取得および塩基
配列の決定 （１）ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子の探索 ビール酵母の凝集性に関与する遺伝子を探索する目的
で、以下の実験を実施した。凝集性ビール酵母、KI084
株から、Stewartの方法 [J.Inst.Brew., 93, 216-219,
(1987)]によって胞子を形成させ、染色体数の減少した
株（以降、このような株を減数体と呼ぶ）を作成した。
得られた減数体の内、６株に関して、表１に記載した培
地を用いて20℃で静置条件下で48時間培養した。培養後
の細胞は遠心にて集菌し、0.1M EDTAで2回洗浄後、滅菌
水で2回洗浄し、滅菌水に再懸濁した。この細胞の凝集
性判定を以下の方法によって行なった。すなわち、最終
OD600=2.0となるように、凝集測定用緩衝液（50mM 酢酸
ナトリウム、0.1% 塩化カルシウム、pH4.6）に懸濁し、
室温で30分間置いた後、20秒間激しく攪拌し、さらに5
分間静置した後、目視によって凝集、非凝集の別を判定
した。この結果、供試した６株の減数体は、２株の非凝
集性株と４株の凝集性株に分類された。
【００２１】
【表１】
【００２２】これらの株から、以下に述べるようにサザ
ン解析およびノザン解析を行なった。全DNAの抽出は、Y
PD培地 [2% バクトペプトン（ディフコ社）、1% 酵母抽
出物（ディフコ社）、2% グルコース] で30℃で振とう
培養し、静止期に達した細胞から、Herefordらの方法
[Cell, 18, 1261-1271, (1979)]によって実施した。抽
出されたDNAは2μg相当をHindIII（ベーリンガー社）で
消化し、1%アガロースゲルを用いて電気泳動後、ナイロ
ンフィルターHybond N+（アマシャム社）に、そのプロ
トコールに従ってブロッティングを行ない、その後のサ
ザン解析に供試した。また、全RNAの抽出は、これらの
株に関し、表１に記載の培地を用いて48時間、20℃で静
置培養を行なった細胞から、VilleneveとMeyerの方法
[Cell, 48,25-37 (1987)] によって実施した。得られた
RNAの10μg を、16μl のグリオキサール・DMSO溶液 [1
M グリオキサール、50% DMSO、10mM りん酸ナトリウム
緩衝液（pH7.0)] 中で、１時間、50℃の処理によってグ
リオキサール化を行なった後、2μl のアプライ用緩衝
液 [50% (w/v) グリセロール、10mM りん酸緩衝液（pH
7.0）、0.4% (w/v) ブロムフェニルブルー] および1 μ
l の1mg/ml 臭化エチジウム溶液を加え、10mM りん酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）、1% アガロースを含むゲル中
で電気泳動を行なった。電気泳動中は、ペリスタポンプ
を用いて、電気泳動層中の緩衝液を常に循環させ、pHの
勾配が生ずることを防いだ。ブロムフェニルブルーがゲ
ルの長さの70% 程度まで達したときに電気泳動を中止
し、紫外線トランスイルミネーターを用いて臭化エチジ
ウムで染色されたゲル中のRNAを観察し、リボゾーマルR
NAを指標にRNAが分解されていないことを確認した。そ
の後に、ゲル中のRNAを、その添付されたプロトコール
に従って、ナイロンフィルターGenescreen-Plus（デュ
ポン社）にブロッティングし、RNAがブロッティングさ
れたフィルターに対し、80℃、2時間の処理を行なっ
た。このフィルターは、Genescreen-Plusに添付された
プロトコールに従ってノザン解析に供試した。
ン解析およびノザン解析を行なった。全DNAの抽出は、Y
PD培地 [2% バクトペプトン（ディフコ社）、1% 酵母抽
出物（ディフコ社）、2% グルコース] で30℃で振とう
培養し、静止期に達した細胞から、Herefordらの方法
[Cell, 18, 1261-1271, (1979)]によって実施した。抽
出されたDNAは2μg相当をHindIII（ベーリンガー社）で
消化し、1%アガロースゲルを用いて電気泳動後、ナイロ
ンフィルターHybond N+（アマシャム社）に、そのプロ
トコールに従ってブロッティングを行ない、その後のサ
ザン解析に供試した。また、全RNAの抽出は、これらの
株に関し、表１に記載の培地を用いて48時間、20℃で静
置培養を行なった細胞から、VilleneveとMeyerの方法
[Cell, 48,25-37 (1987)] によって実施した。得られた
RNAの10μg を、16μl のグリオキサール・DMSO溶液 [1
M グリオキサール、50% DMSO、10mM りん酸ナトリウム
緩衝液（pH7.0)] 中で、１時間、50℃の処理によってグ
リオキサール化を行なった後、2μl のアプライ用緩衝
液 [50% (w/v) グリセロール、10mM りん酸緩衝液（pH
7.0）、0.4% (w/v) ブロムフェニルブルー] および1 μ
l の1mg/ml 臭化エチジウム溶液を加え、10mM りん酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）、1% アガロースを含むゲル中
で電気泳動を行なった。電気泳動中は、ペリスタポンプ
を用いて、電気泳動層中の緩衝液を常に循環させ、pHの
勾配が生ずることを防いだ。ブロムフェニルブルーがゲ
ルの長さの70% 程度まで達したときに電気泳動を中止
し、紫外線トランスイルミネーターを用いて臭化エチジ
ウムで染色されたゲル中のRNAを観察し、リボゾーマルR
NAを指標にRNAが分解されていないことを確認した。そ
の後に、ゲル中のRNAを、その添付されたプロトコール
に従って、ナイロンフィルターGenescreen-Plus（デュ
ポン社）にブロッティングし、RNAがブロッティングさ
れたフィルターに対し、80℃、2時間の処理を行なっ
た。このフィルターは、Genescreen-Plusに添付された
プロトコールに従ってノザン解析に供試した。
【００２３】サザン解析およびノザン解析にプローブと
して用いたFLO1遺伝子の部分長のDNA断片は、以下のよ
うに調製した。Teunissen ら [Yeast, 9, 423-427, (19
93)]の報告したFLO1遺伝子の塩基配列をもとに、5'GATG
AAACTGTCATTGTTGTCAAA3'と5'TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3'
の２種のプライマーを合成した。これらのプライマーを
用い、凝集性ABXL-1D株（a, FLO1, Yeast Genetic St
ock Center）の全DNAを鋳型としてPCRを行ない、全PCR
産物を1%アガロースゲル中で電気泳動し、増幅された10
45bpのDNA断片（以降、FLO1部分長断片と呼ぶ）をゲル
から切り出し、Prep-A-Gene（バイオラッド社）を用い
て回収したDNA断片を得た。この断片は、［a-32P］dCTP
（アマシャム社）で標識し、プローブとして用いた。放
射能の検出は、X線フィルムを用いて行なった。
して用いたFLO1遺伝子の部分長のDNA断片は、以下のよ
うに調製した。Teunissen ら [Yeast, 9, 423-427, (19
93)]の報告したFLO1遺伝子の塩基配列をもとに、5'GATG
AAACTGTCATTGTTGTCAAA3'と5'TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3'
の２種のプライマーを合成した。これらのプライマーを
用い、凝集性ABXL-1D株（a, FLO1, Yeast Genetic St
ock Center）の全DNAを鋳型としてPCRを行ない、全PCR
産物を1%アガロースゲル中で電気泳動し、増幅された10
45bpのDNA断片（以降、FLO1部分長断片と呼ぶ）をゲル
から切り出し、Prep-A-Gene（バイオラッド社）を用い
て回収したDNA断片を得た。この断片は、［a-32P］dCTP
（アマシャム社）で標識し、プローブとして用いた。放
射能の検出は、X線フィルムを用いて行なった。
【００２４】結果を図６に示す。サザン解析の結果、親
株KI084には、約9.5kb、5.4kb、4.8kb、3.7kbの4本のFL
O1遺伝子と相同性のあるHindIII断片が検出された。KI0
84株に由来する減数体株では、約4.8kbと3.7kbの2本の
断片に関しては供試した全ての株に見られた。また、凝
集性判定試験で凝集性と判定された4株の減数体につい
てのみ、共通なバンドに加えて約9.5kbの断片が検出さ
れた。また、ノザン解析の結果から、親株および凝集性
判定試験で凝集性と判定された4株の減数体についての
み、FLO1遺伝子の転写産物が観察された。これらの結果
から、KI084に由来する減数体では、FLO1遺伝子と相同
な3本のHindIII断片の内、約9.5kbのHindIII断片に一部
もしくは全長が含まれるFLO1相同遺伝子のみが転写さ
れ、この相同遺伝子を持つ株のみが凝集性となることが
示唆された。以降、このKI084株の約9.5kbのHindIII断
片に一部もしくは全長が含まれるFLO1相同遺伝子を、Lg
-FLO1(Lager Type-FLO1)と呼ぶ。
株KI084には、約9.5kb、5.4kb、4.8kb、3.7kbの4本のFL
O1遺伝子と相同性のあるHindIII断片が検出された。KI0
84株に由来する減数体株では、約4.8kbと3.7kbの2本の
断片に関しては供試した全ての株に見られた。また、凝
集性判定試験で凝集性と判定された4株の減数体につい
てのみ、共通なバンドに加えて約9.5kbの断片が検出さ
れた。また、ノザン解析の結果から、親株および凝集性
判定試験で凝集性と判定された4株の減数体についての
み、FLO1遺伝子の転写産物が観察された。これらの結果
から、KI084に由来する減数体では、FLO1遺伝子と相同
な3本のHindIII断片の内、約9.5kbのHindIII断片に一部
もしくは全長が含まれるFLO1相同遺伝子のみが転写さ
れ、この相同遺伝子を持つ株のみが凝集性となることが
示唆された。以降、このKI084株の約9.5kbのHindIII断
片に一部もしくは全長が含まれるFLO1相同遺伝子を、Lg
-FLO1(Lager Type-FLO1)と呼ぶ。
【００２５】（２）Lg-FLO1遺伝子の制限酵素地図の作
成 KI084株に由来する減数体の内、凝集性のKMS004株およ
び、非凝集性のKMS001株の各1株ずつを選び、前述の方
法でDNAを調製し、数種類の制限酵素（ベーリンガー
社）を単独で、もしくは２種の酵素を組み合わせて用
い、前述のFLO1部分長断片をプローブとしたサザン解析
を実施した。その結果、凝集性のKMS004株には常に、非
凝集性の減数体と共通な2本のバンドの他に、非凝集性
の減数体には観察されない1本のバンドが検出された。
この凝集性減数体に特異的なバンドにLg-FLO1遺伝子の
一部、もしくは全長が含まれると考えられ、この断片の
長さを測定し、図７に示すような制限酵素地図を作成し
た。
成 KI084株に由来する減数体の内、凝集性のKMS004株およ
び、非凝集性のKMS001株の各1株ずつを選び、前述の方
法でDNAを調製し、数種類の制限酵素（ベーリンガー
社）を単独で、もしくは２種の酵素を組み合わせて用
い、前述のFLO1部分長断片をプローブとしたサザン解析
を実施した。その結果、凝集性のKMS004株には常に、非
凝集性の減数体と共通な2本のバンドの他に、非凝集性
の減数体には観察されない1本のバンドが検出された。
この凝集性減数体に特異的なバンドにLg-FLO1遺伝子の
一部、もしくは全長が含まれると考えられ、この断片の
長さを測定し、図７に示すような制限酵素地図を作成し
た。
【００２６】（３）Lg-FLO1遺伝子の部分長を含むKpnI
断片のクローニング 図７に示した制限酵素地図をもとに、約5.6kbのKpnI断
片のクローニングを試みた。KI084株に由来する凝集性
の減数体KMS004株のDNAをKpnI（ベーリンガー社）で完
全消化後、0.8%アガロース電気泳動法により分画し、約
5.6kbに相当するDNA断片ミックスをゲルより切り出し、
透析チューブ中で電気溶出することにより精製した。前
述のFLO1遺伝子の部分長をプローブとしたサザン解析に
より、精製したDNA断片ミックス中に、目的のDNA断片が
含まれているのを確認した後に、KpnIで完全消化したプ
ラスミドpUC18（宝酒造）と精製DNA断片ミックスをDNA
ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結し、大腸
菌DH5α（BRL社）を形質転換した。得られた形質転換体
のうち、5000株について、ナイロンフィルターHybondN+
（アマシャム社）に添付プロトコールに従ってブロッテ
ィングし、前述のFLO1部分長断片をプローブとしたコロ
ニーハイブリダイゼーションを実施し、10株の陽性株を
取得した。これらの陽性株からアルカリ法によってプラ
スミドを調製し、制限酵素解析を行なった結果、これら
の株がもつプラスミドは同一の挿入断片を持っているこ
とが確認できた。その中の1株のプラスミド、pKF-Kpn11
の挿入断片について、凝集性減数体KMS004株と非凝集性
減数体KMS001株のDNAをコントロールとするサザン解析
をした結果、挿入断片は目的のLg-FLO1遺伝子の一部で
あることが確認できた。このプラスミド、pKF-Kpn11 を
含む大腸菌(Escherichiacoli) EKB624 は、平成７年１
月27日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
され、寄託番号FERM BP-4984が付与されている。
断片のクローニング 図７に示した制限酵素地図をもとに、約5.6kbのKpnI断
片のクローニングを試みた。KI084株に由来する凝集性
の減数体KMS004株のDNAをKpnI（ベーリンガー社）で完
全消化後、0.8%アガロース電気泳動法により分画し、約
5.6kbに相当するDNA断片ミックスをゲルより切り出し、
透析チューブ中で電気溶出することにより精製した。前
述のFLO1遺伝子の部分長をプローブとしたサザン解析に
より、精製したDNA断片ミックス中に、目的のDNA断片が
含まれているのを確認した後に、KpnIで完全消化したプ
ラスミドpUC18（宝酒造）と精製DNA断片ミックスをDNA
ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結し、大腸
菌DH5α（BRL社）を形質転換した。得られた形質転換体
のうち、5000株について、ナイロンフィルターHybondN+
（アマシャム社）に添付プロトコールに従ってブロッテ
ィングし、前述のFLO1部分長断片をプローブとしたコロ
ニーハイブリダイゼーションを実施し、10株の陽性株を
取得した。これらの陽性株からアルカリ法によってプラ
スミドを調製し、制限酵素解析を行なった結果、これら
の株がもつプラスミドは同一の挿入断片を持っているこ
とが確認できた。その中の1株のプラスミド、pKF-Kpn11
の挿入断片について、凝集性減数体KMS004株と非凝集性
減数体KMS001株のDNAをコントロールとするサザン解析
をした結果、挿入断片は目的のLg-FLO1遺伝子の一部で
あることが確認できた。このプラスミド、pKF-Kpn11 を
含む大腸菌(Escherichiacoli) EKB624 は、平成７年１
月27日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
され、寄託番号FERM BP-4984が付与されている。
【００２７】（４）Lg-FLO1遺伝子の部分長を含むKpnI
断片の一部の塩基配列決定 pKF-Kpn11の挿入断片の塩基配列を決定するために、キ
ロシーケンス用 デレーションキット（宝酒造）を用
い、添付プロトコールに従ってpKF-Kpn11の挿入断片の
デレーションシリーズを作成した。塩基配列の決定は、
PCR/Sequencing キット（パーキン・エルマー社）を用
い、DNAシーケンサ（パーキン・エルマー社）によって
行なった。塩基配列の解析は、DNASIS（日立ソフトウェ
アエンジニアリング社）によって行なった。既知のFLO1
遺伝子のコード領域の塩基配列と相同なコード領域が見
出されたKpnI部位からHindIII部位までの2.9kbの塩基配
列を両方向から決定した（配列番号１ないしは図１〜
２）。決定された塩基配列中には、Lg-FLO1遺伝子のコ
ード領域の途中から、終止コドンに至る2.6kbのORFが存
在していた。
断片の一部の塩基配列決定 pKF-Kpn11の挿入断片の塩基配列を決定するために、キ
ロシーケンス用 デレーションキット（宝酒造）を用
い、添付プロトコールに従ってpKF-Kpn11の挿入断片の
デレーションシリーズを作成した。塩基配列の決定は、
PCR/Sequencing キット（パーキン・エルマー社）を用
い、DNAシーケンサ（パーキン・エルマー社）によって
行なった。塩基配列の解析は、DNASIS（日立ソフトウェ
アエンジニアリング社）によって行なった。既知のFLO1
遺伝子のコード領域の塩基配列と相同なコード領域が見
出されたKpnI部位からHindIII部位までの2.9kbの塩基配
列を両方向から決定した（配列番号１ないしは図１〜
２）。決定された塩基配列中には、Lg-FLO1遺伝子のコ
ード領域の途中から、終止コドンに至る2.6kbのORFが存
在していた。
【００２８】〔実施例２〕 酵母の凝集性の判定 判定対象の酵母 [(1) 凝集性ビール酵母、 (2)非凝集性
ビール酵母、 (3)実験室酵母（FLO1保持株)]をYPD 培地
8ml へ接種し、25℃、３日間振とう培養した。これを集
菌して0.5ml のソルビトール溶液 [0.9 M ソルビトー
ル、100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)、100mM EDTA] に
懸濁し、100μl のザイモリエイス溶液 [ソルビトール
溶液にザイモリエイス100T（キリンビール社）を1mg/ml
になるように溶解する] を添加して、37℃、一時間イン
キュベートした。得られたプロトプラストを遠心分離し
て回収し、0.5ml の溶菌緩衝液〔50mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0)、20mM EDTA 〕に懸濁して、100μl の10% (w/
v) SDS 溶液を添加し、水中に１時間放置した。このチ
ューブを15000 rpm 、５分間遠心し、上清を回収して、
等量のイソプロパノールを添加した。最終的に得られた
沈澱物を400μl のTE〔10mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0)
、1mM EDTA〕に溶解させた。
ビール酵母、 (3)実験室酵母（FLO1保持株)]をYPD 培地
8ml へ接種し、25℃、３日間振とう培養した。これを集
菌して0.5ml のソルビトール溶液 [0.9 M ソルビトー
ル、100mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0)、100mM EDTA] に
懸濁し、100μl のザイモリエイス溶液 [ソルビトール
溶液にザイモリエイス100T（キリンビール社）を1mg/ml
になるように溶解する] を添加して、37℃、一時間イン
キュベートした。得られたプロトプラストを遠心分離し
て回収し、0.5ml の溶菌緩衝液〔50mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0)、20mM EDTA 〕に懸濁して、100μl の10% (w/
v) SDS 溶液を添加し、水中に１時間放置した。このチ
ューブを15000 rpm 、５分間遠心し、上清を回収して、
等量のイソプロパノールを添加した。最終的に得られた
沈澱物を400μl のTE〔10mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0)
、1mM EDTA〕に溶解させた。
【００２９】このDNA を鋳型として、プライマー対１〜
４（図５）を用いてPCR 法をおこなった。このプライマ
ーは図１〜２の斜体部分で表される塩基配列をもとに公
知の方法に従って化学合成し、TEに溶解して適当な濃度
に希釈した後に、実験に使用した。尚、各プライマーに
は制限酵素(BamHI) 認識部位を付与した。0.5 mlのマイ
クロチューブに試料DNA を1μl 添加し、表２の量比で
混合後、蒸発防止のためにミネラルオイルを添加し、サ
ーマルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットし
た。94℃で１分間の変性、50℃で２分間のアニ−リン
グ、72℃で２分間の伸長を１サイクルとして、35サイク
ルさせた。
４（図５）を用いてPCR 法をおこなった。このプライマ
ーは図１〜２の斜体部分で表される塩基配列をもとに公
知の方法に従って化学合成し、TEに溶解して適当な濃度
に希釈した後に、実験に使用した。尚、各プライマーに
は制限酵素(BamHI) 認識部位を付与した。0.5 mlのマイ
クロチューブに試料DNA を1μl 添加し、表２の量比で
混合後、蒸発防止のためにミネラルオイルを添加し、サ
ーマルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットし
た。94℃で１分間の変性、50℃で２分間のアニ−リン
グ、72℃で２分間の伸長を１サイクルとして、35サイク
ルさせた。
【００３０】
【表２】
【００３１】反応溶液を電気泳動に供した。1000bp以下
の低分子領域の解像度をあげるために３％ NuSieve GTG
アガロース（FMC 社）、1% Sea-Kemアガロース（FMC
社）を１×TBE 緩衝液〔0.089Mトリスベース、0.089Mほ
う酸、0.002M EDTA 〕に溶解し、ゲルを作製した。泳動
緩衝液として１×TBE 緩衝液を使用し、100V、約50分間
電気泳動した。
の低分子領域の解像度をあげるために３％ NuSieve GTG
アガロース（FMC 社）、1% Sea-Kemアガロース（FMC
社）を１×TBE 緩衝液〔0.089Mトリスベース、0.089Mほ
う酸、0.002M EDTA 〕に溶解し、ゲルを作製した。泳動
緩衝液として１×TBE 緩衝液を使用し、100V、約50分間
電気泳動した。
【００３２】この結果、全ての酵母のサンプルでいくつ
かのバンドが観察された（図８）。プライマー対１、
２、４を用いた場合には、ビール酵母と実験室酵母が区
別することができたが、ビール酵母の凝集性株と非凝集
性株を見分けることができなかった。従って、試験する
菌株が既に凝集性であることが分かっている場合に、そ
の凝集性が実験室酵母タイプであるか、ビール酵母タイ
プであるのか区別する場合に有用である。さらに、プラ
イマー対３を使った場合に、ビール酵母タイプの凝集性
を有する酵母には、全ての酵母に共通したバンドの他に
分子量の大きい約300bp のバンドが観察され、凝集性を
有さない酵母にはそのバンドが観察されないので判定が
可能であった。
かのバンドが観察された（図８）。プライマー対１、
２、４を用いた場合には、ビール酵母と実験室酵母が区
別することができたが、ビール酵母の凝集性株と非凝集
性株を見分けることができなかった。従って、試験する
菌株が既に凝集性であることが分かっている場合に、そ
の凝集性が実験室酵母タイプであるか、ビール酵母タイ
プであるのか区別する場合に有用である。さらに、プラ
イマー対３を使った場合に、ビール酵母タイプの凝集性
を有する酵母には、全ての酵母に共通したバンドの他に
分子量の大きい約300bp のバンドが観察され、凝集性を
有さない酵母にはそのバンドが観察されないので判定が
可能であった。
【００３３】〔実施例３〕 スクリーニングへの応用 凝集性に関する情報のない試験株94株に対して、プライ
マー対３を用いて、実施例２の方法と全く同様にPCR 法
による凝集性の判定をおこなった。凝集性ありと判定さ
れた株が79株、なしと判断された株は15株あった。一
方、これらの試験株を60ml容小規模発酵試験に供し、発
酵終了時に目で見た沈降量の多さで凝集性の有無を確認
した。60ml容小規模発酵試験は麦汁に0.5 重量％となる
ように酵母を懸濁し、試験管に分注し、この試験管を緩
やかに撹拌しながら８℃でおこなった。この結果、本発
明の判定方法によってビール酵母タイプの凝集性ありと
予想されたものは、すべて発酵試験においても凝集性が
確認され、ビール酵母タイプの凝集性なしと予想された
ものはすべて凝集性が確認できなかった。また、発酵試
験では結果を判定するのに５日から７日間かかるが、本
発明の判定方法では１日の作業で判定が可能であった。
マー対３を用いて、実施例２の方法と全く同様にPCR 法
による凝集性の判定をおこなった。凝集性ありと判定さ
れた株が79株、なしと判断された株は15株あった。一
方、これらの試験株を60ml容小規模発酵試験に供し、発
酵終了時に目で見た沈降量の多さで凝集性の有無を確認
した。60ml容小規模発酵試験は麦汁に0.5 重量％となる
ように酵母を懸濁し、試験管に分注し、この試験管を緩
やかに撹拌しながら８℃でおこなった。この結果、本発
明の判定方法によってビール酵母タイプの凝集性ありと
予想されたものは、すべて発酵試験においても凝集性が
確認され、ビール酵母タイプの凝集性なしと予想された
ものはすべて凝集性が確認できなかった。また、発酵試
験では結果を判定するのに５日から７日間かかるが、本
発明の判定方法では１日の作業で判定が可能であった。
【００３４】配列番号：1 配列の長さ：2903 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae） 株名：KMS004 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置： 1 ．．2547 特徴を決定した方法：E 配列 GGT ACC AAC GGT CAA CCA ACT GAC GAA ACT GTC ATT GTT GTC AAA ACA 48 Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr 5 10 15 CCA ACA ACT GCT AAC ACC ATC GTA ACT ACG ACC AAA CCA TGG ACT GGT 96 Pro Thr Thr Ala Asn Thr Ile Val Thr Thr Thr Lys Pro Trp Thr Gly 20 25 30 ACT TTC ACC TCT ACA TCC ACA GAA ATG ACC ACA GTC ACC GGT ACT AAT 144 Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn 35 40 45 GGT CAA CCA ACT GAT GAA ACC GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGT 192 Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser 50 55 60 GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGC ACT TTC ACC 240 Glu Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr 65 70 75 80 TCT ACA TCC ACT GAG GTT ACC ACC ATC ACC GGT ACT AAT GGT CAA CCA 288 Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro 85 90 95 ACT GAC GAA ACC GTT ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACT AGT GAG GGT TTG 336 Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu 100 105 110 GTT ACA ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTC ACT TCG ACT TCC 384 Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser 115 120 125 ACT GGG ATG ACC ACC ATC ACC GGT ACT AAT GGT TTG CCA ACT GAT GAA 432 Thr Gly Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu 130 135 140 ACT GTT ATT GTT GTC AAA ACT CCA ACT ACT GCC ATC TCA TCC AGT TTG 480 Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser Leu 145 150 155 160 TCA TTA TCT TCT TCA GGA CAA ATC ACC AGC TCT ATC ACG TCT TCG CGT 528 Ser Leu Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser Arg 165 170 175 CCA ATT ATT ACC CCA TTC TAT CCT AGC AAT GGA ACT TCA GTA ATT TCT 576 Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile Ser 180 185 190 TCC TCA GAC ACT TCT TCC TCA GAC ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCT TCT 624 Ser Ser Asp Thr Ser Ser Ser Asp Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser 195 200 205 CTA GTC ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCT TCA GTC ATT TCT TCT TCA GTC 672 Leu Val Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val 210 215 220 ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCC TCA GTA ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT 720 Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser 225 230 235 240 TCT CTA GTC ACT TCC TCA GTA ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT TCT CTA 768 Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu 245 250 255 TTC ACT TCT TCT CCA GTC ATT TCT TCC TCG GTC ATT TCT TCT TCT ACA 816 Phe Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr 260 265 270 ACA ACC TCC ACT TCT ATA TTT TTT GAA TCA TCT AAA TCA TCC GTT ATT 864 Thr Thr Ser Thr Ser Ile Phe Phe Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile 275 280 285 CCA ACC AGT AGT TCC ACC TCT GGT TCT TCT GAG AGC AAA ACG AGT TCA 912 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ser Lys Thr Ser Ser 290 295 300 GCT AGT TCT TCC TCT TCT TCC TCT TCT ATC TCT TCT GAG TCA CCA AAG 960 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ser Ser Glu Ser Pro Lys 305 310 315 320 TCT ACA TAT TCG TCT TCT TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1008 Ser Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 325 330 335 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1056 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 340 345 350 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ATC AGT ACA ACA ACA 1104 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Ile Ser Thr Thr Thr 355 360 365 AGC CAG GAA ACT GCT TCT TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1152 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 370 375 380 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1200 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 385 390 395 400 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1248 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 405 410 415 AGT CAG GAA ATA ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1296 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 420 425 430 AGT CAG GAA ATA ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1344 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 435 440 445 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GCG GCA ACA 1392 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Ala Thr 450 455 460 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1440 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 465 470 475 480 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1488 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 485 490 495 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1536 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 500 505 510 AGT CAG GAA ATA ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1584 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 515 520 525 AGC CAA GAA ACT GCT TCT TCA TTA CCA CCT GCT ACC ACT ACA AAA ACG 1632 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr 530 535 540 AGC GAA CAA 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645 650 655 AAC GAC GTT ACC ACA GAA TAC ACA ACA TGG TGT CCT ATT TCC ACC ACA 2016 Asn Asp Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr 660 665 670 GAA TCG AAG CAA CAA ACT ACG CTA GTT ACT GTT ACT TCC TGC GAA TCT 2064 Glu Ser Lys Gln Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser 675 680 685 GGT GTG TGT TCC GAA ACT GCT TCA CCT GCC ATT GTT TCG ACG GCC ACG 2112 Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr 690 695 700 GCT ACT GTG AAT GAT GTT GTT ACG GTC TAT CCT ACA TGG AGG CCA CAG 2160 Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln 705 710 715 720 ACT ACG AAT GAA CAG TCT GTC AGC TCT AAA ATG AAC AGT GCT ACC AGT 2208 Thr Thr Asn Glu Gln Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Ser 725 730 735 GAG ACA ACT ACC AAT ACT GGG GCT GCT GAG ACA AAA ACA GCA GTC ACC 2256 Glu Thr Thr Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Ala Val Thr 740 745 750 TCT TCA CTT TCA AGA TTC AAT CAC GCT GAA ACA CAG ACG GCT TCC GCG 2304 Ser Ser Leu Ser Arg Phe Asn His Ala Glu Thr 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GTTGTTATCA AAAAGTATTA CCACAATAAA ATAAAGTGTT TACATAGAGT TTGTTTCGAG 2790 GTATCTGTGT TTTAACATTA TTAATTCTCT TGTTAGTTAA TGGCCATTCA CACATTCTTT 2850 TAATATCAAT TTCAGGTTAA GCGGGGCAAA AAATCTGTTT TACAAAAAAG CTT 2903
s cerevisiae） 株名：KMS004 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置： 1 ．．2547 特徴を決定した方法：E 配列 GGT ACC AAC GGT CAA CCA ACT GAC GAA ACT GTC ATT GTT GTC AAA ACA 48 Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr 5 10 15 CCA ACA ACT GCT AAC ACC ATC GTA ACT ACG ACC AAA CCA TGG ACT GGT 96 Pro Thr Thr Ala Asn Thr Ile Val Thr Thr Thr Lys Pro Trp Thr Gly 20 25 30 ACT TTC ACC TCT ACA TCC ACA GAA ATG ACC ACA GTC ACC GGT ACT AAT 144 Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn 35 40 45 GGT CAA CCA ACT GAT GAA ACC GTG ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACC AGT 192 Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser 50 55 60 GAA GGT CTA ATC AGC ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGC ACT TTC ACC 240 Glu Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr 65 70 75 80 TCT ACA TCC ACT GAG GTT ACC ACC ATC ACC GGT ACT AAT GGT CAA CCA 288 Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro 85 90 95 ACT GAC GAA ACC GTT ATT GTT ATC AGA ACT CCA ACT AGT GAG GGT TTG 336 Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu 100 105 110 GTT ACA ACC ACC ACT GAA CCA TGG ACT GGT ACT TTC ACT TCG ACT TCC 384 Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser 115 120 125 ACT GGG ATG ACC ACC ATC ACC GGT ACT AAT GGT TTG CCA ACT GAT GAA 432 Thr Gly Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Leu Pro Thr Asp Glu 130 135 140 ACT GTT ATT GTT GTC AAA ACT CCA ACT ACT GCC ATC TCA TCC AGT TTG 480 Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ser Ser Ser Leu 145 150 155 160 TCA TTA TCT TCT TCA GGA CAA ATC ACC AGC TCT ATC ACG TCT TCG CGT 528 Ser Leu Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser Ile Thr Ser Ser Arg 165 170 175 CCA ATT ATT ACC CCA TTC TAT CCT AGC AAT GGA ACT TCA GTA ATT TCT 576 Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly Thr Ser Val Ile Ser 180 185 190 TCC TCA GAC ACT TCT TCC TCA GAC ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCT TCT 624 Ser Ser Asp Thr Ser Ser Ser Asp Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser 195 200 205 CTA GTC ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCT TCA GTC ATT TCT TCT TCA GTC 672 Leu Val Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val 210 215 220 ACT TCT TCT CTA GTC ACT TCC TCA GTA ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT 720 Thr Ser Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser 225 230 235 240 TCT CTA GTC ACT TCC TCA GTA ATT TCT TCC TCA GTC ACT TCT TCT CTA 768 Ser Leu Val Thr Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser Leu 245 250 255 TTC ACT TCT TCT CCA GTC ATT TCT TCC TCG GTC ATT TCT TCT TCT ACA 816 Phe Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Thr 260 265 270 ACA ACC TCC ACT TCT ATA TTT TTT GAA TCA TCT AAA TCA TCC GTT ATT 864 Thr Thr Ser Thr Ser Ile Phe Phe Glu Ser Ser Lys Ser Ser Val Ile 275 280 285 CCA ACC AGT AGT TCC ACC TCT GGT TCT TCT GAG AGC AAA ACG AGT TCA 912 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Glu Ser Lys Thr Ser Ser 290 295 300 GCT AGT TCT TCC TCT TCT TCC TCT TCT ATC TCT TCT GAG TCA CCA AAG 960 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ser Ser Glu Ser Pro Lys 305 310 315 320 TCT ACA TAT TCG TCT TCT TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT 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CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1344 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 435 440 445 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GCG GCA ACA 1392 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Ala Thr 450 455 460 AGC CAG GAA ACT GCT TCA TCA TTA CCG CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1440 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 465 470 475 480 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1488 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 485 490 495 AGT CAG GAA ATC ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GTA ACA ACA 1536 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Val Thr Thr 500 505 510 AGT CAG GAA ATA ACT TCA TCA TTA CCA CCT GTT ACC AGT GCG ACA ACA 1584 Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro Val Thr Ser Ala Thr Thr 515 520 525 AGC CAA GAA ACT GCT TCT TCA TTA CCA CCT GCT ACC ACT ACA AAA ACG 1632 Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Thr 530 535 540 AGC GAA CAA 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645 650 655 AAC GAC GTT ACC ACA GAA TAC ACA ACA TGG TGT CCT ATT TCC ACC ACA 2016 Asn Asp Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr 660 665 670 GAA TCG AAG CAA CAA ACT ACG CTA GTT ACT GTT ACT TCC TGC GAA TCT 2064 Glu Ser Lys Gln Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser 675 680 685 GGT GTG TGT TCC GAA ACT GCT TCA CCT GCC ATT GTT TCG ACG GCC ACG 2112 Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr 690 695 700 GCT ACT GTG AAT GAT GTT GTT ACG GTC TAT CCT ACA TGG AGG CCA CAG 2160 Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln 705 710 715 720 ACT ACG AAT GAA CAG TCT GTC AGC TCT AAA ATG AAC AGT GCT ACC AGT 2208 Thr Thr Asn Glu Gln Ser Val Ser Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Ser 725 730 735 GAG ACA ACT ACC AAT ACT GGG GCT GCT GAG ACA AAA ACA GCA GTC ACC 2256 Glu Thr Thr Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Ala Val Thr 740 745 750 TCT TCA CTT TCA AGA TTC AAT CAC GCT GAA ACA CAG ACG GCT TCC GCG 2304 Ser Ser Leu Ser Arg Phe Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala Ser Ala 755 760 765 ACC GAT GTG ATT GGT CAC AGC AGT AGT GTT GTT TCT GTA TCC GAA ACT 2352 Thr Asp Val Ile Gly His Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser Glu Thr 770 775 780 GGC AAC ACC AAG GGT CTA ATA ACT TCC GAG CTA AGT ACT ATG TCG CAA 2400 Gly Asn Thr Lys Gly Leu Ile Thr Ser Glu Leu Ser Thr Met Ser Gln 785 790 795 800 CAG CCT CGT AGC ACA CCA GCA AGT ACC ATG GTA GGA TCA AGT ACT GCC 2448 Gln Pro Arg Ser Thr Pro Ala Ser Thr Met Val Gly Ser Ser Thr Ala 805 810 815 TCT TTA GAA ATC TCA ACC TAC GTT GGT ATT GCC AAT GGT CTG TTG ACC 2496 Ser Leu Glu Ile Ser Thr Tyr Val Gly Ile Ala Asn Gly Leu Leu Thr 820 825 830 AAT AAT GGC ATA AGT GTC TTT ATT TCC ACC GTA TTG CTG GCA ATC GTA 2544 Asn Asn Gly Ile Ser Val Phe Ile Ser Thr Val Leu Leu Ala Ile Val 835 840 845 TGG TAA 2550 Trp *** ACGAACGGCA TCATCTTATA TTAATAATTC TATCATCACG CTTATAGTGT TTACACATTT 2610 CTCCCCATTT ACTTCGTTCT TTAATATATT AAATATCATA GGATTCATAA ACCTTTTCAA 2670 ATGTCTAAGA GTACATTTTT AGCCTAACTA TTCGGCTTTG CATTATTTTG TTTCAGATGT 2730 GTTGTTATCA AAAAGTATTA CCACAATAAA ATAAAGTGTT TACATAGAGT TTGTTTCGAG 2790 GTATCTGTGT TTTAACATTA TTAATTCTCT TGTTAGTTAA TGGCCATTCA CACATTCTTT 2850 TAATATCAAT TTCAGGTTAA GCGGGGCAAA AAATCTGTTT TACAAAAAAG CTT 2903
【図１】 Lg-FLO1 遺伝子の部分的塩基配列(KpnI から
HindIII までの約2.9Kb,下線は特異配列、斜体はプライ
マー部位) を示す。
HindIII までの約2.9Kb,下線は特異配列、斜体はプライ
マー部位) を示す。
【図２】 Lg-FLO1 遺伝子の部分的塩基配列(KpnI から
HindIII までの約2.9Kb,下線は特異配列、斜体はプライ
マー部位) （続き）を示す。
HindIII までの約2.9Kb,下線は特異配列、斜体はプライ
マー部位) （続き）を示す。
【図３】 実験室酵母FLO1遺伝子の塩基配列（Lg-FLO1
との対応部分）を示す。
との対応部分）を示す。
【図４】 実験室酵母FLO1遺伝子の塩基配列（Lg-FLO1
との対応部分）（続き）を示す。
との対応部分）（続き）を示す。
【図５】 PCR に用いるプライマー対１〜４を示す。
【図６】 ビール酵母およびその減数対のFLO1遺伝子に
関するサザンおよびノザン解析による電気泳動の結果
（写真）を示す。
関するサザンおよびノザン解析による電気泳動の結果
（写真）を示す。
【図７】 Lg-FLO1 遺伝子部分断片の制限酵素地図を示
す。
す。
【図８】 各プライマーを用いたPCR 産物の電気泳動の
結果（写真）を示す。
結果（写真）を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年４月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１に示される塩基配列またはそ
の相補配列の一部あるいは全部を含むことを特徴とす
る、酵母の凝集性判定用DNA 分子。 - 【請求項２】 請求項１記載のDNA 分子を使用すること
を特徴とする酵母の凝集性判定方法。
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