CN116590463A - 核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用 - Google Patents

核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用 Download PDF

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CN116590463A CN202310776180.1A CN202310776180A CN116590463A CN 116590463 A CN116590463 A CN 116590463A CN 202310776180 A CN202310776180 A CN 202310776180A CN 116590463 A CN116590463 A CN 116590463A
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曹瑞红
李慧
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Abstract

本申请涉及一种核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用，核酸组合物，包括目标微生物的核酸扩增引物，目标微生物包括扣囊复膜酵母、横梗霉和黄曲霉中的至少一种；其中，扣囊复膜酵母的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对；横梗霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对；黄曲霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对。本申请的核酸组合物能够用于对各个制曲阶段的大曲样本中的目标微生物进行定量分析，进而区分整优曲和整次曲，从而实现快速、客观地检测各个制曲阶段的大曲质量。

Description

核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸组合物、目标微生物检测试剂盒及其应用。
背景技术
大曲是用来酿酒的一种原料，又称块曲或砖曲，以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物在上面生长而制成。
大曲是大曲酒酿造中的糖化发酵剂，含有多种微生物菌系和各种酿酒酶系。在制曲和酿酒过程中，这些微生物的生长与繁殖，形成了种类繁多的代谢产物，进而赋予各种大曲酒独特的风格与特色。
为了保证大曲酒发酵过程的正常进行，大曲品质稳定至关重要。目前大曲发酵过程质量评价主要依靠制曲师傅基于曲砖外观形态的主观判断，缺少科学的客观评价指标。
因此，如何客观、快速判断大曲发酵过程的质量是大曲质量控制的难点。
发明内容
为了解决上述问题，客观、快速检测发酵过程的大曲质量，提高大曲品质的稳定性，本申请的第一目的在于提供一种核酸组合物，包括目标微生物的核酸扩增引物，目标微生物包括扣囊复膜酵母、横梗霉和黄曲霉中的至少一种；
其中，扣囊复膜酵母的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对；
横梗霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对；
黄曲霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对。
本申请的第二目的在于提供一种分离的核酸，分离的核酸包括权利要求1的核酸组合物的扩增片段；
可选地，分离的核酸为质粒。
本申请的第三目的在于提供上述核酸组合物和/或上述分离的核酸在制备目标微生物检测试剂盒中的应用。
在其中一个实施例中，试剂盒用于检测目标微生物的核酸含量；
可选地，试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：
实时荧光定量PCR和数字PCR。
在其中一个实施例中，试剂盒中的组分满足以下特征(1)和(2)中的至少一个：
(1)试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR反应试剂中的至少一种；
(2)分离的核酸的浓度为103copies/μL～1012copies/μL。
本申请的第四目的在于提供一种根据上述应用制备的试剂盒。
本申请的第五目的在于提供一种根据上述核酸组合物、上述分离的核酸、或者上述试剂盒在检测大曲质量中的应用。
本申请的第六目的在于提供一种检测大曲质量的方法，方法包括：
采用上述核酸组合物、上述分离的核酸、或者上述试剂盒检测待测大曲样本中的目标微生物，待测大曲样本为制曲阶段的大曲样本；
根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量；
其中，制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段。
在其中一个实施例中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为晾霉Ⅱ阶段或后火阶段的大曲样本；
当扣囊复膜酵母的核酸含量大于4×108copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当扣囊复膜酵母的核酸含量小于1×108copies/g时，确定待测大曲样本为次曲。
在其中一个实施例中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为大火阶段的大曲样本；
当横梗霉的核酸含量小于1×1011copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当横梗霉的核酸含量大于4×1011copies/g时，确定待测大曲样本为次曲。
在其中一个实施例中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为晾霉阶段的大曲样本；
当黄曲霉的核酸含量大于1×107copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当黄曲霉的核酸含量小于8×106copies/g时，确定待测大曲样本为次曲；。
本申请的第七目的在于提供一种大曲的制备方法，在制曲阶段，采用上述方法检测大曲的质量；
其中，制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段中的至少一种；
可选地，大曲为清香型白酒大曲；
可选地，晾霉阶段包括晾霉I阶段和晾霉Ⅱ阶段中的至少一种。
本申请的第八目的在于提供一种上述制备方法制备的大曲；
可选地，大曲为清香型白酒大曲。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的后火曲上霉发酵阶段标真菌标志物丰度检测结果；
图2为本申请实施例1提供的后火曲晾霉I阶段真菌标志物丰度检测结果；
图3为本申请实施例1提供的后火曲晾霉I阶段备选真菌标志物丰度检测结果；
图4为本申请实施例1提供的后火曲晾霉II阶段真菌标志物丰度检测结果；
图5为本申请实施例1提供的后火曲潮火阶段真菌标志物丰度检测结果；
图6为本申请实施例1提供的后火曲大火阶段真菌标志物丰度检测结果；
图7为本申请实施例1提供的后火曲后火阶段真菌标志物丰度检测结果；
图8为本申请实施例2提供的多种微生物标志物引物PCR验证结果；其中，图8中，a表示扣囊复膜酵母菌引物鉴定图；b表示黄曲霉菌引物鉴定图；c表示植物乳杆菌引物鉴定图；d表示异常维克汉逊酵母菌和葡萄牙棒孢酵母菌引物鉴定图，泳道1中的条带为异常维克汉逊酵母；泳道2中的条带为葡萄牙棒孢酵母菌；e表示东方伊萨酵母菌引物鉴定图；f表示无根霉菌和横梗霉菌的引物鉴定图，泳道1中的条带为无根霉菌；泳道2中的条带为横梗霉菌；g表示5种真菌引物鉴定图，泳道1和泳道2中的条带分别是橙黄色嗜热子囊菌两对引物，3、4、5泳道中的条带分别代表阿氏丝孢酵母菌、匍枝根霉菌、微小根毛霉菌；M表示DNA的maker；
图9为本申请实施例2提供的微生物标志物标准品的验证结果，图9中，a表示扣囊复膜酵母菌标准品鉴定图；b表示黄曲霉菌标准品鉴定图；c表示无根霉菌标准品鉴定图；d表示阿氏丝孢酵母标准品鉴定图；e表示葡萄牙棒孢酵母菌的标准品鉴定图；f表示横梗霉菌标准品鉴定图；g表示异常维克汉逊酵母菌标准品鉴定图；h表示3种真菌标准品鉴定图，泳道1、2、3中的条带分别表示东方伊萨酵母菌、微小根毛霉菌、植物乳杆菌；i表示2种真菌标准品鉴定图，1、2是橙黄色嗜热子囊菌、匍枝根霉菌；M表示DNA的maker；1-D、2-D、3-D分别表示某种菌以样品DNA为模板进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图；1-Z、2-Z、3-Z分别表示某种菌已构建好的标准品为模板进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图；
图10为本申请实施例3提供的感官优次曲中扣囊复膜酵母生物量在各个发酵阶段差异比较分析结果；其中，图10中，a表示扣囊复膜酵母的RT-qPCR标准曲线；b表示扣囊复膜酵母生物量动态变化曲线；
图11为本申请实施例3提供的感官优次曲中横梗霉生物量在各个发酵阶段差异比较分析结果；其中，图11中，a表示横梗霉的RT-qPCR标准曲线；b表示横梗霉的熔解曲线；c表示横梗霉生物量动态变化曲线；
图12为本申请实施例3提供的感官优次曲中黄曲霉生物量在各个发酵阶段差异比较分析结果；其中，图12中，a表示黄曲霉的RT-qPCR标准曲线；b表示黄曲霉的熔解曲线；c表示黄曲霉生物量动态变化曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
为了至少解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种核酸组合物，包括目标微生物的核酸扩增引物，目标微生物包括扣囊复膜酵母、横梗霉和黄曲霉中的至少一种；
其中，扣囊复膜酵母的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对；
横梗霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对；
黄曲霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对。
具体地，扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)又称扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)，能够表达生淀粉液化酶和糖化酶,被认为是产生淀粉分解酶类的最好的子囊酵母菌之一，是白酒曲和酒醅发酵前期的优势酵母菌，可分泌淀粉酶(α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、生淀粉糖化酶)、蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶类，降解大分子底物，为酿酒酵母等其他白酒发酵微生物的生长提供营养。扣囊复膜酵母与其他微生物的协同作用，对酒精的生成和白酒风味的形成都具有重要贡献。
横梗霉属旧称犁头霉属(Absidia)，广泛分布于自然界，有性期接合孢子同宗配合，其他种均异宗配合；配囊柄生出粗大的毛状附属物；也可有异宗配合。可用于酿造白酒，产腺嘌呤核苷。
黄曲霉菌(学名：Aspergillus flavus)或称为黄曲菌、黄曲霉等，属真菌门、半知菌亚门、丛梗孢科、曲霉属，是一种广泛分布于世界各地的常见腐生霉菌，其中有30％-60％的菌株可产生黄曲霉毒素；而大多数非致病性的菌种，常作为曲种应用于发酵工业，主要是一些有机酸的发酵生产，如黄曲霉Aspergillus flavus H-98可用于L-苹果酸的发酵生产。
本申请创造性地发现通过上述核酸组合物，对目标微生物进行定量分析，可以根据定量分析结果区分优曲和次曲，分析速度快且不需要依赖人力主观判断，从而实现快速、客观地检测大曲质量。
进一步，在实际应用中，本申请通过上述核酸组合物对不同制曲阶段的大曲样本中目标微生物含量进行定量分析，判断生产过程是否正常，为大曲生产过程中调整操作提供参考，进而提升最终大曲品质及稳定性。
本申请的第二方面提供了一种分离的核酸，分离的核酸含有上述核酸组合物的扩增片段。本申请提供的分离的核酸能够作为标准品和上述核酸组合物联用实现目标微生物的定量检测。
一些实施方案中，分离的核酸为质粒。
本申请，术语“质粒”是指是一种独立于染色体外独立复制的双链DNA片段，包括复制起始位点、抗性基因和多克隆位点等，作为载体用来克隆和扩增上述核酸组合物的扩增片段。
具体地，质粒可以为T载体质粒。
一些具体实施方案中，分离的核酸为含有上述核酸组合物的扩增片段的T载体质粒，能够作为目标微生物的标准品，进而用于目标微生物的定量分析。
因此，本申请的第三方面提供了上述核酸组合物和/或分离的核酸在制备目标微生物检测试剂盒中的应用，从而实现目标微生物的定量分析。
一些实施方案中，试剂盒用于检测目标微生物的核酸含量，以对目标微生物的核酸定量分析。
为了实现对目标微生物的定量检测，一些具体实施方案中，试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：
实时荧光定量PCR和数字PCR。
具体地，实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团，使PCR产物和荧光相关，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
数字PCR即Digital PCR(dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR扩增与计数式检测，相较于PCR技术，能够直接计数DNA分子的个数，可实现样品的绝对定量分析。数字PCR过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下，使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中，每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个DNA模板分子，模板分子的分散符合泊松分布。PCR扩增结束后有荧光信号单元记为1，无荧光信号则记为0，即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度。该技术结果判定不依赖于扩增曲线的循环阈值(Ct)，不受扩增效率的影响，具有很好的准确度和重现性，并且可以实现绝对定量分析。
一些实施方案中，试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR反应试剂中的至少一种。具体地，PCR反应试剂包括实时荧光定量PCR反应试剂和数字PCR反应试剂。
本申请的第四方面提供了一种上述应用制备的试剂盒，用于检测目标微生物，特别地，用于检测大曲样本中的目标微生物，从而判定大曲质量。
相应地，本申请的第五方面提供了一种上述核酸组合物、上述分离的核酸、或者上述试剂盒在检测大曲质量中的应用，从而提高检测大曲质量的客观性、准确性和速度。
本申请的第六方面提供了一种检测大曲质量的方法，方法包括：
采用上述核酸组合物、上述分离的核酸、或者上述试剂盒检测待测大曲样本中的目标微生物，待测大曲样本为制曲阶段的大曲样本；
根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量。
具体地，制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段中的至少一种；
根据待测大曲样本中目标微生物的核酸含量的定量分析结果鉴定各个不同制曲阶段的大曲质量，从而将制曲阶段的大曲样本分为优曲和次曲。
一些实施方案中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为晾霉Ⅱ阶段或后火阶段的大曲样本；
当扣囊复膜酵母的核酸含量大于4×108copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当扣囊复膜酵母的核酸含量小于1×108copies/g时，确定待测大曲样本为次曲。
一些实施方案中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为大火阶段的大曲样本；
当横梗霉的核酸含量小于1×1011copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当横梗霉的核酸含量大于4×1011copies/g时，确定待测大曲样本为次曲。
一些实施方案中，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本是否正常发酵具体包括：
若待测大曲样本为晾霉阶段的大曲样本；
当黄曲霉的核酸含量大于1×107copies/g时，确定待测大曲样本为优曲；
当黄曲霉的核酸含量小于8×106copies/g时，确定待测大曲样本为次曲。
本申请的第七方面提供了一种大曲的制备方法，在制曲阶段，采用上述方法检测大曲的质量，为制曲阶段调整发酵过程的操作，比如窗户开的大小以及时间点，提供参考和指导，提升最终大曲品质及稳定性。
其中，制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段中的至少一种。
一些具体实施方案中，晾霉阶段包括晾霉I阶段和晾霉Ⅱ阶段中的至少一种。
一些具体实施方案中，上述制备方法制备的大曲为用于清香型白酒酿造的大曲。
相应地，本申请的第七方面提供了一种上述制备方法制备的大曲，稳定性更好，品质更高。
一些具体实施方案中，大曲为清香型大曲。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
实施例1清香型白酒大曲酿造过程中微生物标志物的筛选
1、仪器：Nanodrop 2000微量紫外分光光度计、实时定量PCR系统、高速冷冻离心机、电子天平、制冰机、超纯水机、涡旋仪
2、微生物多样性分析：通过扩增子分析研究清香型大曲酿造过程中微生物群落结构变化，进而筛选出微生物标志物，具体过程如下：
1)样本取样：实验样品采取自山西省杏花村汾酒厂股份有限公司同一批次发酵低温大曲(后火曲)，对制曲8个阶段：卧曲(WQ)(0天)、上霉(SM)(3day)、晾霉(LMⅠ、Ⅱ)(5～8天)、潮火(CH)(13天)、大火(DH)(17天)、后火(HH)(20天)、养曲(YQ)(24天)、贮曲(ZQ)(3个月)进行大曲取样。其中，晾霉阶段在生产上持续时间较长，并且被认为是一个关键节点，因此在此阶段进行了两次取样。其他阶段均取一次样本，时间为该阶段结束时。所取样本基于外观分为两组，一组为生产上被认为外观表现出色的样本，另一组为外观表现很差的样本。
使用Fast soil kit试剂盒(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,United States)，依照说明书提取样本DNA。提取的DNA保存在-20℃，后续用于Illumina MiSeq扩增子测序。用Nanodrop 2000微量紫外分光光度仪测定DNA的浓度和纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量。使用通用引物组338F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区，用引物ITS1F和ITS2扩增真菌rRNA内部转录间隔(ITS)区域。测序后，经去除引物和barcode序列后对每个样品的reads进行拼接得到原始序列，再经过原始序列质量过滤和嵌合体去除得到有效数据，并采用QIIME2的classify-sklearn算法将得到的ASVs与数据库比对从而得到每个ASV的物种信息并对每个ASV使用预先训练好的Naive Bayes分类器对比细菌16S rRNA基因数据库Greengenes(版本13.8)和真菌ITS数据库UNITE(版本7.1)进行物种注释。
具体步骤：
以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
引物对应区域：
16S V4区引物(515F和806R)：鉴定细菌多样性；
18S V4区引物(528F和706R)：鉴定真核微生物多样性；
ITS1区引物(ITS5-1F-F和ITS1-1F-R)：鉴定真菌多样性；
此外，扩增区域还包括：16S V3-V4/16S V4-V5/16SV5-V7；古菌16S V4-V5/古菌16S V8；18S V9和ITS2区。
2)PCR产物的混样和纯化
PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
3)文库构建和上机测序
使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
数据处理部分：
(1)测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；拼接得到的RawTags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程，进行如下操作：a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75％的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。
(2)ASV降噪和物种注释
利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部Effective Tags进行降噪分析，默认选择dada2，DADA2算法的核心在于序列校正，二代测序的错误是随机发生的(即，任意两条序列的测序错误相对是随机发生的、一条序列的任意两个位置的测序错误也是随机发生的，不存在关联性)，符合泊松分布，通过机器学习算法将认为测序错误的序列去除。对ASVs序列进行物种注释，用qiime2中的NaiveBayes方法与SILVA138(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE(Version3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有ASVs代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
(3)样本复杂度分析(Alpha Diversity)
使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线，Rank abundance曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析；Alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
Alpha多样性指数具体描述如下：
计算菌群丰度(Community richness)的指数有:
Chao-the Chao1 estimator(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1)；
ACE-the ACE estimator(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace)；
计算菌群多样性(Community diversity)的指数有:
Shannon-the Shannon index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon)；
Simpson-the Simpson index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson)；
测序深度指数有:
Coverage-the Good’s coverage(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage)；
系统发育多样性的指数有：
PD_whole_tree-PD_whole_tree index(http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.faith_pd.html？highlight＝pd#skbio.diversity.alpha.faith_pd)
(4)多样本比较分析(Beta Diversity)
用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离、构建UPGMA样本聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCA，PCoA和NMDS图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包，NMDS分析使用R软件的vegan软件包。使用R软件进行Beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
LEfSe分析使用LEfSe软件，默认设置LDA Score的筛选值为4。Metastats分析使用R软件在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species)下，做组间的permutation test，得到p值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法对于p值进行修正，得到q值。Anosim，MRPP和Adonis分析分别使用R vegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。AMOVA分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用R软件做组间T_test检验并作图。
5)大曲发酵过程控制微生物标志物筛选
基于种水平比较不同样本中真菌绝对丰度筛选候选标志物种，后火曲上霉发酵阶段标真菌标志物丰度检测结果如图1所示；后火曲晾霉I阶段真菌标志物丰度检测结果如图2所示；后火曲晾霉I阶段备选真菌标志物丰度检测结果如图3所示；后火曲晾霉II阶段真菌标志物丰度检测结果如图4所示；后火曲潮火阶段真菌标志物丰度检测结果如图5所示；后火曲大火阶段真菌标志物丰度检测结果如图6所示；后火曲后火阶段真菌标志物丰度检测结果如图7所示。具体微生物标志物筛选结果如下：
上霉阶段：黄曲霉(Aspergillus_flavus)在局部优曲和整优曲中的绝对丰度均高于次曲中，在整优曲中尤为显著，其丰度达到7500左右。葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、链格孢菌(Alternaria_alternata)、绿木霉(Trichoderma_virens)、毛孢子菌(Apiotrichum_domesticum)均是在次曲中的丰度高于优曲，其中葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)毛孢子菌(Apiotrichum_domesticum)在次曲局部取样样品中丰度显著高于优曲；绿木霉(Trichoderma_virens)和链格孢菌(Alternaria_alternata)在整次曲中的含量显著高于整优曲。以上真菌将作为重点关注的物种，在后续快检方法开发中进一步分析其序列，设计引物，建立定量快检方法。
另外，扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis_fibuligera)、地丝双足囊菌(Dipodascus geotrichum)、被孢霉属(Mortierella_sp)、被孢霉(Mortierella_chlamydospora)在优次曲中的丰度也存在显著差异，但是在局部样品和整样品中的变化趋势正好相反。单孢哈萨克斯坦酵母(Kazachstania_unispora)在局部样品中没有检出，但在整优曲中含量显著高于整次曲，因此亦可作为候选真菌标志物。
晾霉I阶段：黄曲霉(Aspergillus_flavus)和葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)在优曲中的含量显著高于次曲，鲁氏少根根霉(Rhizopus_arrhizus)、匍枝根霉(Rhizopus_stolonifer)、伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia_burtonii)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、青霉属(Penicillium_sp)均是在次曲中丰度高于优曲。上述真菌可以作为真菌标志物，在后续快检方法开发中进一步分析其序列，设计引物，建立定量快检方法。
此外，地丝双足囊菌(Dipodascus_geotrichum)、东方伊萨酵母(Issatchenkia_orientalis)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces_anomalus)、双足囊菌属(Dipodascaceae_sp)、绿木霉(Trichoderma_virens)、奥默柯达酵母(Kodamaea_ohmeri)、毛霉属(Mucor_sp)在优次曲中的含量也存在显著差异，但是取样方式不同，在优次曲样本中的含量不尽相同。上述真菌可以作为备选的真菌标志物。
晾霉II阶段：扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis_fibuligera)、东方伊萨酵母(Issatchenkia_orientalis)、匍枝根霉(Rhizopus_stolonifer)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、毛孢子菌(Apiotrichum_domesticum)、Cutaneotrichosporon_jirovecii(一种酵母)在优次曲中差异显著。其中，扣囊复膜酵母、匍枝根霉(Rhizopus_stolonifer)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)在此阶段的优曲中含量富集程度很高，这三种真菌可作为重点关注对象，在后续快检方法开发中进一步分析其序列，设计引物，建立定量快检方法。
潮火阶段：扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis_fibuligera)、东方伊萨酵母(Issatchenkia_orientalis)、黄曲霉(Aspergillus_flavus)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、横梗霉属(Lichtheimia_sp)、小麦曲霉(Aspergillus_tritici)在优次曲中差异显著，可以作为候选标志物。其中，扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis_fibuligera)在优曲中含量富集程度依然很高可以作为候选真菌。在此阶段葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)反而在次曲中丰度显著高于优曲，虽然该真菌亦可作为候选标志物，但是晾霉II阶段富集趋势截然相反，因此以可靠性还有待检验；黄曲霉(Aspergillus_flavus)在整优曲样本中丰度显著高于次曲，可以作为整曲取样样本的检测标志物，在后续快检方法开发中进一步分析其序列，设计引物，建立定量快检方法。
大火阶段：黄曲霉(Aspergillus_flavus)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces_anomalus)横梗霉属(Lichtheimia_sp)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)、散囊菌属(Eurotium_sp，也是茶叶中的发酵有益菌)在优次曲中差异显著，可作为此阶段的真菌标志物，在后续快检方法开发中进一步分析其序列，设计引物，建立定量快检方法。
后火阶段：嗜热子囊菌(Thermoascus_aurantiacus)、无根根霉(Rhizopus_arrhizus)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces_anomalus)微小根毛霉(Rhizomucor_pusillus)、横梗霉属(Lichtheimia_sp)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)在优次曲中差异显著，可作为此阶段的真菌标志物。
葡萄牙棒孢酵母(Clavispora_lusitaniae)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces_anomalus)微小根毛霉(Rhizomucor_pusillus)、横梗霉属(Lichtheimia_sp)、丝孢酵母(Trichosporon_coremiiforme)在优次曲中的丰度差异较大，可作为优先候选标志物。
实施例2后火曲发酵过程中微生物标志物快检技术的开发
1、微生物标志物RT-qPCR引物的设计
本实施例结合不同样本中真菌含量差异主要针对12种微生物标志物共设计13对引物进行质粒标准品构建和qPCR检测，12种微生物标志物分别为：橙黄色嗜热子囊菌(2对后期择优选用一对)、扣囊复膜酵母菌、无根霉菌、黄曲霉菌、阿氏丝孢酵母菌、葡萄牙棒孢酵母菌、微小根毛霉菌、植物乳杆菌、横梗霉菌、匍枝根霉菌、东方伊萨酵母菌。质粒标准品构建和qPCR检测具体引物序列和扩增子序列如表1和表2所示。
表1
引物名称 微生物 引物(5’-3’)
P1 总细菌 CCTACGGGAGGCAGCAG(SEQ ID NO:7)
P2 总细菌 ATTACCGCGGCTGCTGG(SEQ ID NO:8)
TLac1 乳酸菌 ACCTGATGGCAACTAAAGATAGGG(SEQ ID NO:9)
TLac2 乳酸菌 AGAACACCAGTGGCGAAGG(SEQ ID NO:10)
B1 芽孢杆菌 TTGACATCCTCTGACAACCCT(SEQ ID NO:11)
B2 芽孢杆菌 GAATGCTGGCAACTAAGATCA(SEQ ID NO:12)
Y1 总真菌 GCGGTAATTCCAGCTCCAATAG(SEQ ID NO:13)
Y2 总真菌 GCCACAAGGACTCAAGGTTAG(SEQ ID NO:14)
Sac1 酵母 GGTGGTGGTGCATGGC(SEQ ID NO:15)
Sac2 酵母 TGTACAAAGGGCAGGGACG(SEQ ID NO:16)
Act1 放线菌 CGCGGCCTATCAGCTTGTTG(SEQ ID NO:17)
Act2 放线菌 ATTACCGCGGCTGCTGG(SEQ ID NO:18)
M1 霉菌 TTGTGCGCTATCGGTCTCTGGCC(SEQ ID NO:19)
M2 霉菌 TGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAA(SEQ ID NO:20)
表2
2、qPCR反应体系
Real-Time qPCR采用了Bio-Rad Ssofast Eva Green Mix预混液，均采用了20μL的反应体系，具体如下：1)对于黄曲霉RT-qPCR，采用的体系如下：
2)对于扣囊复膜酵母、横梗霉RT-qPCR，采用的体系如下：
3、qPCR反应程序：
(1)横梗霉qPCR，采用如下程序：
绘制熔解曲线，从60℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。
(2)黄曲霉qPCR，采用如下程序：
绘制熔解曲线，从62℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。
(3)扣囊复膜酵母qPCR，采用如下程序：
绘制熔解曲线，从60℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。
4、大曲样本基因组DNA提取及质量评估
使用OMEGASoilDNAKit(土壤DNA提取试剂盒)，参照产品操作说明书提取样本DNA。提取的DNA保存在-20℃，后续用于定量qPCR和扩增子测序。用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA的浓度与纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量。
5、微生物标志物RT-qPCR引物验证
对采集到的后火曲不同发酵阶段样本进行混合后，提取混合样本的基因组DNA，并以提取后的DNA为模板对12种菌种所设计的13对引物进行验证。结果如图8所示，12种微生物标志物引物经PCR验证，扩增条带特异并且大小正确，引物能够用于下一步RT-qPCR的分析。
6、微生物标志物标准品的验证
标准品制备结果如图9，12种微生物标志物RT-qPCR标准品的验证，扩增条带均特异并且大小正确，标准品能够用于下一步RT-qPCR的分析。
5、建立快检方法
RT-qPCR方法的建立：以含有目的片段的单拷贝微生物标志物质粒作为标准品，梯度稀释的标准品可建立定量标准曲线，以此计算大曲中微生物标志物的拷贝数范围。
建立定量标准曲线具体实验流程如下：
1、标准品质粒的制备：
1)目标片段的扩增，上面给出了不同微生物目标片段的引物，进行PCR；
2)胶回收；
3)构建T载体：
使用质粒为：19-T(Takara Bio，Dalian)质粒载体
连接体系：
连接条件：16℃连接30min。
4)连T产物转化大肠杆菌感受态细胞
5)质粒提取(天根试剂盒)
为了检测样品中目标微生物总数，荧光信号检测的线性范围为103～1012copies/μL。以上述构建好的质粒作为标准品，梯度稀释，共设置10个梯度，标准品的定量采用紫外分光光度计法，具体计算公式如下：
其中：C标表示DNA模板浓度(copies/μL)；
A为0.05，表示换算系数，即1OD260nm＝0.05μg/(μL双链DNA)；
N为稀释倍数；
6.02×1023为阿佛加德罗常数；
碱基对数需加上T载体骨架的碱基对数；
在做qPCR的时候标准品和待测样品一起上机检测，以标准品为模板，反应体系及条件上文已给出，每个样品进行3次重复。待反应完成时，以阈值循环数Ct(即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)作为横坐标，标准品浓度作为纵坐标绘制标准曲线。在定量PCR的最后一步需绘制熔解曲线，考察引物对目标序列扩增的特异性。
实施例3基于微生物标志物后火曲发酵过程控制的评价标准
1、扣囊复膜酵母可作为晾霉Ⅱ和后火阶段指示发酵是否正常的微生物标志物
如图10所示，图10中a表示的标准曲线结果显示，本实施例中标准曲线方程相关系数R2为0.9455，拟合度较好，符合定量要求。扣囊复膜酵母在不同感官后火曲发酵过程中的变化如图10中b所示，感官优的大曲中从上霉阶段开始，扣囊复膜酵母的生物量快速上升，在晾霉Ⅱ阶段达到4×108copies/g大曲，而感官较差的曲中扣囊复膜酵母的生物量从上霉阶段到晾霉Ⅰ阶段逐渐上升，之后逐渐下降，在晾霉Ⅱ阶段达到5×107copies/g大曲，此阶段优曲中扣囊复膜酵母的生物量是次曲的8倍；潮火阶段优曲和次曲中扣囊复膜酵母的生物量比较接近，优曲中其生物量在大火阶段下降到较低的水平，在后火阶段上升到5×108copies/g大曲，而次曲中其生物量在潮火阶段到大火阶段并没有显著变化变化，在后火阶段下降到5×107copies/g大曲以下。综上所述，扣囊复膜酵母可作为晾霉Ⅱ和后火阶段指示发酵是否正常的微生物标志物。晾霉II和大火阶段优曲中扣囊复膜酵母的阈值均可定为4×108copies/g大曲以上，次曲在1×108copies/g大曲以下；晾霉II阶段结果和扩增子测序结果一致。
2、横梗霉作为大火阶段指示发酵是否正常的微生物标志物
如图11所示，图11中a表示的标准曲线结果显示，本实施例标准曲线方程相关系数R2为0.9596，拟合度符合定量要求。横梗霉在不同感官后火曲发酵过程中的变化如图11中c所示，横梗霉在上霉阶段感官优和感官较差的曲中生物量相差不大；横梗霉在次曲中的生物量从上霉到晾霉Ⅱ先上升再下降，从晾霉Ⅱ阶段到大火阶段呈快速的上升趋势，在大火阶段达到最大值4.49×1011copies/g大曲，之后又快速的下降，直到后火阶段结束。而在优曲中横梗霉含量从晾霉Ⅰ到晾霉Ⅱ快速上升，之后呈下降趋势，潮火阶段与大火阶段横梗霉在优曲中的生物量并无明显的变化，到后火阶段又有明显的上升。根据之前扩增子测序结果，横梗霉可作为作为大火和后火阶段微生物标志物；根据qPCR结果，横梗霉在后火阶段优次曲中的含量与扩增子结果相反；在大火阶段与扩增子测序结果相一致，可以作为大火阶段指示发酵是否正常的微生物标志物，在优曲中其生物量阈值在1×1011copies/g大曲以下；次曲中生物量阈值在4×1011copies/g大曲以上；两者横梗霉生物量相差在5倍以上。
3、黄曲霉可作为晾霉阶段指示发酵是否正常的微生物标志物
如图12所示，图12中a标准曲线结果显示，本实施例的标准曲线方程相关系数R2为0.9912，拟合度符合定量要求。图12中b表示的熔解曲线结果显示产物特异。黄曲霉在不同感官后火曲发酵过程中的变化如图12中的c所示，从上霉阶段到晾霉I阶段，感官差的曲中黄曲霉生物量急剧下降，晾霉I阶段中次曲中的黄曲霉生物量降至6.28×106copies/g大曲，优曲中黄曲霉生物量上升至1.19×107copies/g大曲，优曲中黄曲霉生物量是次曲中的1.9倍。从晾霉I阶段至后火阶段，优曲中黄曲霉生物量趋于总体下降的趋势，在后火阶段中黄曲霉生物量降至最低点，为7.0×106copies/g大曲；次曲中，晾霉I至晾霉II阶段黄曲霉含量升高，后火阶段，之后呈下降趋势，直至大火阶段，黄曲霉生物量降最低点；后火阶段，次曲的黄曲霉生物量升至8.43×106copies/g大曲，比晾霉I阶段次曲中黄曲霉生物量高1.2倍。
综上所述，黄曲霉可作为晾霉阶段中指示发酵是否正常的微生物标志物，在优曲中其生物阈值为1.0×107copies/g大曲以上，在次曲中其生物阈值为8×106copies/g大曲以下；两者黄曲霉生物量差近乎2倍。总体趋势与扩增子结果相似。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.核酸组合物，其特征在于，包括目标微生物的核酸扩增引物，所述目标微生物包括扣囊复膜酵母、横梗霉和黄曲霉中的至少一种；
其中，所述扣囊复膜酵母的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对；
所述横梗霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对；
所述黄曲霉的核酸扩增引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列的引物对。
2.分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸包括权利要求1所述的核酸组合物的扩增片段；
可选地，所述分离的核酸为质粒。
3.权利要求1所述的核酸组合物和/或权利要求2所述的分离的核酸在制备目标微生物检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于执行以下方法中的任意一种：
实时荧光定量PCR和数字PCR。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中的组分满足以下特征(1)和(2)中的至少一个：
(1)所述试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR反应试剂中的至少一种；
(2)所述分离的核酸的工作浓度为103copies/μL～1012copies/μL。
6.根据权利要求3～5任一项所述的应用制备的试剂盒。
7.权利要求1所述的核酸组合物、权利要求2所述的分离的核酸、或者权利要求6所述的试剂盒在检测大曲质量或制备大曲中的应用。
8.一种检测大曲质量的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求1所述的核酸组合物、权利要求2所述的分离的核酸、或者权利要求6所述的试剂盒检测待测大曲样本中的所述目标微生物，所述待测大曲样本为制曲阶段的大曲样本；
根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量；
其中，所述制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段中的至少一种；
可选地，所述晾霉阶段包括晾霉I阶段和晾霉Ⅱ阶段中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据目标微生物的核酸含量确定待测大曲样本的大曲质量具体包括：
若待测大曲样本为晾霉Ⅱ阶段或后火阶段的大曲样本；
当扣囊复膜酵母的核酸含量大于4×108copies/g时，确定所述待测大曲样本为优曲；
当扣囊复膜酵母的核酸含量小于1×108copies/g时，确定所述待测大曲样本为次曲；
及/或
若待测大曲样本为大火阶段的大曲样本；
当横梗霉的核酸含量小于1×1011copies/g时，确定所述待测大曲样本为优曲；
当横梗霉的核酸含量大于4×1011copies/g时，确定所述待测大曲样本为次曲；
及/或
若待测大曲样本为晾霉I阶段的大曲样本；
当黄曲霉的核酸含量大于1×107copies/g时，确定所述待测大曲样本为优曲；
当黄曲霉的核酸含量小于8×106copies/g时，确定所述待测大曲样本为次曲；
可选地，所述大曲为清香型大曲。
10.一种大曲的制备方法，其特征在于，在制曲阶段，采用权利要求8或9所述的方法检测大曲的质量；
其中，所述制曲阶段包括大火阶段、晾霉阶段和后火阶段中的至少一种；
可选地，所述大曲为清香型白酒大曲；
可选地，所述晾霉阶段包括晾霉I阶段和晾霉Ⅱ阶段中的至少一种。
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