CN105647911B

CN105647911B - 一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组dna的方法

Info

Publication number: CN105647911B
Application number: CN201610215547.2A
Authority: CN
Inventors: 杨巧丽; 滚双宝; 马艳萍
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2036-04-08
Also published as: CN105647911A

Abstract

本发明公开了一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法包括：1）组织破碎和DNA保护；2）组织裂解液消化；3）Tris‑饱和酚抽提；4）Tris‑饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提；5）氯仿异戊醇抽提；6）NaAc和充分预冷（‑20℃）的无水乙醇沉淀DNA；7）乙醇漂洗；8）TE缓冲液溶解DNA、保存。本发明显著提高了DNA的得率（DNA浓度112~851 ng/μL），同时节省了DNA提取时在破碎细胞后加蛋白酶K进行消化过夜（≥12h）的时间，从组织破碎到基因组DNA提取完成总耗时约3h。

Description

一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

基因组DNA提取是开展分子生物学研究的一项重要技术环节，并被广泛地应用于种质资源评价及育种研究，为便于查找动物的血缘关系和管理记录，在动物出生后往往采用剪耳缺法对每个个体进行编号，此时采集耳缺组织可满足大样本量的研究且不伤害的动物健康。目前从哺乳动物组织中提取基因组DNA的方法通常采用传统的酚-氯仿抽提法和试剂盒法，前者在组织破碎后直接进行蛋白酶K消化处理，耗时长（≥12h），细胞破碎不充分；后者价格昂贵，且由于耳组织含有少量被毛，难消化，DNA提取浓度低，因此均不适用于大样本量研究的提取。面对大量的研究个体和样本，快速、高效的耳组织基因组DNA提取方法将有利于提高研究效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有基因组DNA提取方法存在的DNA提取浓度低或耗时长等缺陷，提供一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法。

本发明采用以下技术方案：

一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，该方法的具体步骤如下：

1）组织破碎：取组织样于灭菌离心管中，剪碎；快速加入预冷的TE裂解液，尽可能使细胞充分破碎制成溶浆并对溶浆中DNA进行保护；

2）组织裂解液消化；

3）Tris饱和酚抽提；

4）Tris饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提；

5）氯仿异戊醇抽提；

6）醋酸钠和 -20℃ 预冷的无水乙醇沉淀DNA；

7）乙醇漂洗；

8）TE 缓冲液溶解DNA、保存。

步骤1）中所述TE裂解液的组成为：pH8.0的10mM Tris-HCl 和pH8.0的2mM EDTA。

本发明的优点在于：在组织剪碎后快速加入预冷的TE裂解液，通过其成分中稍高的EDTA组分浓度抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，显著提高了DNA的得率（DNA浓度112~851 ng/μL，TE 成分中1mM EDTA组份浓度时提取的DNA浓度40~160 ng/μL），并结合预冷的缓冲体系保护了DNA的完整性；Tris-饱和酚反复抽提有效去除蛋白质，节省了在消化过程中加蛋白酶K消化蛋白质的时间（≥12h），本发明提取DNA过程耗时约3h。

附图说明

图1为本发明提取的哺乳动物耳组织基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测图；

图2为现有技术的TE缓冲液成分中1mM EDTA (pH8.0)组份浓度时提取的哺乳动物耳组织基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳检测图；

电泳条件：1 μL DNA提取样品与1.0 μL 6 × Buffer上样缓冲液混匀，加样于1.0%的琼脂糖凝胶，100 V电压，电泳30 min。

图1中的基因组DNA条带清晰明亮，没有降解，即该方法提取的DNA完整性好、质量高。图2中的基因组DNA明显不如图1的清晰明亮，有轻微的拖带现象，说明有DNA降解。

具体实施方式

下面对本发明及其效果作进一步说明。

1）组织样在灭菌离心管中剪碎后快速加入预冷的TE，使细胞充分破碎并对溶浆中DNA进行保护；

2）组织裂解液消化省去了加蛋白酶K消化过夜的操作；

3）Tris-饱和酚抽提；

4）Tris-饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提；

5）氯仿异戊醇抽提；

6）醋酸钠（NaAc）和-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA；

7）乙醇漂洗；

8）TE溶解DNA、保存。

具体实施方式如下：

1）TE裂解液配制 (pH 8.0)：1M Tris-HCl (pH8.0) 5 mL，0.5M EDTA (pH8.0) 2mL，加ddH₂O 定容至500 mL，高压灭菌。

2）组织裂解液配制：1M Tris. HCl (pH 8.0)25 mL，0.5M EDTA 100 mL，2M NaCl25 mL，10% SDS 50 mL，加ddH₂O定容至500 mL，高压灭菌。

3）取约30 mg仔猪耳组织样，装入1.5 mL灭菌离心管，用手术剪刀剪碎（剪完每一样品所用的镊子和手术剪刀都要用酒精棉球擦洗，以除去残留的组织样；并等待至酒精完全挥发）；

4）加入300 μL充分预冷至-20℃的TE裂解液，反复颠倒离心管5 min，3000 rmp离心5 min、弃上清液；

5）加入600 μL 组织裂解液，缓慢颠倒混匀10 min；

6）加入600 μL Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rpm离心10 min，吸取上层清液；

7）重复步骤6）操作；

8）加入300 μL Tris 饱和酚和300 μL 氯仿/异戊醇（24：1体积比），缓慢颠倒混匀10 min，12000 rmp 离心10 min，吸取上清夜；

9）加入600 μL氯仿/异戊醇（24：1），混匀10 min，12000 rpm离心10 min，吸取上清夜；

10）加入 60 μL 3 M NaAc 和在-20 ℃充分预冷的无水冰乙醇 1 mL，轻微摇晃至出现乳白色丝状 DNA 沉淀，冰浴 15 min，12000 rmp 离心10 min，弃上清液；

11）加入1 mL 75% 乙醇漂洗，12000 rpm 离心2 min，弃上清液；

12）小心倒掉乙醇，将离心管倒扣与滤纸上，置于无菌操作台，至乙醇挥发完全；

13）加入200 μL TE 缓冲液，4 ℃ 放置24 h使DNA完全溶解，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后 -20 ℃保存。

步骤1）中所述TE裂解液的组成为10mM Tris-HCl (pH8.0)和2mM 乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)。Tris的作用是缓冲体系的pH，而EDTA可以螯合Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，为了保证裂解体系的pH并抑制核酸酶，该TE裂解液在EDTA组份浓度上稍高于溶解DNA的TE缓冲液浓度，该对比效果见表1、2。

表1为本发明提取的哺乳动物耳组织基因组DNA浓度和纯度经ND-1000 型紫外分光光度仪检测结果；

表1

表2为现有技术的TE缓冲液成分中1mM EDTA (pH8.0)组份浓度时提取的哺乳动物耳组织基因组DNA浓度和纯度经ND-1000 型紫外分光光度仪检测结果；

表2

基因组DNA的质量浓度以及在波长260 nm和280 nm处吸收值的比值（OD_260/280）分别反应基因组DNA的浓度和纯度。质量较好的DNA其OD_260/2800值在1.7～1.9之间，比值大于1.9表示DNA溶液中有RNA存在，由于RNA易降解，对动物遗传资源评价及育种的研究不会产生影响。表1中提取出的基因组DNA质量浓度明显高于表2的方法中提取的基因组DNA浓度，说明本发明方法提取的基因组DNA得率高。

步骤1）中所述TE裂解液应在-20℃预冷至少30 min，对溶浆中DNA实施低温保护。

步骤1）中所述TE裂解液体积为300 μL，以确保彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸浓度适中。由于核酸浓度低导致沉淀效率低，影响DNA得率；浓度过高，会使去除杂质的过程复杂且不彻底，导致DNA纯度下降。

步骤2）中所述的组织裂解液组成为1M Tris-HCl (pH8.0) 25 mL、0.5M EDTA 100mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、ddH₂O 300 mL。

步骤3）中所述的Tris-饱和酚抽提操作进行了2次。酚是很强的蛋白质变性剂，Tris-饱和酚反复抽提，能使变性的蛋白质溶解在其中，达到有效去除蛋白质的目的，节省了消化过程中加蛋白酶K消化蛋白质的时间（≥12h）。

步骤7）中所述乙醇浓度为75%，以很好的洗去加入的盐，避免了乙醇浓度太高达不到脱盐效果和浓度太低使DNA溶解对提取效果的影响。

Claims

1.一种快速高效提取哺乳动物耳组织基因组DNA的方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：

1）组织破碎：取30 mg仔猪耳组织样于灭菌离心管中，剪碎；快速加入300 μL充分预冷至-20℃的TE裂解液，反复颠倒灭菌离心管5 min，3000 rmp离心5 min、弃上清液；尽可能使细胞充分破碎制成溶浆并对溶浆中DNA进行保护；所述TE裂解液的组成为：pH8.0的10mMTris-HCl 和pH8.0的2mM EDTA；

2）组织裂解液消化；该组织裂解液配置为：pH8.0的1M Tris-HCl 25 mL、0.5M EDTA100 mL、2M NaCl 25 mL、10% SDS 50 mL、加ddH₂O定容至 500 mL，高压灭菌；将该600 μL组织裂解液加入所述灭菌离心管中，缓慢颠倒混匀10 min；

3）Tris饱和酚抽提：加入600 μL Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rpm离心10min，吸取上层清液；

4）重复步骤3）操作；

5）Tris饱和酚和氯仿异戊醇混合抽提：加入300 μL Tris饱和酚和300 μL体积比为24：1氯仿/异戊醇，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rmp离心10 min，吸取上清液；

6）氯仿异戊醇抽提：加入600 μL体积比为24：1的氯仿/异戊醇，混匀10 min，12000 rpm离心10 min，吸取上清液；

7）醋酸钠和 -20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA：加入 60 μL 3 M NaAc 和在-20 ℃充分预冷的无水冰乙醇 1 mL，轻微摇晃至出现乳白色丝状 DNA 沉淀，冰浴 15 min，12000 rmp离心10 min，弃上清液；

8）乙醇漂洗：加入1 mL 75% 乙醇漂洗，12000 rpm 离心2 min，弃上清液；

9）小心倒掉乙醇，将灭菌离心管倒扣于滤纸上，置于无菌操作台，至乙醇挥发完全；

10）TE 缓冲液溶解DNA、保存：加入200 μL TE 缓冲液，4 ℃放置24 h使DNA完全溶解，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后 -20 ℃保存。