CN101020925A - 植物单花粉高通量收集与pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，包括步骤为：显微镜分离花粉以及花粉破囊壁和染色；分装碱性裂解液于PCR板中，密封并离心使裂解液沉于管底；显微镜下用特殊镊子挑选着色单花粉粒并放入PCR管裂解液中；分装矿物油于PCR板中，短暂离心；置于PCR仪上90－98℃温度下裂解；在各管中加入TE缓冲液中和，离心，加入PCR反应成分；短暂离心，置于PCR仪上，反应参数为：90－98℃保持3－8分钟，热循环依不同反应而定，循环数为35－40，最后72℃延伸5－10分钟，保持于4℃下；PCR产物用电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。本发明具有效率高等优点，特别适用于生殖遗传统计分析。

Description

植物单花粉高通量收集与PCR检测方法

所属技术领域：

本发明属于一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法。

背景技术：

单花粉PCR已经在几个物种上成功，但由于单个花粉分离和裂解的困难，单花粉PCR仅限于少量(最多达到60粒)花粉粒。这限制了单花粉PCR在植物遗传分析和染色体制图上的应用。

花粉很小(Pinar and Inceoglu 1999；Su and Saunders 2003；Tel-Zur et al.2003；Wen and Nowicke 1999)，自然条件下在花粉囊裂解后只能存活几分钟(Fritz andLukaszewski 1989；Khatun and Flowers 1995；Luna et al.2001)。因此基于花粉活性的研究，取样和遗传分析的效率显得很重要。PCR方法在单细胞和单花粉的遗传变异(Azizand Sauve 2003；Li et al.1990；Matsunaga et al.1999；Parducci et al.2005；Petersenet al.1996；Zhang et al.1992)、基因表达(Shoemaker et al.2005)和基因型(Aziz etal.2005；Li and Yeung 2002)分析中已经成功。然而，在这些研究中只用到少量的单花粉粒，只有一例最多达到60粒(Aziz et al.2005)。花粉是一组具有不同基因型的单倍体的集合，每一个单花粉只获得了其供体整个核基因组的一部分(Copenhaver et al.2000)。从统计的角度看，大量的花粉分析对于遗传研究至关重要。总体而言，花粉粒很小且具有厚的花粉壁(Pinar and Inceoglu 1999；Su and Saunders 2003；Tel-Zur et al.2003；Wen and Nowicke 1999)，得到足够的花粉粒并把其中DNA释放出来而不抑制PCR反应是单花粉PCR方法的两个瓶颈所在。

单细胞，如人类精细胞可以利用流速细胞计数仪(Li et al.1990；Zhang et al. 1992)、显微操纵器(Shoemaker et al.2005)和毛细管(Li and Yeung 2002)进行分离；单个花粉粒有用激光分离仪(Matsunaga et al.1999)、显微操纵器(Aziz and Sauve 2003；Aziz etal.2005；Haliyo and Regnier 2003)和特制的玻璃微管(Parducci et al.2005)进行分离。显微操纵器是当前分离单个花粉的主要仪器，但由于使用的玻璃微管易折断，不能直接将花粉粒放于PCR管中，因此效率很低，受试的花粉粒个数最高没有超过60(Aziz etal.2005)。激光分离仪可以高效分离单个花粉粒，但十分昂贵。成熟花粉粒既厚又硬的壁(Parre and Geitmann 2005；Santos and Mariath 1999)以及其尺寸大小(0.005 to 0.25mm in diameter)非常适宜在显微镜下用精细的镊子直接分离。另一方面，裂解花粉粒释放核酸比动物细胞困难得多。为此曾尝试了多种方法，包括激光束切割(Matsunaga et al.1999)、缓冲液裂解(Matsunaga et al.1999)、预培养发芽(Aziz and Sauve 2003；Azizet al.2005)，或用吸液管压碎(Parducci et al.2005)等。然而多数实验室没能力购置昂贵的激光束切割器，培养基预发芽会引入许多抑制PCR反应的化学物质(Aziz andSauve 2003；Aziz et al.2005)，吸液管压碎法仅适用于压碎大的花粉粒化石。一些研究显示花粉壁可以被某些化学试剂溶解(Loewus et al.1985；Southworth 1974)。最近，Xin等(2003)报道了一种不影响PCR反应、适用于抽提多种植物DNA的快速方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，该方法能应用于大批量单花粉收集并进行单花粉PCR的能力，为植物遗传分析和染色体制图提供了一种新的方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，依序包括如下步骤：

1)显微镜分离完整、干净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色，将染色液小心排净；留下的花粉粒清洗，最后让花粉粒完全干燥；

2)用取液器分装适宜μL裂解液于适宜个数孔的PCR板中，密封并离心使裂解液沉于管底；

3)在显微镜下用镊子挑选着色的单花粉粒并把着色的单花粉粒放入PCR管底的裂解液中；

4)分装适宜μl矿物油于适宜个数孔的PCR板中，短暂离心；

5)把步骤4)的适宜个数孔的PCR板于PCR仪上在90-98℃温度下保持16分-18分30秒；

6)在步骤5)的每一管中加入适宜μl的TE缓冲液，离心，然后加入PCR反应成分混合液(一般含1×PCR反应缓冲液，适宜量dATP、dTTP、dGTP和dCTP，MgCl₂，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶，H₂O)，调整终体积为20μl；

7)短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为：90-98℃保持3-8分钟进行预变性，热循环参数根据计划进行的相应PCR程序设定，本发明的循环数设定为35-40，最后72℃延伸5-10分钟，获得PCR产物，保持于4℃温度下；

8)步骤7)的PCR产物用电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。

步骤1)所述的显微镜分离完整、干净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色的步骤是在显微镜下用镊子分离一个个完整、干净的未开裂花粉囊放入载玻片上，滴染色液并挑破囊壁使花粉逸出，将载玻片放入带盖的培养皿中于温度为23-30℃下培养20-40分钟，后取出载玻片用镊子将染色液小心排净；留下的花粉粒用灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整视野内密度；最后让花粉粒完全干燥。

上述将载玻片放入带盖的培养皿中在本发明是在优选温度为28℃下培养20-40分钟。

步骤1)所用的染色液是由0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖配成。

步骤2)所述的裂解液的制备方法为：：吸取适量灭菌双蒸水，以及适量的1M NaOH或者1M KOH和适量的20％Tween-20，置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液，所述的裂解液体积可依反应个数多少增减，但裂解液中NaOH或者KOH的终浓度为0.1M，Tween-20终浓度为2％；本发明的裂解液的具体制备方法为：吸取1600μl灭菌双蒸水，200μl 1M NaOH或者1M KOH和200μl 20％Tween-20，置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液。

所述的步骤2)中的取液器为12道取液器，采用12道取液器分装1μl裂解液于96孔PCR板中，用锡箔胶带密封并离心使裂解液沉于管底；所述的步骤4)的96孔PCR板中是分装有5μl矿物油；所述的步骤6)的在每一管中是加入1μl TE缓冲液。

步骤1)所用的镊子的尖端直径小于等于0.01mm，分离花粉是在63倍的显微镜下完成的。

步骤4)所述的短暂离心是自指在离心力为1479g下离心1分钟。

本发明步骤中所述的PCR板是放在PCR仪中且PCR仪中的优选温度控制为95℃，PCR板一般选用96孔PCR板，步骤5)的PCR板于PCR仪上在95℃温度下保持时间优选为17分30秒；步骤7)短暂离心，置于PCR仪上，在优选温度为95℃保持时间3-8分钟进行预变性。

步骤6)所加入的PCR反应成分混合液一般由1×PCR反应缓冲液，适宜量dATP、dTTP、dGTP和dCTP，MgCl2，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶和H₂O组成，具体优选含量可用实施例所述的含量。

步骤7)获得的PCR产物用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖进行电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。

本发明具有的特点为：本方法应用一种特殊的镊子在显微镜下分离单个花粉，在碱和表面活性剂溶液中裂解后用TE缓冲溶液中和。裂解混合液直接作为模板在5S核糖体内转录间隔区(5S rDNA-ITS)、随机扩增多态性DNA(RAPD)和微卫星PCR(SSR-PCR)方法中工作，并对不用预扩增的PCR反应参数进行了优化。应用这种方法，一个经过培训的人每天可以进行288个单花粉PCR反应。该方法以甘蔗单花粉为材料建立，在其它五种可以采集到花粉的植物即玉米、斑茅、青豆、高粱和番茄上验证，效果良好，该发明方法也可以用于其它花粉的采集及PCR检测。该方法大批量收集并进行单花粉PCR的能力为植物遗传分析和染色体制图提供了一种新的方法，并使得遗传分析条件更可控、费用大幅度降低。该方法对于应用经典遗传分析方法困难的物种具有特殊的意义。

本发明具有的优点为：

1)效率高：到目前为止，由于显微操纵器本身烦琐的操作过程限制，单个试验受试的花粉粒个数最多没有超过60，分离单花粉粒效率很低；而应用本发明的方法，一个经过培训的人每天可以进行288个单花粉的分离和PCR反应。而且，制一板花粉粒载玻片可供多次直接取样使用，省去其它方法花粉发芽培养和保存等步骤；再者，花粉裂解液可直接作为PCR反应模板使用，不用沉淀分离DNA，进一步提高了效率。

2)通用性强：本发明方法可应用于多种植物的单花粉PCR分析，包括花粉直径很小的番茄；可应用于多种PCR反应程序，如特异引物PCR、随机引物PCR和微卫星PCR分析。

3)成本低，且简便易行：不需要昂贵的仪器，所需试剂也皆为常规试剂，样品制备简单，不需要复杂DNA抽提和预扩增；操作过程简便易行，没有复杂和要求苛刻的分子生物学实验操作步骤。

4)稳定性强：根据花粉活性染色鉴定方法保证入选花粉粒均含有DNA模板；花粉粒分离收集手段可靠；花粉粒裂解释放DNA效果比发芽等其它方法更好。

5)实用性和可操作性强：按照本发明方法，一般的实验室都具备开展相关研究的条件；一个经过培训的普通人员均可进行试验操作，从而将研究人员从复杂的分子生物学实验操作中解脱出来，专心于数据分析。

6)特别适用于生殖遗传统计分析：分子生物学已经步入后基因组时代，由单个基因克隆进入到多个基因的协同作用研究。而本方法可以高通量收集植物由二倍体经减数分裂产生的单倍体花粉所获得的亲本基因组遗传信息，通过分析可以获得植物最重要的发育阶段—生殖遗传规律，为评价亲本优劣和提高育种效率提供指导。

附图说明：

图1为本发明的花粉粒和镊子尖端直径尺寸比较图。

图中：(A)甘蔗；(B)玉米；(C)青豆；(D)五节芒；(E)高粱；(F)番茄。测量尺：采用OLYMPUS Objective Micrometer OB M 1/100(图中一格代表0.01mm)。

图2为本发明的甘蔗单花粉粒PI/PII PCR反应产物的电泳检查图。

泳道定义：La：DNA标准分子量(Catalog #BN2050)；图中：泳道1-36，优化条件下四个甘蔗品种单花粉PCR反应产物比较；泳道37-48，染色(39至43)与未染色(44至48)单花粉粒PCR反应产物比较。泳道1、10、19、28、37，负对照(H₂O)；泳道2、11、20、29、38，正对照(依次为甘蔗品种L03-378、HoCP03-718、HoCP02-618、TCP99-4474、L03-378的总DNA)；泳道3至9，39至48，L03-378单花粉粒；12至18，HoCP03-718单花粉粒；21至27，HoCP02-618单花粉粒；30至36，TCP99-4474单花粉粒。

图3为本发明的五个物种单花粉粒PI/PII PCR反应产物的电泳检查图。

泳道定义：La：DNA标准分子量(Catalog #BN2050)；图中：泳道1、3、7、11、15、19，负对照(H₂O)；泳道2，正对照(L03-378总DNA)；泳道4至6，玉米；泳道8至10，高粱；泳道12至14，五节芒；泳道16至18，青豆；泳道20至22，番茄。

图4为本发明的高通量单花粉PCR方法在RAPD和SSR PCR反应程序中的应用图(以HoCP02-618的单花粉粒为样本)。

泳道定义：La：DNA标准分子量(Catalog #BN2050)；图中：泳道1至16，应用两条不同RAPD引物的PCR反应；泳道17至32，应用两种不同裂解液的RAPD-PCR反应；泳道33至44，应用两对不同SSR引物的PCR反应；泳道1、9、17、25、33、39，负对照(H₂O)；泳道2、10、18、26、34、40，正对照(HoCP02-618总DNA)；泳道1至8和17至32，引物为OPBE-04的RAPD-PCR；泳道9至16，引物为OPA-17的RAPD-PCR；泳道17至24，含KOH的裂解液；泳道1至16和25至44，含NaOH的裂解液；泳道33至38，引物为SMC336BS的SSR PCR；泳道39至44，引物为SMC1604SA的SSR PCR。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明：

本发明的具体实施方式如下：

(一)材料与方法

1)仪器和试剂

本研究使用的仪器包括一台Narishige公司生产的显微操纵器(Model MN-153)(EastMeadow，NY，USA)、用布朗微管拉制器(Sutter Instrument Company，Novato，CA，USA)制作的玻璃微管、Zeiss显微镜(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.，Thornwood，NY，USA)、镊子(DUMONT No.11254-20)(Fine Science Tools USA，Inc.，Foster City，CA，USA)以及0.5-10μl 12道取液器(Thermo Electron Corporation，Milford，MA，USA)。

配制的下列化学溶液所用试剂购自Sigma-Aldrich公司(Kansas，MO，USA)：1MNaOH；1M KOH；20％Tween-20(吐温-20)；TE缓冲液(0.1M Tris-HCl，2mM EDTA)；1％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)；10％(W/V)PVP-40(聚乙烯吡烙烷酮40)；染色液(0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝，30mM蔗糖)；30mM蔗糖溶液。系列裂解液(0.025M，0.05M，0.1M，0.15M，0.20M NaOH或0.025M，0.05M，0.1M，0.15M，0.20M KOH，2％Tween-20(吐温-20)用前现配。此外，矿物油(mineral oil)、10 mM dNTPs(脱氧核糖核苷酸)混合物和琼脂糖也购自Sigma-Aldrich公司。DNA标准分子量购自Bionexus公司(Oakland，CA，USA)；Taq DNA聚合酶，10倍PCR buffer(PCR反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+，另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA))和25mM氯化镁溶液购自Roche诊断试剂公司(Indianapolis，IN，USA)。

2)植物和花粉材料

所用花穗分别采自四个优良的甘蔗品种(即L03-378，HoCP03-718，HoCP02-618和TCP99-4474)、夏威夷超甜玉米10号(Zea mays L.)、M 81-E号高粱(Sorghum bicolor L.)、Derby(德贝)绿豆(Phaseolus vulgaris L.)以及Florida 91号番茄(Lycopersiconesculentum L.)。按照Pan等(2000)的方法从四个甘蔗品种的叶中提取的DNA作为PCR反应的阳性对照。

3)花粉裂解和单花粉PCR

单个花粉粒放置于装有1μl裂解液的单个PCR管或96孔PCR板中，花粉沉淀后加入5μl矿物油。设置两套副对照，一套管加1μl裂解液，不加花粉粒；另一套加1μl水和一个花粉粒。样品短暂离心(1479g 1分钟)后分别在95℃保温15、17.5和20分钟以裂解花粉粒。之后，加入等摩尔量的TE buffer(TE缓冲液，TE缓冲液组成一般为0.1M Tris-HCl，2mM EDTA)中和，短暂离心。

利用五种DNA引物进行PCR反应。引物碱基序列(5’to 3’)如下：5S rDNA-ITS(ribosomal intergenic spacer)引物PI[TGGGAAGTCCT(C/T)GTGTTGCA]and PII[(T/G)T(A/C)G(T/C)GCTGGTATGATCGCA](Cox等1992)；两个RAPD(randomly amplifiedpolymorphic DNA)引物OPBE-04(CCCAAGCGAA)和OPA-17(GACCGCTTGT)；以及两对甘蔗微卫星引物(SSR)SMC336BS(上游ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA和下游CATGCCAACTTCCAAACAGAC)和SMC1604SA(上游AGGGAAAAGGTAGCCTTGG和下游TTCCAACAGACTTGGGTGG)。其中PI/PII PCR反应体积为20μl，含1μl裂解液、单个花粉粒、等摩尔的TE缓冲液、50mM KCl、10mM Tris.HCl(pH8.3)、3.0mM MgCl₂、0.2mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP(四种脱氧核糖核苷酸)、0.25μM引物、0.1％(W/V)BSA(牛血清白蛋白)和1个单位的Taq DNA聚合酶。PI/PII-PCR反应程序为95℃ 5分钟(在优化试验中延长至10分钟、15分钟)，热循环参数为93℃ 55秒、60℃ 10秒、72℃ 40秒，30个循环(在优化试验中延长至40或50个循环)，最后72℃延伸10分钟。RAPD-PCR反应体积为20μl，除dATP、dTTP、dGTP和dCTP浓度为0.25mM、引物为0.5μM外，其它成分同PI/PII-PCR；RAPD-PCR程序为95℃保持5分钟，热循环参数为93℃ 40秒、40℃30秒、72℃ 60秒，40个循环，最后72℃延伸5分钟。SSR-PCR反应体积也为20μl，除MgCl2为2.75mM、dATP、dTTP、dGTP和dCTP浓度为0.25mM、引物为0.21μM外，其它成分同PI/PII-PCR；SSR-PCR反应程序为95℃保持5分钟，热循环参数为94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒，40个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR扩增仪为GeneAmp^ PCR System 9700(Applied Biosystems，Inc.，Foster CityCA，USA).PCR产物用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖进行电泳分离并在GEL Logic200 Imaging System(New Haven，CT，USA)上进行拍照。

(二)结果与讨论

1)载玻片制备与单花粉收集

用75％的酒精擦拭镊子、不锈钢针和载玻片(75×25mm，Clay Adams^TM)，装有裂解液的50ml灭菌烧杯和消毒纸用于分离花粉后清洗和擦拭镊子。在载玻片上滴一滴染色液，在63倍显微镜下用镊子分离一个完好无损、外壁无花粉粒沾染的未开裂花粉囊放入染色液中，挑破囊壁使花粉逸出。将载玻片放入带盖的培养皿中于28℃培养20-40分钟，后取出载玻片用镊子将染色液小心排净。留下的花粉粒用15滴灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整视野内花粉粒密度，最后让花粉粒完全干燥。

使用的显微操纵器是三维可调装置，拉制的玻璃微管在分离单花粉粒并放入PCR管的过程中易折断，应用这种装置，分离困难且速度低。相反，DUMONT No.11254-20型镊子尖端直径达0.01mm，可直接分离直径大于0.01mm的多个物种单花粉粒(图1)。在放大63倍显微镜下，收集者可以清楚看到载玻片上的单个花粉粒，分离迅速而且可靠，通过开合镊子2-3次，花粉粒很容易进入到PCR管底的裂解液中，在取下一个花粉粒前在显微镜下检查镊子尖以确保每一个PCR管中有一个花粉粒。一般情况下，每人每小时平均可以收集60个花粉粒。

用这种镊子分离花粉粒有一个无法比拟的优点，就是可以感知花粉粒的一些物理特性如硬度和饱满程度，而这些特性与花粉活力密切相关，对花粉PCR的成功很重要(见下文)。当花粉粒直径接近或小于镊子尖端直径时，分离速度会降低，如番茄的花粉粒(见图1F)。此外，花粉粒应当完全干燥，否则，尽管镊子尖有一定的柔软度，花粉粒还会变形。

2)裂解液浓度优化

PCR在所有受试的NaOH和KOH裂解液中(0.025M，0.05M，0.1M，0.15M，0.20M)均能工作。然而，在NaOH和KOH浓度为0.1M和0.15M时，PCR条带清楚且无干扰条带，这与Xin等(2003)的研究结果一致。为验证这个结果，取含0.1M NaOH的裂解液对所有四个受试甘蔗品种的单花粉粒进行了测试。经过17分30秒的加热预处理，运行PI/PII-PCR程序，所有受试花粉粒PCR均产生了目的条带(见图2，1至36泳道)。而以1μl水作为裂解液的对照则没有产生任何PCR条带(图片未显示)，含1μl裂解液而无花粉粒的对照也没有产生任何PCR条带(见图2，泳道1，10，19，28，和37；图3，泳道1，3，7，11，15和19)。显然，这种裂解液对于花粉粒裂解具有重要作用，并且裂解不是品种特异性的。含KOH的裂解液则为类似的PCR反应提供了新的选择。

3)单花粉PCR的添加成分及其影响

为避免加热过程中裂解液体积的损失，在每个PCR管中加入1.0μl裂解液和单花粉粒后再加入5.0μl矿物油，对照则不加矿物油。运行PI/PII-PCR程序，反应混合物用电泳分离。结果，加矿物油的PCR反应条带清晰且稳定(见图2，泳道1至36)，无矿物油的PCR反应要么条带模糊，要么没有条带(图片未显示)。有一些物质如NaOH、Tween-20以及从花粉壁中释放的物质会抑制PCR反应。在DNA模板纯度不高时，BSA常作为Taq酶的稳定剂使用(Al-Soud and Rdstrm 2000；Xin et al.2003)。另一种聚合物PVP，根据报道可在粗制的DNA样品中消除复杂化合物对Taq酶的干扰(Xin等2003)。本试验在PCR反应混合物中加入0.1％BSA和1％PVP，但PCR结果与未加这些物质的对照差别不明显。考虑到裂解花粉壁的混合物中含多种化学物质，建议在进行花粉PCR反应时加入BSA。

4)PCR预变性和加热裂解时间以及循环数对PCR反应的影响

在PI/PII-PCR反应程序中对几发不同预变性时间长度进行了测试，结果显示：5分钟在单花粉PCR反应中效果最好，PCR反应条带丰度更高，这对于有多个条带的PCR反应如RAPD-PCR很重要。5分钟预变性时间与Xin等(2003)的PCR程序不同。Taq酶活性随95℃保温时间而下降，Roche公司Taq酶的半衰期只有40分钟(Roche Applied Science2005/2006)。显然，单花粉PCR对95℃保温时间很敏感，因为单花粉PCR扩增需要更多的循环和更长的时间。

单花粉是具有厚壁的单倍体，因此加热裂解的时间长短和PCR循环数对PCR反应具有重要作用。利用PI/PII-PCR程序，最好的PCR反应结果出现于加热裂解时间为17分30秒和PCR循环数为40时(见图2，泳道1至36)。这些泳道都呈现出清晰的条带，尽管它们来自不同甘蔗品种的单花粉粒。以上结果说明这些单花粉粒在加热裂解时间为17分30秒时已经被成功裂解，单花粉粒裂解后释放的DNA模板在40个PCR循环后已被扩增到一个合适水平。加热裂解时间与PCR循环数的其它组合均未产生理想效果。

5)花粉粒活性对PCR反应的影响

一些花粉粒染色后显示蓝色，而其它的则不能染色仍显黄色。既然有活力的花粉能吸收染色液，而无活力的花粉不能(Pline et al.2002)，我们就专门挑选了一些蓝色的花粉粒，这些花粉粒通常是圆形的；相反，黄色的花粉粒看起来象三角形并且在用镊子夹取时容易变成薄片。用PI/PII-PCR程序扩增，蓝色的花粉粒产生了稳定的PCR条带(见图2，泳道1至36)，而黄色的花粉粒则差异很大(见图2，泳道44至48)。以上结果用分子方法清楚地显示有活力的花粉粒包含有DNA，并且花粉活力对于PCR的成功至关重要。为防止花粉发芽，选择了高浓度的苯胺蓝(0.7mM)以达到快速染色的目的。

6)高通量单花粉PCR方法在其它物种和PCR程序中的应用

为了测试这种高通量单花粉PCR方法的通用性，我们应用PI/PII-PCR程序对其它五种可以采集到花粉的植物即玉米、五节芒、青豆、高梁和番茄进行了单花粉PCR扩增，PCR扩增条件同以上所述的甘蔗品种PCR扩增条件。来自所有这些物种的单花粉均被成功地裂解并得到了特异扩增目的条带(见图3)。以甘蔗品种HoCP02-618的单花粉粒为模板，用RAPD-PCR和SSR-PCR程序进行PCR反应，除热循环参数根据计划进行的相应PCR程序设定外，其它扩增条件同以上所述的甘蔗品种PCR扩增条件，效果同样良好(见图4)。RAPD-PCR揭示了来源于该供体的花粉具有广泛的遗传多样性。据研究者所知，这是首次运用RAPD-PCR方法证明来源于同一供体的花粉粒遗传不同的RAPD分子标记，而且某些花粉粒携带有相同的RAPD分子标记(见图4，泳道7和21；泳道13和14)。这也揭示了该方法在测定来源于同一供体花粉粒的不同基因型的组成比例方面的潜力。我们同时也测试了含NaOH和KOH裂解液对RAPD-PCR的影响，结果发现没有差别(见图4，泳道17至32)。

总而言之，我们建立的单花粉高通量PCR检测方法在所有受试的物种包括甘蔗在内都应用良好，这主要应归功于该方法在单花粉分离效率以及花粉的裂解和PCR稳定性方面的独特优点，并且也省去了对含痕量DNA的花粉粒进行预扩增的步骤。能够应用多种分子标记方法对花粉粒基因组的遗传变异进行高通量分析，且费用大幅度降低。如果某一研究需要对同一批花粉粒的遗传变异进行多种分子标记分析，在单花粉PCR前可以应用全基因组复制的方法将花粉粒的痕量DNA扩增至400-500倍(Blanco et al.1989；Esteban et al.1993；Zhang et al.1992)。

(三)高通量单花粉PCR检测方法的归纳

花粉与植物其它器官相比，在尺寸、结构和活力等许多方面都存在显著不同。所以一个高效的花粉PCR方法应该进行多因素优化，包括花粉染色、裂解溶液、PCR反应成分、花粉裂解时间和模板变性时间等。

综上所述，本发明研究建立的高通量PCR检测方法具体可以归纳如下：

1、在显微镜下(63倍)用镊子分离一个完整、干净的未开裂花粉囊放入载玻片上一滴染色液(0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝，30mM蔗糖)中并挑破囊壁使花粉逸出，将载玻片放入带盖的培养皿中于28℃培养20-40分钟，后取出载玻片用镊子将染色液小心排净。留下的花粉粒用15滴灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整视野内密度。最后让花粉粒完全干燥；

2、吸取1600μl灭菌双蒸水，200μl 1M NaOH(或者1M KOH)和200μl Tween-20，置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液，裂解液体积可依反应个数多少增减，但裂解液中NaOH或者KOH的终浓度为0.1M，Tween-20终浓度为2％；

3、用12道取液器分装1μl裂解液于96孔PCR板中，用锡箔胶带密封并离心使裂解液沉于管底；

4、在显微镜(63倍)下用镊子(DUMONT No.11254-20)挑选着色的单花粉粒放入PCR管底的裂解液中，开合镊子2-3次；

5、将镊子放回显微镜下检查是否有单花粉附着，随后将镊子尖部浸入装有干净裂解液的50ml烧杯中摇动清洗，然后再分离另一个单花粉粒；

6、单花粉粒分离完成后，分装5μl矿物油于96孔PCR板中，短暂离心(1479g离心1分钟)；

7、置96孔PCR板于PCR仪上在95℃保持17分30秒；

8、在每一管中加入1μl TE缓冲液，离心，然后加入PCR反应成分混合液，调整终体积为20μl；

9、短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为：95℃保持5分钟进行预变性，热循环参数根据计划进行的相应PCR程序设定，PCR循环数设定为40，最后72℃延伸10分钟，保持于4℃；

10、PCR产物用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖进行电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。

按照该操作程序，一般情况下，每人使用一台PCR仪8小时工作日内可完成三个96孔PCR板即288个单花粉粒的收集并进行PCR扩增反应。

Claims (10)

1、一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，依序包括如下步骤：

1)显微镜分离完整、干净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色，将染色液小心排净；留下的花粉粒清洗，最后让花粉粒完全干燥；

2)用取液器分装适宜μl裂解液于适宜个数孔的PCR板中，密封并离心使裂解液沉于管底；

3)在显微镜下用镊子挑选着色的单花粉粒并把着色的单花粉粒放入PCR管底的裂解液中；

4)分装适宜μl矿物油于适宜个数孔的PCR板中，短暂离心；

5)把步骤4)的适宜个数孔的PCR板于PCR仪上在90-98℃温度下保持16分-18分30秒；

6)在步骤5)的每一管中加入适宜μl的TE缓冲液中和，离心，然后加入PCR反应成分混合液，调整终体积为20μl；

7)短暂离心，置于PCR仪上，PCR反应参数为：90-98℃保持3-8分钟进行预变性，热循环的循环数设定为35-40，最后72℃延伸5-10分钟，获得PCR产物，保持于4℃温度下；

8)步骤7)的PCR产物用电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。

2、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于步骤1)所述的显微镜分离完整、干净的未开裂花粉以及花粉破囊壁和染色的步骤是在显微镜下用镊子分离一个个完整、干净的未开裂花粉囊放入载玻片上，滴染色液并挑破囊壁使花粉逸出，将载玻片放入带盖的培养皿中于温度为23-30℃下培养20-40分钟，后取出载玻片用镊子将染色液小心排净；留下的花粉粒用灭菌蔗糖液重复清洗，同时调整视野内密度；最后让花粉粒完全干燥。

3、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述的染色液由0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖配成。

4、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述的裂解液的制备方法为：吸取适量灭菌双蒸水，以及适量的1M NaOH或者1M KOH和适量的20％吐温-20，置于2.0ml离心管中，涡旋片刻即制成裂解液，所述制成的裂解液中NaOH或者KOH的终浓度为0.1M，吐温-20终浓度为2％。

5、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述镊子的尖端直径小于等于0.01mm，分离花粉是在63倍的显微镜下完成的。

6、根据权利要求1所述的一种植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于步骤4)所述的短暂离心是自指在离心力为1479g下离心1分钟。

7、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述的PCR板是放在PCR仪中且PCR仪中的优选温度控制为95℃，PCR板优选96孔PCR板，步骤5)的PCR板于PCR仪上在95℃温度下保持时间优选为17分30秒；步骤7)短暂离心，置于PCR仪上，在优选温度为95℃保持时间3-8分钟进行预变性。

8、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于PCR产物用含0.5μg/ml溴化乙啶的1.5％琼脂糖进行电泳分离并在成像系统上进行扫描拍照。

9、根据权利要求1所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述的步骤2)中的取液器为12道取液器，采用12道取液器分装1μl裂解液于96孔PCR板中，用锡箔胶带密封并离心使裂解液沉于管底；所述的步骤4)的96孔PCR板中是分装有5μl矿物油；所述的步骤6)的在每一管中是加入1μl TE缓冲液。

10、根据权利要求2所述的植物单花粉高通量收集与PCR检测方法，其特征在于所述的将载玻片放入带盖的培养皿中是在优选温度为28℃下培养20-40分钟。

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