CN102181462A - 一种提高动物转基因效率的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高动物转基因效率的新方法。本发明探索了精子和卵母细胞作为载体的转基因方法，通过方法改进，将外源基因分别导入精子和卵母细胞，并通过受精过程使二者携带的外源基因在胚胎中进一步整合，提高了外源基因导入细胞核的效率，而后得到高效率的表达。本发明在雌雄小鼠进行交配前，分别采用打点注射法转染雌、雄性生殖细胞系，然后挑选出手术后1～5天与35～40天的公鼠，1～7天的雌鼠进行交配，得到转基因小鼠后代。本发明探索了绵羊的转基因，本发明所述方法可以提高大型哺乳动物转基因效率，为畜牧业的育种提供了一种新途径。本发明探索出一种雌雄生殖细胞联合介导的转基因体系。

Description

一种提高动物转基因效率的新方法

技术领域

本发明涉及转基因的方法。具体而言，本发明涉及将精子和卵母细胞作为载体的转基因方法，将外源基因分别导入精子和卵母细胞，并通过受精过程使二者携带的外源基因在胚胎中进一步整合，以提高外源基因导入细胞核的效率。

背景技术

转基因动物是用实验的方法将所需的目的基因导入动物的受精卵内，使其增殖，并能稳定的遗传给后代。目前科学家已成功地获得了转基因鼠、兔、鸡、山羊、猪、绵羊、牛、蛙以及多种转基因鱼。转基因动物是遗传学发展新的里程碑，在基因功能及表达研究、人类疾病模型建立、器官移植材料供应、珍贵医药用蛋白生产以及畜牧业等各方面显示出巨大的优越性和广阔的应用前景[曾溢涛.转基因动物与生物医药产业.生物学通报，1999，34(4)：1-3.王建辰，马保华.转基因技术在畜牧兽医中的发展前景.动物医学进展，2000，21(1)：1-8.]。转基因技术发展近三十年来，人们探索出了多种方法。现在人们对转基因方法的要求日益提高，除了要求效率高，操作简单，更希望导入方法安全可靠，最好能按照人们的意愿导入或改造多个基因。精子载体法在经过倍受争议的10多年后，已经被研究人员证实，这是一种比较简单有效的转基因方法。同时，卵母细胞作为遗传物质最重要的载体，从一开始就得到大家的广泛关注。

精原干细胞具有自增殖能力，可产生不断更新的干细胞及可定向分化的精原细胞，每次分裂形成的两个细胞，一个通过初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞等过程发育为精子；一个仍为精原干细胞，保持原始未分化状态和继续分裂增殖的能力，因此转染精原干细胞后，该动物能比较持续的产生转染精子。由于这一优越性，精原干细胞的转染也倍受关注。Kuznetsov等[KuznetsovA.V.，Kuznetsova I.V.，Schit IY.DNA interaction with rabbit sperm cellsand its transfer into ova in vitro and in vivo.Mol Reprod Dev，2000，56：292-297.]在实验中结合了慢病毒和精原干细胞介导法转染小鼠，得到40％的转基因小鼠，6％的小鼠能将外源基因遗传给后代。精子载体法作为一种转基因的方法，操作简单，转基因效率高，无需特殊的仪器。效果比较突出的有单精注射法(ICSI)和精子介导的体内转染法。由于精子载体法使用的质粒多线性化，这就使得这种环状基因结构被破坏的几率很高，加之导入的外源基因是随机整合，故极易引起外源基因功能结构的破坏或失活，从而直接影响或抑制其表达[郭志勤.家畜胚胎工程.1998，中国科学技术出版社.]。

有研究表明，绝大多数种类的动物精子有自发结合外源DNA的能力，其结合率从15％到80％不等[Lavitrano M.，Busnelli M.，Cerrito M.G.，et al.Sperm-mediated gene transfer.Reprod Fertil Dev，2006，18(1-2)：19-23.]。Spadafora[Spadafora C.Sperm cells and foreign DNA：a controversialrelation.Bioessays，1998，20：955-964.]提出了外源DNA内化的假想模型：正常射出的精子，顶体后躯膜上的DNA结合蛋白(DBP)结合外源DNA的能力被IF-1因子抑制，当精子充分洗涤或采用无精浆的精液后，IF-1的抑制作用被解除，外源DNA与DBP相互作用形成DNA-DBP复合体，DNA-DBP复合体结合到CD4上，并组装成DNA-DBP-CD4复合体。该复合体内化通过核孔到达核基质，在核基质区外源DNA被解离并与精子的染色体DNA紧密接触。游离的蛋白复合体循环到膜上再转运新的DNA分子。外源DNA在精子基因组中的整合区域多发生在核基质区或拓扑异构酶II的识别序列附近；而整合的时间多发生在受精的前后，受精卵雌雄原核的染色体DNA上有单链断裂缺口，早期胚胎细胞活跃分裂增殖过程中，DNA复制过程中留下了大量复制叉与复制片段，这些单链缺口为外源DNA整合到基因组中提供了前提和保证。另外，外源DNA在进入宿主细胞过程中，激活了核酶系统及DNA修复系统。核酶在降解外源DNA的同时也在自身染色体DNA上产生缺口，在DNA修复系统的作用下，外源DNA得以整合到基因组DNA中。外源DNA在宿主基因组中的整合因发生的时期不同产生的后代类型不同。如果外源DNA在受精卵原核期或胚胎的I细胞期整合到宿主基因组中，得到的是转基因动物，而胚胎II细胞期之后再整合得到的动物就是嵌合体，而那些未能整合到基因组中的外源DNA在胚胎细胞中就会被核酶逐步降解[Chan A.W.，Luetjens C.M.，Schatten G.P.Sperm-mediated gene transfer.Curr Top DevBiol，2000，50：89-102.]。

目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现：体外精子转染法和体内精子转染法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法、体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法等；体内精子转染法又可以分为睾丸内注射法、输精管注射法、曲细精管注射法。睾丸注射法就是将外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内，转染各个发生阶段的精子细胞，转染精子经体内成熟后采用自然交配或人工授精获得转基因动物。睾丸打点注射法是由Soto等[Sato M.，Iwase R.，Kasai K.，et al.Direct injection offoreign DNA into mouse testis as a possible alternative of sperm-mediatedgene transfer.Anim Biotech，1994，5(1)：19-31.]于1994年率先使用。像猪等动物的曲细精管被厚而不透明的白膜所包围，无法准确把脂质体/DNA复合物注射进入曲精细管，所以选择进行睾丸注射，这样外源DNA能有效地整合进入雄性生殖细胞。1999年，Farre等[Farre L.，Rigau T.，Mogas T.，et al.Adenovirus-mediated introduct ion of DNA into pig sperm and offspring.Mol Reprod Dev，1999，53(2)：149-158.]对猪睾丸内转染，得到47％的精子转染阳性和22％的猪胚胎表达阳性率，同年Sato等[Sato M.Testis-mediatedgene transfer(TMGT)in mice：successful transmission of introduced DNAfrom F0 to F2 generations.Transgenics，1999，3：11-22.]通过睾丸内注射获得了转基因小鼠。Giuili[42]等通过该法使外源基因在精子中稳定的高表达。肖红卫等[肖红卫，郑新民，陈思怀等.精子介导生产转hCD59基因猪.华中农业大学学报，2006，25(2)：170-173.]为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率，将重组质粒pcDNA3-hCD59，采用打点式注射入猪的睾丸，得到PCR阳性猪(阳性率4.3％)。

哺乳动物在胎儿出生前后就形成了一定数量的卵母细胞，在胎儿时期，卵巢内有相当数量的由原生殖细胞形成的卵原细胞。卵原细胞进一步形成初级卵母细胞(此期又称为GV期)，此时卵母细胞生长极不明显，可持续几个月到几十年。性成熟后，卵母细胞进入迅速生长阶段，形成大量卵黄，积累各种营养物质，完成了卵质的分化，合成储存了胚胎早期发育所需的发育信息，从卵巢排出完成第一次成熟分裂进入输卵管成为次级卵母细胞，随后迅速进入第二次成熟分裂，并终止于第二次减数分裂中期等待受精。排卵后若在24小时内不受精，次级卵母细胞将退化；若与精子相遇受精，次级卵母细胞即完成第二次成熟分裂，卵母细胞被精子激活，主要体现在有卵子皮质颗粒的外排，减数分裂的恢复并排出第二极体，形成雌雄原核。卵母细胞的成熟分为细胞核的成熟和细胞质的成熟。目前关于胞质的成熟，通过后期的囊胚发育状况及后代的健康状况作为评价的唯一标准。

首次建立精原细胞移植技术以来[Hofmann M.C.，Laura B.S.，Luis D.，etal.Immortalization of Mouse Germ Line Stem Cells.Stem Cells，2005，23(2)：200-210.]该项技术发展迅速，从同种到异种都有成功报道。卵母细胞同样作为一种全能细胞，可以发生细胞分化，进入胚胎发育，可以把其中的基因组所贮存的全部遗传信息扩大到生物体所有的细胞中。利用转基因方法将外源基因转染进入卵母细胞，如果发生外源基因在基因组中的整合，所有的转基因阳性细胞均可被用来进行转基因动物生产。卵母细胞在转基因技术的发展中有着非常重要的作用。早在1980年，人们首次尝试的转基因方法——原核显微注射法，就将卵母细胞作为显微注射的素材。这不仅是因为卵母细胞是动物身体上最大的细胞，还因为它在动物的生殖和遗传中不可替代的重要作用。二十世纪九十年代，这一技术已经走向商业化，有的公司甚至可以提供整合了外源基因的转基因动物，但效率仍然太低，只有4％的卵母细胞在注射后能够继续发育。Anthony等利用慢病毒转染牛的卵母细胞时发现[Chan A.W.，Homan E.J.，Ballou L.U.，et al.Transgenic cattle produced by leverse-transcribedgene transfer in oocytes.Proc Nail Acad Sea U S A，1998，95(24)：14028-14033.]，在卵母细胞第二次有丝分裂结束时，核膜会有短时间的破裂，外源基因在慢病毒介导下，在这一时期成功的进入卵母细胞核。这为人们利用卵母细胞作为转基因载体开辟了一条新途径，卵母细胞核膜的坚强壁垒得以打破。Cabot等将猪的卵母细胞体外培养至成熟[Cabot R.C.，Kuhholzer B.，ChanA.W.，et al.Transgenic pigs produced using oocytes infected with aretroviral vector.Anim Biotech，2001，12(2)：205-214.]，使用逆转录病毒作为载体转染绿色荧光蛋白，随后体外受精，并把受精卵移植到受体母猪。得到两窝小猪，每窝分别随机取一只小猪，检测出外源基因呈阳性。这一方法的成功表明直接转染卵母细胞得到转基因后代的几率是很大的。科学家尝试的将成熟卵母细胞经消化后与DNA质粒和脂质体混合物共孵育，得到转基因小鼠[吴德生，王晓云，吴丛梅等.脂质体介导外源DNA体外转染黄金地鼠卵母细胞地研究，癌变.畸变.突变.2004，16(3)：137-141.]。这是在国内首次证实金黄地鼠卵母细胞可被脂质体包裹的外源DNA转染，即金黄地鼠卵母细胞可以作为外源基因的载体，这一新途径为研究外源基因在金黄地鼠卵母细胞中的表达提供了实验基础。张清健等[张清健，黄天华，谢庆东等.HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞地研究.癌变.畸变.突变.2004，16(6)：324-327.]用该方法建立了HBV垂直传染的小鼠模型。证实了小鼠卵母细胞透明带没有完全阻碍HBV进入卵母细胞。在脂质体的参与下有吸收外源DNA的能力。透明带是卵子外层以糖蛋白为主要成份的非细胞性结构它保护易碎的卵细胞和胚胎免受外界损伤。Grabarek等[Joanna B.Grabarek，Berenika Plusa，David M.Glover etal.Efficient delivery of dsRNA into zona-enclosed mouse oocytes andpreimplantation Embryos by electroporation.Genesis，2002，32(4)：269-276.]证明利用电穿孔法能弱化透明带的阻碍作用。Laurema等[Laurema A.，Heikkila A.，KeskiNisula L.，et al.Transfection of oocytes and othertypes of ovarian cells in rabbits after direct injection into uterirnarteries of adenoviruses and plasmid liposomes.Gene Ther，2003，10(7)：580-584.]在利用腺病毒或DNA质粒脂质体混合物对卵巢进行转染的时候发现，易感的是没有透明带保护的原始生殖细胞核初级卵母细胞，而有了透明带保护的次级卵母细胞，就不易被转染，说明透明带阻碍外源DNA的进入。

脂质体可以用来将多种物质转入到动、植物和微生物的多种类型的细胞中。脂质体可以运载大小不同的基因片段、质粒DNA等，脂质体的包裹可以防止核酸酶的降解以及防止DNA被稀释，能提高转染率。脂质体作为核酸载体与细胞之间作用的主要形式包括膜间转运、接触释药、吸附、融合和内吞[Xiao H.Z.，Huang L.DNA transfection mediated by cationic liposomes containinglipopolylysine：characterization and machanism of action.BBA，1994，1189：195-203.]。Lipofectamine-2000是高效、稳定的阳离子脂质体转染试剂。它的作用机理是带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成脂质体/DNA复合物，这种复合物由于脂质体位于外层而仍带有正电荷，它与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，复合物就可以同细胞融合而被细胞吸收，使DNA进入细胞。

转基因技术手段在哺乳动物基因表达方面的应用，已经成为近30年实验生物学及应用生物学领域最为显著的一项进展。转基因技术自创立以来，各国学者一直在努力寻求技术上的改良，从而达到简化操作，提高转基因动物阳性率的目的。近年来，利用精子作为载体生产转基因动物成为研究的热点，但是由该方法生产的转基因动物的阳性率差异巨大，幅度在4％～90％，因此对这一方法的验证和优化势在必行。由于卵母细胞透明带的坚固屏障，人们对采用卵母细胞作为转基因载体的研究持保守态度。但是，卵母细胞作为后代一半遗传物质的提供者，如果能对其进行成功转染，无疑将提高后代的转基因阳性率。因此，本发明采用同时转染精子和卵母细胞，然后使携带转基因阳性精子和卵母细胞的个体进行自然交配，生产转基因后代，希望通过这个方法得到较高的转基因效率，这一方法将对其他动物应用该方法进行转基因研究可以提供有价值的参考，尤其对大家畜卵母细胞介导法的应用建立了一个模型。本发明所述方法操作方便，不需要昂贵的仪器设备，而且对操作人员的技术要求也不高。本发明得到了高效稳定的转染结果，有利于动物转基因技术的推广，进一步提高育种效率，生产成本低廉的生物反应器，提供便宜的异种移植用器官，培育转基因动物新品种。

发明内容

本发明公开了一种提高动物转基因效率的新方法，包括下述步骤：

1)制备带有外源基因的质粒；

2)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雄性动物睾丸组织；

3)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌性动物卵巢组织；

4)将睾丸注射的雄性动物与雌性动物交配，得到转基因动物后代。

本发明所述的打点注射法是直接将外源基因注射到动物睾丸与卵巢组织。

本发明所述的动物为哺乳动物。

本发明所述的方法可以用于提高子代动物携带外源基因的阳性率。

本发明还公开了一种提高小鼠转基因效率的新方法，包括下述步骤：

1)制备带有外源基因的质粒；

2)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入公鼠睾丸；

3)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌鼠卵巢；

4)挑选出打点注射法手术后1-5天与35～40天的公鼠，打点注射法手术后1-7天的雌鼠；

5)将选择的上述公鼠与雌鼠交配，得到转基因小鼠后代。

本发明利用所述方法初步进行了大型哺乳动物绵羊的转基因研究，结果显示，本发明所述方法可以提高大型哺乳动物转基因效率，为畜牧业的育种提供了一种新途径。

附图说明

图1公鼠手术图。其中图A为手术前，图B为公鼠睾丸，图C为单侧睾丸注射后照片，图D为双侧进行打点注射后的照片。

图2母鼠手术图。图A为手术暴露出母鼠卵巢，图B为用微量进样器注射卵巢，图C为注射后卵巢充溢着蓝色且无溢出。

图3双酶切质粒图。质粒pIRES-eGFP被限制性内切酶BanHI和Xhol酶切后，得到了1060bp的基因片段。

图4扩增结果电泳图。其中明亮条带为298bp的目的基因。

图5PCR检测睾丸与精液中外源DNA判定阳性率。其中精液中阳性率在35-40天时仍处于较高水平。

图6卵巢组织、卵泡液PCR阳性率检测。在母鼠的卵巢打点手术后1-5天内阳性率呈下降趋势。

图7卵母细胞在荧光显微镜下的观察图。结果显示，卵母细胞转基因效果良好。

图8F1代小鼠基因组DNA PCR扩增后电泳图。位于300bp上有一条明显的亮带，与阳性对照大小相同，而对照组老鼠的尾尖没有扩增出该条带。

图9各脏器RT-PCR电泳图。其中泳道1为阴性对照；泳道2为小鼠心脏组织；泳道3为尾尖组织；泳道4为小鼠肾脏组织；泳道5为小鼠肌肉组织；泳道6为小鼠肝脏组织；泳道7为小鼠睾丸组织；泳道8为小鼠卵巢组织。

图10母代打点注射法获取子代小鼠的转基因效率图。其中，睾丸注射的公鼠与正常母鼠交配所得的后代称为A组，卵巢注射的母鼠与正常公鼠交配所得的后代称为B组，公鼠的睾丸与母鼠的卵巢均进行手术后，交配所得后代称为C组。

图11母代打点注射法获取子代绵羊的转基因效率图。其中，A组为睾丸注射的雄性绵羊与正常雌性绵羊交配所得的后代的基因阳性率，B组为卵巢注射的雌性绵羊与正常雄性绵羊交配所得的后代的基因阳性率，C组为均进行打点注射法处理的雄性绵羊与雌性绵羊交配所得后代的基因阳性率。

实施例1  母代打点注射法获取转基因子代小鼠

一.实验材料与试剂配制

1.实验材料

5～8周龄昆明白小鼠，购自中国医学科学院实验动物中心。实验共使用母鼠180只，公鼠90只。台盼兰染液、戊巴比妥钠、PMSG、HCG、人用青霉素/链霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、DEPC(焦碳酸二乙酯)、马来酸、Tween-20、SDS、琼脂粉、DH5α感受态细胞、Lipofectin2000、2×Taq PCR MasterMix、X-gal、IPTG、One-Step RT Kit、DIG High Prime DNA Labeling and Detection StarterKit 1、琼脂糖凝胶回收试剂盒、组织基因组DNA提取试剂盒；加强型荧光蛋白质粒：pIRES-eGFP、无内毒素质粒大提试剂盒、内切酶BamH I、内切酶Xho I、M2培养基。

2.试剂配制

1)生理盐水：0.9％的NaCl溶液，称取9gNaCl，用超纯水定容至1000mL，高压灭菌。

2)激素：取PMSG、HCG各一支(1000IU)溶解于1mL灭据生理盐水或超纯水中，浓度为1000IU·mL，分装于0.2mL灭菌离心管中，-20℃保存，解冻后一次使用。

3)清洁液(常用方，硫酸浓度为25％)：重铬酸钾1000g，浓硫酸2500mL，双蒸水7500mL。

4)0.1％DEPC处理水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，振荡混匀，室温过夜后高压灭菌，分装后4℃保存备用。(注意：实验中与胚胎收集和RNA操作有关的溶液均用0.1％DEPC处理水进行配制)

5)50×TAE缓冲液：Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)100mL，加水至1000mL。

6)LB液体培养基：在950mL蒸馏水加入细菌培养用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器至完全溶解用5mol/L NaOH(约0.2mL)调pH值至7.0，定容到1000mL，高压灭菌。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCI 10g，800mL ddHzO溶解，用5mol/L NaOH(约0.2mL)调pH值至pH7.4后，加入1.5％琼脂粉，高压灭菌，待培养基温度降至60℃左右，加入氨苄(Ampicilin)，超净工作中倒平板，冷却后封口膜封好，4℃保存备用。

7)CaCl₂(1mol/L)：在200mL超纯水中溶解54g CaCl₂·6H₂0，过滤除菌，或高压灭菌，分装成10mL每份，贮存于-20℃。

8)氨苄青霉素钠(100g/L)：1g氨苄青霉素钠溶于10mL超纯水中，过滤除菌，-20℃保存。

9)1％琼脂糖凝胶溶液：称取琼脂糖1g加入1×TBE溶液100mL、Goldenview5μL。(注意：所配制的脂糖凝胶溶液中的缓冲液应与电泳缓冲液的浓度一致)。

10)PH8.3Tris-硼酸-3EDTA缓冲液：称取10.78g Tris，5.500g硼酸0.930GEDTA-Na2溶于去离子水，定容到100mL，用时稀释10倍。

11)EB溶液：溴化乙锭(10mg/mL)用时稀释10倍。

12)0.5％台盼兰：称取0.5g台盼兰，定容到100mL。

13)戊巴比妥钠溶液：称取0.030g戊巴比妥钠，加生理盐水2mL。使用浓度0.015g/mL(现配现用)。

14)变性液：0.5M NaOH；1.5M NaCl。

15)中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl；

16)20×SSC：在800mL水中溶解175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠，用氢氧化钠调pH至7.0，加蒸馏水到1000mL，高压灭菌。

17)10％SDS：量取电泳级SDS100g溶于900mL蒸馏水中，加热至68℃助溶，加水定容至1000mL。

18)洗涤液A：2×SSC，0.1％SDS。

19)洗涤液B：0.1×SSC，0.1％SDS。

20)马来酸溶液(Maleic acid)：11.608g马来酸，8.776gNaCl，加水800mL搅拌溶解后，用固体NaOH调节pH值到7.5，定容至1000mL，分装后高压灭菌。

21)洗涤液C：11.608g马来酸，8.776g NaCl，加水800mL搅拌溶解后，用固体NaOH调节pH值到7.5，定容至1000mL，分装后高压灭菌，冷至室温加入Tween-20溶液3mL混匀。

22)平衡液(Detection buffer)：12.11g Tris，5.85g NaCl，加水800mL搅拌溶解后，用浓盐酸(约1mL)调节pH值到9.5，定容至1000mL，分装后高压灭菌。

23)终止液(TE buffer)：10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，调pH至8.0。

24)抗体溶液(Antibody solution)：2.4μL Anti-DIG+12mL 1×Blocking液。

25)显色底物溶液(Color-substrate Solut ion)：100μL NBT/BCIP+5mL检测溶液(现用现配、避光保存)。

26)Blocking溶液：用马来酸将10×Blocking Solution稀释10倍。

二.实验方法

1.实验鼠的准备

引进老鼠前，使用新洁尔灭对鼠房进行消毒，紫外灭菌灯灭菌。引进老鼠后，训练公鼠的繁殖行为，确认其具有良好的繁殖性能。母鼠待其适应一周即可用于实验。超排过程利用腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)5IU/只，48h后再注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5IU/只。

2.提取RNA器皿的处理

与RNA操作有关的玻璃器皿经常规洗净后，用0.1％的DEPC于37℃浸泡处理过夜，高温高压灭菌去除DEPC，然后200℃烘烤8h。塑料器材及Eppendorf管、Tip头均使用无RNAase的一次性制品。所有溶液(除Tris外)均加入DEPC至终浓度0.1％，37℃处理过夜，然后高温高压灭菌。Tris溶液用处理好的焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制，配制好后再高压灭菌。

3.质粒的转化

1)感受态细胞DH5α，转化质粒pIRES-eGFP。

取50μL的感受态细胞，置于冰上，待其解冻；加入1μL质粒，轻轻摇匀，迅速冰浴30min；42℃水浴90sec，37℃水浴5min；快速冰浴2min，再加入LB液体培养基至1mL混匀，在37℃摇床中200r/min培养60min；取500μL上述培养物，均匀涂于含氨苄霉素的固体LB培养基平板上，待该平板表面液体完全被吸收后，37℃倒置培养12h。

2)挑取单克隆菌体到10mL LB无菌培养基中，37℃，摇床过夜，待其扩增。采用质粒提取试剂盒提取质粒，然后采用紫外分光光度计测量其纯度和浓度。

3)质粒提取方法按照无内毒素质粒提取具体方法如下：

a、500mL菌液倒入两个250mL离心杯，室温，3500～5000×g离心10min。

b、弃去上清，然后在细菌颗粒里面加入7mL溶液I/RNase A，用1mL移液枪吹打混匀。

c、把菌液转入可以承受12000×g有盖的30mL的干净离心管中，加入7mL溶液II，轻轻颠倒7～10次，室温放置5～10min。

d、加入10mL溶液III，轻轻颠倒几次直至白色絮状沉淀出现，室温放置5min，室温12000×g离心10min除去基因组DNA和细胞碎片。

e、取上清，放入50mL的DNA吸附管中，室温下3000～4000g离心5min，弃掉下面的液体。再离心5min后去掉下面液体，管子继续使用。

f、加入5mL HB缓冲液到刚才离心的管中，3000～4000×g室温离心5min，去掉离心后的液体。

g、加入10mL乙醇稀释过的DNA洗涤缓冲液，3000～4000×g室温离心5min，去掉离心后的液体。

h、用10mL无水乙醇3000～4000×g室温离心5min，弃上清。

i、3000～4000×g空管离心10min，去除所有乙醇。

j、真空干燥15min。

k、加入适量预热到70℃的双蒸去离子水或则TE缓冲液，室温放置2min后，3500×g离心5min。得到质粒DNA。

4)用内切酶BamH I和Xho I对质粒进行双酶切后采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定所提质粒是否为目的质粒。用紫外分光光度仪测定质粒浓度。质粒浓度调整为1mg/mL，置于-20℃备用。

4.探针的标记与DNA标记

1)PCR引物的设计

根据pIRES-eGFP质粒序列，用软件Primer premier 5设计了一对引物，用于扩增GFP片段并标记为探针。上游引物为5’-TGC TTC AGC CGC TAC CC-3’(SEQ ID N0：1)，下游引物为3’-AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC-5’(SEQIDNO：2)。理论扩增片段长度为298kb。PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

2)PCR反应体系及条件

PCR反应体系：

加灭菌双蒸水到25μL。

94℃预变性5min，单循环94℃，45s，50℃，45s，72℃，30s，共30个循环，72℃延伸10min结束。取PCR产物5μL于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3)纯化回收

电泳检测结束后，将扩增出的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行产物的纯化回收。纯化步骤为：

a、电泳后，切取含有DNA的凝胶片段。尽量切除多余凝胶。

b、切取胶块称重，并加入3倍体积的QG缓冲液到1.5mL的无色离心管中。

c、50℃共孵育10min(直达胶完全溶解)。

d、凝胶完全溶解后，检查溶液的颜色是否是黄色，如果是进行下一步，如果不是，加入10μL 3M的乙酸钠，混匀，颜色会变为黄色。

e、加入1倍体积的异丙醇，混匀。

f、转移溶液到DNA分离管中(试剂盒提供)，12000×g离心3min。

g、加0.75mL PE缓冲液到分离管中，再12000×g离心3min。

h、把分离管中的柱子转到1.5mL的干净的离心管中，17900×g离心1min。

i、再把柱子放到1.5mL的干净的离心管中，加入双蒸去离子水适量，17900×g离心1min，即得到纯化的目的DNA。

4)目的DNA的标记

将1μg回收的PCR片段加入PCR管中，加入灭菌双蒸水到16μL；沸水中变性10min，再迅速放入冰浴；混匀后，加入4μL DIG-High Prime于变性DNA中，混合并轻轻地离心，37℃共孵育16-20h(过夜)；最后65℃加热10min，终止反应。对照组用1μL对照DNA加入15μL双蒸水，其他步骤同标记组。标记完成后斑点杂交检测标记效率。标记样本-20℃保存。

5.打点注射法转染对公鼠与母鼠繁殖力的影响

将6周龄健康公鼠分成两组，对第一组进行单侧睾丸打点注射，第二组进行双侧睾丸打点注射。首先，将小鼠称重并按每克体重0.0001g的剂量，腹腔注射戊巴比妥钠(Pentobarbital)麻醉剂。等待麻醉的时候，将2μL与4μL脂质体混合孵育20min，使用前，加入0.5％台盼兰3μL。麻醉约20min后，公鼠进入昏迷状态，将小鼠腹腔向上固定于手术盘中。用75％酒精喷洒手术部位，然后用吸水纸擦干净，然后将阴囊部位的毛剪掉。术者用拇指和食指将睾丸挤入阴囊并固定，并用微量进样器(microliter syringes)吸取质粒复合物注射睾丸组织和附睾，单侧注射组注射9μL复合物，双侧注射组则每侧注入4.5μL。手术中使用的微量进样器的针头非常锋利，为了减少手术创伤对小鼠生殖能力的影响，固不必剪开阴囊进行操作。手术过程如图1所示。术后24h，分别将两组实验公鼠与进行超排的正常母鼠交配，过夜检查阴道栓，有阴道栓说明受孕成功。

母鼠的打点要将卵巢拉出体外进行手术，手术中非常容易伤及卵巢，影响母鼠生殖能力。此实验通过比较转基因母鼠与正常母鼠的繁殖力，观察手术对母鼠繁殖性能的影响，以及恢复需要的时间，力求找到母鼠术后休息的合理时间。对母鼠卵巢进行打点注射，方法参照2.5。母鼠手术后单笼饲养24h后，将手术母鼠与对照组母鼠同时于下午16:00腹腔注射PMSG(5IU/只)，48h后注射HCG(5IU/只)。注射后立即将母鼠以1∶1的比例与同系正常公鼠合笼。次日清晨7:00检查栓塞，有栓的母鼠检出计数，然后单笼饲养。让没有栓塞的母鼠继续在笼中与公鼠交配，每日清晨检栓。直到7天后，将未孕母鼠计数后淘汰。将所得的两组数据进行t检验，以分析手术后母鼠与对照组母鼠的产仔能力的差异是否具有显著性。

6.公鼠睾丸与母鼠卵巢打点注射后外源DNA代谢时间的研究

将公鼠在双侧打点注射24h、48h、72h、96h、120h以及35d、40d后，颈椎脱臼处死，每只附睾取精液约2μL，2000r/min离心洗涤3次，用DNase I在37℃下作用30min，然后按组织基因组DNA提取试剂盒说明书上的方法提取精子基因组DNA。取精子基因组DNA 1μL制备总体积为25μL的PCR反应体系。上游引物为5’-TGC TTC AGC CGC TAC CC-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物为3’-AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC-5’(SEQ ID NO：2)。理论扩增片段长度为298kb。PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

取6周龄性成熟健康母鼠，按每克体重0.0001g的剂量，腹腔注射戊巴比妥钠(Pentobarbital)麻醉剂，同时在等待麻醉的时间准备质粒复合物。待母鼠出现抽搐的麻醉反应后，将母鼠俯卧保定。进入昏迷状态后将母鼠背部自头以下约5cm处背中线两侧对称去毛，暴露手术部位。消毒皮肤，分别将皮层和肌肉层打开，用眼科镊拉出白色脂肪垫，卵巢即暴露出来，用微量进样器将质粒复合物3.5μL打点注射到一侧卵巢内，若兰色充满整个卵巢，且没有明显的溢出，说明注射成功，注射完毕在伤口处撒上适量的青链霉素混合物，缝合伤口，在表皮再次撒上青链霉素，手术过程见图2。

术后于24h、48h、60h、72h、84h、96h、120h及10d后分别取母鼠卵巢组织和卵泡液，然后按组织基因组DNA提取试剂盒说明书上的方法提取卵巢组织和卵泡液的基因组DNA，扩增质粒中特有片段进行初步推断质粒在体内代谢的速度。分别取卵巢和卵泡液基因组DNA 1μL制备总体积为25μL的PCR反应体系。上游引物为5’-TGC TTC AGC CGC TAC CC-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物为3’-AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC-5’(SEQ ID NO：2)。理论扩增片段长度为298kb，PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

7.母鼠卵巢打点注射后胚胎eGFP表达的检测

卵巢打点注射了质粒与脂质体复合物后，复合物在很短的时间内就能穿过细胞膜，进入卵巢组织和卵泡里。为检测eGFP基因能否通过卵母细胞在小鼠胚胎中的整合和表达，将术后的昆明白小鼠进行超数排卵，与同系的正常雄鼠进行合笼、交配，次日检查阴道栓，合笼后48h处死实验母鼠，取其受精卵在荧光显微镜下进行观察。

取6周龄的性成熟昆明白雌鼠，4只作为一组。进行卵巢内打点注射质粒与脂质体复合物。手术方法参见2.5。术后20h，下午16:00进行超排，注射hCG后马上与同系的性成熟的雄鼠按照2∶1的比例合笼交配。次日清晨7:00检查阴道栓。有栓者，表示交配成功，放入单独的笼中饲养。有栓的母鼠在注射hCG40h后，用颈椎脱臼法处死。将小鼠腹部向上放平，放在吸水纸上，腹部喷洒70％酒精，用镊子捏住小鼠的腹腔皮肤，剪开皮肤，向头部和尾部拉伸使其腹腔完全打开，用眼科镊子和锋利的剪刀打开腹腔壁，找到子宫和卵巢，用镊子抓住一个子宫角的上部，然后轻轻地把子宫、输卵管、卵巢和脂肪垫拉出体腔。这样可以看到一个很薄的膜(子宫系膜)，它将生殖道和体腔壁连接，并带有明显的血管。用剪刀在靠近输卵管的膜上打开一个口。用镊子将输卵管、卵巢和脂肪垫拉伸，再用剪刀在输卵管与卵巢之间剪开，然后将靠近输卵管的子宫部剪开，子宫角至少留下1cm的长度。用灭菌后的眼科剪取下输卵管和子宫放入胚胎观察玻璃皿中(预先加有室温的M₂培养液)。

在显微镜下找出输卵管的漏斗部，用精细的镊子将输卵管末端缓慢套上冲洗针头，轻轻的将冲洗针头压在培养皿的底部，然后用大约0.1mL的M2培养液冲洗输卵管。用移卵管收集胚胎并在新鲜的M2培养液中洗掉杂质，然后放入一个新鲜的M2培养液做成的滴中。置于荧光显微镜下观察，统计发绿色荧光的胚胎数量。

8.F1代转基因阳性小鼠的筛选和鉴定

转基因操作的目的是能得到携带目的基因的健康后代。质粒与脂质体复合物在整合进卵母细胞和精子后，是否会在基因重组时引起基因组的突变，以至于不能得到健康的后代，需要进行转基因小鼠的传代实验进行证实。

1)术后交配安排

将公鼠进行睾丸打点注射，手术操作参照2.2.6。母鼠进行卵巢打点注射。将公鼠分成手术组和对照组，母鼠也分成手术组和对照组。实验设计如下：手术组母鼠术后12h与对照组同时进行超排。注射hCG后手术组与对照组母鼠分别同性成熟的正常雄鼠按照2∶1的比例合笼交配，同时安排另两组手术组和对照组母鼠同性成熟的手术组雄鼠按照1∶1的比例合笼交配。次日清晨7:00检查栓塞，有栓的母鼠检出计数，然后单笼饲养，让没有栓塞的母鼠继续在笼中与公鼠交配。每日清晨检栓，直到4d，将未孕母鼠计数后淘汰。

仔鼠出生3d，将其置于活体荧光成像仪中观察、拍照，并将小鼠剪脚趾标号。

2)基因组DNA的提取

仔鼠出生10d后，断其尾部约1cm，用做基因组DNA和RNA的提取。基因组DNA提取方法按照基因组DNA提取试剂盒说明书，操作如下：

将断尾放入经预冷的离心管，用剪刀将组织块在冰上剪得尽可能碎，加入200μLGA振荡至彻底悬浮。加入20μL蛋白酶K，混匀。放置于56℃水浴锅中过夜，直到组织溶解。加入200μL GB，立即充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心以除去管盖内壁的水珠。(如果溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少或不纯。)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，出现絮状沉淀后，简短离心以除去管壁上的水珠。

将上步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s。倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500μL GD，12000r/min离心30s。倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700μL PW，12000r/min离心30s。倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心30s。倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。将吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱放置数分钟，以彻底晾干材料中残余的漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部分悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE。室温放置2～5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中备用。

3)PCR筛选转基因阳性个体

根据pIRES-eGFP质粒序列，为了排除内源性的干扰，提供PCR的特异性，以便检测基因整合的阳性个体。用软件Primer premier 5设计了3对引物，三对引物分别是P15’-TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC-3’(SEQ ID NO：3)，P23’-TGT GAT CGC GCT TCT CGT TG-5’(SEQ ID NO：4)；该对引物理论扩增eGFP片段长度为454kb。P35’-GAG CTC GGA TCG ATA TCT GC-3’(SEQ ID NO：5)；P45’-GCC CGG TCT TCT TGA CGA GC-3’(SEQ ID NO：6)；P55’-TGC CTG CTATTG TCT TCC CA-3’(SEQ ID NO：7)。P3P5这对引物扩增片段包含从CMV启动子到PloyA整个阅读框，扩增片段大小为1953bp。P4P5该对引物扩增片段包含从IRES到PloyA的阅读框，整个扩增片段大小为1429bp。PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

进行PCR反应，反应体系如下：

加灭菌双蒸水到25μL。反应条件：

P1P2：按上述体系加入离心混匀，放入PCR仪。94℃预变性5min，单循环程序为94℃，45s，50℃，45s，72℃，30s，共30个循环，72℃延伸10min结束。取PCR产物5μL于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

P3P5：按上述体系加入离心混匀，放入PCR仪。94℃预变性5min，单循环程序为94℃，1min，52℃，1min，72℃，2min，共30个循环，72℃延伸10min结束。取PCR产物5μL于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

P4P5：按上述体系加入离心混匀，放入PCR仪。94℃预变性5min，单循环程序为94℃，1min，51℃，1min，72℃，2min，共30个循环，72℃延伸10min结束。取PCR产物5μL于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4)PCR产物的Southern印迹杂交

PCR产物电泳后切角标记，0.25M HCl浸泡18min，倒掉溶液，用水清洗数次，倒掉溶液，同样操作，变性溶液30min，中和溶液两次，每次15min。用玻板搭建转膜平台，依次铺上20XSSC饱和的滤纸，凝胶，尼龙膜两张2XSSC侵润的3mmol/L的滤纸，然后放一叠干燥吸水纸在此滤纸上面，置一玻璃板在吸水纸上，其上放一重约500g的重物，转移过夜。转膜完成后，将膜在2XSSC中洗涤20s，置于滤纸上风干，120℃烘烤30min后进行预杂交。弃掉预杂交液，将准备好的探针溶液加入塑料袋中，于杂交温度(37℃-42℃)，缓慢振荡杂交4h，杂交完毕后，取出膜，室温下，用洗涤液A漂洗膜2次，每次5min，洗涤过程中应不断缓慢振荡，用65℃的洗涤液B洗膜两次，每次15min，室温洗涤液C洗膜2min，倒掉洗液，加入100mL Blocking溶液，室温振荡30min后倒掉溶液。加入20mL平衡液，室温放置3min，倒掉溶液，加入10mL显色剂，于暗盒中显色，目标条带显色后用50mL TE终止显色。

5)反转录PCR(RT-PCR)检测转入基因的转录

挑选PCR阳性鼠公母各3只，分别取出肝脏、肾、心脏、肌肉、尾尖及公鼠的睾丸组织和母鼠的卵巢组织，提取组织RNA。具体操作参照总RNA提取试剂盒(RNAsimple Total RNA Kit)说明书操作：①每个样品大约0.1g，将组织在液氮中磨碎；②加入1mL裂解液RZ，用匀浆仪进行匀浆处理；将匀浆样品在室温下放置5min，于4℃，12000r/min离心5min；③取上清，转入一个新的无Rnase的离心管中，加入0.2mL氯仿，盖好盖子剧烈振荡15s，室温放置3min，于4℃，12000r/min离心10min；④待管中溶液分相后取水相部分，将其移入新管中。缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将混合溶液全部移入CR管中，于4℃，12000r/min离心30s，倒掉废液；⑤向CR管中加0.5mL去蛋白液RD，于4℃12000r/min离心30s，倒掉废液；⑥向CR管中加0.7mL漂洗液RW，室温静置2min，于4℃12000r/min离心30s，倒掉废液；⑦向CR管中加0.5mL漂洗液RW，室温静置2min，于4℃，12000r/min离心30s，倒掉废液；⑧将吸附柱放回2mL收集管中，4℃12000r/min离心2min，倒掉废液，在室温下放置片刻，使乙醇挥发；⑨将吸附柱放入一个新离心管中，加入30μlRNase-free ddH20，室温放置2min，于4℃，12000r/min离心2min。再往吸附柱中加入30μLRNase-free ddH₂O，室温放置2min，于4℃，12000r/min离心2min。电泳检测后，-70℃保存。取2μL总RNA加入下游引物1μL于无RNA酶的Ep管中，70℃加热5min，冰浴5min，离心之后加入下列物质：

反应体系一共25μL。42℃水浴加热1h，95℃灭活5min，冰浴。作为PCR反应的模板备用。

PCR反应体系如下：

加灭菌双蒸水到25μL。反应条件：

P1P2：按上述体系加入离心混匀，放入PCR仪。94℃预变性5min，单循环程序为94℃，45s，52℃，45s，72℃，30s，共30个循环，72℃延伸10min结束，4℃保存。取PCR产物5μL于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

三.结果与分析

1.质粒的酶切鉴定与PCR产物的电泳结果

质粒pIRES-eGFP用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，得到1060bp和4100bp两条片段，已知该质粒总长为5.2kb，验证了所提质粒为pIRES-eGFP。利用设计引物，扩增出质粒中eGFP上298bp的片段，如图4所示，在Maker中，300bp处有一个明显的亮带，证明该片段有较好的扩增。

2.打点注射法对公鼠与母鼠生殖力的影响程度

直接对双侧睾丸的打点注射将影响公鼠生殖能力。如果采用单侧注射则理论上降低了转染效率，为了验证双侧注射对公鼠繁殖力的影响巨细，将实验公鼠分成单侧和双侧睾丸注射两组。实验结果见表1，实验结果表明双侧注射公鼠睾丸与单侧注射公鼠睾丸使母鼠受孕能力差异不显著，可以认为两种手术方案对公鼠生殖能力有同样的影响，为了产生更多的转基因精子，提高得到转基因阳性鼠的数量，故后续实验都采用双侧睾丸注射法。从实验结果还可以看出，有的公鼠在手术后与母鼠交配，5天后仍不能使母鼠受孕。本实验为了证实打点注射是否能长期影响雄性动物的生殖能力，对交配不成功公鼠继续观察研究，15d后，所有公鼠均能使母鼠受孕。

表1  母鼠受孕情况一览表

“+”表示有阴道栓，“-”表示无阴道栓

7天以来，检查母鼠栓塞计数的结果为：手术后母鼠的怀孕率为75％，正常母鼠同等条件下怀孕率为86.7％。产仔情况如表2所示，可见手术对母鼠的生育能力是有影响的。

表2  实验母鼠与对照组母鼠产仔数

3.外源DNA在睾丸组织和卵巢组织中的代谢时间

手术后12h，发现公鼠行为比较活跃，行为正常，无抓挠阴囊，厌食，啃食异物等症状，说明手术方案对鼠的伤害比较小，身体恢复较快。在对公鼠打点注射24h、48h、72h、96h、120h以及35d、40d后，每次取8只公鼠处死以提取睾丸基因组DNA。实验发现，睾丸组织PCR外源DNA检测阳性的公鼠个体数随着时间的增加在减少，5天后无法检测到外源基因的存在。同时，取8只公鼠进行精液PCR外源DNA阳性检测，公鼠个体数随着时间的增加在减少。由图5可以得知，在打点注射后，阳性鼠的个数缓慢减少，打点注射后35d时，精液中检测到外源基因的公鼠个体数有一个回升，然后阳性率呈下降趋势，40d后下降到一个很低的水平。说明外源基因在动物组织细胞内的代谢时间约为5天，而雄性生殖细胞的分化是个连贯的过程，因此在转染生殖细胞的过程中，转染的是各个时期的雄性生殖细胞，所以在35d后仍可出现阳性精子。这些精子是由于术后被转染的精原干细胞分化而成，因此在约40天内，手术公鼠都能产生阳性精子。

公鼠进行手术时，注射的是睾丸组织和附睾。注射附睾的目的是目的基因能在脂质体的包裹下，快速的与附睾中的精子结合，使公鼠在手术后较短时间内能产生转基因精子。注射睾丸组织的目的则是利用复合物去转染睾丸中的曲细精管的上皮细胞，进而转染曲细精管中的精原干细胞。如果这一过程得以实现，那么在5周后，这批精原干细胞将发育成精子。按照上述理论，人们则可以通过这个方法得到大量的转基因精子。通过检测结果我们可以看出手术后35天出现精子高阳性率的这一现象，说明在公鼠的睾丸注射后，外源基因转染了精原干细胞，而40天以后，阳性率下降明显，所以在术后35至40天这一时期也适合公鼠进行交配，生产转基因动物。

由于对麻药耐受性的个体差异，手术后的母鼠成活率为92.7％。术后12h观察母鼠行为，采食正常，不活跃，精神较萎靡。有的母鼠抓挠伤口，撕咬缝合线，躁动不安。取3只母鼠卵巢，用生理盐水冲洗后，采集其卵泡液，并分别对卵泡液和卵巢组织提取组织DNA，然后进行PCR检测，初步判断质粒代谢时间。检测情况见图6。术后7d，小鼠卵巢组织与卵泡液PCR检测呈阳性个体数减少，这一结果为术后母鼠安排交配时间作出一个比较合理的判断。母鼠在术后7d，如果还不能与公鼠交配成功，则不宜使用。本实验选择在术后12h对母鼠进行超排。

4.卵巢打点注射后卵母细胞的eGFP表达与胚胎的eGFP表达

颈椎脱臼处死超排后的母鼠，收集卵母细胞，并将其置于激发光488nm的荧光显微镜下观察，得到如图7结果。将实验组小鼠进行卵巢打点注射后，进行超数排卵，再与同系的正常雄鼠进行交配。颈椎脱臼处死怀孕母鼠，收集受精卵，并置于荧光显微镜下，在激发光波长为488nm时进行观察，并拍照。结果说明卵巢打点注射法处理的实验组小鼠体内获得的受精卵能够表达绿色荧光蛋白。

5.F1代小鼠基因组PCR产物分析

利用引物P1P2，将F1代小鼠尾尖组织基因组PCR扩增，如图8所示，位于300bp上有一条明显的亮带，与阳性对照大小相同，而对照组老鼠的尾尖没有扩增出该条带。证明目的片断得到了较好的扩增。这一指标可用于初步筛选阳性鼠。将进行睾丸注射的公鼠与正常母鼠的后代称为A组，将进行卵巢注射的母鼠与正常公鼠的后代称为B组，将进行了睾丸注射的公鼠与进行了卵巢注射的母鼠交配所得后代称为C组。A组F1代小鼠尾尖组织经PCR检测阳性率为40.51％(32/79)。B组F1代小鼠经尾尖组织PCR检测阳性率为48.94％(46/94)。C组尾尖组织PCR检测阳性率为81.36％(48/59)。A、B、C三组Southern Blot阳性率分别为32.91％、45.74％、71.18％(42/59)。将A、B、C三组所产F1代仔鼠作PCR检测，C组转基因阳性率与A、B两组比显著提高。详情见表3。

表3  三种方法所得F1代PCR阳性率比较

利用引物P1P2对C组F1代小鼠的基因组进行PCR检测，将检测的阳性的样本用于做Southern杂交分析。分别用3对引物对阳性鼠的基因组作PCR，然后将结果用于琼脂糖凝胶电泳。将电泳后的凝胶变性，中和后进行转膜，再将改膜进行杂交、洗脱、显色。结果如图7所示，第1泳道为阴性对照，第4泳道为阳性对照。第2、3泳道为样本，与阳性对照大小相同。杂交图中，所示的杂交片断都为单一条带。

RT-PCR后，结果如图9所示，1为阴性对照，2、6分别是心脏和肝脏，在这两个器官中，没有检测出RNA转录。在肾脏、肝脏、睾丸和卵巢和尾尖组织里分别检测出外源基因发生RNA转录。可见，外源基因在F1代内脏中的转录是有差异的。随机挑选3个P1P2PCR扩增产物，进行纯化回收后，送北京奥科生物技术有限公司测序。将测序结果与eGFP基因序列对比，发现完全吻合。说明小鼠基因组中整合了eGFP外源基因。

6.活体成像仪中观察F1代阳性鼠

使用北京医学科学院北京协和医院实验动物中心的活体成像仪观察F1代小鼠。初生幼鼠在紫外光激发下，利用体视镜观察，四肢和尾部发荧光。活体荧光成像系统里，局部发荧光。可以说明绿色荧光蛋白在幼鼠体内得以表达。在荧光体视镜下观察小鼠的四肢和尾尖，发现这两个部位有显著的荧光。

四.讨论与结论

1.外源基因进入组织后的命运

在脂质体的帮助下，直接注射进组织的质粒，能比较顺利的穿过细胞膜，进入细胞内部。但是进入细胞中的大多数质粒可能会随着细胞的代谢而被作为异物排出。研究对卵巢直接注射外源基因后通过原位杂交实验发现，大量质粒进入卵母细胞，并且被卵巢细胞吸收，其中包括间质细胞、颗粒细胞和各级卵母细胞。外源基因进入细胞内部后可能被核酸酶降解，也可能由于细胞的自我保护功能而将细胞致死。但是大量的实验结果表明，采用这一方法生产转基因动物还是可行的。理论上讲，只要有一个拷贝的质粒能够进入细胞核，并且与染色体发生整合的话，随着精卵的结合，最终将可能产生携带外源基因的后代。因此，尽可能的增加外源基因的拷贝数，使之进入生殖细胞核的可能性增大，而同时对雌雄生殖细胞进行转染就会从设想变成一个提高转基因效率的一个可行方法。

2.雄性生殖细胞的转染

睾丸打点注射，可转染各个时期的雄性生殖细胞。睾丸注射转染雄性生殖细胞的机理包括两个方面：一方面，在做打点式注入时，进样器针尖将曲细精管划破，质粒/脂质体复合物从伤口处进入曲细精管，从而完成对精原干细胞、精母细胞的转染；另一方面，质粒/脂质体复合物通过注射进入睾丸的组织液中，通过体液循环到达睾丸内各种组织以及附睾组织，进而完成对生殖细胞的转染，当复合物注入睾丸后，引起睾丸内压力增大，这种渗透作用更加显著，促进了包裹后的质粒以上述两种机制完成对生殖细胞的转染。与体外孵育相比，在转染过程中，外源DNA的导入不受精浆的抑制，大大提高了DNA导入效率。体外转染精子在进行受精时，多数的精子头部膜上仍然附着外源DNA，这影响了精子的活力而导致受精能力下降的不良后果。经转染的精子细胞在附睾内进一步成熟，这一过程，使精子的生理状态得到调整，使其生活力不受影响。由于体内转染的精子受精能力未降低，加之转染精子在数量上较体外孵育法所获转染精子多，所以获得转基因动物机率相应提高。

精子的发生是一个精巧的连续同步和空间有序分化的过程，由于从干细胞分化成精子的时间是大致恒定的(小鼠约5周)，任何曲细精管的横切面都具有一组从基膜到管腔典型的细胞组合，这反映了沿曲细精管精子一波一波的连续发生。精子的发生依赖于一个真正的干细胞群体，它们具有自我更新和产生后代分化为精子的能力。因此，对精原干细胞的转染将会长时间产生大量的转基因精子。本发明所述实验中，对打点注射后35d～40d的雄鼠精子进行PCR检测，得到阳性结果可以得知：如果进入体细胞内的外源基因，没有得到整合的话，经过了5d就会检测不到，可能是被细胞内的核酸酶降解，也可能是细胞的胞吐作用以及一些不可知因素被排出。因此对公鼠睾丸的注射，转染的是公鼠的精原干细胞、精母细胞以及精子。

3.结论

将脂质体包裹质粒pIRES-eGFP后直接卵巢注射后，手术采集卵母细胞，在荧光显微镜下发绿色荧光。同时采用正常公鼠与术后母鼠交配，采集2-细胞期胚胎，在荧光显微镜下发绿色荧光。说明该方法使外源基因eGFP整合到了卵巢组织，进入到了卵母细胞的基因组中，并且表达；整合了外源基因的卵母细胞在受精过程中，将这一基因携带进入了胚胎。将脂质体包裹质粒pIRES-eGFP后直接睾丸注射后，使其与正常母鼠交配，采集母鼠阴道中的精液，进行PCR检测，检测结果呈阳性。证实了睾丸的打点注射法是一种有效的转染精子的方法。

将进行睾丸注射的公鼠与正常母鼠交配所得的后代称为A组，将进行卵巢注射的母鼠与正常公鼠交配所得的后代称为B组，公鼠的睾丸与母鼠的卵巢均进行手术后，交配所得后代称为C组。三组实验组所得的F1代小鼠均为活体。三个实验组小鼠的后代PCR阳性率比较结果如下：A组F1代小鼠尾尖组织经PCR检测阳性率为40.51％(32/79)；B组F1代小鼠经尾尖组织PCR检测阳性率为48.94％(46/94)；C组尾尖组织DNA PCR检测阳性率为81.36％(48/59)，A、B、C三组Southern Blot阳性率分别为32.91％、45.74％、71.18％(42/59)(图10)。A、B、C三组仔鼠的阳性率中C组转基因阳性率比A、B两组显著提高。结果表明：分别在活体内转染雌雄个体的生殖细胞，然后使其正常交配，所得后代的转基因阳性率高于只转染雌性生殖细胞或雄性生殖细胞。

实施例2母代打点注射法获取转基因子代绵羊

根据上述实验流程，本发明成功的将抑制素基因通过打点注射法分别转入绵羊的睾丸组织与卵巢组织。将进行睾丸注射的雄性绵羊与正常雌性绵羊交配所得的后代称为A组，将进行卵巢注射的雌性绵羊与正常雄性绵羊交配所得的后代称为B组，雄性绵羊的睾丸与雌性绵羊的卵巢均进行手术后，交配所得后代称为C组。三个实验组绵羊的后代PCR阳性率比较结果如下：A组F1代绵羊尾尖组织经PCR检测阳性率为46.2％(6/13)。B组F1代绵羊经尾尖组织PCR检测阳性率为38.5％(5/13)，C组尾尖组织DNA PCR检测阳性率为66.7％(4/6)(图11)。三组子代的阳性率中母本父本同时打点注射后转基因阳性率比单纯母本与父本之一的手术组两组显著提高。

Claims (5)

1.一种提高动物转基因效率的新方法，包括下述步骤：

1)制备带有外源基因的质粒；

2)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雄性动物睾丸组织；

3)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌性动物卵巢组织；

4)将睾丸注射的雄性动物与雌性动物交配，得到转基因动物后代。

2.根据权利要求1所述的一种提高动物转基因效率的方法，其特征在于，所述的打点注射法是直接将外源基因注射到动物睾丸与卵巢组织。

3.根据权利要求1所述的一种提高动物转基因效率的方法，其特征在于，所述的动物为哺乳动物。

4.根据权利要求1所述的一种提高动物转基因效率的方法，其特征在于，所述的方法可以用于提高子代动物携带外源基因的阳性率。

5.一种提高小鼠转基因效率的新方法，包括下述步骤：

1)制备带有外源基因的质粒；

2)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入公鼠睾丸；

3)将携带外源基因的质粒通过打点注射法导入雌鼠卵巢；

4)挑选出打点注射法手术后1-5天与35～40天的公鼠，打点注射法手术后1-7天的雌鼠；

5)将选择的上述公鼠与雌鼠交配，得到转基因小鼠后代。

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