CN114958826A - 一种成熟白桦叶片dna的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种成熟白桦叶片DNA的提取纯化方法，属于分子生物学技术领域。为了解决由于成熟白桦叶片中多糖、多酚及次级代谢物含量高，利用传统方法提取DNA获得的DNA质量低的问题，本发明先利用特定的提核缓冲液对细胞进行裂解提核，并通过CTAB提取液、氯仿和异戊醇进行DNA的抽提除杂，再用无水乙醇和乙酸钠进行DNA的纯化，从而获得了高质量的基因组DNA。采用本发明所述方法对成熟白桦叶片的DNA进行提取，获得的DNA纯度高，杂质低，保证了提取的DNA的质量，有利于酶切分析、PCR克隆和高通量测序文库等科学研究的进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种成熟白桦叶片DNA的提取纯化方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。在分子生物学领域中，高质量的DNA样品，对于分子克隆，酶切连接，遗传多态性分析以及基因组学等研究尤为重要。随着高通量测序技术的发展，提取高质量DNA对于基因组测序，以及后续的分子分析验证成为关键步骤。
不同植物材料中的多糖，多酚以及其他次级代谢物存在差异。白桦作为北方森林中重要的组成成分，在白桦叶片中，尤其成熟叶片中有着大量的多糖、多酚及次生代谢物，大大提高了白桦的抗逆能力。但是，这给白桦作为生物学研究材料带来了巨大挑战，传统分离出来的DNA能够与多糖等物质结合成粘稠的胶状物，获得的DNA质量低，影响限制性内切酶酶切，PCR扩增，大大的限制了后续的分子生物学实验研究。
对白桦作为研究对象而言，由于其叶片中多糖、多酚及次生代谢物的存在，利用传统方法提取DNA不能获得大量高质量DNA，试剂盒方法价格高昂。因此，亟需开发一种针对成熟白桦的DNA提取方法。
发明内容
为了解决由于成熟白桦叶片中多糖、多酚及次级代谢物含量高，利用传统方法提取DNA获得的DNA质量低的问题，本发明提供了一种成熟白桦叶片DNA的提取纯化方法，其特征在于，先提取细胞核，进而通过CTAB提取液提取并纯化DNA；所述提取细胞核的具体步骤如下：
(1)取成熟白桦叶片样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮，液氮快速冷冻研磨成粉末；PVPP有利于防止多酚氧化和多糖聚集；
(2)加入提核缓冲液EB1，震荡混匀后滤膜过滤，离心弃去上清；所述提核缓冲液EB1的组成为0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，0.13％TritonX-100，5mM巯基乙醇；
(3)加入提核缓冲液EB2，吸打混匀，离心弃去上清，获得的沉淀即为提取到的细胞核；所述提核缓冲液EB2的组成为0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，1％Triton X-100，5mM巯基乙醇。
进一步地限定，所述交联聚乙烯基吡咯烷酮的用量为每1g样品添加交联聚乙烯基吡咯烷酮1～2g。
进一步地限定，所述EB1和EB2中Tris-HCl的pH均为8。
进一步地限定，所述EB1和EB2中除巯基乙醇现用现加，其他成分需要高压蒸汽灭菌。
进一步地限定，所述滤膜为滤布或者尼龙膜。
进一步地限定，所述通过CTAB提取液提取并纯化DNA的具体步骤如下：
①向提取到的细胞核中加入预热的CTAB提取液，置于65℃烘箱中10min，期间震荡4至5次混匀；
②室温放置冷却后加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，震荡混匀，离心；所述氯仿和异戊醇的混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
③取上清，重复步骤②；
④取上清，加入2～3倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠，混匀，-40℃静置60～90min，离心；
⑤弃去上清，加入体积分数75％的酒精洗涤沉淀，离心，弃去上清，继续离心，弃去残留上清，晾干，加入超纯水溶解，即得到成熟白桦叶片基因组DNA。
进一步地限定，所述CTAB提取液的组分为质量分数为2％～4％的CTAB，60mMEDTA，100mM Tris-HCl，1.4MNaCl。
进一步地限定，所述CTAB提取液中乙酸钠的pH为5.2.
进一步地限定，所述CTAB提取液中Tris-HCl和EDTA的pH值均为8。
进一步地限定，所述离心的温度均为4℃，离心力除加入提核缓冲液EB1后使用4000g～5000g外，其他离心力均为10000g～12000g。
附图说明
图1为采用本发明所述方法获得的成熟白桦基因组DNA的琼脂糖胶图；
图2为本发明所述方法与传统CTAB方法提取到的DNA电泳比较结果图，其中，泳道2，3，7和8提取到的DNA材料来源于样本1；泳道4，5，10和11提取到的DNA材料来源于样本2；泳道2，3，4和5是使用本发明所述方法提取的DNA，泳道7，8，10和11是使用传统CTAB方法提取的DNA。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：
一种成熟的白桦叶片的DNA提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)取三片来源地不同的成熟白桦叶片样品各0.1g，分别加入等质量的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)，液氮快速冷冻研磨成粉末；
(2)加入提核缓冲液EB130 mL，震荡混匀后滤膜过滤，4℃，4000g离心，弃去上清；所述提核缓冲液EB1的组成为0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，0.13％TritonX-100，5mM巯基乙醇；
(3)加入提核缓冲液EB21 mL(提前预冷)，吸打混匀，转移至1.5mL EP管，4℃，10000g离心，弃去上清；所述提核缓冲液EB2的组成为0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mMMgCl，1％Triton X-100，5mM巯基乙醇；
(4)加入700uL预热的CTAB提取液，65℃烘箱10min，期间震荡4至5次混匀；
(5)室温放置冷却加入等体积700uL的氯仿和异戊醇的混合溶液，(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，震荡混匀，4℃，10000g离心；
(6)取上清600uL，重复步骤(5)，防止吸取下层和中间层；
(7)取上清500uL，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积乙酸钠，混匀，-40℃静置60min，4℃，10000g离心；
(8)弃去上清，加入体积分数为75％酒精洗涤沉淀，10000g，4℃离心，弃去上清，继续10000g离心，弃去残留上清，晾干，加入10uL超纯水溶解，得到成熟白桦叶片基因组DNA。
分别采用电泳、NanoDrop和Qubit检测获得的三份基因组DNA的质量和纯度。
电泳检测结果见图1，由图1可以看出三个来源不同的成熟白桦叶片提取的DNA琼脂糖电泳均有明显的DNA条带。NanoDrop和Qubit检测结果见表1，表1中NanoDrop检测结果显示三份样品的OD260/280介于1.8～2.0之间，OD260/230在2.0左右；Qubit检测结果显示三份样品的纯度不低于50ng/μL。上述检测结果显示本发明所述的方法能够提取到高质量的成熟白桦叶片DNA。
表1 NanoDrop和Qubit检测结果
实施例2：
一种成熟的白桦叶片的DNA提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)取三片来源地不同的成熟白桦叶片样品各0.3g，分别加入2倍质量的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)，液氮快速冷冻研磨成粉末；
(2)加入提核缓冲液EB130 mL，震荡混匀后滤膜过滤，4℃，4000g离心，弃去上清；所述提核缓冲液EB1的组成为0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，0.13％TritonX-100，5mM巯基乙醇；EB1能够溶解细胞裂解物，便于过滤沉淀；
(3)加入提核缓冲液EB21 mL(提前预冷)，吸打混匀，转移至1.5mL EP管，4℃，10000g离心，弃去上清；所述提核缓冲液EB2的组成为0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mMMgCl，1％Triton X-100，5mM巯基乙醇；EB2能够有效提取细胞核并获得DNA；
(4)加入700uL预热的CTAB提取液，65℃烘箱10min，期间震荡4至5次混匀；
(5)室温放置冷却加入等体积700uL的氯仿和异戊醇的混合溶液，(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，震荡混匀，4℃，12000g离心；
(6)取上清600uL，重复步骤(5)，防止吸取下层和中间层；
(7)取上清500uL，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积乙酸钠，混匀，-40℃静置90min，4℃，12000g离心；
(8)弃去上清，加入体积分数为75％酒精洗涤沉淀，12000g，4℃离心，弃去上清，继续12000g离心，弃去残留上清，晾干，加入10uL超纯水溶解，得到成熟白桦叶片基因组DNA。
实施例3：
取两片来源地不同的成熟白桦叶片样品各0.3g，分别采用本发明实验方法和传统CTAB提取方法提取白桦叶片DNA，并对DNA的提取效果进行对比。
传统CTAB实施如下：
(1)取两片来源地不同的成熟白桦叶片样品各0.3g；
(2)提前预冷研钵研杵，预冷后放入白桦材料进行研磨；
(3)研磨后，将材料放入已经加入700uL预热的CTAB提取液的提取管，65℃烘箱10min，期间震荡4至5次混匀；
(4)室温放置冷却加入等体积700uL的氯仿和异戊醇的混合溶液，(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，震荡混匀，4℃，12000g离心；
(5)取上清600uL，重复步骤(5)，防止吸取下层和中间层；
(6)取上清500uL，加入等体积的冰上预冷的异丙醇，混匀，冰上静置60min，4℃，12000g离心；
(7)弃去上清，加入体积分数为75％酒精洗涤沉淀，12000g，4℃离心，弃去上清，继续12000g离心，弃去残留上清，晾干，加入10uL超纯水溶解，得到成熟白桦叶片基因组DNA。
采用琼脂糖电泳的方法验证DNA提取效果。
通过对两种方法提取获得的DNA溶液状态进行比较发现，传统CTAB方法提取获得的DNA溶液黏稠，包含有大量多糖等杂质，而利用本发明所述方法提取到的DNA溶液不黏稠，便于进行后续实验。电泳比较结果见图2，该图显示，传统CTAB提取方法获得的DNA提取效率低，大量杂质位于点样孔，且泳道中条带拖尾，正是由于多糖等杂质较多导致，而利用本发明所述方法提取到的DNA条带明显，泳道干净，便于进行其他实验。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种成熟白桦叶片DNA的提取纯化方法，其特征在于，先提取细胞核，进而通过CTAB提取液提取并纯化DNA；所述提取细胞核的具体步骤如下：
(1)取成熟白桦叶片样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮，液氮快速冷冻研磨成粉末；
(2)加入提核缓冲液EB1，震荡混匀后滤膜过滤，离心弃去上清；所述提核缓冲液EB1的组成为0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，0.13％TritonX-100，5mM巯基乙醇；
(3)加入提核缓冲液EB2，吸打混匀，离心弃去上清，获得的沉淀即为提取到的细胞核；所述提核缓冲液EB2的组成为0.25M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM MgCl，1％Triton X-100，5mM巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述交联聚乙烯基吡咯烷酮的用量为每1g样品添加交联聚乙烯基吡咯烷酮1～2g。
3.根据权利要求2所述的提取纯化方法，其特征在于，所述EB1和EB2中Tris-HCl的pH均为8。
4.根据权利要求3所述的提取纯化方法，其特征在于，所述EB1和EB2中除巯基乙醇现用现加，其他成分需要高压蒸汽灭菌。
5.根据权利要求4所述的提取纯化方法，其特征在于，所述滤膜为滤布或者尼龙膜。
6.根据权利要求5所述的提取纯化方法，其特征在于，所述通过CTAB提取液提取并纯化DNA的具体步骤如下：
①向提取到的细胞核中加入预热的CTAB提取液，置于65℃烘箱中10min，期间震荡4至5次混匀；
②室温放置冷却后加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，震荡混匀，离心；所述氯仿和异戊醇的混合溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
③取上清，重复步骤②；
④取上清，加入2～3倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠，混匀，-40℃静置60～90min，离心；
⑤弃去上清，加入体积分数75％的酒精洗涤沉淀，离心，弃去上清，继续离心，弃去残留上清，晾干，加入超纯水溶解，即得到成熟白桦叶片基因组DNA。
7.根据权利要6所述的提取纯化方法，其特征在于，所述CTAB提取液的组分为质量分数为2％～4％的CTAB，60mM EDTA，100mM Tris-HCl，1.4M NaCl。
8.根据权利要求7所述的提取纯化方法，其特征在于，所述CTAB提取液中乙酸钠的pH为5.2。
9.根据权利要求7所述的提取纯化方法，其特征在于，所述CTAB提取液中Tris-HCl和EDTA的pH值均为8。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的提取纯化方法，其特征在于，所述离心的温度均为4℃，离心力除加入提核缓冲液EB1后使用4000g～5000g外，其他离心力均为10000g～12000g。
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| Title |
|---|
| MOHAMMAD HOSSEIN REZADOOST等: ""An efficient protocol for isolation of inhibitor-free nucleic acids even from recalcitrant plants"" * |
| 孙丰: ""蓝果忍冬SRAP反应体系的建立及遗传多样性分析"" * |
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