CN111534508A - 一种适合沙棘的dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

一种适合沙棘的DNA提取方法，本发明涉及一种适合沙棘的DNA提取方法。本发明的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，本发明通过研磨前预冷，去掉了部分糖类物质，在研磨加入了PVP，减少了酚类、单宁类物质的影响，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，去糖缓冲液去除了糖类物质，为后续提取高质量DNA打好基础；用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K，在加快细胞膜破裂的同时，蛋白酶协同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白，提高了DNA的纯度和产量。制备出的DNA OD260/OD280值可达1.92，DNA的纯度较高。本发明应用于分子生物学领域。

Description

一种适合沙棘的DNA提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木，为药食同源植物，其根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀等功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用；沙棘成长周期较长，一般3～4年才开花结果，为实现其经济价值，沙棘在分子生物学方面的研究亟待展开，便于后续在其优质种株鉴定，病虫害防治等方向的研究。
进行分子生物学分析的关键第一步，是提取高质量的基因组DNA，这是获得准确试验结果的基础。沙棘组织中富含多糖、多酚和粗蛋白，这些次生代谢物会严重的阻扰DNA的提取纯化。现有CTAB法提取植物基因组织中的DNA，是在CTAB缓冲液中加入PVP以去除少许多糖，加上用Tris-酚:氯仿:异戊醇来抽提蛋白质，OD260/OD280比值低于1.8，说明仍有较多的多糖及蛋白质与DNA混杂在一起，DNA纯度低。因此需要更加有效的方法来解决提取DNA中存在多糖和粗蛋白污染的问题，获得高纯度DNA。
发明内容
本发明的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，而提供一种适合沙棘的DNA提取方法。
一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：
一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；
二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；
三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；
四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/L Tris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇，
五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；
六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；
七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；
八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；
其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；
步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/L Tris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/lPVPK-90。
本发明的优点：
1、本发明中有效去除沙棘叶片组织中的多糖、多酚和粗蛋白，提取效果理想，所得DNA的纯度高，DNA片段完整，能满足于进一步分子生物学实验的要求，准确度更高。
2、本发明通过研磨前预冷，去掉了部分糖类物质，在研磨加入了PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，减少了酚类、单宁类物质的影响，可以起到抗氧化作用，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，还可以去除多糖和色素，而色素是PCR的强抑制剂；去糖缓冲液去除了糖类物质，为后续提取高质量DNA打好基础；用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K，在加快细胞膜破裂的同时，蛋白酶K使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，DNA充分游离，协同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白，提高了DNA的纯度和产量，本发明提取的DNA的OD260/OD280值为1.87～1.92，DNA的纯度较高。
3、本发明成本低、操作简便。
本发明适用于提取沙棘DNA，应用于分子生物学领域。
附图说明
图1为实施例1提取的沙棘DNA的0.75％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道1为Maker，2-7为实施例1提取的沙棘DNA。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：
一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；
二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；
三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；
四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；
五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；
六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；
七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；
八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；
其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；
步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/L Tris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/lPVPK-90。
本实施方式步骤八中DNA的溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度；结果OD260/OD280值为1.87～1.92，DNA的纯度较高。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤一中取沙棘幼嫩叶片两枚，置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中，并于4℃下预处理24h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤二中加0.05gPVP于研钵中，加1g剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中，每管0.3g，再加入1mL的-18℃预冷的去糖缓冲液和10μl的β-巯基乙醇，混合后冰上静止10min，4℃下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三中0.15mL的2mg/mL蛋白酶K和80μl的硼砂。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三中是在常温下12500rpm离心10min，取上清液并加入80μl的PVP，常温下10000rpm离心8min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤四中混合溶液后于37℃水浴处理30min，并每隔5min颠倒混匀，常温下400rpm离心10min，取上清液于10mLEP管中；混合溶液：5mmol/L盐酸胍、15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25％乙醇。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤五中向步骤四上清液中加入2mL的质量浓度为30％的乙醇，然后再加入5mL的Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心5min，取上清液；其中Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液中Tris-酚、氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤六向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，4℃下12000rpm离心8min，取上清液；其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤七中在-20℃下沉淀30min后，再4℃下12000rpm离心5min，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，12000rpm离心2min，取沉淀并自然风干。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤八中向风干后的沉淀中加入50μl含RNase的TE溶液；其中50μl含RNase的TE溶液中含1μl 50mg/mL的RNase。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
本实施例一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：
一、取沙棘幼嫩叶片两枚，置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中，并于4℃下预处理24h，取出后自然风干并剪碎；
二、用液氮将研钵预冷，加0.05gPVP于研钵中，加1g剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中，每管0.2g，再加入1mL的-18℃预冷的去糖缓冲液和10μl的β-巯基乙醇，混合后冰上静止10min，4℃下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；
三、在上述沉淀中加入1mL65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和80μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴8min，然后常温下12500rpm离心10min，取上清液并加入80μl的PVP，常温下10000rpm离心8min，取上清液；
四、取步骤三最终得到的上清液至2mL离心管中，加入混合溶液，然后于37℃水浴处理30min，并每隔5min颠倒混匀，常温下400rpm离心10min，取上清液于10mLEP管中；混合溶液：5mmol/L盐酸胍、15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25％乙醇；
五、向步骤四上清液中加入2mL的质量浓度为30％的乙醇，然后再加入5mL的Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心5min，取上清液；其中Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液中Tris-酚、氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1；
六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，4℃下12000rpm离心8min，取上清液；其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30min，再在4℃下12000rpm离心5min，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，12000rpm离心2min，取沉淀并自然风干；
八、向风干后的沉淀中加入50μl含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30min，置于-20℃冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；
其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；
步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/LNaCl，0.1mol/LTris-Hcl，0.02mol/LEDTA，2mol/LPVPK-90；
步骤八中50μl含RNase的TE溶液中含1μl 50mg/mLRNase。
将本实施例提取的DNA溶液用双蒸水稀释50倍后，用紫外分光光度计测定其在260nm和280nm的OD值，根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度，然后根据DNA浓度(ng/μL)＝OD260×50×稀释倍数，计算DNA的浓度。
表1DNA纯度和浓度的检测
编号 OD260/OD280 DNA浓度(ng/μL)
1 1.89 717
2 1.91 823
3 1.87 804
4 1.91 931
5 1.92 929
6 1.84 728
由上述结果可知，本实施例提取的DNA OD260/OD280值为1.92，DNA的纯度较高。将本实施例提取的沙棘基因组DNA进行0.75％琼脂糖凝胶电泳检测，从电泳图1中可见，在750bp和500bp之间有一条明显的亮带(大约619bp)，这条带亮度高且清晰整齐，说明无杂质残留，说明DNA产量高、无降解、完整性好，纯度高。
对照组采用常规CTAB法提取沙棘DNA,提取的DNA溶液用双蒸水稀释50倍后，用紫外分光光度计测定其在260nm和280nm的OD值，根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度，对照组的OD260/OD280值为1.71-1.77，电泳图上有明显降解现象，拖尾严重难以区分主带，由此可知，对照组提取的DNA中多糖、多酚类和蛋白类物质残余量高。

Claims (10)

1.一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；
二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；
三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；
四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；
五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；
六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；
七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；
八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；
其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；
步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/L Tris-Hcl，0.02mol/L EDTA，2mol/lPVPK-90。
2.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤一中取沙棘幼嫩叶片两枚，置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中，并于4℃下预处理24h。
3.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤二中加0.05gPVP于研钵中，加1g剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中，每管0.3g，再加入1mL的-18℃预冷的去糖缓冲液和10μl的β-巯基乙醇，混合后冰上静止10min，4℃下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤三中0.15mL的2mg/mL蛋白酶K和80μl的硼砂。
5.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤三中是在常温下12500rpm离心10min，取上清液并加入80μl的PVP，常温下10000rpm离心8min。
6.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤四中混合溶液后于37℃水浴处理30min，并每隔5min颠倒混匀，常温下400rpm离心10min，取上清液于10mLEP管中；混合溶液：5mmol/L盐酸胍、15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25％乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤五中向步骤四上清液中加入2mL的质量浓度为30％的乙醇，然后再加入5mL的Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心5min，取上清液；其中Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液中Tris-酚、氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1。
8.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤六向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，4℃下12000rpm离心8min，取上清液；其中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
9.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤七中在-20℃下沉淀30min后，再4℃下12000rpm离心5min，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，12000rpm离心2min，取沉淀并自然风干。
10.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤八中向风干后的沉淀中加入50μl含RNase的TE溶液；其中50μl含RNase的TE溶液中含1μl50mg/mL的RNase。
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