CN102732503A - 一种藻类叶绿体dna的提取方法 - Google Patents
一种藻类叶绿体dna的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102732503A CN102732503A CN2011100853744A CN201110085374A CN102732503A CN 102732503 A CN102732503 A CN 102732503A CN 2011100853744 A CN2011100853744 A CN 2011100853744A CN 201110085374 A CN201110085374 A CN 201110085374A CN 102732503 A CN102732503 A CN 102732503A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algae
- dna
- chloroplast
- chloroplast dna
- carrying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种藻类叶绿体DNA的提取方法，新鲜或冷冻藻体为原料，用组织匀浆机匀浆，加入缓冲液A以3,000-6,000×g离心力离心处理，取沉淀物，加入缓冲液B，在60-70℃下水浴裂解1-2h，裂解液去除变性蛋白质，加入CsCl和Hoechst 33258，以360,000-400,000×g离心力离心8-12h，取出含叶绿体DNA条带去除Hoechst 33258，加入2.5～3.5M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，在-20℃下放置20～40min，离心力12,000-16,000×g离心15-30min，得到的沉淀纯化后，即得到藻类叶绿体DNA。与现有技术相比，本发明简化了提取步骤，操作简单易行，提高了藻类叶绿体DNA的提取率和纯度，提取的藻类叶绿体DNA得率在150-200μg/g(新鲜藻体)，且完全能够满足基因组测序、特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体设计一种大型藻类叶绿体DNA高效高纯度的提取方法。
背景技术
叶绿体是植物进行光合作用极为重要的细胞器，它具有独立复制的遗传物质。叶绿体DNA(cpDNA)被广泛应用于细胞质遗传、植物雄性不育、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等方面的研究。由于叶绿体及其DNA的重要功能，所以它们一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。由于难以获得足量的完整叶绿体进而得到高纯度的叶绿体DNA(cpDNA)，此项研究进展缓慢。目前，很多方法通过破碎植物体如匀浆法、超声破碎法、冻融法以及化学方法等，以获得完整叶绿体粗提液，再通过差速离心分离，密度梯度离心分离、纯化，进而提取得到叶绿体DNA。这些方法在一定程度上适用于提取高等植物叶绿体细胞器，但海藻组织通常富含的多糖、酚类化合物，很难分离得到量大纯度高的叶绿体，并且酚类化合物极易被氧化，可在核酸分离纯化时，与核酸相互作用生成物(如醌类)能与核酸稳定的结合，从而影响核酸的分离纯化。多糖会形成难溶的胶状物，与核酸共沉淀下来，并且多糖可以抑制很多酶的活性。
另有报道利用蔗糖密度梯度离心分离藻类叶绿体细胞器再用CsCl密度梯度离心分离纯化叶绿体DNA。由于藻类细胞壁比较厚不易破碎，叶绿体细胞器得率低，并且组织富含多糖多酚，分离得到叶绿体细胞器纯度不高。报道中还涉及叶绿体DNA溶液透析以去除CsCl的步骤，此步骤极易导致叶绿体DNA得率降低，并且延长提取时间。利用目前已报道的藻类叶绿体提取方法，叶绿体DNA的提取率一般在10-15μg/g(新鲜藻体)，提取率低下。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便快速的藻类叶绿体DNA的提取方法，提取的藻类叶绿体DNA具有质量好、提取率高等优点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种藻类叶绿体DNA的提取方法，其特征包括以下步骤：
1)选取新鲜或冷冻藻体如裙带菜或者孔石莼，洗净沥水后，称取20-60g藻体，加150-300ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4℃下，匀浆成藻液；
2)将匀浆后的藻液用尼龙布过滤，将滤液离心处理后，弃上清液，取沉淀物；
3)在沉淀物中加入10-30ml缓冲液B，在60-70℃下水浴裂解1-2h，得到裂解液；
4)将裂解液用酚-氯仿-异戊醇(体积比24～26∶23～25∶1，体积比优选25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(体积比23～25∶1，体积比优选24∶1)处理去除变性蛋白质，再加入CsCl和Hoechst 33258，以360,000-400,000×g离心力离心6-8h，其中CsCl与Hoechst 33258的加入量的终浓度为1.35-1.65g/ml和10-30μg/ml；
5)迅速取出含叶绿体DNA的条带，用0.8-1.2M NaCl饱和异丙醇去除Hoechst33258；
6)在去除Hoechst 33258的叶绿体DNA溶液中加入浓度2.5-3.5M的醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为1.5～2.5∶1.5～2.5∶3.5～4.5∶4.5～5.5，混合均匀后混合液在-20℃下，放置20-40min；
7)将混合液以12,000-16,000×g离心力离心15-30min，得到的沉淀经过65-75％乙醇洗涤去杂后，即得纯的藻类叶绿体DNA，提取得到的DNA OD260/280为1.75-1.85，得率为150-200μg/g(新鲜藻体)；
其中，所述缓冲液A的组分及配比如下：
调节pH至7-8，补充水至1L；
所述缓冲液B的组分及配比如下：
调节pH至7-8，补充水至1L。
作为改进，所述步骤2)中的离心处理是在3,000-6,000×g离心力下离心5-10min。
作为改进，所述步骤5)是采用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带。
作为优选，所述缓冲液A的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L。
再优选，所述缓冲液B的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L。
再优选，所述尼龙布为40-100目。
最后，所述步骤6)中的叶绿体DNA溶液与醋酸钠、双蒸水和异丙醇的体积比优选为2∶2∶4∶5。
与现有技术相比，本发明的优点在于：利用高速匀浆机在低温条件下破碎藻体组织，使得细胞器的得率很高；同时通过加入醋酸钾沉淀多糖多酚，以达到藻体细胞器和多糖多酚分离的效果。在提取过程中省去差速离心分离叶绿体的步骤，节省了操作时间，提高叶绿体DNA的得率；通过稀释含CsCl的叶绿体DNA溶液，直接沉淀DNA，省去透析去除CsCl的步骤，并且减少透析过程中DNA的损耗，提高叶绿体DNA的得率。本发明的提取方法简便快速、提取率高，提取的藻类叶绿体DNA得率在150-200μg/g(新鲜藻体)，具有纯度高、产率高的优点，完全能够满足基因组测序、特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1)原料准备：选取新鲜裙带菜藻体，洗净沥水后，称取20g藻体，加150ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4℃下，均匀搅碎成藻液；
2)匀浆的藻液用60目尼龙布过滤，滤液以4,000×g离心力离心10min，取得沉淀物；
3)收集的离心沉淀物加15ml缓冲液B在65℃，水浴1h；
4)裂解液利用酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(体积比24∶1)处理去除变性蛋白质，加入CsCl(终浓度1.45g/ml)和Hoechst 33258(终浓度10μg/ml)，380,000×g，离心8h；
5)利用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带，利用含1M NaCl饱和异丙醇，去除Hoechst 33258；
6)叶绿体DNA溶液中加入3M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为2∶2∶4∶5，混合液在-20℃下，放置30min；
7)混合液在离心力15,000×g离心15min，得到的沉淀经过70％乙醇洗涤去杂后，即得裙带菜叶绿体DNA，提取得到的DNA OD260/280为1.85，得率为180μg/g(新鲜藻体)。
其中，所述缓冲液A的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L；
所述缓冲液B的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L。
实施例2
1)原料准备：选取新鲜孔石莼藻体，洗净沥水后，称取25g藻体，加150ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4℃下，均匀搅碎成藻液；
2)匀浆的藻液用60目尼龙布过滤，滤液以4,000×g离心力离心10min，取得沉淀物；
3)收集的离心沉淀物加20ml缓冲液B在65℃，水浴1.5h；
4)裂解液利用酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(体积比24∶1)处理去除变性蛋白质，加入CsCl(终浓度1.35g/ml)和Hoechst 33258(终浓度10μg/ml)，380,000×g，离心8h；
5)利用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带，利用含1M NaCl饱和异丙醇，去除Hoechst 33258；
6)叶绿体DNA溶液中加入3M醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为2∶2∶4∶5，混合液在-20℃下，放置30min；
7)混合液在离心力14,000×g离心20min，得到的沉淀经过70％乙醇洗涤去杂后，即得孔石莼叶绿体DNA，提取得到的DNA OD260/280为1.84，得率为186μg/g(新鲜藻体)。
其中缓冲液A、B的配比同实施例1。
本发明提取的叶绿体DNA得率在150-200μg/g(新鲜藻体)。通过PCR法扩增核DNA保守基因序列(18S rDNA)和叶绿体DNA保守基因序列(rbcL)检测叶绿体DNA的纯度，结果显示提取的叶绿体DNA不含核DNA成分，说明提取的叶绿体DNA纯度很高。
Claims (7)
1.一种藻类叶绿体DNA的提取方法，其特征包括以下步骤：
1)选取新鲜或冷冻藻体，洗净沥水后，称取20-60g藻体，加150-300ml缓冲液A，用组织匀浆机在0-4℃下，匀浆成藻液；
2)将匀浆后的藻液用尼龙布过滤，将滤液离心处理后，弃上清液，取沉淀物；
3)在沉淀物中加入10-30ml缓冲液B，在60-70℃下水浴裂解1-2h，得到裂解液；
4)将裂解液用体积比24～26∶23～25∶1的酚-氯仿-异戊醇和体积比23～25∶1的氯仿-异戊醇处理去除变性蛋白质，再加入CsCl和Hoechst 33258，以360,000-400,000×g离心力离心8-12h，其中CsCl与Hoechst 33258的加入量为终浓度1.35-1.65g/ml和10-30μg/ml；
5)迅速取出含叶绿体DNA的条带，用0.8-1.2M NaCl饱和异丙醇去除Hoechst33258；
6)在去除Hoechst 33258的叶绿体DNA溶液中加入浓度2.5-3.5M的醋酸钠、双蒸水和异丙醇，体积比为1.5～2.5∶1.5～2.5∶3.5～4.5∶4.5～5.5，混合均匀后混合液在-20℃下，放置20-40min；
7)将混合液以12,000-16,000×g离心力离心15-30min，得到的沉淀经过65-75％乙醇洗涤去杂后，即得纯的藻类叶绿体DNA；
其中，所述的缓冲液A的组分及配比如下：
调节pH至7-8，补充水至1L；
所述的缓冲液B的组分及配比如下：
调节pH至7-8，补充水至1L。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤2)中的离心处理是在3,000-6,000×g离心力下离心5-10min。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤5)是采用注射器在紫外灯照射下，迅速取出含叶绿体DNA的条带。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述缓冲液A的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述缓冲液B的组分及配比为：
调节pH至7.5，补充水至1L。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述尼龙布为40-100目。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步骤6)中的叶绿体DNA溶液与醋酸钠、双蒸水和异丙醇的体积比为2∶2∶4∶5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110085374.4A CN102732503B (zh) | 2011-03-30 | 2011-03-30 | 一种藻类叶绿体dna的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110085374.4A CN102732503B (zh) | 2011-03-30 | 2011-03-30 | 一种藻类叶绿体dna的提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102732503A true CN102732503A (zh) | 2012-10-17 |
| CN102732503B CN102732503B (zh) | 2014-07-09 |
Family
ID=46988806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110085374.4A Expired - Fee Related CN102732503B (zh) | 2011-03-30 | 2011-03-30 | 一种藻类叶绿体dna的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102732503B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103215251A (zh) * | 2013-03-01 | 2013-07-24 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 一种分离叶绿体dna的方法 |
| AU2017269608B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-07-16 | Norgen Biotek Corp. | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| CN113846000A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-12-28 | 向化英 | 基于冻融法的植物叶绿体提取用设备 |
-
2011
- 2011-03-30 CN CN201110085374.4A patent/CN102732503B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ALDRICH AND CATTOLICO: "Isolation and Characterization of Chloroplast DNA from the Marine Chromophyte, Olisthodiscus luteus: Electron Microscopic Visualization of Isomeric Molecular Forms", 《PLANT PHYSIOL》 * |
| SHIVJI: "Organization of the chloroplast genome in the red alga Porphyra yezoensis", 《CURR GENET》 * |
| 李世国: "大型褐藻配子体培养及海带自交系AFLP分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
| 李晋楠和汪志平: "高质量螺旋藻基因组DNA制备方法研究", 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 * |
| 秦松等: "红藻真江蓠质粒的发现", 《海洋与湖沼》 * |
| 邓元告等: "坛紫菜(porphyra haitanensis)叶绿体DNA的快速提取", 《厦门大学学报（自然科学版）》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103215251A (zh) * | 2013-03-01 | 2013-07-24 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 一种分离叶绿体dna的方法 |
| CN103215251B (zh) * | 2013-03-01 | 2016-02-17 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 一种分离叶绿体dna的方法 |
| AU2017269608B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-07-16 | Norgen Biotek Corp. | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| EP3464588B1 (en) | 2016-05-27 | 2022-07-27 | Norgen Biotek Corporation | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| US11767522B2 (en) | 2016-05-27 | 2023-09-26 | Norgen Biotek Corp. | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| AU2017269608C1 (en) * | 2016-05-27 | 2023-12-07 | Norgen Biotek Corp. | Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples |
| CN113846000A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-12-28 | 向化英 | 基于冻融法的植物叶绿体提取用设备 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102732503B (zh) | 2014-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101962639B (zh) | 一种广谱高效提取植物rna的试剂盒 | |
| CN101864414A (zh) | 仿刺参体壁总rna提取方法 | |
| CN102732503B (zh) | 一种藻类叶绿体dna的提取方法 | |
| CN111019838B (zh) | 一株内生真菌及其提取物与用途 | |
| CN101434630B (zh) | 一种香菇基因组的提取方法 | |
| CN103667072B (zh) | 一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用 | |
| CN103232354B (zh) | 一种从缬氨酸发酵液中分离杂酸的方法 | |
| CN103820434A (zh) | 一种真菌菌丝总dna的提取方法 | |
| CN102807958A (zh) | 一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用 | |
| CN102499415A (zh) | 绿藻精营养液及其制备方法 | |
| CN101760437B (zh) | 一种高核酸面包酵母及其制备方法 | |
| CN102687778A (zh) | 一种杜仲红茶粉的制备方法 | |
| CN115417935A (zh) | 一种海藻硒多糖的制备方法 | |
| CN108424468A (zh) | 一种鲍鱼多糖的制备工艺 | |
| CN113005042A (zh) | 一种虎奶菇原生质体制备方法 | |
| CN102835652A (zh) | 一种基于膜技术提取虫草被孢菌丝体的方法 | |
| CN112812978A (zh) | 一株食用菌红侧耳及其应用 | |
| CN110878281A (zh) | 一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法 | |
| CN107779404B (zh) | 一株白耙齿菌及其培养方法和应用 | |
| CN103504287A (zh) | 一种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法 | |
| CN113005041B (zh) | 一种菱形藻及其培养方法与其在超盐产油中的应用 | |
| CN113604364B (zh) | 一种棘孢木霉菌株及其应用 | |
| CN114836393B (zh) | 毛栓孔菌漆酶基因及其重组漆酶的制备方法和应用 | |
| CN112980698B (zh) | 微生物发酵碳源及其制备方法 | |
| CN109628543B (zh) | 利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140709 Termination date: 20160330 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |