CN104232752A - 一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法，具体步骤为：（1）设计引物和探针；（2）提取待测淀粉样品的DNA模板；（3）测定提取DNA的质量浓度；（4）两对对特异性引物以及相对应荧光探针进行实时荧光PCR扩增；（5）PCR扩增产物的检测，根据每个循环结束记录荧光信号的数据，反应结束后根据数据绘制扩增曲线，最后判断特异性和灵敏性。本发明的检测方法准确性高、反应灵敏、特异性高，可以快速检测淀粉样品中是否含荸荠和马蹄成分，较之传统方法，提高木薯淀粉和荸荠淀粉鉴定的客观性和准确度，适合快速鉴定木薯淀粉和荸荠淀粉使用。

Description

一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明涉及淀粉检测技术，特别是涉及一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法。
背景技术
随着加工技术的进步和经济的发展，木薯和荸荠已日益成为淀粉工业重要的基础原料。广西作为中国木薯、荸荠的主产区,两者的种植面积与产量均已跃居全国首位，是我国重要的淀粉生产基地，广西同时也是我国进境木薯淀粉的输入口岸。特别是2010年开放了边境贸易，进口木薯淀粉的数量与货值均大量增加。但是，相应的假冒伪劣产品也充斥市场，这种现象对生产者和消费者来说都是一种损害，同时对国家资源也会造成程度不等的浪费。
目前，市场上淀粉产品经常出现参假，异种淀粉混入等造假现象，木薯和马蹄淀粉有时候作为异种淀粉混入其他淀粉中，有时本身又会被掺入价格较为低廉的玉米淀粉。例如2011年福建地区发现木薯淀粉掺假情况，部分利益熏心的商家在木薯淀粉中加入一定量的玉米淀粉，进而通过降低价格来吸引买家。当年玉米淀粉每吨价格在3200元左右，而木薯淀粉每吨价格为4600元，相差1000多元，给消费者带来巨大的经济损失。
传统检测方法以及标准，要从色泽，感官，白度，显微镜表征观察等诸多技术指标去区别鉴定，对于检验人员要求高、主观性大，容易产生误判。例如使用的示意图和文字描述简单，缺乏实物标样参照，给实际检验工作带来困难。因此，急需提供一种具有客观性和准确度较高的检测分辨木薯和荸荠淀粉制品的荧光PCR鉴定方法。
发明内容
本发明目的要解决现有淀粉检测技术不客观、准确度不高的技术问题，提供一种具有客观性和准确度高的检测分辨荸荠淀粉和木薯淀粉制品的荧光PCR鉴定方法，并适用于口岸快速鉴定提供检测技术。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
首先设计引物和探针：
核糖体上的基因为多拷贝、中度重复序列, 一个重复单位由5.8S、1 8S、26S 编码区以及一些间隔区组成。ITS( internal transcribed spacer) 区位于18S和26S 基因之间, 中部被5.8S 一分为二, 即ITS1区与ITS2 区。5.8S、18S、26S 进化速率慢, 常用于探讨科级和科级以上等级的系统发育问题。而间隔区如ITS 区进化速率较编码区快, 一般用于研究较低等级如属间、种间甚至居群间的系统关系。
本研究根据被子植物核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列在植物属内、近缘属间乃至科内系统发育研究中的应用,针对于NCBI数据库上已公布的荸荠和木薯糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列，荸荠ITS序列1，木薯ITS序列2，运用设计软件用Primer5.0获得一些候选引物，最后筛选出两对针对荸荠淀粉与木薯淀粉实时荧光检测的PCR引物和TaqMan探针。
用于荸荠淀粉的检测方法的一对特异性引物和探针为：
正向引物 F: 5’- GGCCAAAGCAATAGATTGAGATG-3’；
反向引物  R: 5’- CGCATTTCGCTACGTTCTTCA-3’。
荧光探针为：5’-FAM-TCCCGGCAACGGATATCTCGGC-TAMARA-3’。
用于木薯淀粉的检测方法的一对特异性引物与探针为：
正向引物  F: 5’- CCGCCCGAATCGGTTTAC-3’；
反向引物  R: 5’- GATCATTGGCAAAAACGAAATTT-3’；
荧光探针为：5’-FAM-AATGGGATGTCCTACTGC-TAMARA-3’；
所述引物预扩增片段序列为：
荸荠预扩增序列长度79bp
1      GGCCAAAGCA ATAAATTGGG ATGACTCCCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG
61     AAGAACGTAG CGAAATGCG
木薯预扩增序列长度66bp
1      CCGCCCGAAT CGGTTTACTA ATGGGATGTC CTACTGCGTT ACAAAATTTC GTTTTTGCCA
61     ATGATC
所述的探针5’端用报告荧光基团FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3和Cy5其中的一种标记，3’端用淬灭荧光基团MGBNFQ、Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1和Bhq2其中的一种标记。
所述的实时荧光PCR反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s、55℃ 1min，共45个循环。
1.一种荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，包括DNA提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征是：具体步骤如下：
（1）提取DNA：
A、分别秤取等重均匀的荸荠淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、莲藕淀粉、马铃薯淀粉和甘薯淀粉200mg置于Axygen 1.5ml的离心管中，加入65℃预热的改良后的CTAB提取缓冲液700ul，充分振荡混匀，65℃温育3h，每隔半30min颠倒混匀一次；所述的改良CTAB提取缓冲液由2% m/V CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2 mol/L NaCl，1% PVP，0.1% β-疏基乙醇组成；
B、取出离心管，待冷至25℃后，加入700ul酚与氯仿配比＝1:1的混合溶液上下颠倒充分混合5分钟，以12000 rpm 离心10分钟取上清，然后再重复此步骤一次；
C、用剪去头部的200μl 枪头将上清液转移到另一个新的离心管中，加入浓度为10mg/ml的 RNaseA2μl；
D、加入体积为700μl的氯仿，上下颠倒充分混合，5分钟，后抽提；
E、室温下，以12000 rpm 离心10分钟，吸取将上清液转移到另一新的离心管中；
F、加入体积为700μl的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟后可见沉淀，待完全沉淀后完全，在-20℃放置1-2小时；
G、室温下，12000 rpm 离心10分钟，沉淀积于管底，弃尽倒去上清液；
H、加入700μl 体积百分含量为70%的乙醇清洗30分钟；
I、倒去离心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干；
J、加入100ulddH2O溶解，放入-20℃冰箱保存备用；
（2）DNA的质量浓度测定：
取5ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量，另再取1-2ul提取的DNA溶液利用微量紫外分光光度计测定所提取的DNA的精确浓度和纯度；
（3）PCR检测体系建立：
实时荧光PCR反应体系为总体积25μl，内含淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，特异引物终浓度0.2μmol/L，探针引物终浓度为0.1μmol/L，用ddH2O补充到25μl，在一定的反应条件下进行实时荧光PCR反应；
（4）PCR扩增产物的检测：
A、荸荠淀粉、木薯淀粉两对引物以及Tagman探针扩增产物特异性检测
以荸荠淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、藕粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，检测引物探针的特异性。
结果显示，检测荸荠淀粉和木薯淀粉的特异性引物探针只在马蹄淀粉与木薯淀上有信号，同时两者互相没有交叉反应，在其它材料中均无信号（见图2）。
B、荸荠淀粉、木薯淀粉检测用探针引物灵敏度检测
将荸荠淀粉、木薯淀粉的总DNA以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板进行荧光PCR反应，以检测方法的灵敏度。
结果显示，检测荸荠淀粉和木薯淀粉的特异性引物探针的灵敏度为1pg（见图3、图4）。
工作原理：
本发明所用TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。通过这种方法，就能够检测到样品中是否有荸荠淀粉或者木薯淀粉成分。
本发明的有益效果：
1、本发明荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法，是通过荸荠和木薯保守序列设计出相对应的引物和Tagman探针，较之传统方法，提高木薯淀粉和荸荠淀粉鉴定的客观性和准确度，同时为口岸快速鉴定提供技术储备。
2、本检测方法采用的引物和探针检测特异性好，用于检测实时荧光PCR灵敏性高。
3、本检测方法准确性高，反应灵敏，可以快速检测淀粉样品中是否含荸荠和马蹄成分，两种淀粉也可相互检测，特异性高。
附图说明
图1为荸荠淀粉、木薯淀粉特异性检测实时荧光PCR图；
图中标识：1、横坐标Cycle Number-扩增循环数；2、纵坐标Delta Rn-荧光强度；3、①-荸荠；4、②-木薯。
图2为六种淀粉样品中，荸荠淀粉、木薯淀粉特异性检测实时荧光PCR图；
图中标识：1、横坐标Cycle Number-扩增循环数；2、纵坐标Delta Rn-荧光强度；3、①-荸荠；4、②-木薯。
图3荸荠淀粉实时荧光PCR方法的灵敏度；
图中标识：1、横坐标Cycle Number-扩增循环数；2、纵坐标Delta Rn-荧光强度；3、①-荸荠DNA模板浓度100ng；4、②-荸荠DNA模板浓度10ng；5、③-荸荠DNA模板浓度1ng； 6、④-荸荠DNA模板浓度100pg；7、⑤-荸荠DNA模板浓度10pg。
图4木薯淀粉实时荧光PCR方法的灵敏度；
图中标识：1、横坐标Cycle Number-扩增循环数；2、纵坐标Delta Rn-荧光强度；3、①-木薯DNA模板浓度100ng；4、②-木薯DNA模板浓度10ng；5、③-木薯DNA模板浓度1ng； 6、④-木薯DNA模板浓度100pg；7、⑤-木薯DNA模板浓度10pg。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明进一步的详细描述。
本研究根据被子植物核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列在植物属内、近缘属间乃至科内系统发育研究中的应用,针对于NCBI数据库上已公布的荸荠和木薯糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列（荸荠ITS序列1，木薯ITS序列2），运用设计软件用Primer5.0获得一些候选引物，最后筛选出两对针对荸荠淀粉与木薯淀粉实时荧光检测的PCR引物和TaqMan探针。
用于荸荠淀粉的检测方法的一对特异性引物和探针为：
正向引物 F: 5’- GGCCAAAGCAATAGATTGAGATG-3’；
反向引物  R: 5’- CGCATTTCGCTACGTTCTTCA-3’。
荧光探针为：5’-FAM-TCCCGGCAACGGATATCTCGGC-TAMARA-3’。
用于木薯淀粉的检测方法的一对特异性引物与探针为：
正向引物  F: 5’- CCGCCCGAATCGGTTTAC-3’；
反向引物  R: 5’- GATCATTGGCAAAAACGAAATTT-3’；
荧光探针为：5’-FAM-AATGGGATGTCCTACTGC-TAMARA-3’；
所述的探针5’端用报告荧光基团FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3和Cy5其中的一种标记，3’端用淬灭荧光基团MGBNFQ、Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1和Bhq2其中的一种标记。
实施例1：
样品总DNA的提取和检测：
A、分别秤取等重均匀的荸荠淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、莲藕淀粉、马铃薯淀粉和甘薯淀粉200mg置于Axygen 1.5ml的离心管中，加入65℃预热的改良后的CTAB提取缓冲液700ul，充分振荡混匀，65℃温育3h，每隔半30min颠倒混匀一次；
B、取出离心管，待冷至25℃后，加入700ul酚与氯仿配比＝1:1的混合溶液上下颠倒充分混合5分钟，以12000 rpm 离心10分钟取上清，然后再重复此步骤一次；
C、用剪去头部的200μl 枪头将上清液转移到另一个新的离心管中，加入浓度为10mg/ml的 RNaseA2μl；
D、加入体积为700μl的氯仿，上下颠倒充分混合，5分钟，后抽提；
E、室温下，以12000 rpm 离心10分钟，吸取将上清液转移到另一新的离心管中；
F、加入体积为700μl的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟后可见沉淀，待完全沉淀后完全，在-20℃放置1-2小时；
G、室温下，12000 rpm 离心10分钟，沉淀积于管底，弃尽倒去上清液；
H、加入700μl 体积百分含量为70%的乙醇清洗30分钟；
I、倒去离心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干；
J、加入100ulddH2O溶解，放入-20℃冰箱保存备用；
所述的改良CTAB提取缓冲液由2% m/V CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2 mol/L NaCl，1% PVP，0.1% β-疏基乙醇组成；其他溶液配制以及方法均采用经典CTAB方法。
样品总DNA的检测：荸荠淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、莲藕淀粉、马铃薯淀粉和甘薯淀粉提取的DNA溶液各取5ul，分别以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。另再分别取1-2ul提取的DNA溶液利用微量紫外分光光度计测定所提取的DNA的精确浓度和纯度。
实施例2：
本实施例为验证荸荠淀粉、木薯淀粉两对引物以及Tagman探针扩增产物特异性
分别提取荸荠淀粉和木薯淀粉的DNA，提取后的DNA均定量至50ng/μl，分别以本发明设计的两对引物以及Tagman探针扩增两种淀粉样品，；阴性对照均为TE缓冲液，空白对照均为双蒸水。PCR反应体系为：淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，引物终浓度0.2μmol/L，探针终浓度为0.1μmol/L，用ddH2O补充到25μl；实时荧光PCR反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s、55℃ 1min，共45个循环。
从图1可见，本发明设计的针对于荸荠核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测荸荠淀粉DNA的循环阈值(cycle threshold，Ct值)≤35，为16.17，检测木薯淀粉DNA在Ct值40以内无数值；针对于木薯核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测木薯淀粉DNA的Ct值≤35，为18.66，检测荸荠淀粉DNA在Ct值35以内无数值；此外在Ct值35以内，阴性对照与空白对照无数值，故此检测荸荠淀粉和木薯淀粉的特异性引物与探针只在马蹄淀粉与木薯淀上有荧光信号，同时两者互相没有交叉反应，特异性好。
实施例3：
本实施例为进一步验证荸荠淀粉、木薯淀粉两对引物以及Tagman探针特异性
分别提取荸荠淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、藕粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的DNA，提取后的DNA均定量至50ng/μl，分别以本发明设计的两对引物以及Tagman探针扩增全部淀粉样品，阴性对照模板均为TE缓冲液，空白对照模板均为双蒸水，PCR反应体系为： 淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，引物终浓度0.2μmol/L，探针终浓度为0.1μmol/L，用ddH2O补充到25μl；实时荧光PCR反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s、55℃ 1min，共45个循环。
从图2可见，本发明设计的针对于荸荠核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测荸荠淀粉DNA的Ct值≤35，为16.48，检测木薯淀粉、马铃薯淀粉、藕粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的DNA在Ct值35以内无数值；针对于木薯核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测木薯淀粉DNA的Ct值≤35，为19.04，检测荸荠淀粉、马铃薯淀粉、藕粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的DNA在Ct值35以内无数值；此外在Ct值35以内，阴性对照与空白对照无数值，故此检测荸荠淀粉和木薯淀粉的特异性引物与探针只在马蹄淀粉与木薯淀上有荧光信号，同时不与除去自身之外的其他5种淀粉发生交叉反应，特异性好。
实施例4：
本实施例为确定方法灵敏度
分别取实施例1中提取的荸荠淀粉和木薯淀粉DNA，提取的DNA均定量至100ng/μl后，分别以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg的稀释浓度作为模板进行荧光PCR反应，阴性对照模板均为TE缓冲液，空白对照模板均为双蒸水，PCR反应体系为： 淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，引物终浓度0.2μmol/L，探针终浓度为0.1μmol/L，用ddH2O补充到25μl；实时荧光PCR反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s、55℃ 1min，共45个循环。
从图3,4可见，本发明设计的针对于荸荠核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测荸荠淀粉DNA，在Ct值35以内，各个荸荠DNA稀释浓度扩增曲线均有数值，且阴性对照，空白对照正常，故检测荸荠淀粉实时荧光PCR方法的灵敏度为10pg；针对于木薯核糖体DNA 中的内转录间隔区ITS序列设计的引物与Tagman探针检测木薯淀粉DNA，在Ct值35以内，除了DNA样品浓度为10pg时,其他几个浓度均有数值，且阴性对照，空白对照正常，故检测木薯淀粉实时荧光PCR方法的灵敏度为100pg。
以上所述的实施例，只是本发明的较优选的具体方式之一，本领域的技术员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
 
序列表
荸荠ITS序列1，
1 ttgcctctcg agaacgcgac cggcgcacga gtaacgtaaa atccgccgag gagctgcctc
61 ctcggttccg ccggccacga acgtgctctc ccgcgggggc gcaccgggcg tggttccgga
121 acacggcgtg ggatgacgcc aaggaacacg tatttgtcga gcaggcggcg gtgctctcgc
181 atcgtgcggt ctgtcgaggc caaagcaata aattgggatg actcccggca acggatatct
241 cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga aatgcgatac atggtgtgaa ttgcagaatc
301 ccgtgaacca tcgagtcttt gaacgcaagt tgcgcccgag ggaccatccc gagggcacgc
 361 ctgcctcatg ggcgttagaa gcccattcca cgctcggagc agctgcatcg cagcgtgcgc
 421 cgatgcggac atcggccctc cgagccgcga ggcacgacgg gcacaagtgt agggccatcg
 481 gttgaggccg ggggcagcga gtggtgggct actgcgcgcg ctgcctccgg ttcgaatgcc
 541 gctagagggc ctagtccgac cccgaaacga tgcctgtcgt cgcgtgcggc agcttcggac
 601 cgat
木薯ITS序列2
1741 ataattataa tgggttgccc gggactcgaa cccggaacta gtcggataga gtagaaattt
1801 tccttaaata ggtaaaaaaa tcaaataggt aaaaaaatcc ctctccaagc cgtgcttgca
1861 tttttcattg cacatggctt tccctatgta tacatctaaa actcagttcc cttcctagac
1921 gaaatctcta aggaagttga atactcaatt gcccaatccc tactcgtata ttgtatgagc
1981 atttcataat agaaataaat gaattttttg ttatcccttc atcatttagg gatcatttcg
2041 atttacatgt tttcataacc aattattcat gattggccaa atcattgata gaaataatat
2101 ccaaatacca aacacgtcct ctatataacc tgcgcgaact agaagaaact tttggaaaga
2161 tcaaagaaag aatctgttct tcctccgtaa aaaactcttc taataattcc gaacctaatc
2221 ttttcaaaaa agcgcgtaca gtacttttgt gtttacgggc caaagtttta acacaagaaa
2281 gtcgaagtat atattttatt cgatacaaac tctttttttt tgaggatccg ctataataat
2341 gagaaagatt tctgcatata cgcacaaatc ggtcgataat atcagaatcc gccgaatccg
2401 cccgaatcgg tttactaatg ggatgtccta ctgcgttaca aaatttcgtt tttgccaatg
2461 atccaattaa aggaataatt ggaactattg tatcgagttt cttcatagta ctatctttat
2521 ctattataaa tgaattttct aacatttgac tccgtaccac caaaggattt aattgtacat
2581 ttgaaagata gcccaaaaag ttgagagaat gcttggataa tgaatttata tagatctttt
2641 ctggttgaaa ccagacataa aaatgacatt gacataagtt gacaaggtaa tatttccatt
2701 ttttcatcag aaaaggccga tcttttgaag ccagaattga ttttccttga tatctaacat
2761 aatgcatgaa aggatccttg aacaaccaca agatggcctg aaaatcatta gcaaagactt
2821 ccgcaaaatg ttctattttt ccatagaaaa aaattcgttc aagaaggact cgcaaaaata
2881 ttgatcgtaa atgaaaggat tggttacgga gaaaaaagaa gatggattcg tattcatata
2941 catgagaatt atataggaac aagaaaaatc ttggattcct ttttataaaa atagtaataa
 3001 atttctttgg aataataaga ctgttcaaat tccaatactc atgaagaaag agtcgtaata
3061 aatgcaaaga agagggatct ttcacccaat agcgaagggt ttgaaccaat ttttctagat
3121 ggatggggta aggtattaat atatctgaca cataatttaa atgtggaaat ttgtcctcta
3181 aaaaaggaaa tattgaatga attgatcgta atttatgaga ttttactatc tctgaccttt
3241 ctaaatctaa agaagatact aatcgtaggg aaaatggaat ttccacaata actgcaaagc
3301 cctctgatat catttgataa tacaaattct tgttgtacct aaaaaataga ttttggttag
3361 aatcattagc agaaataatc aaatgattct gttgatacat tcgagtaatt aaacgtttta
3421 caattaataa actagattta ttgtcataac ctacattttc caacaaaata gatctattta
3481 aactatgatc atgagcgaat gtataaatat actcccgaaa gataaatggg tataggaagt
3541 cgttttttcg agatctatct aattctaaat atctttcctc catttttttt tgttttattt
3601 taaattcaat ttgattgaag caaggataga ggatttttat tggattatta aatgatacat
3661 agtgcgatat agtaaaaaca aagtagtata ataagaaaag aatagatacc tcggaaatag
3721 gtaaactcat caacggactg cccatcccct ctttttttcc atctaattgg tttatgtgta
3781 ttataggata ggataaaaag ataattagaa atcctttatt ttttcaagcc gatcgctctt
3841 ttgattttgg gaaaaaatct cgttatcaat atactctttc ttctacacat gcatctcccc
3901 ctcatagtgg agaataacta atagttagga cttattaaaa gaaaatcgga aatctgctca
3961 tagaaattcc cgcattaggt actaatttat ttttaacgtc taattagatc ggataatcat
4021 tcaaattaag aacgtaagct cgttgctttt ttgtttccct ataattggaa ccgtaggagt
4081 ctatccattt atttactcga cccaattttg aattcatttt tttatgttcc gcaccaagaa
4141 ttcaaataaa gtttggaccg atccggcaaa aattaaatat tctcagaatt ctccattgat
4201 acgacatgct gttttttcca gtcattcctt tcaggatcag tcgtggtctt acaaactata
4261 ccgatggtat ggacgaatcc ctttcttcat acaaatgtgt aaaagatatt agccgcactt
4321 aaaagccgag tactctacca ttgagttagc aacccccctc cccccccccc ctactaaaaa
4381 aaattagatt atgtagatac aatcggaatc aaaataaaaa ataaataaag agattgaatc
4441 atacgacaca attaaaacat taaactagca aaaaattaaa agaaatgaaa tataaaaatt
荸荠ITS序列1，
1 ttgcctctcg agaacgcgac cggcgcacga gtaacgtaaa atccgccgag gagctgcctc
61 ctcggttccg ccggccacga acgtgctctc ccgcgggggc gcaccgggcg tggttccgga
121 acacggcgtg ggatgacgcc aaggaacacg tatttgtcga gcaggcggcg gtgctctcgc
181 atcgtgcggt ctgtcgaggc caaagcaata aattgggatg actcccggca acggatatct
241 cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga aatgcgatac atggtgtgaa ttgcagaatc
301 ccgtgaacca tcgagtcttt gaacgcaagt tgcgcccgag ggaccatccc gagggcacgc
 361 ctgcctcatg ggcgttagaa gcccattcca cgctcggagc agctgcatcg cagcgtgcgc
 421 cgatgcggac atcggccctc cgagccgcga ggcacgacgg gcacaagtgt agggccatcg
 481 gttgaggccg ggggcagcga gtggtgggct actgcgcgcg ctgcctccgg ttcgaatgcc
 541 gctagagggc ctagtccgac cccgaaacga tgcctgtcgt cgcgtgcggc agcttcggac
 601 cgat
 
木薯ITS序列2
1741 ataattataa tgggttgccc gggactcgaa cccggaacta gtcggataga gtagaaattt
1801 tccttaaata ggtaaaaaaa tcaaataggt aaaaaaatcc ctctccaagc cgtgcttgca
1861 tttttcattg cacatggctt tccctatgta tacatctaaa actcagttcc cttcctagac
1921 gaaatctcta aggaagttga atactcaatt gcccaatccc tactcgtata ttgtatgagc
1981 atttcataat agaaataaat gaattttttg ttatcccttc atcatttagg gatcatttcg
2041 atttacatgt tttcataacc aattattcat gattggccaa atcattgata gaaataatat
2101 ccaaatacca aacacgtcct ctatataacc tgcgcgaact agaagaaact tttggaaaga
2161 tcaaagaaag aatctgttct tcctccgtaa aaaactcttc taataattcc gaacctaatc
2221 ttttcaaaaa agcgcgtaca gtacttttgt gtttacgggc caaagtttta acacaagaaa
2281 gtcgaagtat atattttatt cgatacaaac tctttttttt tgaggatccg ctataataat
2341 gagaaagatt tctgcatata cgcacaaatc ggtcgataat atcagaatcc gccgaatccg
2401 cccgaatcgg tttactaatg ggatgtccta ctgcgttaca aaatttcgtt tttgccaatg
2461 atccaattaa aggaataatt ggaactattg tatcgagttt cttcatagta ctatctttat
2521 ctattataaa tgaattttct aacatttgac tccgtaccac caaaggattt aattgtacat
2581 ttgaaagata gcccaaaaag ttgagagaat gcttggataa tgaatttata tagatctttt
2641 ctggttgaaa ccagacataa aaatgacatt gacataagtt gacaaggtaa tatttccatt
2701 ttttcatcag aaaaggccga tcttttgaag ccagaattga ttttccttga tatctaacat
2761 aatgcatgaa aggatccttg aacaaccaca agatggcctg aaaatcatta gcaaagactt
2821 ccgcaaaatg ttctattttt ccatagaaaa aaattcgttc aagaaggact cgcaaaaata
2881 ttgatcgtaa atgaaaggat tggttacgga gaaaaaagaa gatggattcg tattcatata
2941 catgagaatt atataggaac aagaaaaatc ttggattcct ttttataaaa atagtaataa
 3001 atttctttgg aataataaga ctgttcaaat tccaatactc atgaagaaag agtcgtaata
3061 aatgcaaaga agagggatct ttcacccaat agcgaagggt ttgaaccaat ttttctagat
3121 ggatggggta aggtattaat atatctgaca cataatttaa atgtggaaat ttgtcctcta
3181 aaaaaggaaa tattgaatga attgatcgta atttatgaga ttttactatc tctgaccttt
3241 ctaaatctaa agaagatact aatcgtaggg aaaatggaat ttccacaata actgcaaagc
3301 cctctgatat catttgataa tacaaattct tgttgtacct aaaaaataga ttttggttag
3361 aatcattagc agaaataatc aaatgattct gttgatacat tcgagtaatt aaacgtttta
3421 caattaataa actagattta ttgtcataac ctacattttc caacaaaata gatctattta
3481 aactatgatc atgagcgaat gtataaatat actcccgaaa gataaatggg tataggaagt
3541 cgttttttcg agatctatct aattctaaat atctttcctc catttttttt tgttttattt
3601 taaattcaat ttgattgaag caaggataga ggatttttat tggattatta aatgatacat
3661 agtgcgatat agtaaaaaca aagtagtata ataagaaaag aatagatacc tcggaaatag
3721 gtaaactcat caacggactg cccatcccct ctttttttcc atctaattgg tttatgtgta
3781 ttataggata ggataaaaag ataattagaa atcctttatt ttttcaagcc gatcgctctt
3841 ttgattttgg gaaaaaatct cgttatcaat atactctttc ttctacacat gcatctcccc
3901 ctcatagtgg agaataacta atagttagga cttattaaaa gaaaatcgga aatctgctca
3961 tagaaattcc cgcattaggt actaatttat ttttaacgtc taattagatc ggataatcat
4021 tcaaattaag aacgtaagct cgttgctttt ttgtttccct ataattggaa ccgtaggagt
4081 ctatccattt atttactcga cccaattttg aattcatttt tttatgttcc gcaccaagaa
4141 ttcaaataaa gtttggaccg atccggcaaa aattaaatat tctcagaatt ctccattgat
4201 acgacatgct gttttttcca gtcattcctt tcaggatcag tcgtggtctt acaaactata
4261 ccgatggtat ggacgaatcc ctttcttcat acaaatgtgt aaaagatatt agccgcactt
4321 aaaagccgag tactctacca ttgagttagc aacccccctc cccccccccc ctactaaaaa
4381 aaattagatt atgtagatac aatcggaatc aaaataaaaa ataaataaag agattgaatc
4441 atacgacaca attaaaacat taaactagca aaaaattaaa agaaatgaaa tataaaaatt

Claims (6)

1.一种荸荠淀粉和木薯淀粉的实时荧光PCR检测方法，包括DNA提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征是：具体步骤如下：
（1）提取DNA：
A、分别秤取等重均匀的荸荠淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、莲藕淀粉、马铃薯淀粉和甘薯淀粉200mg置于Axygen 1.5ml的离心管中，加入65℃预热的改良CTAB提取缓冲液700ul，充分振荡混匀，65℃温育3h，每隔半30min颠倒混匀一次；
B、取出离心管，待冷至25℃后，加入700ul酚与氯仿配比＝1:1的混合溶液上下颠倒充分混合5分钟，以12000 rpm 离心10分钟取上清，然后再重复此步骤一次；
C、用剪去头部的200μl 枪头将上清液转移到另一个新的离心管中，加入浓度为10mg/ml的 RNaseA2μl；
D、加入体积为700μl的氯仿，上下颠倒充分混合，5分钟，后抽提；
E、室温下，以12000 rpm 离心10分钟，吸取将上清液转移到另一新的离心管中；
F、加入体积为700μl的异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟后可见沉淀，待完全沉淀后完全，在-20℃放置1-2小时；
G、室温下，12000 rpm 离心10分钟，沉淀积于管底，弃尽倒去上清液；
H、加入700μl 体积百分含量为70%的乙醇清洗30分钟；
I、倒去离心管中的乙醇，使DNA沉淀在管中自然晾干；
J、加入100ulddH2O溶解，放入-20℃冰箱保存备用；
（2）DNA的质量浓度测定：
取5ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量，另再取1-2ul提取的DNA溶液利用微量紫外分光光度计测定所提取的DNA的精确浓度和纯度；
（3）PCR检测体系建立：
实时荧光PCR反应体系为总体积25μl，内含淀粉DNA样品2μl，Mix 12.5μl，特异引物终浓度0.2μmol/L，探针引物终浓度为0.1μmol/L，用ddH2O补充到25μl，在一定的反应条件下进行实时荧光PCR反应；
（4）PCR扩增产物的检测：
对荸荠淀粉、木薯淀粉两对引物以及Tagman探针扩增产物特异性和灵敏性检测。
2.根据权利要求1所述的荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，其特征是：步骤（1）所述的改良CTAB提取缓冲液配方的组分质量浓度为：2% m/V CTAB，100 mmol/L Tris-HCl  pH 8.0，20 mmol/L EDTA  pH 8.0，2 mol/L NaCl，1% PVP，0.1% β-疏基乙醇。
3.根据权利要求1所述的荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，其特征是：步骤（3）所述的特异引物和探针引物为：
荸荠淀粉特异性引物和探针为：
正向引物 F: 5’- GGCCAAAGCAATAGATTGAGATG-3’；
反向引物  R: 5’- CGCATTTCGCTACGTTCTTCA-3’；
荧光探针为：5’-FAM-TCCCGGCAACGGATATCTCGGC-TAMARA-3’；
木薯淀粉特异性引物和探针为：
正向引物  F: 5’- CCGCCCGAATCGGTTTAC-3’；
反向引物  R: 5’- GATCATTGGCAAAAACGAAATTT-3’；
荧光探针为：5’-FAM-AATGGGATGTCCTACTGC-TAMARA-3’。
4.根据权利要求3所述的荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，其特征是：所述的探针引物5’端用报告荧光基团FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3和Cy5其中的一种标记，引物3’端用淬灭荧光基团MGBNFQ、Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1和Bhq2其中的一种标记。
5.根据权利要求1所述的荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，其特征是：步骤（3）所述的实时荧光PCR反应条件为：95℃ 10min；95℃ 15s、55℃ 1min，共45个循环。
6.根据权利要求1所述的荸荠淀粉和木薯淀粉的PCR检测方法，其特征是：所述的改良CTAB提取缓冲液由2% m/V CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2 mol/L NaCl，1% PVP，0.1% β-疏基乙醇组成。
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