CN104313159A - 一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重pcr-ldr检测试剂盒 - Google Patents

一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重pcr-ldr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测14个耳聋易感基因的PCR-LDR检测试剂盒，包括包装盒体(1)，PCR扩增和LDR反应试剂(2)-(5)；包括8对PCR引物、16组探针其中包括2组通用探针和14组检测探针。该方法灵敏度高，判读清晰准确；相对传统测序技术，本试剂盒能完成一次性获得14个关键耳聋基因突变诊断结果的高通量筛查，具有经济、高效和高准确率等优势。

Description

一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及DNA分子检测技术领域，具体是一种14个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒。
背景技术
耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素(如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等)或基因和环境两者共同作用而致。我国现有听力残疾人群2780万，居各类残疾之首(33％)。有研究发现GJB2、SLC26A4、线粒体基因是导致中国大部分非综合征性耳聋的3个最常见的致病基因。
GJB2基因是第一个被克隆和鉴定的遗传性耳聋致病基因，也是导致非综合性耳聋最常见的致病基因。在非综合征性耳聋中，约有20％是GJB2基因突变导致的。GJB2基因编码的Cx26蛋白在耳蜗内呈高水平表达，与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道。这些通道在信息传递和物质交换中起重要作用，是电解质、第二信使和代谢产物在细胞间转换的重要通道。GJB2基因突变后，使钾离子回流进入内淋巴的循环受到影响，导致感音神经性耳聋。GJB2基因最常见的突变类型是235de1C，其次是299-230delA＞T和176-191del16，其等位基因频率分别为11.90％、2.22％和0.65％。病理性235delC突变导致移码突变，产生无功能的蛋白质，使缝隙连接缺损，从而影响离子通道的正常开闭。299-300delAT突变导致Cx26多肽的CL区大部分缺失，TM3、EC2和TM4区完全缺失，可能丧失对缝隙连接通道pH值的调控，降低缝隙连接对异型蛋白的辨别能力。176-191del16指176位后16个碱基丢失，从59号密码子开始移码，使得终止密码提前至75号，产生无功能的蛋白质。
间隙连接蛋白家族中GJB3是编码间隙连接蛋白31(Cx31)，其功能主要以连接子复合体的形式融入膜间隙连接通道，参与细胞通讯。已有的耳聋群体分子流行病学资料表明，GJB3基因c.538C＞T点突变导致其编码的Cx31蛋白的结构与功能发生变化，可以通过影响细胞间隙连接的形成，从而导致遗传性耳聋的发生。
SLC26A4基因属于离子转运体26A家族(solute carder family26A。SLC26A)，编码离子转运相关蛋白。在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性耳聋DFNB4和Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)。SLC26A4基因最常见突变类型是IVS7-2A＞G，此外还包括2168A＞G，1226G＞A，1174A＞T，1975G＞C，2027T＞A等热点突变。
WSF1基因定位于人类染色体的4p16上，其编码产物是一种对糖苷内切酶敏感的膜糖蛋白，其功能与担任细胞内、外离子转运功能的微管网状组织密切相关，直接影响内耳的生理功能。研究证明，WSF1基因的突变被证实是导致低频感音神经性听力损失的主要原因之一。主要表现为两处突变：2158A＞G、2596G＞A，WFS1基因的突变杂合子可以引起常染色体显性遗传病低频感音神经性听力损失的突变杂合子可以引起常染色体显性遗传病低频感音神经性听力损失。
线粒体DNA突变是引起听力损伤的重要原因之一。其中，线粒体12SrRNA基因突变与综合征型耳聋和非综合征型耳聋相关，位于12SrRNA解码区的1555A＞G和1494C＞T突变是造成氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合征型耳聋常见的分子机制。这些突变可能造成12SrRNA二级结构的改变，破坏了线粒体蛋白的合成，降低细胞内ATP的产生，是细胞内外离子浓度失衡，耳蜗毛细胞凋亡，由此引起的线粒体功能障碍导致耳聋。
目前常用的基因突变检测技术主要包括：直接测序技术、限制性片段长度多态性(RFLP)、DNA芯片技术(Micro array)、变性高效液相色谱(DHPLC)、单链构象多态性(SSCP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)等。这些方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。
本试剂盒采用一种通用荧光探针的多重PCR-LDR基因多态性检测方法。本发明旨在设计2套不同碱基序列的通用荧光探针组合即2条通用模板及对应2种不同荧光修饰通用探针，进行多重PCR-LDR反应和毛细管电泳技术，同时可检出耳聋14个基因位点并对其进行基因分型。本发明方法包括以下步骤：引物及探针设计，多重PCR体系反应、多重LDR连接反应、测序仪结果检测。本试剂盒由于测序结果的直接性，解决了结果的假阳性和假阴性；3730xl测序平台的样本高通量性，可同时进行94例样本的检测；利用3730xl测序仪的5色荧光检测系统，一个泳道检出14个耳聋基因位点，加快了检测速度。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测14个耳聋易感基因GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G、2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点的PCR-LDR检测试剂盒。
为了实现上述目的，该试剂盒包括PCR扩增试剂和LDR连接反应试剂、基因分型试剂及质控品。
所述PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2，dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，2组引物混合物(Primerl包含GJB2、GJB3、线粒体12SrDNA及WSF1基因共4对引物；Primer2包含2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226及WSF1基因位点共5对引物)以及超纯水；
所述LDR连接反应试剂包括：2组通用荧光探针及14组检测探针混合物，DNA连接酶，10X缓冲液及超纯水。
所述基因分型试剂包括：ROX-300内标，用于基因分型的14个耳聋基因突变位点对应的基因分型标准物。
所述质控品包括：阴性质控品为灭菌的双蒸水，野生型质控品为经测序鉴定14个位点均为野生型的基因组DNA，阳性质控品为GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点的突变质粒。
使用所述的试剂盒进行复合PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的PH值为8.3-8.9，镁离子浓度为1.5-3mM，4种dNTP的终浓度为200-300uM，Taq酶的用量为0.5-1U，2组引物混合物中单对引物终浓度为0.5-5uM，LDR探针混合物中，通用探针终浓度0.1-0.5uM，14组检测探针终浓度为1-5uM。
使用所述试剂盒进行LDR-PCR反应时，扩增阶段反应及LDR连接反应分别在一个复合体系中进行，同时扩增连接GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点。
本发明14个耳聋易感基因位点PCR-LDR检测试剂盒，其特征在于PCR复合扩增使用2组多重引物混合物，LDR复合体系使用16组探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针。
用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del163个基因位点检测的上下游引物目的片段长度为1136bp，其序列分别为：
SEQ NO.1：G2F，GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT
SEQ NO.2：G2R，GAATCTATGTGTTGGGATATGGT
用于IVS7-2A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为450bp，其序列分别为为：
SEQ NO.3：IVS7-2F，CACTGCTGGATTGCTCTC
SEQ NO.4：IVS7-2R，CAAATGGCTTGACGTTTGT
用于2168A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为700bp，其序列分别为为：
SEQ NO.5：2168F，ATCACTTGAACTTGGGACAC
SEQ NO.6：2168R，CTGGGCTTCTTTGTGGCCT
用于1226G＞A、1174A＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为885bp，其序列分别为为：
SEQ NO.7：1226-1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA
SEQ NO.8：1226-1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG
用于1975G＞C、2027T＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为287bp，其序列分别为为：
SEQ NO.9：1975-2027F，TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA
SEQ NO.10：1975-2027R，ATTGCCAAAGCTCCAAACGT
用于线粒体12SrDNA基因1555A＞G、1494C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为923bp，其序列分别为为：
SEQ NO.11：1555-1492F，GATACCCCACTATGCTAGCCCTAA
SEQ NO.12：1555-1492R，GGTAGGTTTGTCGCCTCTACCTATAA
用于GJB3基因538C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为600bp，其序列分别为为：
SEQ NO.13：GJB3F，CGTGTGGGGGGATGAGCAG
SEQ NO.14：GJB3R，GCAGCGGCAGGTGGAAGC
用于WSF1基因2158A＞G、25966＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为671bp，其序列分别为为：
SEQ NO.15：WSF1F，CTGACCTGGCAGCAGTATCG
SEQ NO.16：WSF1R，AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC
本试剂盒使用16组LDR探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针
LDR通用模板1：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG
通用荧光探针1：P-GCATCACTCAGAGGG-FAM
LDR通用模板2：GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT
通用荧光探针2：P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX
176-191del16检测探针序列为：
GJB2_176_M：P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_176_del：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA
GJB2_176_NOdel：TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC
235delC位点检测探针序列为
GJB2_235_M：P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_235_delC：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA
GJB2_235_C：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG
299-230delAT位点检测探针序列为
GJB2_299_M：P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_299_delAT：TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC
GJB2_299_AT：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT
用于SLC26A4基因1975G＞C的检测探针序列为：
1975_M：P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1975_C：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG
1975_G：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
用于SLC26A4基因2027T＞A的检测探针序列为
2027_M：P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2027_T：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA
2027_A：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT
用于SLC26A4基因1174A＞T的检测探针序列为：
1174_M：P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1174_A：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT
1174_T：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA
用于SLC26A4基因1226G＞A的检测探针序列为：
1226_M：P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1226_G：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC
1226_A：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT
用于SLC26A4基因IVS7-2A＞G的检测探针序列为：
IVS7-2_M：P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
IVS7-2_A：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT
IVS7-2_G：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC
用于SLC26A4基因2168A＞G的检测探针序列为：
2168_M：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2168_A：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT
2168_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC
用于12srRNA基因的1494C＞T的的检测探针序列为：
1494_M：P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC
1494_C：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG
1494_T：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA
用于12srRNA基因的1555G＞A的的检测探针序列为：
1555_M：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC
1555_G：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG
1555_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT
用于GJB3基因的538C＞T的检测位点的探针序列如下：
538_M：P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
538_C：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG
538_T：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA
用于WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A，2个检测位点的探针序列分别为：
2158_M：P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
2158_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT
2158_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC
2596_M：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2596_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC
2596_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT
所述16组探针，其中2条通用探针5’端需进行磷酸化修饰，3’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料为不同的荧光素。
使用所述试剂盒时，所检测的材料为人类基因组DNA，选用磁珠或Chelex-100法提取基因组DNA提取对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的血液、组织、羊水、滤纸片血斑、口腔拭子样本、FTA卡血斑等。
使用所述试剂盒进行PCR-LDR反应时，可在任何型号的PCR仪进行，PCR条件为：95°3min；95°30s，60°30s，72°60s，30个循环；72°10min；LDR连接反应条件：95°2min；95°30S，60°2min，30个循环。
根据本发明的实施方案，使用本试剂盒判定检测结果的标准是：每次都同时检测阴性质控品、野生型质控品和突变型质控品，检测结果阴性质控品为阴性，野生型质控品为野生型，突变型质控品为阳性时，实验才有效。
有益效果：
本试剂盒首次采用复合PCR-LDR连接酶检测反应，同时对GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G、1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G、2596G＞A进行PCR-LDR扩增，而后经毛细管电泳后分析片段大小，即可实现对14个耳聋位点的同时检测。高温连接酶(LDR)技术是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，所以该方法特异性极强，我们给予测序分型技术的LDR试剂盒是针对临床应用设计，填补了国内外基因分型及DNA多态性检测在遗传性耳聋分子诊测应用上的空白。相对传统的测序技术，本试剂盒具有以下显著优势：
降低成本：测序反应的所有相关试剂BigDye完全由ABI这样的型国外企业掌握，试剂成本昂贵，但必需使用无法替代，而PCR-LDR技术所使用得探针引物及试剂都可以在国内公司合成订购，可大幅度降低成本。
通量高：DNA序列的测定只是针对某一区段进行，而选中的区段可能只是一个位点，而基于LDR技术的检测系统可以进行多为点的SNP分型，本试剂盒采用复合PCR-LDR体系，一次可以同时检测14个耳聋基因位点信息，同时检测上百例样品，不仅提高了检测效率，也很大程度上节约成本费用。
灵敏度高：传统的测序法(Sanger法)检测灵敏度低，无法检测低滴度样本(突变比率小于15％)；基于PCR-LDR的14位点耳聋易感基因检测方案能够突破传统核酸突变检测技术的局限，对多个突变位点进行检测，检测灵敏度达到1％
操作简单流程短：从DNA制备开始，仅需要5个小时，而传统测序需要10个小时，大大节约了人力物力和时间、防止多步骤操作而产生污染。
附图说明
图1是本发明的试剂盒针对GJB2基因：235delC突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图2是本发明的试剂盒针对GJB2基因299-230delA＞T突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图3是本发明的试剂盒针对GJB2基因：176-191del16突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图4是本发明的试剂盒针对SLC26A4：IVS7-2A＞G突变个体血斑来源DNA测序分型后结果；
图5是本发明的试剂盒针对SLC26A4：2168A＞G突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图6是本发明的试剂盒针对SLC26A4：1226G＞A突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图7是本发明的试剂盒针对SLC26A4：1174A＞T突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图8是本发明的试剂盒针对SLC26A4：1975G＞C突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图9是本发明的试剂盒针对SLC26A4：2027T＞A突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图10是本发明的试剂盒针对线粒体12SrDNA：1494C＞T突变个体血斑来源DNA检测分型后结果；
图11是本发明的试剂盒针对线粒体12SrDNA：1555A＞G突变个体血斑来源DNA检测分型后结果。
图12是本发明的试剂盒针对GJB3基因：538C＞T位点突变个体血斑来源DNA检测分型后结果。
图13是本发明的试剂盒针对WSF1基因的2158A＞G位点突变个体血斑来源DNA检测分型后结果。
图14是本发明的试剂盒针对WSF1基因的2596G＞A位点突变个体血斑来源DNA检测分型后结果。
图15是本发明的试剂盒突变率灵敏度检测试验以1494位点为例说明的DNA检测结果
图16为野生型检测结果
图17是本发明确定的最优引物单重扩增及多重PCR产物凝胶图像，17-1从左至右Marker，GJB2、线粒体12SrDNA、2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226、WSF1、及GJB3基因的引物对应的扩增产物，Marker。17-2为多重PCR产物凝胶图像，多重PCR体系-1包含GJB2、GJB3、线粒体12SrDNA及WSF1基因的PCR产物；多重PCR体系-2包含2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226及WSF1基因位点的PCR产物。
具体实施方式
实施例1：14个耳聋易感基因位点的PCR-LDR检测试剂盒及其使用
1.试剂盒组成：PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2，dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，2组引物混合物(Primer1包含GJB2、GJB3、线粒体12SrDNA及WSF1基因共4对引物；Primer2包含2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226及WSF1基因位点共5对引物)以及超纯水；LDR连接反应试剂包括：2组通用荧光探针及14组检测探针混合物，DNA连接酶，10X缓冲液及超纯水；基因分型试剂包括：ROX-300内标，用于基因分型的14个耳聋基因突变位点对应的基因分型标准物；质控品包括：阴性质控品为灭菌的双蒸水，野生型质控品为经测序鉴定14个位点均为野生型的基因组DNA，阳性质控品为GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点的突变质粒。
2.基因组DNA准备：待检样品选用磁珠或Chelex-100法提取基因组DNA，提取的样品基因组DNA定量在约1ng/ul-10ng/ul。
3.多重PCR反应：PCR缓冲液、MgCl2，dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8对引物混合物以及超纯水，按如下过程实验：
体系：25ul
每次实验都要求同时做阴性对照、野生型对照和阳性对照。
PCR循环参数：
备注：因各地PCR仪器性能不同，循环参数中的退火温度可提高或降低1℃。
3、连接酶反应体系：LDR连接反应试剂包括2组通用荧光探针及14组检测探针混合物，DNA连接酶，10X缓冲液及超纯水
体系：10ul
反应条件：
94℃    2min
94℃    30S；     60℃2min，30Cycles
20℃    pause
4.连接产物在遗传分析仪上分析：
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物{(分子量内标取0.2ul)x(近样数)+(9.8ul去离子甲酰胺)x(近样数)}。将10ul上样混合物与1ul连接产物或基因分型标准物混合，3700rpm离心，避免产生气泡。95℃变性5min，立即冰浴5min，并尽快电泳检测。检测结果用GeneMaper4.0软件进行分析。
5.检测结果判定：
检测阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时实验结果才有效。根据设计的探针长度和构建的等位基因Lader进行判定样本是属于野生型、还是属于14种突变位点的那种突变型。
结论：本试剂盒基因分型结果完整清晰可靠，与测序检测的结果完全一致，详见附图说明。
实施例2确定最佳引物及多重PCR体系
首先设计一系列引物对进行筛选最终选择最优的引物对建立单重PCR反应体系，其结果表明，所设计的引物能够正确地扩增出目的条带，且各条带均较明亮，所有的单重PCR产物均通过测序验证正确。如图17-1所示。从左至右Marker，GJB2、线粒体12SrDNA、2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226、WSF1、及GJB3基因的引物对应的扩增产物，Marker1000bp。其次建立多重PCR体系，通过调整引物之间不同浓度配比，确定最佳的多重PCR体系，本发明建立的多重PCR体系条带清晰，无非特异性条带扩增，如图17-2。
实施例3：特异性试验
取材：取已知14个耳聋基因位点阳性DNA标本，阳性质粒标本，已知阴性标本5个，上述所有标本都进行基因测序，同时使用本试剂盒进行检测，结果分析验证：14位点的耳聋易感基因PCR-LDR检测试剂盒所检测的结果与测序结果完全一致，该试剂盒具有很强的特异性。
实施例4突变检测率灵敏度试验：
1.模板准备
1.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度235 M质粒1uL
2.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 235 M质粒1uL
3.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 235 M质粒1uL
4.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 235 M质粒1uL
5.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度1494 M质粒1uL
6.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 1494 M质粒1uL
7.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 1494 M质粒1uL
8.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 1494 M质粒1uL
9.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度538 M质粒1uL
10.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 538 M质粒1uL
11.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 538 M质粒1uL
12.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 538 M质粒1uL
13.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度2158 M质粒1Ul
14.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 2158 M质粒1uL
15.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 2158 M质粒1uL
16.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 2158 M质粒1uL
17.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+H2O 1Ul
18.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度2596 M质粒1uL
19.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 2596 M质粒1uL
20.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 2596M质粒1uL
21.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 2596M质粒1uL
22.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度2027 M质粒1uL
23.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 2027 M质粒1uL
24.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 2027 M质粒1uL
25.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 2027 M质粒1uL
26.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度1226 M质粒1uL
27.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X 1226 M质粒1uL
28.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X 1226M质粒1uL
29.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X 1226 M质粒1uL
30.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度IVS7-2 M质粒1uL
31.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释10X IVS7-2 M质粒1uL
32.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释100X IVS7-2M质粒1uL
33.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+1ng/ul浓度稀释1000X IVS7-2 M质粒1uL
34.1ng/ul 野生型标本DNA 1uL+H2O 1Ul
2.PCR-LDR反应体系及反应条件按实施例一方案实施。
结论：传统的测序法(Sanger法)检测灵敏度低，无法检测低滴度样本(突变比率小于15％)；基于PCR-LDR的14位点耳聋易感基因检测方案能够突破传统核酸突变检测技术的局限，对多个突变位点进行检测，检测灵敏度可达达到1％，参见附图15
实施例4：临床样本检测
根据上述实施方式，对1000份待测全血样本进行耳聋易感基因检测，其中GJB2235delC突变标本检出10份，299-230delA＞T突变标本检出1份，176-191del16突变标本检出0份，SLC26A4：IVS7-2A＞G突变标本检出5份、2168A＞G突变标本检出2份、1226G＞A突变标本检出2份、1174A＞T突变标本检出1份、1975G＞C突变标本检出6份、2027T＞A突变标本检出3份，线粒体12SrDNA：1555A＞G突变标本检出1份1494C＞T突变标本检出1份，GJB3基因：538C＞T突变标本检出1份和WSF1基因的2158A＞G突变标本检出2份、2596G＞A突变标本检出1份，所有待测标本都已经使用DNA基因组提取，PCR扩增，产物直接测序法进行验证两种方法检测结果一致。结论：
1.相对于直接测序法，PCR-LDR试剂盒的灵敏度更高，数据读取分析更直接，快捷。
2.实验周期比较：直接测序法需10个小时，PCR-LDR试剂盒需4个小时，大大节约了时间。
3.节约成本。与直接测序法比较，PCR-LDR节约了大量试剂，并且可以建立多重体系，更进一步节约了成本。

Claims (3)

1.一种同时检测14个耳聋易感基因的PCR-LDR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包装盒体(1)，PCR扩增试剂(2)，LDR连接反应试剂(3)，基因分型试剂(4)，质控品(5)；
所述PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2，dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8对引物混合物以及超纯水；
所述LDR连接反应试剂包括：2组通用荧光探针及14组检测探针混合物，DNA连接酶，10X缓冲液及超纯水；
所述基因分型试剂包括：ROX-300内标，用于基因分型的14个耳聋基因突变位点对应的基因分型标准物；
所述质控品包括：阴性质控品为灭菌的双蒸水，野生型质控品为经测序鉴定14个位点均为野生型的基因组DNA，阳性质控品为GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191 del 16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226 G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点的突变质粒；
使用所述的试剂盒进行复合PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的PH值为8.3-8.9，镁离子浓度为1.5-3mM，4种dNTP的终浓度为200-300uM，Taq酶的用量为0.5-1U，8对引物混合物中单对引物终浓度为0.5-5uM，LDR探针混合物中，通用探针终浓度0.1-0.5uM，14组检测探针终浓度为1-5uM；
使用所述试剂盒进行LDR-PCR反应时，扩增阶段反应及LDR连接反应分别在一个复合体系中进行，同时扩增连接GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191 del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点；
所述试剂盒中包括PCR复合扩增使用8对引物，LDR复合体系使用16组探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针；
用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del16 3个基因位点检测的上下游引物目的片段长度为1136bp，其序列分别为：
SEQ NO.1：G2F.GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT
SEQ NO.2：G2R.GAATCTATGTGTTGGGATATGGT
用于IVS7-2A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为450bp，其序列分别为：
SEQ NO.3：IVS7-2F，CACTGCTGGATTGCTCTC
SEQ NO.4：IVS7-2R.CAAATGGCTTGACGTTTGT
用于2168A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为700bp，其序列分别为：
SEQ NO.5：2168F，ATCACTTGAACTTGGGACAC
SEQ NO.6：2168R.CTGGGCTTCTTTGTGGCCT
用于1226G＞A、1174A＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为885bp，其序列分别为：
SEQ NO.7：1226-1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA
SEQ NO.8：1226-1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG
用于1975G＞C、2027T＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为287bp，其序列分别为：
SEQ NO.9：1975-2027F，TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA
SEQ NO.10：1975-2027R，ATTGCCAAAGCTCCAAACGT
用于线粒体12SrDNA基因1555A＞G、1494C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为923bp，其序列分别为：
SEQ NO.11：M-F，gataccccactatgcttagccctaa
SEQ NO.12：M-R.ggtaggtttgtcgcctctacctataa
用于GJB3基因538C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为600bp，其序列分别为：
SEQ NO.13：GJB3F，CGTGTGGGGGGATGAGCAG
SEQ NO.14：GJB3R，GCAGCGGCAGGTGGAAGC
用于WSF1基因2158A＞G、2596G＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为671bp，其序列分别为：
SEQ NO.15：WSF1F，CTGACCTGGCAGCAGTATCG
SEQ NO.16：WSF1R，AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC
所述试剂盒使用16组LDR探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针
LDR通用模板1：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG
通用荧光探针1：P-GCATCACTCAGAGGG-FAM
LDR通用模板2：GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT
通用荧光探针2：P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX
176-191 del16检测探针序列为：
GJB2_176_M：P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_176_del：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA
GJB2_176_NOdel：TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC
235delC位点检测探针序列为
GJB2_235_M：P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_235_delC：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA
GJB2_235_C：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG
299-230delAT位点检测探针序列为
GJB2_299_M：P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
GJB2_299_delAT：TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC
GJB2_299_AT：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT
用于SLC26A4基因1975G＞C的检测探针序列为：
1975_M：P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1975_C：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG
1975_G：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
用于SLC26A4基因2027T＞A的检测探针序列为
2027_M：P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2027_T：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA
2027_A：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT
用于SLC26A4基因1174A＞T的检测探针序列为：
1174_M：P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1174_A：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT
1174_T：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA
用于SLC26A4基因1226G＞A的检测探针序列为：
1226_M：P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
1226_G：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC
1226_A：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT
用于SLC26A4基因IVS7-2A＞G的检测探针序列为：
IVS7-2_M：P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
IVS7-2_A：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT
IVS7-2_G：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC
用于SLC26A4基因2168A＞G的检测探针序列为：
2168_M：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2168 A：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT
2168_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC
用于12srRNA基因的1494C＞T的的检测探针序列为：
1494_M：P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC
1494_C：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG
1494_T：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA
用于12srRNA基因的1555G＞A的的检测探针序列为：
1555_M：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC
1555_G：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG
1555_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT
用于GJB3基因的538C＞T的检测位点的探针序列如下：
538_M：P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
538_C：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG
538_T：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA
用于WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A，2个检测位点的探针序列分别为：
2158_M：P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
2158_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT
2158_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC
2596_M：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
2596_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC
2596_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT
所述16组探针，其中2条通用探针5’端需进行磷酸化修饰，3’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料为不同的荧光素。
2.权利要求1所述所述试剂盒，其特征在于，所检测的材料为人类基因组DNA，选用磁珠或Chelex-100法提取基因组DNA提取对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的血液、组织、羊水、滤纸片血斑、口腔拭子样本、FTA卡血斑等。
3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，使用所述试剂盒进行PCR-LDR反应时，可在任何型号的PCR仪进行，PCR条件为：95°3min；95°30s，60°30s，72°60s，30个循环；72°10min；LDR连接反应条件：95°2min；95°30S，60°2min，30个循环。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694644A (zh) * 2015-02-27 2015-06-10 济南英盛生物技术有限公司 一种先天性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒
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CN107794575A (zh) * 2017-10-16 2018-03-13 深圳华大基因股份有限公司 用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒
CN109554463A (zh) * 2018-12-29 2019-04-02 中国人民解放军第四军医大学 一种感音神经性耳聋致病基因gjb2突变检测用试剂盒
CN111073975A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种用于基因snp位点检测的探针体系及其应用
CN111961720A (zh) * 2020-09-02 2020-11-20 诚谨医学检验所(山东)有限公司 一种恶性高热多重pcr-ldr分子诊断试剂盒及其应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694644A (zh) * 2015-02-27 2015-06-10 济南英盛生物技术有限公司 一种先天性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒
CN107641838A (zh) * 2016-07-22 2018-01-30 深圳华大基因股份有限公司 用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法
CN107794575A (zh) * 2017-10-16 2018-03-13 深圳华大基因股份有限公司 用于Pacbio平台的DNA大片段文库构建方法和试剂盒
CN109554463A (zh) * 2018-12-29 2019-04-02 中国人民解放军第四军医大学 一种感音神经性耳聋致病基因gjb2突变检测用试剂盒
CN111073975A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种用于基因snp位点检测的探针体系及其应用
CN111073975B (zh) * 2019-12-31 2023-07-07 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种用于基因snp位点检测的探针体系及其应用
CN111961720A (zh) * 2020-09-02 2020-11-20 诚谨医学检验所(山东)有限公司 一种恶性高热多重pcr-ldr分子诊断试剂盒及其应用

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