CN101657549B

CN101657549B - 用于鉴别单核苷酸多态性（snp）的方法

Info

Publication number: CN101657549B
Application number: CN200880004126.9A
Authority: CN
Inventors: J·沃伊斯滕; M·J·D·德科克
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux BV; Biomerieux Inc
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2028-02-05
Also published as: JP2010517545A; US8119345B2; EP2121973B1; US20100041038A1; EP1956097A1; WO2008095680A1; CN101657549A; ES2475190T3; JP5286283B2; EP2121973A1

Abstract

本发明提供用于鉴别单核苷酸多态性(SNP)的方法，该方法提供了改良的灵敏度和特异性。本发明还涉及检测试剂盒。因此，本发明涉及在对生物学样品的分型检测中进行基因分型的方法，所述样品含有一种感兴趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有单核苷酸多态性(SNP)，该方法包括以下步骤：在存在至少两种不同的标记探针的条件下，对所述靶进行实时扩增，产生扩增子的多个拷贝，其中每种探针允许在野生型和至少一种可能的突变的SNP位置进行实时检测；基于两种检测探针的每一组合的信号评估判别变量值；和区分基因型。本发明在用于诊断、预防和治疗应用的方法中尤其有用。

Description

用于鉴别单核苷酸多态性(SNP)的方法

本发明提供用于鉴别单核苷酸多态性(SNP)的方法，该方法提供改良的灵敏度和特异性。

单核苷酸多态性(SNP)是单碱基改变或点突变，还包括所谓的“indel”突变(核苷酸的插入或缺失)，从而在个体间产生遗传变异。SNP占全部人类遗传变异的约90%，在30亿个碱基的人类基因组中每100-300个碱基发生一次。然而，SNP可以在其他生物体(如，病毒)中更为频繁地发生。SNP可以发生在基因组的编码区或非编码区。编码区的SNP可以改变或不改变蛋白质产物的氨基酸序列。非编码区的SNP可以改变启动子或加工位点，并可以影响基因转录和/或加工。了解个体是否在基因组区域具有感兴趣的特定SNP，可以提供足够的信息以开发针对多种疾病的诊断、预防和治疗性应用。

存在多种对SNP进行基因分型的方法。对SNP基因分型方法的关键要求是其能明确地区分存在的等位基因突变体。因为人类是二倍体，对双等位基因SNP而言存在3种可能的基因型：患者具有纯合的野生型序列、纯合的突变序列、或杂合序列。这些方法中的大多数可基于分子机制分为4组：等位基因特异性杂交、等位基因特异性寡核苷酸连接、引物延伸、测序。

近来，实时PCR的出现使得可以开发用于SNP检测的均质法(homogeneous methods)，例如FRET探针的解链曲线分析和5’荧光核酸酶检测(也称作

检测)。这些方法是有吸引力的，因为信号扩增和等位基因检测可在同一个封闭的试管中完成。它们使用荧光等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针，并通常在包含整合的荧光计的热循环仪上进行。这些方法要求适当的探针设计和缓冲液组成以及对PCR循环条件的调整。因此，在这些循环条件中，其中一个最重要的待优化变量是退火温度(Ta)，即允许引物与单条DNA链结合的温度。低Ta可导致非特异性PCR产物的合成，而使用高Ta可减少所需PCR产物的生成。因此，最佳Ta的应用在甚至存在错配的情形下使靶DNA与引物的交叉杂交降至最少而不是避免这种交叉杂交。引物间PCR扩增效率的差异不足以大得允许容易地将正常的核苷酸和突变的核苷酸区分开。

为了通过实时PCR改善SNP检测，对荧光监测进行了优化。

FRET杂交探针的解链曲线分析是Utah大学的专利技术(WO-A-97/46707)。在其最简单的形式中，反应混合物包括两种与靶序列的邻近区域杂交的寡核苷酸探针。以荧光染料标记所述两种探针邻近的3'和5'末端。由“供体”发射的荧光刺激“受体”荧光团产生独特的荧光复合物。所述复合物仅在所述探针与所扩增DNA上的邻近位点结合时形成。一旦完成PCR扩增，可通过缓慢加热扩增子/探针异源双链体并测量探针与扩增子解离所产生荧光的改变生成“解链曲线”。解链曲线分析的原理是各双链DNA有其自身特定的解链温度(Tm)，Tm被定义成50%的DNA变为单链时的温度。因此，温度曲线对于正常和突变的等位基因有所不同。相对于探针与突变等位基因形成的复合物而言，突变探针与野生型等位基因间的单核苷酸错配使得探针在更低的温度解离或解链。

虽然这一技术可用以鉴定核酸中的SNP，但其在实际应用上存在一些缺点。由于两种类型的等位基因之间的序列差异非常小，设计为优先与一种类型的扩增子结合的探针也很有可能显示出可与另一种扩增子类型相结合。例如，在如SNP这种情形的取代中，对PCR产物的解链动力学的影响非常小以至于不能被可靠地检测。

解链曲线方法通常的取代方式是使用水解型

探针。这一技术在国际申请WO-A-92/02638中被公开。5'外切核酸酶检测使用FRET淬灭对聚合酶链反应(PCR)扩增的靶DNA进行分析。探针是含有优选位于5'和3'末端的荧光团和淬灭部分的寡核苷酸。该方法使用两种标记的与突变和正常等位基因互补的ASO探针。这两种探针具有不同的荧光报告染料，但享用共同的淬灭染料。当探针完整时，由于报告染料与淬灭染料近似，所述探针不发荧光。在PCR的退火阶段，这两种探针与它们位于引物位点下游的靶序列竞争性地杂交。随后，随着引物的延伸，杂交的探针通过嗜热水生菌(Thermophilus aquaticus)(Taq)聚合酶的5'核酸酶活性被剪切。这导致报告染料与引起荧光发射显著增加的淬灭物的分离。通过在PCR扩增之后对两种报告染料的荧光强度进行测量而进行基因分型。因为

探针在实时PCR过程中被消化，因此探针不能用于扩增后的解链曲线分析。采用这一典型的5'核酸酶检测技术，在PCR过程中通过对杂交的TaqMan探针的外切核酸酶降解产生了不依赖于温度的荧光信号。

这一方法需要对探针进行仔细设计以允许对多态性靶加以区分，因为优先地精确配对的探针被降解并导致荧光信号的增加。如以上对解链曲线分析的描述，这一技术会发生类似的出现假象的问题。

因此，仍然需要可用于测定核酸序列中的SNP的高灵敏方法。如上述，实时扩增已经允许开发用于SNP基因分型的定性检测，以及对基因表达或病毒载量测量的定量检测。在这些领域，扩增过程中所获得的数据被用于确定原始样品中靶核酸的量。大量研究是进行定量检测所必需的，并存在数种方法。在与分子信标检测相关的NASBA扩增过程中，一种用于对病毒载量进行定量的方法已被描述于Nucleic Acids Research,2002,vol.30,N°6e26。该方法允许对原始样品中HIV-1RNA的量进行测定。该量的评估是基于NASBA的转录率以及信标与其特异性扩增子/靶的结合率产生的荧光的动力学。当野生型RNA(WT)在存在固定量的校准RNA(calibrator RNA)(Q)的条件下被共扩增时，通过k_1,WT V_WT/k_1,Q V_Q的商确定定量变量，其中k_1,RNA(代表k_1,WT和k_1,Q)是分子信标结合的反应速率常数，V_RNA(代表V_WT和V_Q)是转录率。以HIV-1检测进行的许多研究已表明这一定量变量实际上是固定的校准RNA浓度下野生型RNA浓度的稳定估量值。

与所有的预期相反，本申请发明人发现当上述的定量变量k_1,WT V_WT/k_1,Q V_Q用于基于NASBA的定量检测时，可用作SNP基因分型检测的判别变量(discriminatory variable)，这相对于基于单独的荧光信号的分类具有更好的结果。

因此，本发明涉及在对生物学样品的分型检测中进行基因分型的方法，所述样品含有一种感兴趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有单核苷酸多态性(SNP)，该方法包括以下步骤：

-在存在至少两种不同的标记探针的条件下，对所述靶进行实时扩增，产生扩增子的多个拷贝，其中每种探针允许在野生型和至少一种可能的突变的SNP位置进行实时检测；

-基于两种检测探针的每一组合的信号评估判别变量值；和

-区分基因型。

在双等位基因检测中，基因型之间的差别可用于从纯合野生型或纯合突变体区分出杂合突变体。

判别变量值的区分能力是基于相对结合反应速率常数(K₁)，因为如下面所解释的那样，转录率比值抵消。

在分型检测中，K₁值背后的理论比以精心设计的校准品(calibrator)进行的定量检测更为复杂，这是由探针与不同类型扩增子之间的交叉反应性所致。因此，对于双等位基因分型检测，必须区分4种结合反应速率常数：

·k_WT→WT：反映与野生型扩增子结合的野生型探针的反应速率常数，

·k_WT→m：反映与突变的扩增子结合的野生型探针的反应速率常数，

·k_m→WT：反映与野生型扩增子结合的突变探针的反应速率常数，

·k_m→m：反映与突变的扩增子结合的突变探针的反应速率常数。

由于探针的特异性，k_m→WT的值远小于k_WT→WT的值，这也同样适用于k_WT→m相对于k_m→m的关系。

尽管分型检测从定义上讲不是自然定量的，可衍生自两种荧光曲线的定量变量可用作用于分类的判别变量。为了对此进行解释，考虑进行双基因分型检测。在纯合样品的情形中，只存在一种类型的RNA扩增子，两种信标都与其结合。因此，转录率仅指一种类型的扩增子(野生型或突变的扩增子)。

如果考虑对野生型纯合靶进行扩增，则将野生型探针产生的信号用于评估k_WT→WT V_WT的值，V_WT是野生型扩增子的转录率。当这一扩增子是唯一产生的扩增子时，将由突变探针产生的信号用于评估k_m→WT V_WT的值。因此，在定量检测中所使用的商k_1,WT V_WT/k_1,Q V_Q简化为k_WT→WT V_WT/k_m→WT V_WT，然后再进一步简化为k_WT→WT/k_m→WT，因为转录率被约去。因此，根据该方法的一个实施方式，通过计算比值k_WT→WT/k_m→WT或其倒数实现对用于纯合野生型的判别变量值的评估。

类似地，对于纯合的突变基因型，所述商简化为k_WT→m V_m/k_m→m V_m，然后再进一步简化为k_WT→m/k_m→m。显然，第一个比值(k_WT→WT/k_m→WT)在数值上将远大于第二个比值(k_WT→m/k_m→m)。因此，根据该方法的一个实施方式，通过计算比值k_WT→m/k_m→m或其倒数实现对用于纯合突变类型的判别变量值的评估。

对于杂合基因型，存在两种不同的靶。当扩增的起始材料是DNA时，很显然扩增后样品中的扩增子的浓度是相同的，因为两种等位基因以相同的量存在。同样，由于在靶序列上存在非常小的差异，扩增子的转录率将被认为是相同的。现在，所述商的分子简化为k_WT→WT和k_wt→m的合并，反应野生型探针的结合；所述商的分母简化为k_m→m和k_m→WT的合并，反应突变探针的结合。由于两种基因的浓度相同，这种合并是加法，所述商因此变成(k_WT→WT+k_WT→m)/(k_m→m+k_m→WT)。因此，根据该方法的一个实施方式，通过计算比值(k_WT→WT+k_WT→m)/(k_m→m+k_m→WT)或其倒数实现对用于杂合型的判别变量值的评估。

本领域技术人员了解有可能从本发明的教导出发，将比值用于评估SNP的存在，其可以轻微偏离上述本发明的比值但仍然发挥作用。例如，除加法外，减法、乘法或除法运算都同样是可能的。应用这些比值的任何其它方案都将落入本发明的保护范围。

因为转录率比值约去，仅剩下探针结合率，所观察到的判别变量值与靶、引物和酶的确切量无关，且与酶的活性无关。因此，判别变量值可用于涉及除NASBA外其他扩增方法(例如PCR)的基因分型检测。

根据该方法的一个实施方式，通过评估反应的相对结合反应速率常数(k1)实现对两种检测探针的每种组合的判别变量值的评估，这两种检测探针在所述反应中与扩增子结合。

根据该方法的另一个实施方式，通过评估反应的相对解离反应速率常数(k2)实现对两种检测探针的每种组合的判别变量值的评估，这两种检测探针在所述反应中与扩增子解离。

因此，对每种检测探针的判别变量值的评估允许对基因型进行确定。表示判别变量的数值范围可以利用临界值分为不同的范围，其值取决于探针特性。

因此，根据该方法的一个实施方式，可以利用多个临界值将衍生自两种探针信号的组合的判别变量所能达到的值的范围分为多个范围，使得用于每种基因型的判别变量所能达到的值集中于这些范围中的一个范围中。

在双等位基因SNP的情形下，利用临界值将判别变量所能达到的值分为3个范围：

·较低的范围将含有

ο纯合野生型的簇(条件是第一种探针允许检测突变型，而第二种探针允许检测野生型)。第一种探针和第二种探针涉及判别变量比值中的反应速率的位置。第一种探针的反应速率位于分子，第二种探针的反应速率位于分母。

ο纯合突变型的簇(条件是第一种探针允许检测野生型，而第二种探针允许检测突变型)。

·较高的范围将含有

ο纯合野生型的簇(条件是第一种探针允许检测野生型，而第二种探针允许检测突变型)。

ο纯合突变型的簇(条件是第二种探针允许检测野生型，而第一种探针允许检测突变型)。

·中间的范围(介于较低的范围与较高的范围之间，且不重叠)将含有杂合型的簇。

根据另一个实施方式，本发明涉及用于在多等位基因分型检测中进行基因分析的方法，在所述分型检测中必须检测超过两种的遗传类型。

在必须使用两种探针的情形下，适用上述相同的原则，但是判别变量所能达到的值的范围将被分为超过3个的范围。例如，对于三等位基因分型检测，一个范围将含有3种野生型等位基因的结果的簇，一个范围将含有两种野生型和一种突变等位基因的结果，一个范围将含有一种野生型和两种突变等位基因的结果，第四个范围将含有3种突变等位基因的结果。

对于三等位基因分型检测，基因型例如可以是AAA、AAG、AGG和GGG。与双等位基因分型检测类似，所述判别变量分别评估k_1,A→A/k_1,G→A、(2k_1,A→A+k_1,A→G)/(2k_1,G→A+k_1,G→G)、(k_1,A→A+2k_1,A→G)/(k₁,_G→A+2k₁,_G→G)以及k_1,A→G/k_1,G→G。这随后产生4个不同的范围，两个中间组相互之间最为接近。

在必须使用三种或更多种探针的情形下，判别变量值可得自每两条荧光曲线的组合。将使用应用相同原则的多维分类策略。

优选地，所述探针含有一或多个核苷酸和/或核苷酸类似物，所述核苷酸类似物具有增加亲和力的修饰。对多态性的灵敏度由于探针对多态位点的亲和力增加而降低。因此，所述探针能识别几种扩增子，每种扩增子含有一种不同的已知或未知的SNP。

同样，引物的一个或一些核苷酸可以由其它的核苷酸取代，只要所述

引物的特异性和所述引物的解链温度没有太大的改变。显然，对于本领域技术人员而言，除常用的核苷酸A、G、C和T之外，经修饰的核苷酸例如肌苷(inosin)、2’-O-甲基等也可以用在引物和探针中。其它实例有含有经修饰的碱基(例如5-甲基脱氧胞苷、5-二甲氨基脱氧尿苷、脱氧尿苷、2,6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿苷)或任何其它允许杂交的经修饰的碱基的至少一种核苷酸。其它经修饰的核苷酸可见于US5,405,950和US5,633,364(发明人均为Mock和Lovern)。本发明的教导使得从权利要求的主题出发进行这样的修饰成为可能。

根据该方法的一个实施方式，通过将样品与一对引物相接触进行扩增，其中正向和反向引物位于SNP位置的两侧。当进行NASBA方法时，正向引物位于SNP位置的下游，反向引物位于SNP位置的上游。当进行PCR扩增时，正向引物位于SNP位置的上游，反向引物位于SNP位置的下游。

根据该方法的另一实施方式，通过将样品同时与一对引物和至少两种经标记的探针接触进行实时扩增。

根据该方法的任一个实施方式，每种探针允许通过与扩增子杂交进行实时检测，探针-扩增子杂交体包括所述SNP位置。

根据该方法的另一实施方式，每种探针通过其提供可区别信号的标记及其存在至少一个核苷酸差异的序列而不同于其它探针。

探针序列对应于野生型靶或一种可能的突变。

在该方法的一个特别的实施方式中，所述探针由分子信标组成。

在该方法的另一个特别的实施方式中，所述靶核酸序列是DNA。

在该方法的另一个特别的实施方式中，所述扩增反应是基于转录的扩增方法，优选NASBA方法。

NASBA方法在欧洲专利EP-B-0329822中有记载。尽管该方法允许对RNA进行扩增，该方法如欧洲专利申请EP-A-1366179中记载的那样可用于扩增双链核酸。这些方法相对于PCR的主要优势在于其是等温地进行。

本发明的另一目的是一种用于在对生物学样品的SNP分型检测中进行基因型检测的检测试剂盒，其包含

-一套寡核苷酸引物，

-至少两种寡核苷酸探针，所述探针包含与至少部分所扩增核酸序列

基本互补的核酸序列，其中一种探针用于野生型鉴定，另一种探针

用于突变型鉴定，每种探针具有互不相同的可检测标记；和

-适当的扩增试剂。

在所述试剂盒的一个特别的实施方式中，所述寡核苷酸引物中的至少一种(称作正向引物)与RNA聚合酶(优选T7RNA聚合酶)启动子结合。

在所述试剂盒的一个特别的实施方式中，其还包含含有能与利用所述正向引物和反向引物扩增的核酸的区域杂交的核酸序列的寡核苷酸探针。

最后，本发明涉及一种检测试剂盒，其中适当的扩增试剂使得可以进行基于转录的扩增方法，优选NASBA方法。

定义

根据本发明，术语“等位基因”指给定基因或DNA片段的一或多种替代形式中的任何一种；给定基因或DNA片段的两种或所有等位基因与相同的性状或特征相关，但是由特定等位基因编码的产物或功能与由该基因或DNA片段的其它等位基因编码的产物或功能在质量和/或数量上有所不同。

因此，术语“多等位基因”指特征在于存在超过一种等位基因的多态位点。术语“双等位基因”指特征在于存在两种不同的等位基因的多态位点。因此，双等位基因SNP是一种多等位基因SNP。

本申请所用术语“基因型”指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有等位基因的何种组合。

术语“基因分型”包括确定特定的等位基因或位于多态位点的特定的核苷酸。

“核酸(NA)”意指DNA和RNA两者，两者均以任何可能的构型存在，即以双链(ds)核酸的形式，或以单链(ss)核酸的形式，或者以其组合形式(部分ds或ss)。这样的核酸对应于任选地包含至少一种修饰的核苷酸的至少两个连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

该多核苷酸也可以在核苷酸间的键的水平上被修饰(例如硫代磷酸、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)，在主链的水平上被修饰(例如α-寡核苷酸(FR-A-2607507)或PNA(M.Egholm et al.,J.Am.Chem.Soc.,114,1895-1897,1992)或2'-O-烷基核糖。这些修饰中的每一种可以联合发生，只要在核酸中存在至少一种磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA、通过酶促扩增技术获得的核酸，所述酶促扩增技术例如是：

-PCR(聚合酶链反应)，记载于US4,683,195、US4,683,202和US4,800,159，及其RT-PCR(反转录PCR)衍生形式(尤其是如专利EP-B-0,569,272中所述的一步形式)，

-RCR(修复链反应(Repair Chain Reaction)),记载于专利申请WO-A-90/01069中，

-3SR(自动维持序列扩增)，记载于专利申请WO-A-90/06995中，

-NASBA(依赖核酸序列的扩增)，记载于专利申请WO-A-91/02818中，以及

-TMA(转录介导的扩增)，记载于US

这样的“核酸”可以用作引物和探针。本申请所用术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖DNA或依赖RNA的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模版或靶序列)互补。通常，一套引物将由至少两条引物组成，一条“上游引物”和一条“下游引物”，它们共同限定扩增子(将利用所述引物扩增的序列)。

“靶序列”被定义为待检测的核酸分子的一部分。其通过引物和与扩增相关的酶进行扩增。扩增生成“扩增子”，扩增子是通过与探针的杂交而被物理检测的核酸分子。

本申请所用术语“探针”包含与扩增子杂交的一段核苷酸。优选地，杂交部分为10-50，更优选15-35，最优选15-30个核苷酸的一段。优选地，根据本发明的探针是所谓的分子信标(MB)。促进特异性核酸靶序列的同质检测的一类寡核苷酸探针(称作分子信标)已有描述(Piatek et al.(1998)Nature Biotechnology16:359-363;Tyagi and Kramer(1996)Nature Biotechnology14:303-308)。分子信标是具有茎环结构的单链寡核苷酸。环部分含有与扩增子(DNA或RNA)互补的序列。茎由于3'末端与5'末端的互补序列的杂交而形成。所述茎可以与扩增子无关，且是双链的。所述茎的一个臂以荧光染料(荧光团)标记，另一个臂与淬灭部分结合。在茎-环状态下，探针不产生荧光，因为荧光团的能量被转移至淬灭分子。当分子信标与扩增子杂交时，茎环结构丧失，且淬灭物和荧光团变成相互分离。在这一阶段，由荧光团发射的荧光可以被检测并定量。

术语“判别变量”意指可衍生自观察到的两种探针的应答并可用于最终分类的应答变量。“判别变量”也可以称作可衍生自荧光曲线的“定量变量”。

本发明将通过实施例并参考附图进行进一步描述，在附图中：

-图1表示根据现有技术获得的结果。

所观测到的两种分子信标信号的荧光信号增长不产生足够的差异。

图例：A，AA基因型；G，GG基因型；H，杂合基因型GA。

-图2表示用根据本发明的技术获得的结果。

相对于来自图1的荧光比值，定量变量值以对数刻度标在纵坐标上。获得各组间所需区别的唯一方式是基于标于纵坐标上的定量变量值。

图例：A，AA基因型；G，GG基因型；H，杂合基因型GA。

实施例：

血栓形成是一种主要的人类病患，每年通过心肌梗塞、肺栓塞或中风使几十万人死亡并使得数百万人变得虚弱。风险因素包括遗传性和获得性疾病。通常，血栓形成的趋势可以起因于机能亢进性凝血途径(hyperactive coagulation pathways)、低活跃抗凝剂机制(hypoactive anticoagulant mechanisms)或低活跃纤维蛋白溶解作用(hypoactive fibrinolysis)。编码这些途径中的蛋白质的基因的突变在从诱因到血栓形成的过程中发挥重要作用。

一种可能的SNP涉及编码一种凝血因子(即，因子II)的基因。在特定的位置，可以存在G(野生型)或A(突变型)核苷酸。

对来自3组患者(纯合野生型、纯合突变体和杂合子)的临床样品进行NucliSens EasyQ因子II检测(NucliSens EasyQ Factor II assay)。在该检测中，在存在两种分子信标的条件下对基因组DNA进行扩增。由于扩增产物的累积产生荧光信号。用及时观察到的最大荧光信号相对于最初背景水平的比值建立对该信号的量的简单测量。

明显的分类是基于荧光增加的程度：

-在纯合基因型中，一种信号类型可能占据优势(A或G)，

-在杂合基因型中，两种信号均出现。

由于基因型间的高同源性，然而又不能开发完全特异性的信标，因此，如从图1可见的那样，在全部3组中两种信号均出现。显然，基因型GG组与其他两组(GA和AA)相区分，但这两组显示出大量的重叠。

或者，使用定量变量。结果见于图2中。横坐标给出了荧光信号增加的比值。显然，定量变量值的分离是完全的。

对定量变量值的一些概述性统计见于下表1：

表1

基因型	n	最小值	最大值	平均值	标准差
						AA	90	-1.71	-1.42	-1.58	0.075
GA	90	-1.20	-1.03	-1.11	0.042
						GG	54	-0.25	+0.13	+0.03	0.087

Claims

1.在对生物学样品的分型检测中进行基因分型的方法，所述样品含有一种感兴趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有单核苷酸多态性(SNP)，该方法包括以下步骤：

-其中每种探针允许通过与扩增子杂交进行实时检测，探针-扩增子杂交体包括所述SNP位置；

-其中，当所述SNP是双等位基因SNP的情形下，基于所述两种不同的标记探针的每一组合的信号主动计算判别变量值；和基于所述判别变量值区分基因型，

杂合基因型的判别变量值是选自以下一组的比值：(k_WT→WT+k_WT→m)/(k_m→m+k_m→WT)、(k_WT→WT-k_WT→m)/(k_m→m-k_m→WT)、(k_WT→WT x k_WT→m)/(k_m→m x k_m→WT)、(k_WT→WT/k_WT→m)/(k_m→m/k_m→WT)和它们的倒数；

纯合突变型的判别变量值是比值k_WT→m/k_m→m或其倒数；

纯合野生型的判别变量值是比值k_WT→WT/k_m→WT或其倒数；

其中k_WT→WT、k_WT→m、k_m→m和k_m→WT分别定义如下：

k_WT→WT：与野生型扩增子结合的野生型探针的反应速率常数；

k_WT→m：与突变的扩增子结合的野生型探针的反应速率常数；

k_m→WT：与野生型扩增子结合的突变探针的反应速率常数；和

k_m→m：与突变的扩增子结合的突变探针的反应速率常数；

-其中，当所述SNP是三等位基因SNP的情形下，基于所述至少两种不同的标记探针的每一组合的信号主动计算判别变量值；和基于所述判别变量值区分基因型，

AAA基因型的判别变量值是比值k_A→A/k_G→A或其倒数；

AAG基因型的判别变量值是选自以下一组的比值：(2k_A→A+k_A→G)/(2k_G→A+k_G→G)、(2k_A→A-k_A→G)/(2k_G→A-k_G→G)、(2k_A→A x k_A→G)/(2k_G→A xk_G→G)、(2k_A→A/k_A→G)/(2k_G→A/k_G→G)和它们的倒数；

AGG基因型的判别变量值是选自以下一组的比值：(k_A→A+2k_A→G)/(k_G→A+2k_G→G)、(k_A→A-2k_A→G)/(k_G→A-2k_G→G)、(k_A→A x 2k_A→G)/(k_G→A x2k_G→G)、(k_A→A/2k_A→G)/(k_G→A/2k_G→G)和它们的倒数；

GGG基因型的判别变量值是比值k_A→G/k_G→G或其倒数；

其中k_A→A、k_A→G、k_G→A和k_G→G分别定义如下：

k_A→A：与野生型扩增子A结合的野生型探针A的反应速率常数；

k_A→G：与突变的扩增子G结合的野生型探针A的反应速率常数；

k_G→A：与野生型扩增子A结合的突变探针G的反应速率常数；和

k_G→G：与突变的扩增子G结合的突变探针G的反应速率常数。

2.根据权利要求1的方法，其中通过将样品与一对引物相接触进行扩增，其中所述一对引物包含位于SNP位置的两侧的正向和反向引物。

3.根据权利要求1的方法，其中通过将样品同时与一对引物和至少两种经标记的探针接触进行实时扩增。

4.根据权利要求1的方法，其中所述至少两种不同的标记探针通过其提供可区别信号的标记及其存在至少一个核苷酸差异的序列而彼此不同。

5.根据权利要求4的方法，其中所述至少两种不同的标记探针的序列对应于野生型靶或一种可能的突变。

6.根据权利要求1的方法，其中所述至少两种不同的标记探针的每一组合的判别变量值是反应的相对结合反应速率常数K₁的比值，在所述反应中所述至少两种不同的标记探针与扩增子结合。

7.根据权利要求1的方法，其中所述至少两种不同的标记探针的每种组合的判别变量值是反应的相对解离反应速率常数k₂的比值，在所述反应中所述至少两种不同的标记探针与扩增子解离。

8.根据权利要求6的方法，其中可以利用多个临界值将衍生自所述至少两种不同的标记探针的信号的组合的判别变量所能达到的值的范围分为多个范围，使得用于每种基因型的判别变量所能达到的值集中于这些范围中的一个范围中。

9.根据权利要求1的方法，其中所述SNP是双等位基因SNP。

10.根据权利要求9的方法，其中利用临界值将判别变量所能达到的值分为3个范围，所述3个范围是较低的范围、中间的范围和较高的范围。

11.根据权利要求10的方法，其中用于杂合靶的判别变量所能达到的值集中在中间的范围。

12.根据权利要求10的方法，其中当判别变量所能达到的值集中在较低的范围时，靶序列是：

·纯合野生型，条件是第一种探针允许检测突变型，而第二种探针允许检测野生型，

·纯合突变型，条件是第一种探针允许检测野生型，而第二种探针允许检测突变型。

13.根据权利要求10的方法，其中当判别变量所能达到的值集中在较高的范围时，靶序列是：

·纯合野生型，条件是第一种探针允许检测野生型，而第二种探针允许检测突变型，

·纯合突变型，条件是第二种探针允许检测野生型，而第一种探针允许检测突变型。

14.根据权利要求1的方法，其中所述探针由分子信标组成。

15.根据权利要求1的方法，其中所述靶核酸序列是DNA。

16.根据权利要求1的方法，其中所述扩增反应是NASBA方法。

17.根据权利要求1的方法，其中所述SNP是三等位基因SNP。