CN101374961A - Pde4d等位基因变体和中风的关联 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过关联磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因的等位基因变体和高血压状态检测个体中的中风倾向的方法。本发明还涉及检测PDE4D多态性的试剂盒和计算机程序产品，所述PDE4D多态性指示与个体的高血压状态相关的中风倾向。

Description

PDE4D等位基因变体和中风的关联

本发明提供通过关联磷酸二酯4D(PDE4D)基因的等位基因变体和高血压状态检测个体中的中风倾向的方法。本发明还涉及检测PDE4D多态性的试剂盒和计算机程序产品，所述PDE4D多态性指示与个体的高血压状态相关的中风倾向。

发明背景

最近，磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因已被鉴别为缺血性中风的风险因素(Gretarsdottir等，Am J Hum Genet(2002)70：593-603)。Gretarsdottir等(2002)进行了全基因组扫描，在染色体5q121上发现连锁峰(LOD＝4.4)。精细作图和相关性研究将PDE4D鉴别为与冰岛人群中的缺血性中风连锁的基因(Gretarsdottir等，Nat Genet(2003)35：131-138)。而且，在转化的B-淋巴细胞中几种PDE4D同种型的mRNA水平在中风病例和对照之间显著变化(Gretarsdottir等，(2003)，出处同上)。

PDE4D是全长1.5Mb的大基因，具有至少22个外显子和8个剪接变体(Gretarsdottir等，(2003)，出处同上；Wang等，Cell Signal(2003)15：883-891；和Bolger等，Biochem J(1997)328：539-548)。PDE4D水解环状AMP(cAMP)(Conti等，J Biol Chem(2003)278：5493-5496)，并以可变的剪接变体表达模式在多种组织中表达(Wang等，出处同上)。PDE4D存在于脑、肺、肾脏、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞以及血管平滑肌细胞中(Bolger等，出处同上；Conti等，出处同上；和Pan等，Biochem Pharmacol(1994)48：827-835)。几个研究已报道PDE4D涉及炎症、增殖和迁移、牵涉中风发作的过程(Ariga等，JImmunol(2004)173：7531-7538；Miro等，Biochem Biophys Res Commun(2000)274：415-421；Palmer等，Circ Res(1998)82：852-861；Pan等，出处同上；和Johnson-Mills等，Biochem Pharmacol(1998)56：1065-1073)。

最初在冰岛人群中鉴别出特异性PDE4D SNP和单倍型与中风的关联(Gretarsdottir等，出处同上(2003))。然而，直至本发明为止，还没有评价在特定亚群中特异性PDE4D SNP和微卫星与中风的关联。本申请解决了这种需求。

发明概述

本发明基于以下发现：存在磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因的至少一种等位基因多态性在个体中基于他们的高血压状态(即有或没有高血压)指示着增加的罹患中风的风险。业已在有或没有高血压的个体中鉴别出预示着中风风险的多态性。

因此，第一方面，本发明提供对没有高血压的个体预测中风倾向的方法，该方法包括

a)在个体样品中检测在PDE4D基因座中包含至少一种多态性的等位基因的存在或不存在，其中在无高血压的个体中存在该等位基因与中风倾向相关；和

b)基于样品中该等位基因的存在或不存在预测人中存在或不存在中风倾向，其中在无高血压个体中存在该等位基因与中风倾向相关。在一个实施方案中，多态性在有高血压的个体中不预示中风。在一个实施方案中，多态性在有高血压的个体中独立地预示中风。

另一方面，本发明提供在人中预测中风倾向的方法，该方法包括

a)在人的样品中检测PDE4D基因座的SNP 175 T/C；和

b)基于样品中多态性的等位基因的存在或不存在预测人中存在或不存在中风倾向，其中存在T与高血压个体中的中风倾向相关。

又一方面，本发明提供在没有高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒含有，

区分SNP 9 A/G的A等位基因和G等位基因的探针或引物；或

区分SNP 219 C/T的C等位基因和T等位基因的探针或引物；或区分SNP 220 C/A的C等位基因和A等位基因的探针或引物。典型地，所述探针或引物在例如聚合酶链式反应(PCR)或引物延伸反应的多聚化依赖性反应中区分多态等位基因。多态性的一种等位基因的选择性扩增可与扩增反应同时检测(即“实时”)，或在扩增反应之后检测。

又一方面，本发明提供在具有高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒含有，

区分SNP 175 T/C的T等位基因和C等位基因的探针或引物。

又一方面，本发明提供用于在个体中预测中风倾向的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含：

用程序码编码的计算机可读介质，所述程序码包含：

用于在主机接收信息的计算机代码，所述信息指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座的多态性的等位基因，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219 C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT₈、TCAT₉、TCAT₁₀、TCAT₁₁、TCAT₁₂或TCAT₁₃)和SNP 175 T/C；和

用于确定个体的中风倾向的计算机代码，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP 175 T/C中的T。

又一方面，本发明提供用于确定个体的中风倾向的计算机实施方法，所述方法包括：

在主机接收信息，所述信息指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座多态性的等位基因，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219 C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)和SNP175T/C；和

确定个体的中风倾向，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP 175 T/C中的T。

附图简述

图1图示了PDE4D基因。图1A)PDE4D的结构。每个方框都代表外显子或外显子系列，两个基因分型区由基因上的条棒显示。图1B)在A区中基因分型的多态性。图1C)在图1D区域中基因分型的多态性。

图2图示了在骨质疏松性骨折(SOF)研究的中风子研究和冰岛研究中针对对照的连锁不平衡图比较。每个方块中的数字为r²×100的值，颜色强度显示了每个SNP对的P值。颜色强度图例为对数分度，星号标记约0.05的位置。每个图上方的图描绘了多态性的相对位置。

发明详述

1.引言

本发明基于以下发现：磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因的多态性在与个体的高血压状态关联时指示个体中增加的中风风险。尽管先前已鉴别出本文描述的众多PDE4D遗传变体，但它们的存在或不存在与预测的中风风险明显无关联。但是，发明人已发现，在按照他们的高血压状态(即有或没有高血压)划分个体时，鉴别出其存在或不存在预示着中风风险的单独或组合的某些多态性。

2.定义

术语“中风”指由可促发局部血管疾病的神经欠缺突然发作限定的脑血管意外(参见Kasper等，Harrison’s Principles of InternalMedicine，2005，第16版，McGraw-Hill的第349章)。术语“中风”包括任一种在临床上定义的不同类型的中风，包括但不限于缺血性中风、心栓型中风、出血性中风、动脉粥样硬化血栓形成性梗塞、小间隙(小血管)梗塞、颈动脉中风、大血管中风等。

本文使用的术语“高血压”指收缩血压≥160mmHg和/或舒张血压≥90mmHg的受试者中的病症。高血压受试者还可以服用噻嗪类利尿剂。高血压详细描述于例如可在万维网merck.com/mrkshared/mmanual/home.jsp获得的The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第17版，Beers和Berkow编辑，2005的第199章，以及Harrison’s Internal Medicine，第16版，Kasper等编辑，2005的第230章。

本文使用的术语“倾向”指在个体的群体或亚群中经历中风的易感性增加。倾向可相比于一般性或未划分群体、不同亚群或相同亚群检测。

在本文可互换使用的表述“与中风倾向相关”或“预示中风”指一种或多种多态性(例如SNP、微卫星、单倍型)或等位基因或其组合，其存在在统计学上与个体群体中增加的中风发生风险显著相关(即p值小于0.05)。相关或关联可相比于一般性或未划分群体、不同亚群或相同亚群检测。所述群体可为已划分的或未划分的。所述群体可由一个或多个参数限定，例如性别、种族、种族本源、年龄、存在另一种疾病(例如存在高血压、没有高血压、肥胖、糖尿病、尼古丁依赖)。

表述“抗中风的保护作用”指在统计学上与个体群中降低的中风发病率或降低的中风发生风险相关联的一种或多种多态性。保护性作用可相比于一般性或未划分群体、不同亚群或相同亚群检测。所述群体可为已划分的或未划分的。所述群体可由一个或多个参数限定，例如性别、种族、种族本源、年龄、存在另一种疾病(例如存在高血压、没有高血压、肥胖、糖尿病、尼古丁依赖)。

术语“优势比”或“OR”指具有事件(例如中风)的可能性对没有事件的可能性的比率。如果OR大于1，则人具有事件的风险增加，如果OR小于1，则人具有事件的风险降低。参见Norman和Streiner，Biostatistics The Bare Essentials，第2版，BC Decker Inc，2000。

术语“风险比”或“HR”指假定存活至时间t并针对特定预后性变量(例如年龄、高血压等)值时在时间t的事件(例如中风)可能性。如果HR大于1，则人具有事件的风险增加，如果HR小于1，则人具有事件的风险降低。参见Norman和Streiner，出处同上。

术语“相对风险度”或“RR”指在第一组中具有事件(例如中风)的可能性与第二组中出现的可能性相比的比率。一般而言是与未选择的一般性个体群相比。如果RR大于1，则人具有事件的风险增加，如果RR小于1，则人具有事件的风险降低。参见Norman和Streiner，出处同上。

术语“磷酸二酯酶4D”或“PDE4D”指水解环化AMP(cAMP)的磷酸二酯酶4D蛋白，或编码该蛋白的核酸，包括任何剪接变体、外显子、内含子或未翻译区域。术语PDE4D通常指基因组核酸序列。例如，PDE4D含有与美国专利公布号2005/0164220中公开的SEQ IDNO：1或另一个基因组PDE4D核酸序列(包括GenBank数据库登录号NT_086673、NT_006713或AY406254)至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。在其它实施方案中，PDE4D指mRNA或cDNA核酸序列，包括任何剪接变体。例如，PDE4D可含有与GenBank数据库登录号NM_006203、BC036319、BC008390、AY245867、AY245866、AY388960、AF536977、AF536976、AF536975、U50159、U50158、U50157、U79571、AF012074或AF012073至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

术语“等位基因”指目标基因的核苷酸序列变体。

术语“基因型”指个体或样品中包含的基因的等位基因的描述。在本发明范围内，没有对个体基因型和来源于个体的样品的基因型加以区别。尽管通常基因型由二倍体细胞的样品确定，但基因型可由单倍体细胞如精细胞的样品确定。

“多态性”指群体中出现基因的两个或多个遗传确定的可变序列。通常，第一个已鉴定的等位基因型任意地称为参比形式，其它等位基因型称为可变或变体等位基因。有时将在选定群体中最经常出现的等位基因型称为野生型。

术语“单倍型”指两个或多个等位基因或两个或多个多态性的组合。

本文使用的术语“连锁不平衡”指在不同基因座随机不相关(即不和它们的频率成比例相关)的等位基因。如果等位基因为正连锁不平衡，则等位基因比预期的假定统计学无关更经常地一起出现。相反，如果等位基因为负连锁不平衡，则等位基因没有比预期的假定统计学无关更经常地一起出现。

“单核苷酸多态性”或“SNP”是在等位基因之间可变的1个核苷酸位点。单核苷酸多态性可出现在基因的任何区域。在某些情况下，多态性可导致蛋白序列改变。蛋白序列的改变可影响或不影响蛋白功能。

本文提及的PDE4D单核苷酸多态性(SNP)和微卫星序列如先前在美国专利公布号2005/0164220和Gretarsdottir等，Nature Genetics(2003)35(2)：131-138中所述编号(即SNP9)，包括所有附图、表和序列表。在本申请中论述的SNP和微卫星序列描述于下表1。

“微卫星”指由串联重复可变次数的短碱基对序列产生的DNA多态性类别。短碱基对序列通常长约1、2、3、4、5或6个核苷酸碱基。微卫星可包含例如约5-100个或更多个串联重复序列，更通常包含约5-50个或5-25个串联重复序列，典型地包含约5-15个或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个串联重复序列。

术语“杂交”指两个单链核酸由于互补碱基配对形成双链结构。杂交可发生在完全互补的核酸链之间或含有小错配区域的核酸链之间。

本文使用的术语“基本互补”指除了小错配区域之外互补的序列。典型地，对于长约15个核苷酸的序列，在杂交区域内错配核苷酸的总数不超过3个核苷酸。在其下仅完全互补的核酸链才杂交的条件称为“严格”或“序列特异性”杂交条件。大致互补的核酸的稳定双链体可在不太严格的杂交条件下获得。核酸技术领域的技术人员可考虑许多变量凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度和碱基对浓度、离子强度和错配碱基对发生率。用于计算双链体稳定性的计算机软件可购自National Biosciences，Inc.(Plymouth，Minn.)；例如OLIGO第5版参考手册。

在其下寡核苷酸将仅与完全互补的靶序列杂交的严格的序列特异性杂交条件在本领域众所周知(参见例如在有关检测核酸序列中的多态性的章节中提供的一般性参考文献)。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中将不同。一般来说，选择的严格条件为比特定序列在限定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在其下50％的碱基对解离的温度(在限定的离子强度和pH下)。放松杂交条件的严格性将容许序列错配；容许的错配程度可通过杂交条件的适宜调整来控制。

术语“引物”指在其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在适宜的缓冲液中存在4种不同的三磷酸核苷和用于聚合的物质(即DNA聚合酶或逆转录酶)和适宜的温度下，用作DNA合成起点的寡核苷酸。引物通常为单链寡脱氧核糖核苷酸。引物包括与靶序列完全或大致互补的“杂交区域”，通常约15个至约35个核苷酸长。本领域众所周知的影响杂交稳定性的修饰碱基或碱基类似物的应用可使得能够使用具有相仿稳定性的较短或较长的引物。引物寡核苷酸可完全由杂交区组成，或者可以包含允许检测、固定或操作扩增产物的额外特征，但其不改变引物用作DNA合成起始试剂的能力。例如，可在与捕获寡核苷酸杂交的引物的5′末端包含核酸序列尾。

本文使用的“等位基因特异性引物”是这样的引物：其与靶序列杂交，使得引物的3′末端，通常为3′末端核苷酸，与目标多态位点对齐，并与多态位点的其中一个等位基因完全互补。本文使用的引物对在3′末端与其完全互补的等位基因是“特异性的”。一般来说，在错配存在于引物的3′末端时引物延伸被抑制。等位基因特异性引物在与完全互补的等位基因杂交时可以较高的效率延伸。同一引物在与其它等位基因杂交时由于在杂交双链体中的引物3′末端的错配而不容易延伸。因此，等位基因特异性引物的使用基于是否形成可评估的延伸产物区分等位基因。等位基因特异性引物区分一个等位基因和另一个等位基因或其它等位基因。

术语“探针”指在适宜条件下与靶核酸选择性杂交的寡核苷酸。探针杂交区域通常为约10个和至约35个核苷酸长，更通常约15个和至约35个核苷酸长。本领域众所周知的影响杂交稳定性的修饰碱基或碱基类似物的应用可使得能够使用具有相仿稳定性的较短或较长的引物。探针寡核苷酸可完全由杂交区组成，或者可以包含允许检测或固定探针的额外特征，但其不显著改变杂交区的杂交特征。

“等位基因特异性”探针包含与靶序列完全或大致互补的“杂交区”，其在目标多态位点与靶序列完全互补。在足够严格的杂交条件下使用探针进行的杂交测定能够选择性检测特定靶序列。等位基因特异性探针区分一个等位基因和另一个等位基因或其它等位基因。

术语“靶序列”或“靶区域”指待分析的并包含目标多态位点的核酸区域。

本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、探针和寡聚物片段。该术语不受长度限制，是聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)以及嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任何其它N-糖苷的线性聚合物的统称。这些术语包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。本发明的寡核苷酸可用作引物和/或探针。因此，在本文被称为“引物”的寡核苷酸可用作探针，被称为“探针”的寡核苷酸在某些实施方案中可用作引物。

核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含磷酸二酯键或修饰的键，包括但不限于磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硅氧烷键、碳酸酯键、羧甲基酯键、氨基乙酸酯(acetamidate)键、氨基甲酸酯键、硫醚键、桥接的氨基磷酸酯键、桥接的亚甲基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、桥接的硫代磷酸酯键或砜键，以及这些键的组合。

核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含5个生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或非5个生物学上存在的碱基的碱基。这些碱基可用于多种目的，例如稳定或去稳定杂交；促进或抑制探针降解；或作为可检测部分或猝灭部分的连接点。例如，本发明的多核苷酸可包含一个或多个修饰的、非标准的或衍生化的碱基部分，包括但不限于N⁶-甲基-腺嘌呤、N⁶-叔丁基-苄基-腺嘌呤、咪唑、取代的咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D甘露糖Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(即胸腺嘧啶)、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-二氨基嘌呤和5-炔丙基嘧啶。修饰的、非标准的或衍生化的碱基部分的其它实例可见于例如美国专利第6,001,611、5,955,589、5,844,106、5,789,562、5,750,343、5,728,525和5,679,785号。

而且，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含一个或多个修饰的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖。

3.详细实施方案

第一方面，本发明提供对没有高血压的个体预测中风倾向的方法，所述方法包括

a)在个体样品中检测在PDE4D基因座中包含至少一种多态性的等位基因的存在或不存在，其中在无高血压的个体中存在该等位基因与中风倾向相关；和

b)基于样品中该等位基因的存在或不存在预测人中存在或不存在中风倾向，其中在无高血压个体中存在该等位基因与中风倾向相关。在一个实施方案中，多态性在有高血压的个体中不预示中风。在一个实施方案中，多态性在有高血压的个体中独立地预示中风。在某些实施方案中，该方法预示缺血性中风、颈动脉中风、心原性中风、心栓性中风、小血管中风、大血管中风。

在某些实施方案中，至少一种多态性选自：

SNP 9 A/G，其中A的存在与中风倾向相关；

SNP 219 C/T，其中T的存在与中风倾向相关；

SNP 42 A/G，其中G的存在与中风倾向相关；

SNP 220 C/A，其中A的存在与中风倾向相关；和

AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)，其中9次微卫星重复序列(TCAT)的存在与中风倾向相关。

在其它实施方案中，至少一种多态性包含SNP 45 G/A和AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)的组合，其中9次微卫星重复序列(TCAT)的存在与中风倾向相关。在其它实施方案中，至少一种多态性选自SNP 9 A/G、SNP 26 A/G、SNP 32 C/T、SNP 34 C/A、SNP42 A/G、SNP 45 G/A、SNP 56 T/A、SNP 148 A/G、SNP 175 T/C、SNP199 A/G、SNP 219 C/T、SNP 220 C/A、SNP 222 A/G，以及AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)的次数，例如AC008818-1中的8次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-8)、AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-4)、AC008818-1中的10次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因0)、AC008818-1中的11次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因4)、AC008818-1中的12次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因8)或AC008818-1中的13次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因12)。

在某些实施方案中，检测步骤包括检测含有多态性的至少一种等位基因，所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 42 A/G、SNP 219 C/T、SNP220C/A和AC008818-1中的9次、10次或12次微卫星重复序列(TCAT)的单核苷酸多态性(SNP)；以及

预测步骤包括如果存在以下的至少一种多态性则预示中风倾向：

SNP 9 A/G，其中A的存在与中风倾向相关；

SNP 219 C/T，其中T的存在与中风倾向相关；

SNP 42 A/G，其中G的存在与中风倾向相关；

SNP 220 C/A，其中A的存在与中风倾向相关；和

AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)，其中9次微卫星重复序列(TCAT)的存在与中风倾向相关。

在其它实施方案中，检测步骤包括检测SNP 45 G/A和AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)的组合，其中9次微卫星重复序列(TCAT)的存在与中风倾向相关。在其它实施方案中，检测步骤包括检测至少一种选自以下的多态性：SNP 9 A/G、SNP 26 A/G、SNP32 C/T、SNP 34 C/A、SNP 42 A/G、SNP 45 G/A、SNP 56 T/A、SNP 148A/G、SNP 175 T/C、SNP 199 A/G、SNP 219 C/T、SNP 220 C/A、SNP222A/G，以及AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)次数，例如AC008818-1中的8次卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-8)、AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-4)、AC008818-1中的10次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因0)、AC008818-1中的11次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因4)、AC008818-1中的12次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因8)或AC008818-1中的13次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因12)。

适宜时，2、3、4、5种或更多种多态性可同时检测，并可用于预测通常与他们的高血压状态相关联的个体的中风倾向。

本发明还提供在高血压个体中预测增加的中风风险的方法。因此，在另一方面，本发明提供预测人中的中风倾向的方法，该方法包括：

检测人样品中的PDE4D基因座的SNP 175 T/C；和

基于样品中存在或不存在多态性的等位基因预测人中存在或不存在中风倾向，其中T的存在在高血压个体中与中风倾向相关。

本发明还提供在无高血压的个体中预测中风风险降低的方法。另一方面，本发明提供预测人的中风风险降低的方法，该方法包括：

检测人样品中PDE4D的AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)；和

基于样品中存在或不存在多态性的等位基因预测人中存在或不存在中风风险降低，其中存在10次微卫星重复序列(TCAT)在无高血压的个体中与中风风险降低相关。在某些实施方案中，存在10次或12次微卫星重复序列(TCAT)与中风风险降低相关。

在某些实施方案中，预测步骤包括记录个体中风倾向的存在或不存在。

在某些实施方案中，多态性用区分多态性的至少两个可变等位基因的寡核苷酸(例如引物或探针)来检测。在某些实施方案中，寡核苷酸例如用荧光部分、放射性部分、生物素部分可检测地标记。在某些实施方案中，寡核苷酸用连接至寡核苷酸的5′末端的荧光部分可检测地标记。在某些实施方案中，寡核苷酸还包括在寡核苷酸完整时猝灭荧光部分的猝灭部分。

所述方法可应用于为男性或女性的个体。所述方法还可以应用于与他们的种族或种族本源无关的个体。在某些实施方案中，所述个体为白人、亚洲人、非洲人、西班牙人、印第安人、美洲人，或者具有种族或种族本源的组合。

在某些实施方案中，等位基因为累加的、倍增的、显性的或隐性的、共显性的，或其组合。

又一方面，本发明提供在无高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒含有区分SNP 9 A/G的A等位基因和G等位基因的探针或引物；或者区分SNP 219 C/T的C等位基因和T等位基因的探针或引物；或者区分SNP 220 C/A的C等位基因和A等位基因的探针或引物。典型地，探针或引物以聚合酶依赖性反应区分多态等位基因，所述聚合酶依赖性反应例如为聚合酶链式反应(PCR)或引物延伸反应。多态性的一种等位基因的选择性扩增可与扩增反应同时检测(即“实时”)，或在扩增反应之后检测。在某些实施方案中，探针或引物以聚合酶非依赖性反应区分多态等位基因，例如侵入性切割反应(参见例如Olivier，Mut.Res.(2005)573(1-2)：103-10)。

在某些实施方案中，所述试剂盒还含有一种或多种区分PDE4D等位基因的额外探针或引物。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有：区分SNP42A/G的A等位基因和G等位基因的探针或引物；或者区分AC008818-1中微卫星重复序列(TCAT)的次数的探针或引物。

又一方面，本发明提供在具有高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒包含区分SNP 175 T/C的T等位基因和C等位基因的探针或引物。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒还含有热稳定性聚合酶。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有脱氧核苷酸。在某些实施方案中，所述试剂盒的探针被可检测标记。在某些实施方案中，所述试剂盒的探针用荧光部分可检测标记。在某些实施方案中，荧光部分处于探针的5′末端。在某些实施方案中，所述试剂盒的探针含有当探针完整时猝灭荧光部分的猝灭部分。

又一方面，本发明提供用于在个体中预测中风倾向的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含：

用程序码编码的计算机可读介质，所述程序码包含：

用于在主机接收信息的计算机代码，所述信息指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座的多态性的等位基因，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219 C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1中的微卫星重复序列和SNP 175 T/C；和

用于确定个体的中风倾向的计算机代码，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP 175 T/C中的T。

又一方面，本发明提供用于确定个体的中风倾向的计算机实施方法，所述方法包括：

在主机接收指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座多态性的等位基因的信息，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)和SNP 175 T/C；和

确定个体的中风倾向，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP 175 T/C中的T。

在某些实施方案中，计算机实施方法还包括输出个体的中风倾向存在或不存在的步骤。

本领域技术人员会认识到，除了存在或不存在高血压之外，本发明的方法可协同其它分析一起用于检测中风倾向，所述分析包括但不限于性别、种族、种族起源、年龄、体重指数、腰:臀比、血压、胆固醇、血清脂质(包括高密度脂蛋白和/或低密度脂蛋白)、高超敏C反应蛋白(hsCRP)血清水平、存在或不存在糖尿病，个体是否吸烟、锻炼等。例如，在某些实施方案中，如果患者具有中风发病的额外风险因素，则所述方法可包括评价例如年龄、糖尿病、吸烟或任何以上列出风险因素或其它风险因素中的一种或多种的额外步骤。可分析女性、男性或未划分群体的多态性存在情况。分析可在任何年龄进行。等位基因频率可在特定群体之间变化。

4.核酸多态性的检测

用于评价核酸的SNP存在情况的检测技术包括分子遗传学领域众所周知的方法。许多但不是全部的方法涉及核酸扩增。本领域提供了实施扩增的丰富指引。代表性的参考文献包括诸如以下的手册：PCRTechnology：Principles and Applications for DNA Amplification(H.A.Erlich编辑，Freeman Press，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等编辑，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，1994-1999，包括至2004年4月的补充更新；Sambrook & Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)。检测单核苷酸多态性的一般方法公开于Single Nucletides Polymorphisms：Methodsand Protocols，Pui-Yan Kwok编辑，2003，Humana Press。

尽管所述方法通常使用PCR步骤，但也可以使用其它扩增方法。适宜的扩增方法包括连接酶链式反应(参见例如Wu & Wallace，Genomics 4：560-569，1988)；链置换测定(参见例如Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396，1992；美国专利第5,455,166号)；和几个基于转录的扩增系统，包括描述于美国专利第5,437,990、5,409,818和5,399,491号的方法；转录扩增系统(TAS)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177，1989)；和自主序列复制(3SR)(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878，1990；WO 92/08800)。或者，可使用扩增探针至可检测水平的方法，例如Qβ-复制酶扩增(Kramer &Lizardi，Nature 339：401-402，1989；Lomeli等，Clin.Chem.35：1826-1831，1989)。已知扩增方法的综述例如由Abramson和Myers，CurrentOpinion in Biotechnology 4：41-47，1993提供。

个体的PDE4D基因型、单倍型、SNP、微卫星或其它多态性的检测可使用寡核苷酸引物和/或探针进行。寡核苷酸可通过任何适宜的方法制备，通常为化学合成。寡核苷酸可使用市售试剂和设备合成。或者，它们可通过商业来源购买。合成寡核苷酸的方法在本领域众所周知(参见例如Narang等，Meth.Enzymol.68：90-99，1979；Brown等，Meth.Enzymol.68：109-151，1979；Beaucage等，Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981；以及美国专利第4,458,066号的固体支持体方法)。另外，上述合成方法的修改可用于合乎需要地影响针对合成寡核苷酸的酶行为。例如，将修饰的磷酸二酯键(例如硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、氨基磷酸酯(phosphoamidate)键或硼磷酸酯(boranophosphate)键)或非亚磷酸衍生物的键掺入寡核苷酸中可用于防止在选定位点的切割。另外，使用2’-氨基修饰的糖在与又为新核酸链合成模板的核酸杂交时倾向于支持寡核苷酸置换胜过支持寡核苷酸消化。

个体的PDE4D多态性的基因型可使用本领域众所周知的许多检测方法测定。大部分测定需要几种一般性方案之一：使用等位基因特异性寡核苷酸杂交、引物延伸、等位基因特异性连接、测序或电泳分离技术，例如单链构象多态性(SSCP)和异源双链分析。代表性测定包括5′-核酸酶测定、模板介导的染料-终止子掺入、分子探针等位基因特异性寡核苷酸测定、单碱基延伸测定和通过实时焦磷酸序列进行SNP记分。扩增序列的分析可使用多种技术进行，例如微芯片、荧光偏振测定和基质辅助的激光解吸电离(MALDI)质谱。还可以使用的两种方法是基于采用Flap核酸酶的侵入性切割的测定和使用锁式探针的方法。

测定特定PDE4D等位基因的存在或不存在一般通过分析得自待分析个体的核酸样品进行。核酸样品经常含有基因组DNA。基因组DNA通常得自血液样品，但也可以得自其它细胞或组织。

还有可能分析RNA样品的多态等位基因的存在情况。例如，mRNA可用于测定个体在一个或多个PDE4D多态位点的基因型。在此情况下，核酸样品得自其中表达目标核酸的细胞，例如脂肪细胞。该分析可如下进行：首先使用例如病毒逆转录酶逆转录目标RNA，然后扩增所获cDNA；或使用如在美国专利第5,310,652、5,322,770、5,561,058、5,641,864和5,693,517号中描述的组合高温的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。

简单描述了用于分析核酸样品以检测SNP的常用方法。但是，本领域已知的任何方法都可用于检测单核苷酸取代的存在情况。

a.等位基因特异性杂交

该技术通常还称为等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)(例如Stoneking等，Am.J.Hum.Genet.48：70-382，1991；Saiki等，Nature 324，163-166，1986；EP 235,726；和WO 89/11548)，依靠通过对其中一种变体特异性的寡核苷酸探针与由扩增的核酸样品获得的扩增产物的杂交区分相差一个碱基的两个DNA分子。该方法通常使用短寡核苷酸，例如长15-20个碱基。探针设计用于差异化杂交一种变体与另一种变体。设计这些探针的原则和指引在本领域是可获得的，例如在本文提及的参考文献中。杂交条件应足够严格，使得在等位基因的杂交强度之间存在显著差异，并产生基本上二元的响应，由此探针仅与其中一种等位基因杂交。某些探针设计用于与目标DNA区段杂交，使得多态位点与探针的中心位置(例如在15个碱基的寡核苷酸中于7位；在16个碱基的寡核苷酸中于8或9位)对齐，但该设计不是必需的。

通过检测与样品杂交的等位基因特异性寡核苷酸的量测定等位基因的量和/或存在情况。典型地，寡核苷酸用诸如荧光标记的标记来标记。例如，将等位基因特异性寡核苷酸应用于代表PDE4D SNP序列的固定化寡核苷酸。在严格杂交和漂洗条件后，检测每个SNP寡核苷酸的荧光强度。

在一个实施方案中，在多态位点存在的核苷酸通过于序列特异性杂交条件下与寡核苷酸探针或引物杂交来鉴别，所述寡核苷酸探针或引物和包含多态位点的区域中的其中一种多态等位基因完全互补。选择探针或引物杂交序列和序列特异性杂交条件，使得在多态位点处的单个错配足以破坏杂交双链体的稳定，使其不能有效形成。因此，在序列特异性杂交条件下，稳定双链体将仅在探针或引物和完全互补的等位基因序列之间形成。因此，长约10个至约35个核苷酸、通常长约15个至约35个核苷酸、与包含多态位点的区域中的等位基因序列完全互补的寡核苷酸在本发明的范围之内。

在替代的实施方案中，存在于多态位点的核苷酸通过在足够严格的杂交条件下与包含多态位点的区域中的其中一个SNP等位基因大致互补的寡核苷酸以及和多态位点处的等位基因完全互补的寡核苷酸杂交来鉴别。因为在非多态位点处存在的错配是与两种等位基因的错配，所以在与目标等位基因形成的双链体和与对应的非目标等位基因序列形成的双链体中的错配数差异与使用和目标等位基因序列完全互补的寡核苷酸时的差异是相同的。在该实施方案中，杂交条件被放松得足以允许和目标序列形成稳定双链体，同时保持足够的严格性，以排除和非目标序列形成稳定双链体。在这些足够严格的杂交条件下，稳定双链体将仅在探针或引物和目标等位基因之间形成。因此，长约10个至约35个核苷酸、通常长约15个至约35个核苷酸、与包含多态位点的区域中的等位基因序列大致互补的寡核苷酸在本发明的范围之内。

使用大致而不是完全互补的寡核苷酸在其中杂交条件优化受限的测定形式中可能合乎需要。例如，在典型的多目标固定化寡核苷酸测定形式中，针对每个目标的探针或引物被固定在单个固体支持体上。通过使固体支持体接触含靶DNA的溶液同时进行杂交。因为所有的杂交都在相同条件下进行，所以杂交条件不能对每个探针或引物单独优化。将错配掺入到探针或引物中可用于在测定形式不能调节杂交调节时调节双链体稳定性。具体导入的错配对双链体稳定性的作用是众所周知的，双链体稳定性可如上所述常规评估和凭经验确定。适宜的杂交条件取决于探针或引物的确切大小和序列，可使用本文提供的和本领域众所周知的指引凭经验选择。使用寡核苷酸探针或引物检测序列中的单碱基对差异描述于例如Conner等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：278-282，和美国专利第5,468,613和5,604,099号。

完全匹配和单碱基错配的杂交双链体之间稳定性的成比例变化取决于杂交寡核苷酸的长度。与较短探针序列形成的双链体被存在的错配更成比例地去稳定化。长约15个至约35个核苷酸的寡核苷酸经常用于序列特异性检测。而且，因为杂交的寡核苷酸的末端由于热能而经历连续的随机解离和再退火，所以在任一个末端的错配都不如内部存在的错配去稳定杂交双链体。为辨别目标序列中的单碱基对改变，选择与目标序列杂交以使多态位点存在于探针内部区域的探针序列。

将以上用于选择与特定PDE4D等位基因杂交的探针序列的标准应用于探针的杂交区，即涉及与靶序列杂交的探针部分。探针可结合至额外的核酸序列，例如用于固定探针的poly-T尾，而不显著改变探针的杂交特征。本领域技术人员会认识到，为用于本方法，结合与目标序列不互补并因此不参与杂交的额外核酸序列的探针基本上等同于未结合的探针。

检测在样品中的探针和靶核酸序列之间形成的杂种的适宜测定形式在本领域是已知的，包括固定化靶(点印迹)形式和固定化探针(反向点印迹或反向线性印迹)测定形式。点印迹和反向点印迹测定形式描述于美国专利第5,310,893、5,451,512、5,468,613和5,604,099号。

在点印迹形式中，扩增的靶DNA被固定在固体支持体上，例如尼龙膜。膜-靶复合物与标记的探针在适宜的杂交条件下温育，未杂交的探针通过在适宜的严格条件下漂洗而被去除，监测膜的结合探针的存在情况。

在反向点印迹(或线性印迹)形式中，探针被固定在固体支持体上，如尼龙膜或微量滴定板。通常在扩增过程中通过掺入标记的引物标记靶DNA。可标记一种或两种引物。膜-探针复合物与标记的扩增靶DNA在适宜的杂交条件下温育，未杂交的靶DNA通过在适宜的严格条件漂洗被去除，监测膜的结合靶DNA的存在情况。反向线性印迹检测试验在实施例中描述。

对其中一种多态变体特异性的等位基因特异性探针经常协同另一种多态变体的等位基因特异性探针一起使用。在某些实施方案中，探针固定在固体支持体上，在个体中的靶序列使用两种探针同时分析。核酸阵列的实例描述于WO 95/11995。特征多态性分析可使用相同阵列或不同阵列。WO 95/11995还描述了为检测预先表征的多态性的变体形式而优化的子阵列。此子阵列可用于检测本文描述的PDE4D多态性的存在情况。

b.等位基因特异性引物

多态性通常还使用等位基因特异性扩增或引物延伸方法检测。这些反应通常包括使用设计用于经引物3′末端的错配特异性靶向多态性的引物。当聚合酶没有错误校正活性时，错配的存在影响聚合酶延伸引物的能力。例如，为使用基于等位基因特异性扩增或延伸的方法检测等位基因序列，设计与多态性的一种等位基因互补的引物，使3′末端核苷酸在多态性位置杂交。特定等位基因的存在情况可通过引物启动延伸的能力确定。如果3′末端被错配，则延伸被阻止。

在某些实施方案中，引物协同第二种引物一起在扩增反应中使用。第二种引物在与多态位置不相关的位点杂交。扩增由两种引物继续进行，产生表明存在特定等位基因形式的可检测产物。基于等位基因特异性扩增或延伸的方法描述于例如WO 93/22456、美国专利第5,137,806、5,595,890、5,639,611和美国专利第4,851,331号。

使用基于等位基因特异性扩增的基因分型，等位基因的鉴别仅需要检测扩增靶序列的存在或不存在。用于检测扩增的靶序列的方法在本领域众所周知。例如，所描述的凝胶电泳和探针杂交测定经常用于检测核酸的存在情况。

在替代的无探针方法中，扩增核酸通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来检测，描述于例如美国专利第5,994,056号和欧洲专利公布号487,218和512,334。双链靶DNA的检测依赖于多种DNA结合染料(例如SYBR Green)在结合至双链DNA时表现出的增加的荧光。

如本领域人员所意识到的，等位基因特异性扩增方法可在使用多种等位基因特异性引物以靶向特定等位基因的反应中进行。用于这些多重应用的引物一般用可区分的标记来标记，或者进行选择，以使由等位基因生产的扩增产物可通过大小区分。因此，例如，在单个样品中的两种等位基因可使用单个扩增通过扩增产物的凝胶分析鉴别。

如同等位基因特异性探针的情况一样，等位基因特异性寡核苷酸引物可与杂交区中的其中一种多态等位基因完全互补，或者可以在非寡核苷酸3′末端的位置具有某些错配，所述错配存在于两个等位基因序列的非多态位点处。

c.可检测探针

i)5′-核酸酶测定探针

基因分型还可以使用如在美国专利第5,210,015、5,487,972和5,804,375以及Holland等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276-7280中所述的或“5′-核酸酶测定”进行。在

测定中，在扩增反应当中加入在扩增区内杂交的已标记检测探针。修饰探针，以便阻止探针起用于DNA合成的引物的作用。扩增使用具有5′-至3′-外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。在扩增的每个合成步骤当中，与处于要延伸的引物下游的靶核酸杂交的任何探针都被DNA聚合酶的5′-至3′-外切核酸酶活性降解。因此，新目标链的合成还导致探针降解，降解产物的累积提供了靶序列合成的检测。

杂交探针可为区分SNP等位基因的等位基因特异性探针。或者，所述方法可使用等位基因特异性引物和结合扩增产物的标记探针进行。

适于检测降解产物的任何方法都可用于5′-核酸酶测定。通常，检测探针用两种荧光染料标记，其中一种染料能够猝灭另一种染料的荧光。染料与探针连接，通常一种染料连接至5′-末端，另一种染料连接至内部位点，使得在探针处于未杂交状态时发生猝灭，并使得在两种染料之间发生DNA聚合酶的5′-至3′-外切核酸酶活性对探针的切割。扩增导致染料之间的探针切割，并伴随猝灭的消除和可由初始被猝灭的染料观察到的荧光增加。降解产物的累积通过检测反应荧光的增加来监测。美国专利第5,491,063和5,571,673号描述了检测伴随扩增发生的探针降解的替代方法。

ii)二级结构探针

在二级结构改变时可检测的探针也适于检测多态性，包括SNP。示例性的二级结构或茎-环结构探针包括分子信标或

引物/探针。分子信标探针是可形成发夹结构的单链寡核酸探针，其中荧光团和猝灭剂通常处于寡核苷酸的相对末端。在探针的任一个末端，短互补序列都允许形成分子内茎，其能使荧光团和猝灭剂密切接近。分子信标的环部分与目标靶核酸互补。该探针与其目标靶核酸的结合形成迫使茎分开的杂种。这引起构象改变，这种改变将荧光团和猝灭剂彼此移开，产生更强的荧光信号。然而，分子信标探针对探针靶的小序列变化是高度敏感的(Tyagi S.和Kramer F.R.，Nature Biotechnology，14卷，303-308页(1996)；Tyagi等，Nature Biotechnology，16卷，49-53页(1998)；Piatek等，Nature Biotechnology，16卷，359-363页(1998)；Marras S.等，Genetic Analysis：Biomolecular Engineering，14卷，151-156页(1999)；Tpp I.等，BioTechniques，28卷，732-738页(2000))。

引物/探针包含共价连接至引物的茎-环结构探针。

d.DNA测序和单碱基延伸

PDE4D SNP还可以通过直接测序检测。方法包括例如基于双脱氧测序的方法和其它方法，例如Maxam和Gilbert测序(参见例如Sambrook和Russell，出处同上)。

其它检测方法包括寡核苷酸长度产物的Pyrosequencing^TM。该方法经常使用诸如PCR的扩增技术。例如，在焦磷酸测序中，测序引物与PCR扩增的单链DNA模板杂交；并与酶(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶)和底物(腺嘌呤5′磷酸硫酸(APS)和萤光素)温育。将4种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的第一个加入反应。如果该脱氧核苷酸三磷酸与模板链中的碱基互补，则DNA聚合酶催化其掺入DNA链。每个掺入事件都伴随着和掺入的核苷酸量等摩尔量的焦磷酸(PPi)释放。在腺嘌呤5′磷酸硫酸存在下，ATP硫酸化酶定量地将PPi转变为ATP。该ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素的转变，该转变以和ATP量成比例的量产生可见光。在萤光素酶催化的反应中产生的光通过电荷耦合器件(CCD)照相机检测，并作为pyrogram^TM中的峰进行观察。每个光信号都与掺入的核苷酸数成比例。腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸降解酶，持续降解未掺入的dNTP和过量的ATP。当降解完成时，加入另一个dNTP。

表征SNP的另一种类似方法不需要使用完整的PCR，而是通常仅使用经由单个荧光标记的双脱氧核糖核酸分子(ddNTP)进行的引物延伸，所述双脱氧核糖核酸分子与要研究的核苷酸互补。在多态位点的核苷酸可经引物检测来鉴别，所述引物已被延伸了一个碱基，并被荧光标记(例如Kobayashi等，Mol.Cell.Probes，9：175-182，1995)。

e.电泳

使用聚合酶链式反应产生的扩增产物可通过使用变性梯度凝胶电泳分析。不同的等位基因可基于溶液中DNA的不同序列依赖性解链特性和电泳迁移来鉴别(参见例如Erlich编辑，PCR Technology， Principles and Applications for DNA Amplification，W.H.Freeman andCo，New York，1992，第7章)。

微卫星多态性的区分可使用毛细管电泳进行。毛细管电泳便利地允许鉴别特定微卫星等位基因中的重复序列次数。毛细管电泳应用于分析DNA多态性是本领域技术人员周知的(参见例如Szantai等，JChromatogr A.(2005)1079(1-2)：41-9；Bjorheim和Ekstrom，Electrophoresis(2005)26(13)：2520-30以及Mitchelson，Mol Biotechnol.(2003)24(1)：41-68)。

f.单链构象多态性分析

靶序列的等位基因可以使用单链多态性构象分析来区分，单链多态性构象分析通过单链PCR产物的电泳迁移的改变鉴别碱基差异，如在Orita等，Proc.Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)中所述。扩增的PCR产物可如上所述产生，并加热或以其它方法变性，以形成单链扩增产物。单链核酸可重折叠，或形成部分取决于碱基序列的二级结构。单链扩增产物的不同电泳迁移率可与目标等位基因之间的碱基序列差异相关联。

SNP检测方法经常使用标记的寡核苷酸。寡核苷酸可通过掺入经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的标记来标记。有用的标记包括荧光染料、放射性标记如³²P、电子致密试剂、酶(例如过氧化物酶或碱性磷酸酶)、生物素或者可对其应用抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。标记技术在本领域众所周知(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，出处同上；Sambrook & Russell，出处同上)。

5.记录诊断

本发明的方法通常包括记录与中风倾向相关的SNP的存在情况。该信息可适宜地储存为计算机可读形式或储存在纸上。此计算机系统通常包含较大的子系统，例如中央处理器、系统内存(通常为RAM)、输入/输出(I/O)控制器、外部设备，例如借助于显示适配器的显示屏、串口、键盘、借助于存储界面的固定磁盘驱动器和进行接受软盘操作的软驱，以及进行接受CD-ROM操作的CD-ROM(或DVD-ROM)。可连接许多其它设备，例如借助于串口连接的网络接口。

计算机系统还可以连接网络，包括大量经由数据线连接的计算机设备，例如以太网线(同轴电缆或10BaseT)、电话线、ISDN线、无线网络、光纤或其它适宜的信号传输介质，由此至少一个网络设备(例如计算机、磁盘阵列等)含有磁畴(例如磁盘)和/或电荷畴(例如DRAM单元阵列)模式，其由编码由本发明测定获得的数据的位模式组成。

计算机系统可包含解译评价一种或多种PDE4D多态等位基因的基因型研究结果的编码。因此，在示例性的实施方案中，基因型结果被提供给计算机，在计算机中中央处理器执行用于确定增加的或降低的中风倾向的倾向性的计算机程序。

本发明还提供例如上述的计算机系统的应用，所述计算机系统含有：(1)计算机；(2)编码通过本发明方法获得的基因分型结果的存储位模式，其可存储在计算机中；(3)和，任选地，(4)确定中风倾向的程序。

6.试剂盒

本发明还提供含有对实施所述方法有用的组分的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒可包含一种或多种等位基因特异性检测探针，所述探针任选地可固定至适宜的支持膜。此试剂盒还可以含有一种或多种扩增引物，所述引物用于扩增含有一个或多个多态位点的PDE4D基因座的区域。或者，有用的试剂盒可以含有一个或多个引物组，其包含用于多态等位基因的特异性扩增的等位基因特异性引物。此试剂盒还可以含有用于检测扩增产物的探针。

其它任选的试剂盒组分包括用于基因分型患者的额外试剂。例如，试剂盒可含有聚合酶如热稳定的DNA聚合酶、底物核苷三磷酸、用于标记和/或检测核酸的工具(例如抗生物素蛋白-酶缀合物和酶底物，以及在标记为生物素时的色原)、用于扩增或杂交反应的适宜缓冲液，以及用于实施本方法的说明书。

适宜时，所述试剂盒可以含有用于检测2、3、4、5种或更多种多态性的多个探针或引物。例如，所述试剂盒可以包括用于检测或区分至少一种多态性的探针或引物，所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 26A/G、SNP 32 C/T、SNP 34 C/A、SNP 42 A/G、SNP 45 G/A、SNP 56 T/A、SNP 148 A/G、SNP 175 T/C、SNP 199 A/G、SNP 219 C/T、SNP 220 C/A、SNP 222 A/G以及AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)次数，例如AC008818-1中的8次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-8)、AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因-4)、AC008818-1中的10次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因0)、AC008818-1中的11次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因4)、AC008818-1中的12次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因8)或AC008818-1中的13次微卫星重复序列(TCAT)(即等位基因12)。在某些实施方案中，所述试剂盒包括用于检测或区分至少一种多态性的探针或引物，所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 42 A/G、SNP 219 C/T和SNP 220 C/A。在其它实施方案中，试剂盒包括用于区分SNP175的等位基因的探针或引物。在其它实施方案中，试剂盒包括用于区分AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)的多态性的探针或引物。

7.关联性检验

几种关联性检验模型中的一种或多种可应用于在统计学上关联一种或多种PDE4D多态性的存在或不存在与中风、高血压的存在或不存在以及任选地一种或多种额外的风险因素。示例性的遗传模型包括但不限于显性、隐性、共显性、等位/倍增/累加。

等位/倍增/累加(分对数量度)模型描述了相比于参比等位基因(通常是最普通的变体)由特定等位基因赋予的疾病风险。

显性遗传模型描述了携带一个或两个拷贝的等位基因(通常为少量的或罕有的变体)的个体相比于没有这些等位基因的那些个体的疾病风险。

隐性遗传模型描述了携带恰好两个拷贝等位基因(通常为少量的或罕有的变体)的个体相比于具有任一个或没有等位基因拷贝的那些个体的疾病风险。

共显性遗传模型将每个基因型都视为赋予不同的疾病风险。

实施例

提供以下实施例是为了阐述，而不是为了限制要求保护的本发明。

实施例1：在有或没有高血压的个体中鉴别和检测指示中风的PDE4D SNP

材料和方法

受试者

骨质疏松性骨折(SOF)的研究(参见Browner等，J Clin EndocrinolMetab(2001)86：631-637)在1986至1988年间在俄勒冈州波特兰、明尼苏达州明尼阿波利斯、马里兰州巴尔的摩和宾夕法尼亚州莫农加希拉谷的4个临床中心征募门诊妇女(Cummings等，JAMA(1990)263：665-668)。研究小组由9704名至少65岁的白人妇女组成，她们在征募时没有双侧髋关节置换或早期髋部骨折。中风发病病例判为缺血性中风(Browner等，出处同上)(N＝248)。对照在研究征募之前或5.4年的平均随访过程中没有出现中风(N＝560)。高血压基线限定为收缩血压(BP)>160mm Hg或舒张压BP>90mm Hg，或者使用噻嗪类利尿剂。在随访期当中死亡的个体包括在内。研究得到临床实验机构伦理委员会的批准，所有妇女都提供了书面知会同意。

先前已描述了冰岛人群(Gretarsdottir等，Nature Genetics(2003)35(2)：131-138)。为与SOF中风比较，在Gretarsdottir等中没有提供的某些结果概述于表2和3。

表2

表2.使用等位基因性模型在SOF中风和冰岛中风人群中的小等位基因频率和未调节的关联。P值<0.05为粗体。

SNP 9对照在HWE之外(确切的P＝0.048)

SNP 222病例在HWE之外(确切的P＝0.024)

表3

表3.在SOF和冰岛人群中评价的与中风相关的单倍型。显示了两个组中P值<0.05并具有至少1％的等位基因频率的单倍型。

区域单倍型SNP，编号：SNP9-26-32-34-42

D区单倍型SNP，编号：SNP148-175-199-219-220-222

^*报告为RR；冰岛病例＝988，对照＝652

基因分型

使用Applied Biosystems(AB)

和软件产生AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)的基因分型，之后用AB 3100Genetic Analyzer通过片段大小分级毛细管电泳进行等位基因测定。使用等位基因特异性实时PCR(即动力学热循环)基因分型8个SNP，并使用Germer等(Genome Res(2000)10：258-266)的修改方法用AB 5700(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过SYBR^TM Green(MolecularProbes，Eugene，OR)检测。样品经历广泛的质量控制。

通过基于固定化探针的测定基因分型5个SNP。我们已开发了用于基因中的候选标记的多靶基因分型测定，所述基因来自涉及动脉粥样硬化和血栓形成疾病的多个途径，所述候选标记包括磷酸二酯酶(PDE4D)基因中的SNP(Cheng等，Genome Res(1999)9：936-949；和Burns等，Genes Immun(2005)6(5)：438-444)。简而言之，以采用5′-生物素化引物的多重PCR扩增15ng的基因组DNA，PCR产物与固定化的寡核苷酸序列特异性探针的线性阵列杂交。检测通过HRP介导的比色法进行。SNP命名如在Gretarsdottir等(Gretarsdottir等，(2003)，出处同上)的附表2中所述。

引物和探针

在本研究中使用以下引物和探针。

线性阵列引物(SNP)

E＝生物素

线性阵列探针(SNP)

J＝BSA(牛血清白蛋白缀合物)

L＝5-炔丙基dUTP(取代T并产生较强的碱基配对)

动力学热循环(实时PCR)引物

统计学分析

基因分型和等位基因频率通过计数测定，并使用卡方检验或精确检验评价与Hardy-Weinberg平衡(HWE)的偏离。使用Cox比例风险模型(Cox等，Journal of the Royal Statistical Society(1972)34：187-220)检验SNP与意外中风的关联。已调整的分析包括作为共变量的年龄、体重、糖尿病和吸烟。分析使用SAS统计学软件(8.2版，SAS Institute Inc.，Cary，NC)进行。配对连锁不平衡通过期望最大化(EM)算法计算。

在通过EM算法估计单倍型频率后，用似然比检验来检验SNP单倍型与SOF样本中病例/对照状态的关联。在冰岛的SNP单倍型关联通过以NEMO软件(Gretarsdottir等，(2003)，出处同上)执行的EM算法计算，该算法造成了所确定的单倍型计数的不确定性。

基于在冰岛中风人群中获得的结果选择14个多态性(表2和5，见上文)，因此预期其作为单SNP或作为单倍型与中风关联，结果没有被校准用于多重比较。

结果

如所预期的，中风病例比对照老，更可能具有高血压和糖尿病(表4)。依据高血压划分对年龄、体重或吸烟分布几乎没有影响，但糖尿病在高血压患者中更常见，但风险比(HR)小于非高血压患者中的风险比(HR 2.43对3.80)。两个SNP适当地偏离HWE：对照中的SNP 9(P＝0.048)和病例中的SNP 222(P＝0.024)。在SNP等位基因和意外中风之间没有显著关联。在累加、显性或隐性模型中各一个的3种多态性—SNP 9、219和222与中风弱相关(P<0.10)(表2，见上文)。

表4

表4.SOF中风病例和对照的选定特征

HR：风险比

^*每5岁或每10kg

依据高血压划分

在依据高血压划分后，在没有中等或严重高血压的妇女中4个SNP显示出与中风显著相关(P<0.05)(累加模型SNP 9、42、219和220；显性模型SNP 9、42、219和220；隐性模型SNP42)。SNP 175在高血压患者中与中风显著相关(表5)。提出的数据针对年龄、糖尿病、吸烟和体重进行调整。未调整的结果非常类似。表6在依据高血压状态划分后显示出SOF中风等位基因频率。

在未划分的SOF群体中，AC008818-1的微卫星等位基因没有一个与中风显著相关，但在划分后，两个等位基因是显著的：等位基因0(10次重复的等位基因，RR 0.62，P＝0.001)和等位基因4(9次重复的序列，RR 1.35，P＝0.031)(表7)。

单倍型分析

为与Gretarsdottir等(2003，出处同上)的结果比较，我们检查了SNP45/微卫星单倍型和中风之间的关联。与冰岛结果相反(RR2.07，G/0相对于A/X的P＝7.2×10^-8；X＝非0等位基因)，单倍型仅在没有高血压的SOF受试者中是显著的(G/0相对于A/X，RR 0.46，P＝0.003)，关联为相反反向。但是，相对于SOF样本中单独的微卫星，单倍型几乎没有提供改善。

基于在冰岛的结果(表3，出处同上)，检验针对D区域中的6个SNP和A区域中的5个SNP估计的单倍型在SOF样本中与中风的关联。冰岛单倍型在SOF样本中不显著相关；相反的情况也成立(表3)。在A区域中，一个单倍型GATAA实现了P值≤0.05，该单倍型与除SNP9(在冰岛中为A等位基因，在SOF中为G等位基因)之外的冰岛单倍型相同。另外，相关的方向在两个群体中是相反的。在依据高血压划分后，GATAA单倍型在非高血压患者中仍是唯一显著的单倍型(P＝0.015，OR＝0.43)，在高血压患者中没有单倍型与中风显著相关。

对于区域D，SOF中风中的几种单倍型显示出相关性，名义P值≤0.05，但仅有1个在病例和对照中均具有大于1％的频率(表3)。该单倍型与冰岛单倍型的区别在于3个位置，但二者均赋予增加的风险。在非高血压患者中，3个单倍型具有大于1％的频率和P<0.05。在高血压患者中，1个单倍型具有大于1％的频率和P值<0.05。

我们研究了与冰岛中风研究人群相比在SOF中风群体中的连锁不平衡(LD)模式。图2显示了在各个群体对照中观察到的LD。依据r²的检测，某些SNP对显示出人群之间的LD差异。例如，SNP 42和45之间的r²在冰岛为0.49，在SOF中为0.32。令人感兴趣的是，在冰岛，SNP 42和45均与中风显著相关，但在SOF中，仅SNP 42与中风显著相关。在病例中的LD显示出类似的差异。

要理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于阐述目的，本领域技术人员会依据本发明提出多种变更或改变，这些变更或改变包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求的范围之内。

序列表

SEQ ID NO：3-SNP 32

SEQ ID NO：4-SNP 34

SEQ ID NO：5-SNP 42

SEQ ID NO：6-SNP 45

SEQ ID NO：7-SNP 56

SEQ ID NO：8-SNP 222

SEQ ID NO：9-SNP 220

SEQ ID NO：10-SNP 219

SEQ ID NO：11-SNP 199

SEQ ID NO：12-SNP 175

SEQ ID NO：13-SNP 148

SEQ ID NO：14-微卫星AC008818-1，等位基因-8，(TCAT)₈

SEQ ID NO：15-微卫星AC008818-1，等位基因-4，(TCAT)₉

SEQ ID NO：16-微卫星AC008818-1，等位基因0，(TCAT)₁₀

SEQ ID NO：17-微卫星AC008818-1，等位基因4，(TCAT)₁₁

SEQ ID NO：18-微卫星AC008818-1，等位基因8，(TCAT)₁₂

SEQ ID NO：19-微卫星AC008818-1，等位基因12，(TCAT)₁₃

线性阵列引物(SNP)

E＝生物素

线性阵列探针(SNP)

J＝BSA(牛血清白蛋白缀合物)

L＝5-炔丙基dUTP(取代T并产生较强的碱基配对)

动力学热循环(实时PCR)引物

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司

     罗氏诊断公司

<120>PDE4D等位基因变体与中风的关联

<130>23290 WO-KOE

<140>还未指定

<141>还未指定

<150>US 60/730,248

<151>2005-10-25

<160>113

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>等位基因

<221>修饰的碱基

<222>(1)...(1)

<223>n＝缀合牛血清白蛋白(BSA)的t

<400>47

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>线性阵列探针PDE4D178RQ

<221>修饰的碱基

<222>(1)...(1)

<223>n＝缀合牛血清白蛋白(BSA)的c

<400>48

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

Claims (19)

1.一种对没有高血压的个体预测中风倾向的方法，所述方法包括：

在个体样品中检测PDE4D基因座中多态性的等位基因的存在或不存在，其中存在所述等位基因与无高血压个体的中风倾向有关；和

基于样品中所述等位基因的存在或不存在预测所述人个体的中风倾向的存在或不存在，其中存在所述等位基因在无高血压个体中与中风倾向相关，但在有高血压的个体中不预示中风。

2.权利要求1的方法，其中所述多态性选自：

SNP 9 A/G，其中A的存在与中风倾向相关；

SNP 219 C/T，其中T的存在与中风倾向相关；

SNP 42 A/G，其中G的存在与中风倾向相关；

SNP 220 C/A，其中A的存在与中风倾向相关；和

AC008818-1中的微卫星重复序列(TCAT)，其中9次微卫星重复序列(TCAT)的存在与中风倾向相关。

3.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括检测SNP 9 A/G的等位基因；以及所述预测步骤包括如果存在SNP 9 A/G的A等位基因则预示中风倾向。

4.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括检测SNP 219 C/T的等位基因；以及所述预测步骤包括如果存在SNP 219 C/T的T等位基因则预示中风倾向。

5.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括检测SNP 42 A/G的等位基因；以及所述预测步骤包括如果存在SNP 42 A/G的G等位基因则预示中风倾向。

6.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括检测SNP 220 C/A的等位基因；以及所述预测步骤包括如果存在SNP 220 C/A的A等位基因则预示中风倾向。

7.权利要求2的方法，其中所述检测步骤包括检测AC008818-1的微卫星等位基因；以及所述预测步骤包括如果在AC008818-1中存在9次微卫星重复序列(TCAT)则预示中风倾向。

8.权利要求1的方法，其中所述预测步骤包括记录所述个体中风倾向的存在或不存在。

9.权利要求1的方法，其中所述多态性用区分多态性的至少两个可变等位基因的寡核苷酸检测。

10.权利要求9的方法，其中所述寡核苷酸可检测标记。

11.权利要求10的方法，其中所述寡核苷酸用荧光部分可检测标记。

12.权利要求11的方法，其中所述荧光部分处于所述寡核苷酸的5′末端。

13.权利要求11的方法，其中所述寡核苷酸还包含在所述寡核苷酸完整时猝灭荧光部分的猝灭部分。

14.在没有高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒包含：

区分SNP 9 A/G的A等位基因和G等位基因的探针或引物；或

区分SNP 219 C/T的C等位基因和T等位基因的探针或引物；或

区分SNP 220 C/A的C等位基因和A等位基因的探针或引物。

15.用于在个体中预测中风倾向的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含：

用程序码编码的计算机可读介质，所述程序码包含：

用于在主机接收信息的计算机代码，所述信息指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座多态性的等位基因，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219 C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1的微卫星等位基因(TCAT₉)和SNP 175 T/C；和

用于确定个体的中风倾向的计算机代码，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP175 T/C中的T。

16.用于确定个体的中风倾向的计算机实施方法，所述方法包括：

在主机接收指示在个体中存在与中风倾向相关的PDE4D基因座多态性的等位基因的信息，其中所述多态性选自SNP 9 A/G、SNP 219C/T、SNP 42 A/G、SNP 220 C/A、AC008818-1的微卫星等位基因(TCAT₉)和SNP 175 T/C；和

确定所述个体的中风倾向，其中如果个体具有以下项目则预示中风倾向：

SNP 9 A/G中的A；

SNP 219 C/T中的T；

SNP 42 A/G中的G；

SNP 220 C/A中的A；

AC008818-1中的9次微卫星重复序列(TCAT)；或

SNP 175 T/C中的T。

17.在人中预测中风倾向的方法，所述方法包括：

在来自人的样品中检测PDE4D基因座的SNP 175 T/C；和

基于样品中多态性等位基因的存在或不存在预测在人中存在或不存在中风倾向，其中在高血压个体中存在T与中风倾向相关。

18.用于在具有高血压的人中预测中风倾向的试剂盒，所述试剂盒含有区分SNP 175 T/C的T等位基因和C等位基因的探针或引物。

19.预测人的中风风险降低的方法，所述方法包括：

在来自人的样品中检测PDE4D的AC008818-1的微卫星等位基因；和

基于样品中多态性等位基因的存在或不存在预测在人中存在或不存在中风风险降低，其中在没有高血压的个体中存在10次微卫星重复序列(TCAT)与中风风险降低相关。

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