CN102888396A - 一种分离植物低分子量rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离植物低分子量RNA的方法，主要包括：样品处理，DNA和蛋白质的去除，大分子量RNA的去除，低分子量RNA的获得，低分子量RNA的保存。本发明提取低分子量RNA过程中对DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分级沉淀，用30%聚乙二醇（PEG）和1/3体积的无水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3体积的无水乙醇沉淀低分子量RNA，实现低分子量RNA的富集；提取过程中操作简便、所需时间短，是一种简单、经济、高效的提取高质量植物低分子量RNA的方法。

Description

一种分离植物低分子量RNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种分离植物低分子量RNA的方法。
背景技术
低分子量RNA包括大小在20nt～24nt的siRNAs和miRNAs，这类小RNA分子对植物的生长、发育及响应逆境胁迫方面起着重要的调控作用。自从2002年科学家首次在植物中发现miRNAs以来，miRNAs数据库已收录了4169条植物miRNAs，小RNA分子的研究越来越受到植物科学家的重视。小RNA分子的获得是开展小RNA研究的前提，小RNA的质量直接影响后续实验的开展。不管是用哪种提取方法，都要求所获得的低分子量RNA纯度高、质量好，没有多酚、多糖等物质的污染。
目前，科研上获得植物小RNA的方法主要有以下几种：①通过商业试剂盒提取小RNA；②从总RNA中回收小RNA；③直接富集小RNA。这3种方法的不同之处主要在于它们分离小RNA的手段。Ambion、Stratagene等公司开发的小RNA提取试剂盒是利用高分子材料制成的膜吸附小RNA，然后再从膜上将其回收，这一方法虽然使用方便，但其价格昂贵，而且这些试剂盒不适合小RNA的大量提取。从总RNA中回收小RNA的方法是经典的分离小RNA的方法，该方法首先要从植物组织中分离总RNA（大分子量RNA和低分子量RNA），然后再利用切胶回收的方法从总RNA中回收低分子量RNA，这一方法耗时长，且小RNA的得率低。文献报导的直接富集小RNA的方法有两种，一种是用7.5%的聚乙二醇和1.25mol/L的氯化钠来沉淀大分子量RNA，然后用等体积的异丙醇过夜沉淀回收小RNA；另外一种是用5%的聚乙二醇和1/9体积的异丙醇来沉淀大分子量RNA，然后用等体积的异丙醇沉淀小RNA，这两种方法虽然小RNA的得率较高，但耗时都相对较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效的提取高质量植物低分子量RNA的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种分离植物低分子量RNA的方法，包括如下步骤：
1)样品处理：称取0.5g新鲜的幼嫩植物叶片，放进盛有液氮的研钵中，研磨成粉末，然后将粉末迅速转移至15ml的离心管中，加入经65℃预热的CTAB提取缓冲液5ml和β-巯基乙醇200μl，震荡混匀；
所述的CTAB提取缓冲液的成分为：2%十六烷基三甲基溴化铵,25mmol/L乙二胺四乙酸,2mol/L氯化钠,3%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）,100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（pH8.0）,0.5g/L亚精胺；
2)DNA和蛋白质的去除：在上述离心管中加入水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）溶液5ml，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4℃，12000rpm离心20min；离心后将离心管中的上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4℃，12000rpm离心10min；离心后将离心管中的上清液转移至新的离心管中，再次加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4℃，12000rpm离心10min；上清液中的蛋白质和DNA被沉淀，RNA存留于上清液中；
3)大分子量RNA的去除：转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入1/4体积的30%聚乙二醇6000（PEG6000）溶液，混匀后冰浴30min，然后在4℃，13000rpm离心10min；再将离心管中的上清液转移至新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心5min；上清液中的大分子量RNA被沉淀，低分子量RNA存留于上清液中；
4)低分子量RNA的获得：转移上述离心管中的上清液至新离心管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）溶液和2/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心10min，所得沉淀物即为低分子量RNA；然后用75%乙醇将离心管中的沉淀清洗两次，获得低分子量RNA；
5)低分子量RNA的保存：将低分子量RNA沉淀风干后，用50μl DEPC水溶解沉淀，然后将其转入1.5ml离心管中，–80℃保存备用。
本发明所用的植物材料为木瓜、香蕉、橡胶树的新鲜叶片。低分子量RNA质量评价过程中所用到的引物和接头序列如下：
PCR-F：TCGGACCAGGCTTCATTCCCC
PCR-R：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC
5’接头：CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA
反转录引物：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN
本发明的优点在于：①整个提取过程操作简便、实验成本低、提取过程所需时间短，用150min即可完成低分子量RNA的提取；②提取过程中对DNA、大分子量RNA和低分子量RNA采用分级沉淀，用30%聚乙二醇（PEG）和1/3体积的无水乙醇沉淀DNA和大分子量RNA，用2/3体积的无水乙醇沉淀低分子量RNA；③本方法所分离到的小RNA分子适用于进一步的低分子量RNA相关研究，用电泳和紫外分光光度法对所提取的低分子量RNA进行检测，结果表明，用本方法提取的橡胶树、香蕉和木瓜低分子量RNA质量高，电泳条带清晰，无拖尾（图1），纯度好，得率高（表1）；用RT-PCR法对提取的橡胶树低分子量RNA进行HbmiR166的扩增检测，结果表明，提取的橡胶树小RNA中包含有HbmiR166（图2，图3）。
表1不同材料的低分子量RNA的纯度和得率
Figure BDA00002107769300041
注：平均值±标准差来自3次重复实验。
附图说明
图1：利用本发明提取的植物低分子量RNA在1.0%琼脂糖甲醛变性胶中的电泳图谱。
泳道1为木瓜低分子量RNA，泳道2为香蕉低分子量RNA，泳道3为橡胶树低分子量RNA，泳道4为木瓜的PEG6000沉淀物，泳道5为香蕉的PEG6000沉淀物，泳道6为橡胶树的PEG6000沉淀物。
图2：橡胶树HbmiR166的扩增结果。
泳道1～泳道4分别为4次重复，M泳道为20bp ladder marker。
图3：橡胶树HbmiR166扩增产物的测序结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施本发明时，可用木瓜、香蕉、橡胶树的新鲜叶片。实施步骤为：
(1)称取0.5g叶片，用液氮研磨成粉末后，迅速将粉末转移至15ml的离心管中，并在离心管中加入经65℃预热的CTAB提取缓冲液[2%十六烷基三甲基溴化铵,25mmol/L乙二胺四乙酸,2mol/L氯化钠,3%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）,100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（pH8.0）,0.5g/L亚精胺]5ml和β-巯基乙醇200μl，震荡混匀；接着在离心管中加入水饱和酚∶氯仿∶异戊醇为（25∶24∶1）溶液5ml，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4℃，12000rpm离心20min。
(2)转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液，将离心管盖紧，翻转50次混合均匀，然后在4℃，12000rpm离心10min；(本步骤重复一次)。
(3)转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入1/4体积的30%聚乙二醇6000（PEG6000）溶液，混匀后冰浴30min，然后在4℃，13000rpm离心10min。
(4)转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心5min。
(5)转移上述离心管中的上清液至新的离心管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）溶液和2/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心10min，所得沉淀物为低分子量RNA；然后用75%乙醇将离心管中的沉淀物清洗两次；待清洗过的沉淀物风干后，用50μl DEPC水溶解沉淀物，然后将其转入1.5ml离心管中，-80℃保存备用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA00002107770200011
Figure IDA00002107770200021

Claims (3)

1.一种分离植物低分子量RNA的方法，其特征在于包括样品处理、DNA和蛋白质的去除、DNA和大分子量RNA的去除、低分子量RNA的获得、低分子量RNA的保存；
所述的样品处理加入的CTAB提取缓冲液的成分为：2%十六烷基三甲基溴化铵,25mmol/L乙二胺四乙酸,2mol/L氯化钠,3%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）,100mmol/L三羟甲基氨基甲烷（pH8.0）,0.5g/L亚精胺。
2.根据权利要求1所述的一种分离植物低分子量RNA的方法，其特征在于，所述DNA和大分子量RNA的去除，是在RNA上清液加入1/4体积的30%聚乙二醇6000（PEG6000）溶液，混匀后冰浴30min，然后在4℃，13000rpm离心10min；再将离心管中的上清液转移至新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心5min；上清液中的DNA和大分子量RNA被沉淀，低分子量RNA存留于上清液中，为低分子量RNA上清液。
3.根据权利要求1所述的一种分离植物低分子量RNA的方法，其特征在于，所述低分子量RNA的获得，是在低分子量RNA上清液加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2）溶液和2/3体积的无水乙醇，混匀后于4℃，13000rpm离心10min，所得沉淀物即为低分子量RNA；然后用75%乙醇将离心管中的沉淀清洗两次，获得低分子量RNA。
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