CN102206629B - 提取莲细胞核dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取莲细胞核DNA的方法；涉及分子生物学领域中提取DNA的方法。其主要步骤是：向研磨成细粉状的莲黄化苗叶片中加入细胞核提取缓冲液，经磁力搅拌、过滤、离心、漂洗后，得到纯化细胞核；加入细胞核裂解缓冲液于65℃水浴，经氯仿：异戊醇萃取和异丙醇沉淀后，得到絮状DNA沉淀物；经70%乙醇洗涤和室温干燥后，加Tris-EDTA缓冲液溶解DNA，于-20℃保存备用。通过本发明所获得的DNA为高质量的莲细胞核DNA，叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少。本发明适用于构建BAC文库和基因组测序等方面所需高质量细胞核DNA的提取。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域中提取DNA的方法，尤其涉及一种提取莲细胞核DNA的方法；具体涉及了一种以莲黄化苗叶片为材料、有效提取高质量莲细胞核DNA的方法。
背景技术
莲，俗称荷花，是被子植物中起源最早的植物之一，素有“活化石”之称。它在我国的栽培历史悠久，是重要的水生经济作物，集食用、药用、观赏于一身。因莲具有独特的经济、文化和观赏价值，已引起了人们广泛的重视，但就分子生物技术在莲研究中的应用，目前主要集中在品种鉴定及演化关系分析、种质间遗传多样性评估等方面，还未开展深层次的莲基因组学研究。
随着Illumina公司发布了新一代测序仪Genome Analyzer（Solexa产品系列）之后，Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有通量高、单位成本低、测序周期短和操作简单等优点，是植物全基因组测序最经济有效的测序平台；但其对DNA质量有比较高的要求。DNA质量是基因组测序技术的基础，分离纯度高（少多糖、少多酚、少色素和蛋白质）、叶绿体DNA和线粒体DNA含量低的核DNA，是测序仪高效和准确工作的基础，也是使测序序列达到最高可用性的保证。
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵法）法是一种快速简便的提取植物总DNA的常规方法（包括磨样、裂解、萃取、沉淀DNA，去除RNA等过程），但通过CTAB法所获得的莲DNA样品含有较多的叶绿体DNA和线粒体DNA，而且杂质多、纯度低，在很大程度上影响莲基因组测序的均一性、无偏性和序列的有用性，从而最终影响序列的拼接质量，不适合用于莲基因组测序。因此，需要一种新方法提取高质量的莲细胞核DNA用于基于新一代测序技术的莲基因组测序。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的问题和不足，提供一种提取莲细胞核DNA的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一、提取莲细胞核DNA的方法
本方法包括下列步骤：
①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经-20℃预冷5-6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；
②将细粉状样品转移至装有200毫升、经4℃预冷1-2小时的细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；
③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布（美国Caibiochem公司产品）过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；
④向白色沉淀物中加入40毫升Solution Ⅰ缓冲液，轻轻晃动使之混合均匀，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；
重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；
⑤向纯化细胞核内加入5毫升65℃的细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ，并加入10微升、浓度为10mg/ml的核糖核酸酶（RNase）溶液，轻轻转动使之混合均匀，在65℃的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；
⑥向混合液中加入5毫升的氯仿：异戊醇=体积比为24:1的萃取液，上下颠倒混匀，然后在室温下静置5分钟，再于离心机上12000rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；
⑦吸取上层水相至另一50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混匀，再置于-20℃的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA；
⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升70%乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液；
⑨再次加入1毫升70%乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3-4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；
⑩向离心管中加200微升的Tris-EDTA（三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸）缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入-20℃冰柜中保存。
工作原理：
经液氮研磨的莲黄化苗叶片用细胞核提取缓冲液提取和纯化细胞核，加入细胞核裂解缓冲液在65℃下裂解细胞核，再经过氯仿：异戊醇的萃取、异丙醇的沉淀，得到絮状的DNA沉淀，最后利用70%乙醇的洗涤DNA沉淀，即得高质量的莲细胞核DNA。本发明可分离到高纯度（少多糖、少多酚、少色素和蛋白质）、低叶绿体DNA和线粒体DNA含量的细胞核DNA，满足莲基因组测序与研究所需要的高质量细胞核DNA。
实验证明，通过本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
①通过本发明所获得的DNA为莲细胞核DNA，叶绿素DNA和线粒体DNA含量低；
②通过本发明所获得的莲细胞核DNA质量和纯度高，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少。
③本发明适用于构建BAC文库和基因组测序等方面所需高质量细胞核DNA的提取。
具体实施方式
一、两种缓冲液
1、细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ
（1）细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ的组分
三羟甲基氨基甲烷（Tris-base） 10毫摩尔/升；
乙二胺四乙酸（EDTA） 10毫摩尔/升；
氯化钾（KCl） 80毫摩尔/升；
蔗糖（Sucrose） 0.5摩尔/升；
聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100） 0.5%；
聚乙烯醇吡咯烷酮-30（PVP-30） 2%；
亚精胺（Spermidine） 1毫摩尔/升；
精胺（Spermine） 1毫摩尔/升；
β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol） 0.15%。
（2）细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ的制备方法
①前5种组分溶解和混合后，将pH调至9.4-9.5，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌12-16分钟；
②加入后4种组分混合；
③密封备用。
2、细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ
（1）细胞核裂解缓冲液Solution Ⅱ的组分
三羟甲基氨基甲烷（Tris-base） 50毫摩尔/升；
乙二胺四乙酸（EDTA） 5毫摩尔/升；
山梨糖醇（Sorbitol） 350毫摩尔/升；
氯化纳（NaCl） 710毫摩尔/升；
十二烷基硫酸钠（SDS） 1%；
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 0.1%；
β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol） 0.1%。
（2）细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ的制备方法
①前6种组分溶解和混合后，将pH调至7.9-8.0，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌20分钟；
②加入最后1种组分混合；
③密封备用。
二、实验结果
将通过本发明获得的莲细胞核DNA和通过CTAB常规法获得的莲基因组DNA分别置于紫外分光光度计（型号为Ultrospec 1100）上测定其在波长260纳米、230纳米和280纳米的吸光值，并比较两种方法所得DNA的A260/A280和A260/A230的比值，结果见下表：
由表可知，通过本方法获得DNA的A260/A280和A260/A230的比值均大于CTAB法所提取DNA的A260/A280和A260/A230比值，即通过本方法所获得的DNA质量优于CTAB常规法所得DNA，多酚、多糖、色素及蛋白质等杂质较少，DNA纯度较高；通过本方法所获得的DNA是裂解细胞核所得，主要为细胞核DNA，叶绿体DNA和线粒体DNA含量低。
故本发明可作为提取莲细胞核DNA进行基因组测序与研究的首选方法。
Claims (1)
1.提取莲细胞核DNA的方法，其特征在于下列步骤：
①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经-20℃预冷5-6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；
②将细粉状样品转移至装有200毫升、4℃预冷1-2小时的细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；
③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；
④向白色沉淀物中加入40毫升Solution Ⅰ缓冲液，轻轻晃动使之混合均匀，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；
重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；
⑤向纯化细胞核内加入5毫升65℃的细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ，并加入10微升、浓度为10mg/ml的核糖核酸酶溶液，轻轻转动使之混合均匀，在65℃的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；
⑥向混合液中加入5毫升的氯仿：异戊醇萃取液，上下颠倒混匀，然后在室温下静置5分钟，再于离心机上12000rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；
⑦吸取上层水相至另一50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混匀，再置于-20℃的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA；
⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升70%乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液；
⑨再次加入1毫升70%乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3-4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；
⑩向离心管中加200微升的Tris-EDTA缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入-20℃冰柜中保存；
其中：
细胞核提取缓冲液Solution Ⅰ的组分
三羟甲基氨基甲烷 10毫摩尔/升；
乙二胺四乙酸 10毫摩尔/升；
氯化钾 80毫摩尔/升；
蔗糖 0.5摩尔/升；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.5%；
亚精胺 1毫摩尔/升；
精胺 1毫摩尔/升；
聚乙烯醇吡咯烷酮-30 2%；
β-巯基乙醇 0.15%；
pH为9.4-9.5；
细胞核裂解缓冲液Solution Ⅱ的组分
三羟甲基氨基甲烷 50毫摩尔/升；
乙二胺四乙酸 5毫摩尔/升；
山梨糖醇 350毫摩尔/升；
氯化钠 710毫摩尔/升；
十二烷基硫酸钠 1%；
十六烷基三甲基溴化铵 0.1%；
β-巯基乙醇 0.1%；
pH为7.9-8.0。
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