CN114606175B - 一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法 - Google Patents
一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，包括如下步骤：配置好所需裂解液和灭菌相关容器；将柑橘幼嫩的叶片材料迅速用液氮浸没固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混匀；使用Miracloth分离细胞核与其他非核材料；离心过滤液，不同大小离心管离心参数有差异,离心整个过程中，通过处理过的宽口枪头吸打，逐步分离叶绿体等杂质，对细胞核与其他非核材料进行精细分离，最终得到所需质量和浓度的细胞核；本发明中所提供的柑橘细胞核提取方法，使用范围广，可适用于十余种柑橘品种，能够去除叶绿体污染又对细胞核破坏较低，细胞核的纯度得到提高，且提取浓度高。
Description
技术领域
本发明涉及柑橘细胞核提取技术领域，具体涉及一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法。
背景技术
植物细胞非对称融合、染色体杂交育种、大片段基因组文库构建、DNA纤维制备、细胞核中DNA、RNA、蛋白质含量的分析及染色质结构分析等，需要分离纯化出较多个体完整，分散较好的细胞核。学者们曾尝试用不同方法进行植物细胞核的分离，比如大豆、玉米、水稻、烟草、小麦、棉花、长春花、杉木等细胞核的分离或纯化近来又有过报道，但由于不同植物材料由于结构和组分的不同，所以适合一种植物的细胞核制备方法并不适合于其它植物。
因此，为提高柑橘细胞核提取效率，亟需提供一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题，普遍适用于十余种柑橘品种，所提细胞核完整性好，浓度高，步骤简便，3-4小时便可获取结果。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，包括如下步骤：
S1、配置好所需裂解液和灭菌相关容器；
S2、将柑橘幼嫩的叶片材料迅速用液氮浸没固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混匀；
S3、使用Miracloth分离细胞核与其他非核材料；
S4、离心过滤液，不同大小离心管离心参数有差异：
首先，使用50mL离心管调整到高转速5000rpm以尽量增加细胞核的回收率；
其次，将10mL离心管降低到中转速3000rpm以尽量分离非核材料；
最后，将1.5mL离心管降低到低转速2000rpm以减少细胞核的破碎率；离心整个过程中，通过处理过的宽口枪头吸打，逐步分离叶绿体等杂质，对细胞核与其他非核材料进行精细分离，最终得到所需质量和浓度的细胞核；
所述裂解液为100 mLHB (homogenization buffer) stock 10X 、1000 mLHB1Xsolution、100 mLTriton X-100 和NIB (nuclear isolation buffer)；
所述HB(homogenization buffer)为1.21g Trizma base、5.96g KCl 、20mL 0.5M EDTA、0.255g Spermidine和0.348g Spermine，使用双蒸水补充到100mL，调节pH 至9-9.4， 可在4℃的玻璃瓶中保存1年；
所述1000 mLHB 1Xsolution为100 mL 10X HB和171.2g 蔗糖，使用双蒸水补充到700mL，直至完全溶解，补充到最终体积1000mL，可在4 °C的玻璃瓶中保存三个月。
其中，所述100 mLTriton X-100 为20mL Triton X-100、10 mL 10X HB和17.15g蔗糖，使用双蒸水补充到60 mL，直至完全溶解，补充到最终体积100mL，可在4℃的玻璃瓶中保存一年。
其中，所述NIB (nuclear isolation buffer)为97.5 mL 1X HB、2.5 mL TritonX-100 mix和250μLβ-巯基乙醇β-mercaptoethanoL，在使用前立即加入1 g 聚乙烯吡咯烷酮PVP搅拌直至溶解。
其中，所述步骤S4中的宽口枪头为1mL剪口枪头，利用宽口枪头轻轻悬浮底部绿色沉淀，避免气泡和泡沫产生，继续冰上裂解30min。
其中，所述步骤S2中的研磨采用研钵，使用前，先用液氮提前预冷。
其中，所述步骤S3中的Miracloth为一种孔径22－25μm的聚酯人造纤维滤布，使用时，将其放置于漏斗上，折叠成3-5层，通过重力作用过滤进50mL离心管。
综上所述，由于采用了上述技术，本发明的有益效果是：
1、本发明中所提供的柑橘细胞核提取方法，使用范围广，可适用于十余种柑橘品种，其中包括宜昌橙、丹娜香橼、本地早、黄皮、琯溪蜜柚、小叶枳、克里曼丁、山金柑、酒饼簕和甜橙等；
2、本发明中所提供的柑橘细胞核提取方法，所提细胞核完整性好，能够去除叶绿体污染又对细胞核破坏较低，细胞核的纯度最大程度地得到提高，且提取浓度高；
3、本发明中所提供的柑橘细胞核提取方法，步骤简便，3-4小时便可获取结果。
附图说明
图1为本发明为宜昌橙的细胞核DAPI染色图；
图2为本发明为丹娜香橼的细胞核DAPI染色图；
图3为本发明为本地早的细胞核DAPI染色图；
图4为本发明为黄皮的细胞核DAPI染色图；
图5为本发明为琯溪蜜柚的细胞核DAPI染色图；
图6为本发明为小叶枳的细胞核DAPI染色图；
图7为本发明为克里曼丁的细胞核DAPI染色图；
图8为本发明为山金柑的细胞核DAPI染色图；
图9为本发明为酒饼簕的细胞核DAPI染色图；
图10为本发明为甜橙的细胞核DAPI染色图；
图11为本发明一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如图11所示的一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，包括如下步骤：
S1、配置好所需裂解液和灭菌相关容器；
S2、将柑橘幼嫩的叶片材料迅速用液氮浸没固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混匀；
S3、使用Miracloth分离细胞核与其他非核材料；
S4、离心过滤液，不同大小离心管离心参数有差异：
首先，使用50mL离心管调整到高转速5000rpm以尽量增加细胞核的回收率；
其次，将10mL离心管降低到中转速3000rpm以尽量分离非核材料；
最后，将1.5mL离心管降低到低转速2000rpm以减少细胞核的破碎率；离心整个过程中，通过处理过的宽口枪头吸打，逐步分离叶绿体等杂质，对细胞核与其他非核材料进行精细分离，最终得到所需质量和浓度的细胞核。
所述裂解液为HB (homogenization buffer) stock 10X (100 mL)、1000 mLHB1Xsolution、100 mLTriton X-100 和NIB (nuclear isolation buffer)；所述HB(homogenization buffer)为1.21 g Trizma base、5.96 g KCl 、20mL 0.5 M EDTA、0.255g Spermidine和0.348 g Spermine，使用双蒸水补充到100mL，调节pH 至9-9.4；所述1000mLHB 1Xsolution为100 mL 10X HB和171.2g 蔗糖，使用双蒸水补充到700mL，直至完全溶解，补充到最终体积1000mL，可在4℃的玻璃瓶中保存三个月。
具体的，所述100 mLTriton X-100 为20mL Triton X-100、10 mL 10X HB和17.15g 蔗糖，使用双蒸水补充到60 mL，直至完全溶解，补充到最终体积100mL，可在4℃的玻璃瓶中保存三个月。
具体的，所述NIB (nuclear isolation buffer)为97.5 mL 1X HB、2.5 mLTriton X-100 mix和250μLβ-巯基乙醇β-mercaptoethanoL，在使用前立即加入1 g 聚乙烯吡咯烷酮PVP搅拌直至溶解。
具体的，所述步骤S4中的宽口枪头为1mL剪口枪头，利用宽口枪头轻轻悬浮底部绿色沉淀，避免气泡和泡沫产生，继续冰上裂解30min。
具体的，所述步骤S2中的研磨采用研钵，使用前，先用液氮提前预冷。
具体的，所述步骤S3中的Miracloth为一种孔径22－25μm的聚酯人造纤维滤布，使用时，将其放置于漏斗上，折叠成3-5层，通过重力作用过滤进50mL离心管。
根据图1-10所提供的不同品种的柑橘细胞核DAPI染色图，通过实验分别对下表中的柑橘品种进行细胞核提取：
| 序号 | 种质名称 | 种名 | 采摘位置 |
| 1 | 宜昌橙 | Citrus macropermaGuo.et Ye. | 叶片、枝条 |
| 2 | 丹娜香橼 | Citrus medicaL. | 叶片、枝条 |
| 3 | 本地早 | Citrus succosaHort.ex Tanaka | 叶片、枝条 |
| 4 | 黄皮 | CLausena Lansium（Lour.）SkeeLs | 叶片、枝条 |
| 5 | 琯溪蜜柚 | Citrus grandis(L.) Osbeck | 叶片、枝条 |
| 6 | 小叶枳 | Poncirus trifoLiataRaf. | 叶片、枝条 |
| 7 | 克里曼丁 | Citrus cLementinahort.ex. Tanaka | 叶片、枝条 |
| 8 | 山金柑 | FortuneLLa hindssiSwingLe | 叶片、枝条 |
| 9 | 酒饼簕 | Severinia | 叶片、枝条 |
| 10 | 甜橙 | Citrus sinensis(L.) Osbeck | 叶片、枝条 |
S1、柑橘材料要求选取来自液氮处理的新鲜、健康叶片，或者从-80℃超低温冰箱中取用。要求尽可能幼嫩、触摸柔软，称取1g左右；
S2、使用研钵前，先用液氮提前预冷，再加入材料，研磨时尽可能充分，研磨15min左右，至磨成无大颗粒，细白粉末为宜，慢慢从沿壁用预冷的药品勺刮下，立即加入到已预冷的含有10mL NIB裂解液的加盖三角瓶（50mL规格）中，快速握旋混匀以防止组织在裂解液中结块，但不要产生过多气泡，待到裂解液中无大块颗粒，叶片粉末分散均匀时，把三角瓶固定在冰盒上，冰盒固定在在水平脱色摇床上，冰浴振荡，转速为200rpm，时间为15min；
S3、将Miracloth放置于漏斗上，折叠成3-5层，通过重力作用过滤进50mL离心管，当裂解液过滤通畅时，Miracloth可折叠成5层；当裂解液过滤困难时，Miracloth可折叠成3层。使用1mL剪口枪头，轻轻吸打Miracloth沿壁的细胞核沉淀以帮助过滤通畅，过滤全程凭借重力作用，勿用外力挤压。过滤完毕后，立刻盖好离心管盖子，期间始终保持冰浴，配平离心管，离心，离心机保持4℃、5000rpm、20min；
S4、离心完毕，缓缓倾倒弃置上清液，加入1-2mL NIB裂解液，使用1mL剪口枪头轻轻悬浮底部绿色沉淀，转移重悬液至10 mL离心管中，用NIB裂解液补齐至10mL，配平离心管，离心，离心机保持4℃、3000rpm、10min；
S5、离心完毕，缓缓倾倒弃置上清液，加入1-2mL NIB裂解液，使用1mL剪口枪头轻轻悬浮底部绿色沉淀，用NIB裂解液补齐至10mL，配平离心管，离心，离心机保持4℃、3000rpm、10min；
S6、离心完毕，缓缓倾倒弃置上清液，使用1mL剪口枪头尽量吸走绿色沉淀，同时要减少白色沉淀的损失，剩余白色沉淀轻轻用1mL NIB裂解液吸打悬浮，转移至新的1.5mL离心管中，配平离心管，离心，离心机保持4℃、2000rpm、5min；
S7、离心完毕，使用200μl剪口枪头尽量弃置绿色沉淀，留下白色沉淀用500μL1XHB悬浮，冰浴备用；
S8、染色前，先用1mL剪口枪头轻轻悬浮均匀细胞核混合液，悬浮均匀后，吸取5μl悬浮液和5μLDAPI吸打混匀，涂布于血球计数板上，调整荧光显微镜通道至DAPI通道，计数得出细胞核浓度，并观察细胞核整体质量，包含：破碎完整、杂质多少、核数量等情况。
通过分别对宜昌橙、丹娜香橼、本地早、黄皮、琯溪蜜柚、小叶枳、克里曼丁、山金柑、酒饼簕和甜橙进行上述步骤，均可以得到完整性好，浓度高的细胞核提取物。
需要说明的是，在本发明中，细胞核、裂解液及容器全程需放置冰上处理；且本提取过程中所用到的容器、离心管需灭菌，台面进行75％酒精消毒处理。
综上所述，本发明中所提供的柑橘细胞核提取方法，使用范围广，可适用于十余种柑橘品种，其中包括宜昌橙、丹娜香橼、本地早、黄皮、琯溪蜜柚、小叶枳、克里曼丁、山金柑、酒饼簕和甜橙等；所提细胞核完整性好，能够去除叶绿体污染又对细胞核破坏较低，细胞核的纯度最大程度地得到提高，且提取浓度高；且此方法步骤简便，3-4小时便可获取结果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
Claims (3)
1.一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、配置好所需裂解液和灭菌相关容器；
S2、将柑橘幼嫩的叶片材料迅速用液氮浸没固定，快速充分研磨，加入到裂解液中充分混匀；
S3、使用Miracloth分离细胞核与其他非核材料；
S4、离心过滤液，不同大小离心管离心参数有差异：
首先，使用50mL离心管调整到高转速5000rpm以尽量增加细胞核的回收率；
其次，将10mL离心管降低到中转速3000rpm以尽量分离非核材料；
最后，将1.5mL离心管降低到低转速2000rpm以减少细胞核的破碎率；离心整个过程中，通过处理过的宽口枪头吸打，逐步分离叶绿体等杂质，对细胞核与其他非核材料进行精细分离，最终得到所需质量和浓度的细胞核；
所述裂解液为100 mLHB stock 10X 、1000 mLHB 1Xsolution、100 mLTriton X-100和NIB；
所述HB为1.21g Trizma base、5.96g KCl 、20mL 0.5 M EDTA、0.255g Spermidine和0.348g Spermine，使用双蒸水补充到100mL，调节pH 至9-9.4；
所述1000 mLHB 1Xsolution为100 mL 10X HB和171.2g 蔗糖，使用双蒸水补充到700mL，直至完全溶解，补充到最终体积1000mL；
所述100 mLTriton X-100 为20mL Triton X-100、10 mL 10X HB和17.15g 蔗糖，使用双蒸水补充到60 mL，直至完全溶解，补充到最终体积100mL；
所述NIB为97.5 mL 1X HB、2.5 mL Triton X-100 mix和250μLβ-巯基乙醇β-mercaptoethanoL，在使用前立即加入1 g 聚乙烯吡咯烷酮PVP搅拌直至溶解；
所述步骤S3中的Miracloth为一种孔径22－25μm的聚酯人造纤维滤布，使用时，将其放置于漏斗上，折叠成3-5层，通过重力作用过滤进50mL离心管。
2.根据权利要求1所述的一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，其特征在于：所述步骤S4中的宽口枪头为1mL剪口枪头，利用宽口枪头轻轻悬浮底部绿色沉淀，避免气泡和泡沫产生，继续冰上裂解30min。
3.根据权利要求1所述的一种应用于多品种的柑橘细胞核提取方法，其特征在于：所述步骤S2中的研磨采用研钵，使用前，先用液氮提前预冷。
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