CN105238776A - 一种芒果组织rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学技术领域，具体的说是涉及一种芒果组织RNA的提取方法。本发明的提取方法用LiCL溶液替代现有技术中的醋酸钾溶液，结合乙醇进行第二次分离沉淀RNA，结果对RNA选择性沉淀效果好，大大减少了无效沉淀对RNA产物的干扰，纯度和得率都大大提高，提高了芒果叶片RNA的提取质量和成功率。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体的说是涉及一种芒果组织RNA的提取方法。
背景技术
复杂植物组织RNA的提取的难点之一是去除多糖多酚等物质，避免它们随RNA一起沉淀使之发生不可逆结合或降解。芒果叶片组织成分较为复杂，用一般方法较难提取高质量的总RNA。
芒果叶片组织的复杂成分严重干扰RNA的提取，且成分随叶龄不同而有很大差异，老叶片比低叶龄叶片在RNA提取上要明显困难。另外不同品种芒果叶片RNA提取难度有很大差异，例如四季蜜芒比象牙芒更难提取叶片RNA，表现出更容易生成褐化的沉淀，得率明显降低，RNA产物容易发生降解的现象。许多文献阐述了植物中影响RNA提取的主要是多糖，多酚等次生代谢产物，并报道了针对这些问题的一些RNA提取方法，其中对芒果组织RNA提取较成功的有R.López-Gómez和M.A.Gómez-Lim用于对芒果果皮RNA的提取法；肖洁凝，黄学林，黎茵等用于对芒果子叶RNA的提取法。本文对比将这些方法用于对芒果叶片组织RNA的提取，均不能获得满意的结果，特别是对四季蜜芒老叶片组织RNA的提取效果较差。本文实验结果发现，在上述两篇文献所述丙酮洗涤优化及LiCl沉淀法的技术基础上，用低浓度LiCl溶液代替现有技术中的醋酸钾溶液进行第二次RNA沉淀，结果对RNA选择性沉淀效果好，大大减少了无效沉淀对RNA产物的干扰，RNA纯度和得率都大大提高，能够很好地实现芒果叶片RNA的提取，仅用0.5g左右的鲜样即能为后续实验提取到高质量的总RNA。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对传统芒果组织RNA的提取方法的不足，本发明的目的是提供一种新型芒果组织RNA的提取方法。
本发明提供的技术方案为：
一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤2-3次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥5-10min，得到干燥后的沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
作为优选，步骤(1)中所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片。
作为优选，步骤(1)中所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％。
作为优选，步骤(2)中所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5。
作为优选，所述的弱酸为硼酸。
作为优选，步骤(3)中所述的LiCl溶液的终浓度为3mol/L。
作为优选，步骤(4)中所述的LiCl溶液的终浓度为0.3mol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的提取方法用LiCL溶液替代现有技术中的醋酸钾溶液，结合乙醇进行第二次分离沉淀RNA，结果对RNA选择性沉淀效果好，大大减少了无效沉淀对RNA产物的干扰，纯度和得率都大大提高，提高了芒果叶片RNA的提取质量和成功率。
附图说明
图1为实施例提取RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
有关附图标记的说明：
A-采用改进前方法提取RNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道5，6对应的分别是实施例5，6提取的RNA；B-采用本发明方法提取RNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1，2，3，4对应的分别是实施例1，2，3，4提取的RNA。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤2次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥5min，得到干燥后的沉淀；所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片；所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5；所述的弱酸为硼酸；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
实施例2：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤3次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥10min，得到干燥后的沉淀；所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片；所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5；所述的弱酸为硼酸；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
实施例3：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤2次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥8min，得到干燥后的沉淀；所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片；所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5；所述的弱酸为硼酸；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
实施例4：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤3次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥6min，得到干燥后的沉淀；所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片；所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5；所述的弱酸为硼酸；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
对比实施例5：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g新鲜芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，再用含1％β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液洗涤2次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥5min，得到干燥后的沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，获得的上清液即为RNA粗提取液；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，在-20℃下过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min后收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入醋酸钾溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积无水乙醇，在-20℃条件下过夜沉淀RNA；12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀，用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管倒置开口干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱备用。
对比实施例6：一种芒果组织RNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取0.5g新鲜芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，再用含1％β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液洗涤3次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥10min，得到干燥后的沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，获得的上清液即为RNA粗提取液；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度3mol/L，在-20℃下过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min后收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入醋酸钾溶液至终浓度0.3mol/L，再加入2倍体积无水乙醇，在-20℃条件下过夜沉淀RNA；12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀，用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管倒置开口干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱备用。
表1本发明的提取方法提取的芒果组织RNA的纯度和提取率测定
注：实施例1，2，3，4为本发明的实施例；对比实施例5，6为现有技术中提取芒果组织RNA的方法。
如见表1所示，实施例1，2，3，4中提取的芒果组织RNA的纯度和RNA的提取率均高于与对比实施例5，6。
综上所述，本发明的提取方法用LiCl溶液替代现有技术中的醋酸钾溶液，结合无水乙醇进行第二次分离沉淀RNA，结果对RNA选择性沉淀效果好，大大减少了无效沉淀对RNA产物的干扰，纯度和得率都大大提高，提高了芒果叶片RNA的提取质量和成功率。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取0.5g芒果叶片放入研钵内，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮，用液氮将芒果叶片研磨成粉末，将其转移至2mL离心管中，用丙酮溶液洗涤2-3次，每次洗涤后12000r/min4℃离心5min，弃去丙酮，将收集有沉淀的离心管置于冰上开口干燥5-10min，得到干燥后的沉淀；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入600μL提取缓冲液，室温下振荡充分混匀；加入150μL无水乙醇，66μL5mol/L的乙酸钾，振荡充分混匀；加入800μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000r/min4℃离心抽提2次，弃去沉淀，获得上清液即为RNA粗提取液；
(3)在RNA粗提取液中加入LiCL溶液至终浓度，-20℃过夜沉淀RNA，12000r/min4℃离心10min收集沉淀，再用3mol/LLiCL洗涤沉淀2次，每次洗涤后均用12000r/min4℃离心10min收集沉淀；
(4)用DEPC处理水溶解沉淀，加入LiCL溶液至终浓度，再加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀RNA；用75％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，每次洗涤后用12000r/min4℃离心10min收集RNA沉淀；将收集有RNA沉淀的离心管开口倒置干燥2-4min除去乙醇，用30μLDEPC处理水溶解RNA沉淀并保存于-80℃冰箱，备用。
2.根据权利要求1所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的芒果叶片为新鲜的芒果叶片。
3.根据权利要求1所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的丙酮溶液中β-巯基乙醇质量百分含量为1％。
4.根据权利要求1所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述的提取缓冲液成分为：2％SDS、1％β-巯基乙醇、50mMEDTA和150mMTris，加入弱酸调提取缓冲液pH为7.5。
5.根据权利要求4所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，所述的弱酸为硼酸。
6.根据权利要求1所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的LiCl溶液的终浓度为3mol/L。
7.根据权利要求1所述的芒果组织RNA的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述的LiCl溶液的终浓度为0.3mol/L。
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|---|---|---|---|---|
| CN101781646A (zh) * | 2009-12-25 | 2010-07-21 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种提取甘薯块根rna的方法及其应用 |
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