CN105985414A - 一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述蛋白不会产生过度的免疫排斥反应；其次，所述蛋白对TLR信号通路的干扰作用存在剂量依赖关系，通过降低作用浓度使其产生适度的抑制，但却不损害宿主的防御能力，以避免过度抑炎反应造成的副作用；所述蛋白与临床所应用的抗炎症因子抗体不同的是，它们针对的不是单一一种致炎因子，而是多种因子、多条途径，利于损伤组织的修复。

Description

一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用。

背景技术

沙门菌是一类人兽共患的肠道致病菌，在全球范围内每年大约有13亿人因感染沙门菌而导致胃肠炎、腹泻和伤寒等疾病。天然免疫系统作为机体第一道免疫防线，可以通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns,PAMPs)，激活核转录因子κB(Nuclear factorκB,NFκB)信号通路，诱导产生前炎性细胞因子和抗菌肽来抵抗病原微生物的入侵。

NFκB通路的激活对防御病原微生物的侵袭尤为重要，然而，信号的异常活化可能会引起炎性和自身免疫疾病或癌症。许多感染性疾病、自身免疫病和恶性肿瘤都会引发机体产生过度炎症反应，因而靶向天然免疫应答和信号传递的药物具有潜在的医疗前景。在革兰氏阴性菌引起的败血症病人中，TLR4拮抗剂可用于预防因LPS引起的内毒素性休克，目前已有两种脂质A类似物TAK-242和Eritoran被批准用于治疗败血病人的临床试验。TLRs拮抗剂可用于治疗自身免疫性疾病，尤其是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)。TLR7和TLR9参与了机体自身抗体的产生，并靶向内源性TLR配体，同时也是pDC介导的Ⅰ型IFN产生所必需的。靶向TLRs的治疗学方法可能会有效地抑制自身免疫疾病的发展和恶化。

细菌逃逸TLRs-NFκB信号通路的机制为未来抗炎性药物的研究提供了理论基础。微生物已经进化出相应的策略来抑制机体的炎性应答，这些细菌效应分子本身或经修饰后或许会具有治疗药物的潜能。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗炎作用的蛋白及其制备与应用，该蛋白能够干扰TLR信号通路，并抑制炎性细胞因子的分泌，具有抑制炎症反应的功能。

本发明一方面提供了一种分离的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：

MSISTTMSNINRIQKDIASLQKQLSDEQRKEAQLSGKINQIKRSVTKSTSLSTLNSKMSEISRHKNDISRCNSKKADINKKITAKTGDLHRYQLQLIKEQENDQKKRIAAQKKLEKEQLDYQKKITRELKSQKRAISPSHKFNRPVINKSDETEDITESYDVFISHATEDKDSFVRPLAELLRAKGINVWYDEFSLGWGKSLRKTIDYGLANSRFGVVVLSKSFIKKDWTEYELNGLTAREMSGENQVILPIWHEVSKSDILKFSPTLVDKMALNTSINTIDEIAEQLESLLK。

在本发明的实施例中，将本发明的蛋白，取名为TcpS。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，其编码所述蛋白。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

进一步的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：ATGTCTATAAGCACCACAATGTCAAATATCAACAGAATACAAAAAGACATTGCTAGTCTACAAAAACAACTTTCTGATGAGCAGCGTAAAGAGGCCCAACTTTCAGGAAAAATCAATCAAATAAAGCGTAGCGTCACTAAGTCAACGTCTTTAAGCACATTGAATTCCAAAATGTCAGAGATCTCTCGTCATAAAAATGATATTTCAAGATGTAACTCTAAAAAAGCAGATATTAATAAAAAAATAACAGCAAAAACTGGAGACTTACACCGTTATCAATTACAACTCATTAAAGAGCAAGAGAATGACCAGAAAAAAAGAATTGCTGCACAGAAGAAACTTGAAAAAGAACAATTAGATTACCAGAAGAAAATCACACGAGAATTGAAATCGCAGAAAAGGGCAATATCTCCAAGCCATAAATTCAATCGTCCAGTCATCAACAAATCTGATGAGACAGAAGATATTACAGAGAGTTATGATGTTTTTATCTCTCATGCAACAGAAGATAAAGATAGTTTTGTCCGTCCCCTTGCTGAGTTGTTAAGAGCAAAAGGGATAAATGTATGGTATGACGAATTCTCTTTAGGCTGGGGTAAAAGTCTACGTAAGACAATCGATTATGGATTAGCAAATTCTCGGTTTGGAGTTGTTGTTTTATCTAAATCCTTTATCAAAAAGGACTGGACAGAGTATGAATTAAATGGTTTGACTGCTAGAGAGATGAGCGGTGAAAACCAAGTAATACTGCCTATCTGGCACGAAGTATCTAAATCTGATATTTTAAAATTCAGCCCTACACTAGTAGATAAAATGGCATTAAATACATCGATAAATACCATTGATGAAATTGCTGAACAGCTTGAATCATTATTGAAATGA。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有前述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述蛋白的DNA有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成，进而表达蛋白。

较佳的，所述表达载体为真核表达载体。进一步的，所述真核表达载体可在HEK293T和RAW264.7真核细胞内稳定表达，如真核载体pCMV-Myc等。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的实施例中，采用的宿主细胞为HEK293T和RAW264.7细胞。

本发明第五方面提供了所述蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)在适合表达所述蛋白的条件下，培养上述被转化的宿主细胞；

2)从培养物中分离出所述蛋白。

从培养物中分离出具有抗炎作用的蛋白的方法可采用镍柱纯化法提取。

本发明第六方面，提供了与上述蛋白特异结合的抗体。

本发明第七方面，提供了检测样品中是否存在所述蛋白的方法，所述方法包括：将样品与所述蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在所述蛋白。

本发明第八方面，提供了本发明前述分离的蛋白、前述分离的多核苷酸、前述表达载体、或前述宿主细胞在制备抗炎药物中的用途。

较佳的，所述用途中抗炎药物具体是指干扰TLR信号通路并抑制炎性细胞因子分泌的药物。

本发明第九方面，提供了一种抗炎药物组合物，所述组合物包含本发明前述分离的蛋白、前述分离的多核苷酸、前述表达载体、或前述宿主细胞。

进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体或赋形剂包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

进一步的，所述抗炎药物组合物的抗炎活性成分含有所述蛋白。

较佳的，所述蛋白为所述抗炎药物组合物的唯一抗炎活性成分。

本发明的有益效果为：

TcpS作为一种小分子蛋白，不会产生过度的免疫排斥反应；其次，TcpS对TLR信号通路的干扰作用存在剂量依赖关系，通过降低作用浓度使其产生适度的抑制，但却不损害宿主的防御能力，以避免过度抑炎反应造成的副作用；而同样具有抑炎功能的TcpB，其对NF-κB信号通路的抑制作用有时却是彻底的(图4)，是不适合药物的设计的。TcpS与临床所应用的抗炎症因子抗体不同的是，它们针对的不是单一一种致炎因子，而是多种因子、多条途径，利于损伤组织的修复。

附图说明

图1：为原核表达TcpS蛋白的SDS-PAGE图片。其中，泳道M为：蛋白Marker；泳道1、2和3为：TcpS蛋白(36kDa处有目的条带)。

图2：为Western blotting鉴定肠炎沙门菌C50041表达并分泌TcpS图片。其中，泳道M为：蛋白Marker；泳道1为：细菌C50041培养后菌体；泳道2为：细菌C50041培养后上清；泳道3为：细菌与细胞共培养后菌体，泳道4为：细菌与细胞共培养后上清。一抗为制备的TcpS多抗血清(1:500)。

图3：为Western blotting鉴定真核表达质粒pTcpS在细胞中的表达。其中，pMyC表示HEK293T(pMyC)，pMyC-tcpS表示HEK293T(pMyC-tcpS)。一抗为制备的TcpS多抗血清(1:500)。

图4：为TcpS靶向TLR2、TLR4和TLR5介导的NFκB的活化。共转染NF-κB luciferasereporter、pTLR4+pMD2(或pTLR2、pTLR5)和pTcpS(或pTcpB)到HEK293T细胞中，转染24h后1μg/mL Pam3CSK4(或100ng/mL LPS、100ng/mL FliC)进行刺激，刺激5h后检测荧光素酶活性，其中pTcpB为阳性对照。

图5：为在RAW264.7细胞中TcpS可抑制不同TLRLs诱导的NF-κB的活化。共转染NF-κBluciferase reporter和pTcpS到RAW264.7细胞中，转染24h后分别用100ng/mL LPS(TLR4L)，2.5μg/mL R848(TLR7L)，2μM CpG(TLR9L)刺激。刺激后5h检测荧光素酶活性。

图6：为TcpS抑制炎性细胞因子IL-8的分泌。共转染pTLR4、pMD2和pTcpS到HEK293T细胞中，转染24h后100ng/mL LPS进行刺激，刺激5h后ELISA试剂盒(BD公司)检测IL-8水平。

图7：为TcpS抑制炎性细胞因子的产生。共转染pTLR4、pMD2和pTcpS到HEK293T细胞中，转染24h后100ng/mL LPS进行刺激，刺激5h后qRT-PCR检测炎性下拨因子IL-1β、IL-8、IL-17A和TNF-α的转录水平。其中，(A)为：IL-1β；(B)为：IL-8；(C)为：IL-17A；(D)为：TNF-α，内参为β-actin。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1Western blotting技术鉴定肠炎沙门菌C50041表达并分泌TcpS

(1)构建原核表达质粒pCold-tcpS

首先，设计带有KpnI和XbaI双酶切位点的引物：

正向引物：5’-GGGGGGTACCATGTCTATAAGCACCACAATG-3’SEQ ID NO:3

反向引物：5’-GCTCTAGATCATTTCAATAATGATTCAAGC-3’SEQ ID NO:4

然后，从肠炎C50041菌株中提取基因组为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列为扩增引物PCR扩增tcpS(序列如SEQ ID NO:2所示)基因后进行琼脂糖凝胶电泳回收，将tcpS产物和pCold载体分别进行双酶切并回收，使用T4DNA连接酶16℃连接过夜，次日转化DH5α，并涂布抗性LB固体培养基进行筛选。挑取阳性克隆进行鉴定，测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)正确后得到原核表达质粒pCold-tcpS。

(2)制备TcpS多抗血清：

将质粒pCold-tcpS转化BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株，15℃0.5mM IPTG诱导表达，经镍柱纯化后得到TcpS蛋白(如图1所示)，与弗氏佐剂等体积混合后免疫BALB/c小鼠获得抗TcpS多抗血清。

(3)Western blotting技术鉴定肠炎沙门菌C50041表达并分泌TcpS

将C50041与RAW264.7细胞共培养后5h，分别收集上清和细胞；C50041过夜培养后离心收集上清和菌体。使用TcpS多抗血清(1:500)鉴定TcpS的表达情况，Western blotting结果显示共培养后上清可检测到TcpS，表明肠炎C50041菌株是可表达并分泌TcpS蛋白的，且共培养能促进沙门菌TcpS的表达(如图2所示)，表明tcpS具有编码蛋白功能的基因。

实施例2TcpS可干扰TLR信号通路并抑制炎性细胞因子分泌

(1)TcpS可抑制TLR2、TLR4和TLR5介导的NF-κB的活化

1)构建真核表达质粒pCMV-Myc-tcpS、pCMV-Myc-tcpB和pCMV-MD2，pcDNA3.1-TLR5为实验室保存质粒，购买pCMV-GFP-TLR2和pCMV-GFP-TLR4(Origene公司)：

具体的，真核表达质粒pCMV-Myc-tcpS的构建方法为：

首先，设计带有SalI和KpnI双酶切位点的引物如下：

正向引物：5’-ACGCGTCGACCATGTCTATAAGCACCACAATG-3’SEQ ID NO:5

反向引物：5’-CCCCGGTACCTCATTTCAATAATGATTCAAGC-3’SEQ ID NO:6

然后，从肠炎C50041菌株中提取基因组为模板，以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列为扩增引物PCR扩增tcpS(序列如SEQ ID NO:2所示)，将tcpS片段和pCMV-Myc载体分别经SalI和KpnI双酶切后进行连接，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经酶切和测序鉴定正确后获得重组质粒pCMV-Myc-tcpS。

具体的，真核表达质粒pCMV-Myc-tcpB的构建方法为：

首先，设计带有SalI和KpnI双酶切位点的引物如下：

正向引物：5’-ACGCGTCGACCATGTCTAAAGAGAAACAAGCCCAATC-3’SEQ IDNO:7

反向引物：5’-CCCCGGTACCTCAGATAAGGGAATGCAGTTCTTTCG-3’SEQ ID NO:8

然后，以布鲁氏菌S19基因组(GenBank:CP000887)为模板，以SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8的序列为扩增引物PCR扩增tcpB，所述tcpB的基因序列如SEQ ID NO:11所示，具体为：

ATGTCTAAAGAGAAACAAGCCCAATCAAAAGCCCACAAAGCCCAACAAGCTATCAGTTCAGCAAAATCACTCTCCACACAGAAAAGCAAAATGTCAGAGCTTGAGCGCGCCACGAGGGATGGTGCCGCGATTGGCAAGAAGCGAGCGGATATCGCCAAAAAAATTGCCGATAAGGCAAAACAGTTAAGCTCCTATCAGGCTAAGCAATTCAAAGCTGATGAGCAGGCTGTTAAAAAGGTCGCGCAGGAGCAAAAGCGTTTATCAGATGAGCGAACCAAGCATGAAGCTTTCATCAAACAATCATTGAGCTCCATGCGAACAACTGCGAGCGCGACTATGGAAGCAGAAGAAGAATACGATTTCTTCATATCACATGCGAGCGAAGACAAAGAAGCATTCGTTCAGGATCTAGCCGCCGCGCTTCGCGACCTAGGAGCTAAGATTTTCTATGACGCATATACGTTGAAGGTCGGTGACAGCCTTCGGCGCAAAATCGATCAGGGGCTCGCGAACTCCAAATTTGGCATAGTTGTTCTATCGGAACACTTTTTTAGCAAGCAATGGCCCGCAAGAGAATTAGATGGACTGACGGCAATGGAAATTGGCGGACAGACGCGAATATTGCCGATCTGGCATAAAGTTTCCTACGATGAAGTTCGGCGTTTCAGTCCCTCATTGGCCGACAAAGTGGCACTGAACACATCGCTAAAGAGCGTGGAAGAAATCGCGAAAGAACTGCATTCCCTTATC)，将tcpB片段和pCMV-Myc载体分别经SalI和KpnI双酶切后进行连接，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经酶切和测序鉴定正确后获得重组质粒pCMV-Myc-tcpB。

具体的，真核表达质粒pCMV-MD2的构建方法为：

首先，设计带有SalI和KpnI双酶切位点的引物如下：

正向引物：5’-ACGCGTCGACCATGTTGCCATTTATTCTCTTTTCGAC-3’SEQ ID NO:9

反向引物：5’-CCCCGGTACCCTAATTGACATCACGGCGGTGAATG-3’SEQ ID NO:10

然后，以RAW264.7细胞基因组为模板，以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列为扩增引物PCR扩增MD2(GenBank:AB018550)，将MD2片段和pCMV载体分别经SalI和KpnI双酶切后进行连接，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经酶切和测序鉴定正确后获得重组质粒pCMV-MD2。

具体的，pcDNA3.1-TLR5质粒来自实验室保存，为之前构建(Xiong et al.Molecular cloningand functional analysis of duck Toll-like receptor 5.Res Vet Sci,2014,97(1):43-45.)。

2)共转染NF-κB luciferase reporter(200ng/mL)、pTLR4(5ng/mL)+pMD2(5ng/mL)(或pTLR2、pTLR5)和pTcpS(或pTcpB)到HEK293T细胞中，转染24h后1μg/mL Pam3CSK4(或100ng/mL LPS、100ng/mL FliC)进行刺激，刺激5h后检测荧光素酶活性(Bright-Glo^TMLuciferase Assay System,Promega)，同时，Western blotting检测TcpS的表达情况。

3)结果表明TcpS在HEK293T细胞中成功表达(如图3所示)，TcpS可以显著抑制TLR2(32％-78％)、TLR4(81％-91％)和TLR5(71％-99％)介导的NF-κB的活化，且这种抑制作用存在剂量依赖关系(如图4所示)。

(2)在RAW264.7细胞中TcpS可抑制不同TLRLs诱导的NF-κB的活化

共转染NF-κB luciferase reporter和pTcpS到RAW264.7细胞中，转染24h后分别用100ng/mLLPS(TLR4L)，2.5μg/mL R848(TLR7L)，2μM CpG(TLR9L)刺激。刺激后5h检测荧光素酶活性。结果表明相对空白组，转染pTcpS组在不同配体的刺激下均显著抑制了NFκB的活化(抑制率分别为81％-99％，56％-99％，49％-89％)，且抑制作用存在剂量依赖关系(如图5所示)。

(3)TcpS可抑制炎性细胞因子的表达

为直接检测TcpS对炎性细胞因子的影响，我们共转染pTLR4、pMD2和pTcpS到HEK293T细胞中，转染24h后100ng/mL LPS进行刺激，刺激5h后ELISA试剂盒(BD公司)检测培养基上清IL-8分泌水平，同时Trizol裂解细胞提取RNA，去DNA后反转录成cDNA，荧光定量PCR(qRT-PCR)检测炎性因子IL-1β、IL-8、IL-17A和TNF-α的转录水平。结果表明同NF-κB活性检测结果一致，TcpS可显著抑制炎性细胞因子IL-1β(37％-45％)、IL-8(42％-83％)、IL-17A(14％-41％)和TNF-α(71％-73％)的产生(内参为β-actin)，且这种抑制作用存在剂量依赖关系(如图6、图7所示)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种分离的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的蛋白。

3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种表达载体，其含有如权利要求2或3所述多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其被权利要求4所述的表达载体转化。

6.一种制备如权利要求1所述的蛋白的方法，包括如下步骤：

1)在适合权利要求1所述的蛋白表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；

2)从培养物中分离出权利要求1所述的蛋白。

7.一种抗体，其特征在于，所述抗体与权利要求1所述的蛋白特异性结合。

8.如权利要求1所述的分离的蛋白、权利要求2所述的分离的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的宿主细胞在制备抗炎药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途中所述抗炎药物具体是指干扰TLR信号通路并抑制炎性细胞因子分泌的药物。

10.一种抗炎药物组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的分离的蛋白、权利要求2所述的分离的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的宿主细胞。