CN105754956B

CN105754956B - 一种用于检测及分离样本的呼吸道病毒的样本前处理液

Info

Publication number: CN105754956B
Application number: CN201610150642.9A
Authority: CN
Inventors: 潘丽峰
Original assignee: Shanghai Pudong New Area Center For Disease Contorl And Prevention
Current assignee: Shanghai Pudong New Area Center For Disease Contorl And Prevention
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: CN105754956A

Abstract

本发明提供了一种用于检测及分离样本的呼吸道病毒的样本前处理液，具体地，本发明提供了一种用于检测及分离样本中呼吸道病毒的样本前处理液，所述样本处理液包括：(i)病毒保护剂，所述病毒保护剂选自下组：氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水葡萄糖、或其组合；(ii)显色剂；(iii)灭菌剂，所述灭菌剂包括：青霉素、链霉素、或青链霉素；和(iv)pH调节剂；其中，所述样本前处理液的pH为7.2‑7.8。用本发明的样本前处理液处理样本，可显著降低加样出错率，保持病毒活性，提高分离的病毒的表达效率。

Description

一种用于检测及分离样本的呼吸道病毒的样本前处理液

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于检测及分离样本中呼吸道病毒的样本前处理液。

背景技术

呼吸道病毒是是指主要以呼吸道为侵入门户，首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官损害的病毒的总称。临床上的急性呼吸感染中有90～95％是由这群毒引起的，主要的呼吸道病毒有流感病毒(甲、乙、丙)、副流感病毒(1，2，3，4，5型)、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺淡病毒鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒(1，2，3，4型)、腺病毒(3，4，7，14，21型)、人疱疹病毒风疹病毒及巨细胞病毒等。下呼吸道标本(痰、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物，胸腔穿刺液等)中呼吸道病毒的检出率要远高于上呼吸道标本(鼻拭子、咽拭子及鼻咽拭子)中的检出率。因此，下呼吸道标本是检测呼吸道病毒感染的较好样本来源。

狗肾细胞MDCK，恒猴猴肾细胞LLC-MK2，人喉癌上皮细胞Hep-2等细胞系是呼吸道病毒分离的敏感细胞系，通常使用这些细胞来分离流感病毒等呼吸道病毒。

由于含有粘液等原因，最初国内外许多学者多采用各种蛋白分解酶如胰酶、糜蛋白酶等对下呼吸道标本进行前期处理，但酶能够切断肽键、破坏蛋白质或多肽，故现在很少使用。目前对于呼吸道病毒样本处理主要通过直接离心或加样本处理液(以磷酸缓冲液或生理盐水为主)后物理震荡或搅拌后离心，用上清液的方法来制备核酸提取以及病毒分离的下呼吸道样本。在实际的检测工作中，由于样本及样本处理液均为无色或者白色，在加样时由于样本的颜色与加样板的颜色一致或形成透明状，很容易造成样本的漏加或者错加，从而导致检测结果的不对应。

因此本领域迫切需要开发一种既可以减少加样出错率，还可以保护病毒，有助于后续病毒分离的样本前处理液。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既可以减少加样出错率，还可以保护病毒，有助于后续病毒分离的样本前处理液。

本发明的第一方面提供了一种用于检测及分离样本中呼吸道病毒的样本前处理液，所述样本前处理液包括：

(i)病毒保护剂，所述病毒保护剂选自下组：氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水葡萄糖、或其组合；

(ii)显色剂；

(iii)灭菌剂，所述灭菌剂包括：青霉素、链霉素、或青链霉素；和

(iv)pH调节剂；

其中，所述样本前处理液的pH为7.2-7.8。

在另一优选例中，所述显色剂选自下组：苯酚红、中性红、或其组合。

在另一优选例中，所述显色剂包括苯酚红。

在另一优选例中，所述灭菌剂包括青链霉素。

在另一优选例中，所述pH调节剂选自下组：2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、NaHCO₃、或其组合。

在另一优选例中，所述pH调节剂包括2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸。

在另一优选例中，所述样本前处理液的pH为7.2-7.6，较佳地，7.2-7.4。

在另一优选例中，所述灭菌剂为含有青霉素和链霉素的NaCl溶液，所述青霉素的浓度为5000-50000U/ml，较佳地，7000-30000U/ml，更佳地，8000-20000U/ml；所述链霉素的浓度为5000-50000μg/ml，较佳地，7000-30000μg/ml，更佳地，8000-20000μg/ml。

在另一优选例中，所述样本包括下呼吸道样本、上呼吸道样本、或其组合。

在另一优选例中，所述样本包括下呼吸道样本。

在另一优选例中，所述下呼吸道样本选自下组：痰、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物、胸腔穿刺液、或其组合。

在另一优选例中，所述病毒保护剂的浓度(以无水葡萄糖计)为500-6000mg/L，较佳地，700-3000mg/L，更佳地，800－2000mg/L。

在另一优选例中，所述显色剂的浓度为2-50mg/L，较佳地，5-40mg/L，更佳地，8-20mg/L。

在另一优选例中，所述pH调节剂的浓度为400-20000mg/L，较佳地，1000-10000mg/L，更佳地，2000-6000mg/L。

本发明第二方面提供了一种样本前处理试剂盒，所述试剂盒含有本发明第一方面所述的样本前处理液；和

标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于减少加样出错率，保护病毒，提高分离的病毒的表达效率。

在另一优选例中，所述样本前处理液的各个组分分别位于不同容器中。

在另一优选例中，所述样本前处理液的各个组分位于同一容器中。

本发明第三方面提供了一种样本前处理方法，包括步骤：

在本发明第一方面所述的样本前处理液存在下，对含有呼吸道病毒的所述样本进行处理。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为用实施例1、对比例1和实施例2的样本前处理液处理呼吸道标本后的图片。

其中，图1－1为用实施例1的样本前处理液处理后加1-5列后的加样效果图，图1-2为用实施例1的样本前处理液处理后1-12列的加样效果图，图1-3为用实施例2的样本前处理液处理后加1-6列的加样效果图，图1-4为用实施例2的样本前处理液处理后1-12列的加样效果图，图1-5为用对比例1的样本前处理液处理后1-5列的加样效果图，图1-6为用对比例1的样本前处理液处理后1-12列的加样效果图。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，将(i)病毒保护剂，所述病毒保护剂选自下组：氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水葡萄糖、或其组合；(ii)显色剂；(iii)灭菌剂，所述灭菌剂包括：青霉素、链霉素、或青链霉素；和(iv)pH调节剂分别以一定浓度进行配比，配制的样本前处理液的pH为7.2-7.8，样本显示为红色，用该样本前处理液对下呼吸道样本进行处理，不仅可显著减少加样出错率，还可以显著保持病毒活性，提高分离的病毒的表达效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

样本

如本文所用，术语“样本”、“标本”可互换使用。在本发明中，所述样本的来源没有特别限制，可以由生物体采集，在一优选例中，所述“样本”来自下呼吸道样本，优选痰、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物、胸腔穿刺液等。并且，采集样本的方法没有特别限制，可以采用常规方法进行采集。

样本前处理液

本发明提供了一种用于检测及分离样本中呼吸道病毒的样本前处理液，在本发明中，所述样本前处理液含有如下组分：(i)病毒保护剂，所述病毒保护剂选自下组：氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠、无水葡萄糖、或其组合；(ii)显色剂；(iii)灭菌剂，所述灭菌剂包括青霉素、链霉素、或青链霉素；和(iv)pH调节剂；其中，所述样本前处理液的pH为7.2-7.8(较佳地，7.2-7.6，更佳地7.2-7.4)。

在本发明中，所述显色剂及其浓度不受特别的限制，所述显色剂可以是苯酚红、中性红等。一种优选的显色剂为苯酚红，一种优选地显色剂的浓度为2-50mg/L，较佳地，5-40mg/L，更佳地，8-20mg/L。

在本发明中，所述病毒保护剂的浓度不受特别的限制，一种优选的病毒保护剂的浓度为500-6000mg/L，较佳地，700-3000mg/L，更佳地，800－2000mg/L(以无水葡萄糖计)。在本发明中，所述灭菌剂及其浓度不受特别限制，所述灭菌剂可以是青霉素溶液、链霉素溶液、或青链霉素溶液，一种优选的灭菌剂为青链霉素溶液，所述青链霉素溶液为含有青霉素和链霉素的NaCl溶液，所述青霉素的浓度为5000-50000U/ml，较佳地，7000-30000U/ml，更佳地，8000-20000U/ml；所述链霉素的浓度为5000-50000μg/ml，较佳地，7000-30000μg/ml，更佳地，8000-20000μg/ml。

在本发明中，所述pH调节剂及其浓度不受特别的限制，所述pH调节剂可以是2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、NaHCO₃等。一种优选的pH调节剂为2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，一种优选的pH调节剂的浓度为2-50mg/L，较佳地，5-40mg/L，更佳地，8-20mg/L。

用本发明的样本前处理液处理下呼吸道样本(如痰、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物、胸腔穿刺液等)，不仅可减少加样出错率，还可以显著保持病毒活性，提高分离的病毒的表达效率。

样本前处理试剂盒

本发明还提供了一种可减少加样出错率、保持病毒活性、提高病毒表达效率的样本前处理试剂盒。

在本发明中，本发明的试剂盒含有以下组分的样本前处理液：

(ii)显色剂；

(iv)pH调节剂；

其中，所述样本前处理液的pH为7.2-7.8。

在本发明中，本发明的试剂盒中的各个组分之间的比例，以及各个组分的含量不受特别限制。

本发明的试剂盒中的各组分可购买获得，或用常规方法制备。

在本发明中，所述样本前处理液的各个组分可分别位于不同容器中或位于同一容器中。

本发明的试剂盒可减少加样出错率，显著保持病毒活性，提高分离的病毒的表达效率。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的样本前处理液呈现红色，避免了加样过程中可能出现的错误。

(2)本发明的样本前处理液添加病毒保护剂，保护了样本中病毒，提高了分离的病毒的表达效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明所用的材料和细胞系如无特别说明，均为市售产品。

实施例1样本前处理液的制备及其对样本(标本)的处理

1.样本前处理液的成分

组分1：含200mg氯化钙；97.67mg无水硫酸镁；400mg氯化钾；6800mg氯化钠；122mg无水磷酸二氢钠以及1000mg无水葡萄糖。

组分2：含10 mg的苯酚红。

组分3：含1ml青链霉素溶液(母液为青霉素10,000U/mL,10,000μg/mL链霉素溶于100ml 0.85％NaCl)。

组分4：含4766mg的2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸。

2.样本前处理液的配制步骤(以1L计)

2.1在干净玻璃杯中倒入50mL的蒸馏水。

2.2将组分1-2倒入玻璃杯中，磁力搅拌助溶。

2.3将组分3加入到玻璃杯中。

2.4加入组分4，调节pH到7.4。

3、下呼吸道标本的处理步骤

3.1以体积比1:5加入5倍体积的样本前处理液。

3.2将样本与处理液在振荡器上震荡混匀。

3.3室温静置5分钟，2000rpm离心20min。

3.4上清液即为处理完毕的下呼吸道标本，可进行核酸提取或毒株分离。

实施例2样本前处理液的制备及其对样本(标本)的处理

在本实施例中，样本前处理液的成分为10mM的PBS，不添加苯酚红，pH为7.4。用实施例1的方法，对下呼吸道标本进行处理。

对比例1

样本前处理液的成分为10mM的PBS和苯酚红，pH为7.4。用实施例1的方法，对下呼吸道标本进行处理。

实施例3实施例1、对比例1与实施例2的加样效果比较结果

实施例1、对比例1与实施例2的加样结果如图1所示。

结果显示，从图1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6中可以清晰区分实施例1的处理液在加样时候的优势，由于处理以后的样本呈红色，因此可以很容易判断到底样本加到哪一个位置，而经实施例2的处理液处理的样本由于显示的为无色或透明色，因此很难判断加样位置，加样途中如被打扰或者分心就很容易出现加样错误。

用对比例1的样本前处理液进行加样，加样中虽然有颜色变化，但是产生的颜色变化没有实施例1中的颜色变化显著。

综上，结果表明，用实施例1的样本前处理液处理样本可显著降低加样出错率。

实施例4对病毒分离的影响

由于实施例1的样本前处理液的主要组成成分与病毒分离液的组成接近，因此，实施例1的样本前处理液为呼吸道病毒提供了无机盐、有机物以及缓冲体系，可更好的对呼吸道病毒进行保护。

将处理好的呼吸道样本(实施例1、2和对比例1)接种到生长状态敏感细胞系(狗肾细胞MDCK，恒猴猴肾细胞LLC-MK2，人喉癌上皮细胞Hep-2等)，放置于37℃，5％CO₂培养箱培养，每日观察细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落，以0～25％细胞CPE变化为“+”，26～50％细胞CPE变化为“++”，51～75％细胞CPE变化为“+++”，76～100％细胞CPE变化为“++++”，正常细胞形态为“-”。收获的病毒液通过聚合酶链式反应或者红细胞凝集试验等方法进行鉴定是否分离到病毒毒株。

实施例1、对比例1和实施例2的样本前处理液处理后的样本，分别用Hep-2细胞分离方法对病毒活性进行测定，结果显示，实施例1、对比例1和实施例2中病毒的存活率分别为3.32％(20/603)、2.15％(15/698)和2.34％(10/437)。

因此，从结果可以看出，实施例1的样本前处理液处理样本后，所测定的病毒存活率比对比例1处理后的病毒存活率高35.2％，比实施例2处理后的病毒存活率高29.5％。

从上述结果可以得出如下结论：用实施例1的样本前处理液处理样本，不仅可显著降低加样出错率，还可显著保持病毒活性，具有更好的病毒保护效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于检测及分离样本中呼吸道病毒的样本前处理液，其特征在于，所述样本前处理液由以下成分构成：

（i）病毒保护剂，所述病毒保护剂为氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、氯化钠、无水磷酸二氢钠和无水葡萄糖；

（ii）显色剂；所述显色剂为苯酚红；

（iii）灭菌剂，所述灭菌剂为青链霉素；和

（iv）pH调节剂；所述pH调节剂为2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸；

其中，所述样本前处理液的pH为7.2-7.8；

并且，所述病毒保护剂的浓度为700-3000mg/L，以无水葡萄糖计；

所述显色剂的浓度为5-40 mg/L；

所述灭菌剂为含有青霉素和链霉素的NaCl溶液，所述青霉素的浓度为8000-20000U/ml；所述链霉素的浓度为8000-20000μg/ml；

所述pH调节剂的浓度为2000-6000mg/L。

2.如权利要求1所述的样本前处理液，其特征在于，所述样本前处理液的pH为7.2-7.6。

3.如权利要求2所述的样本前处理液，其特征在于，所述样本前处理液的pH为7.2-7.4。

4.如权利要求1所述的样本前处理液，其特征在于，所述灭菌剂为含有青霉素和链霉素的NaCl溶液，所述青霉素的浓度为10000U/ml；所述链霉素的浓度为 10000μg/ml。

5.如权利要求1所述的样本前处理液，其特征在于，所述病毒保护剂的浓度为800－2000mg/L，以无水葡萄糖计。

6.如权利要求1所述的样本前处理液，其特征在于，所述显色剂的浓度为8-20 mg/L。

7.如权利要求1所述的样本前处理液，其特征在于，所述样本选自下组：下呼吸道样本、上呼吸道样本或其组合。

8.如权利要求7所述的样本前处理液，其特征在于，所述下呼吸道样本选自下组：痰、支气管肺泡灌洗液、鼻咽抽吸物、胸腔穿刺液或其组合。

9.一种样本前处理试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的样本前处理液；和

10.一种样本前处理方法，其特征在于，包括步骤：

在权利要求1所述的样本前处理液存在下，对含有呼吸道病毒的所述样本进行处理。