WO2023162065A1 - 生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキット - Google Patents

生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキット Download PDF

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preservative
mol
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polyatomic monovalent
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知明 久慈
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Ｂｌｕｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present disclosure relates to a biological sample preservative for preserving a biological sample, a method for producing a biological sample preservative, a method for preserving a biological sample, and a kit for preserving a biological sample.
  • Patent Document 1 describes a cryopreservation solution characterized by containing modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group. Specifically, after immersing living cells or tissues in an equilibration solution, the cells or tissues are taken out together with a small amount of the equilibration solution using a pipette or other thin tubular jig, and transferred to a cryopreservation solution. .
  • the cells or tissues are immersed in the cryopreservation solution for a predetermined time, they are taken out together with a small amount of the cryopreservation solution, and the cells or tissues are dropped onto the sheet of the cryopreservation jig together with a small amount of the cryopreservation solution. . After that, the sheet on which the cells or tissues are placed is immersed in a cooling medium such as liquid nitrogen and frozen. According to the preservation technique described in Patent Document 1, cells and tissues of a living body are preserved through the steps described above.
  • an object of the present disclosure is to provide a novel biological sample preservative that enables preservation of a biological sample at room temperature, a method for producing the biological sample preservative, a method for preserving a biological sample, and a kit for preserving a biological sample. do.
  • the present disclosure discloses a substance having 1.0 to 10.0 mol/L of a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or composed of the polyatomic monovalent cation
  • the present inventors have found a biological sample preservative that enables preservation at room temperature by containing a compound that Therefore, the first aspect of the present disclosure is (1) a substance having 1.0 to 10.0 mol/L of a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or composed of the polyatomic monovalent cation
  • a biological sample preservative comprising a compound that
  • the concentration of the substance having the polyatomic monovalent cation or the compound composed of the polyatomic monovalent cation is 1.7 to 5.0 mol/L.
  • the substance having polyatomic monovalent cations or the compound composed of polyatomic monovalent cations includes at least one of ammonium sulfate and ammonium nitrate, and (1) ) or the biological sample preservation agent according to (2).
  • a preferred embodiment of the present disclosure is (4) the biological sample preservation agent according to any one of (1) to (3) above, further comprising 0.004 to 10.000 mol/L of a chelating reagent. .
  • a preferred aspect of the present disclosure is (5) the biological sample preservative according to (4) above, wherein the chelating reagent has a concentration of 0.006 to 0.500 mol/L.
  • a preferred aspect of the present disclosure is (6) the biological sample preservation agent according to (4) above, wherein the chelating reagent contains at least one of sodium citrate and trisodium citrate monohydrate. .
  • a preferred embodiment of the present disclosure is (7) the biological sample preservation agent according to any one of (1) to (6) above, further comprising a buffering agent of 0.004 to 10.000 mol/L.
  • a preferred aspect of the present disclosure is (8) the biological sample preservative according to (7) above, wherein the buffer has a concentration of 0.010 to 5.000 mol/L.
  • a preferred aspect of the present disclosure is (9) the biological sample preservation agent according to (7) or (8) above, wherein the buffer is ethylenediaminetetraacetic acid.
  • a preferred embodiment of the present disclosure is (10) the biological sample preservation agent according to any one of (1) to (9) above, further comprising 0.25 to 30% by weight of an excipient.
  • a preferred aspect of the present disclosure is (11) the biological sample preservation agent according to any one of (1) to (10) above, which is a freeze-dried powder.
  • the present inventors have found a substance having a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + at 1.0 to 10.0 mol/L or from the polyatomic monovalent cation
  • a method for producing a biological sample preservative that enables storage at room temperature by containing the constituent compound. Therefore, another aspect of the present disclosure is (12) a substance having a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + at 1.0 to 10.0 mol/L in a predetermined solvent, or the polyatomic monovalent cation
  • a method for producing a biological sample preservative, comprising a first addition step of adding a compound composed of ions.
  • a preferred embodiment of the present disclosure further comprises (13) a second addition step of further adding 0.25 to 30% by weight of an excipient to the solution obtained by the first addition step, A method for producing a biological sample preservative according to (12).
  • a preferred embodiment of the present disclosure is (14) above (13), further comprising a freeze-drying step of freeze-drying the solution obtained in the second addition step at -10°C to -100°C. and a method for producing the biological sample preservative of
  • a preferred embodiment of the present disclosure is (15) the dehydration step of dehydrating the solution obtained in the first addition step under heating conditions or vacuum conditions, according to (12) above.
  • a method for producing a biological sample preservative is (15) the dehydration step of dehydrating the solution obtained in the first addition step under heating conditions or vacuum conditions, according to (12) above.
  • a substance having a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + at 1.0 to 10.0 mol/L or from the polyatomic monovalent cation A method of preserving a biological sample using a biological sample preservative solution containing a compound composed of the present invention has been found. Therefore, another aspect of the present disclosure is (16) a substance having 1.0 to 10.0 mol/L of a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or composed of said polyatomic monovalent cation including a preservation step of immersing the biological sample in a biological sample preservative solution containing the compound and preserving the biological sample at room temperature.
  • kits for biological sample preservation that includes a biological sample preservation agent comprising a compound that is composed. Therefore, another aspect of the present disclosure is (17) a substance having 1.0 to 10.0 mol/L of a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or composed of said polyatomic monovalent cation
  • a kit for biological sample preservation, comprising a biological sample preservation agent comprising a compound comprising a compound.
  • the present disclosure can provide a novel biological sample preservative that enables preservation of a biological sample at room temperature, a method for producing a biological sample preservative, a method for preserving a biological sample, and a kit for preserving a biological sample.
  • FIG. 1 shows the results of 24 hours at 37° C. of mouse liver in the stock solution, 1/2 dilution, 1/4 dilution, and phosphate-buffered saline prepared as a negative control of the biological sample preservative of Example 1.
  • FIG. 11 shows an image of each microtube after storage.
  • FIG. 10 is a diagram showing images of microtubes after mouse livers were preserved at 37° C. for 24 hours in the biological sample preservative solutions of Examples 1 to 9 and in phosphate-buffered saline prepared as a negative control. be.
  • Embodiments for carrying out the biological sample preservative, the method for producing the biological sample preservative, and the method for preserving the biological sample of the present disclosure will be described in detail below. However, the following embodiment is an example for explaining the present disclosure, and the present disclosure is not limited only to the embodiment.
  • the biological sample preservative can be produced by, for example, adding each component to a predetermined solvent, and optionally a freeze-drying step or dehydration step. .
  • the manufacturing process will be specifically described below.
  • a biological sample is a sample collected from or used for a living body, and includes organs, tissues, cells (including cultured cells), body fluids, nucleic acids, proteins, or combinations thereof. is. More preferably, nucleic acids, proteins, or combinations thereof are used as biological samples. In addition to samples collected from living organisms, these biological samples may include samples artificially synthesized for living organisms. Moreover, the invention according to the present disclosure is not necessarily limited to the examples exemplified here.
  • the biological sample preservative to be manufactured is preferably provided in the form of a solution during preservation of living organisms, but may be in any form such as dry form, solid form, powder form, anhydrous form, and granular form. may When the biological sample preservative is in a form other than a solution, it is preferably used after being dissolved in a predetermined solvent so as to obtain a desired concentration. Moreover, the invention according to the present disclosure is not limited to these forms.
  • the biological sample preservative to be manufactured may be provided as a preservative or preservative composition having the above-described form. It may be provided as a kit for biological sample storage containing.
  • First addition step in the present disclosure, a required amount of a predetermined solvent is put into a container and stirred at room temperature of 5 to 50°C, more preferably 10 to 40°C. Pure water is typically used as the solvent, but treated water such as filtered water, purified water, distilled water, deionized water, or combinations thereof, which has been treated by filtration, distillation, deionization, or a combination thereof; , water containing these treated water may be used.
  • treated water such as filtered water, purified water, distilled water, deionized water, or combinations thereof, which has been treated by filtration, distillation, deionization, or a combination thereof.
  • a buffering agent is then added at a predetermined concentration to the stirred solvent.
  • Buffers to be added include phosphate buffer, Tris-HCl buffer, ethylenediaminetetraacetic acid buffer, Tris-ethylenediaminetetraacetic acid buffer, Trisacetic acid-ethylenediaminetetraacetic acid buffer, Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid buffer, Various buffers such as SSC buffers, SSPE buffers, sodium citrate buffers, carbonate-bicarbonate buffers, sodium borate buffers, 2-morpholinoethanesulfonic acid buffers and combinations thereof can be used. is. Among these, ethylenediaminetetraacetic acid buffer is more preferably used as the buffer.
  • the invention according to the present disclosure is not limited to these buffer solutions.
  • the buffer solution is added so as to have a concentration of 0.004 to 10.000 mol/L, more preferably 0.010 to 5.000 mol/L in the final biological sample preservative. .
  • each material such as other main components and additive materials is added to the solution to which the buffer solution has been added.
  • Principal components include substances having polyatomic monovalent cations represented by the chemical formula NH4 + or compounds composed of said polyatomic monovalent cations. Such substances or compounds are selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate and combinations thereof.
  • a substance having a polyatomic monovalent cation represented by NH4 + or a compound composed of the polyatomic monovalent cation that is, a substance or compound containing an ammonium ion
  • a biological sample can be stored at room temperature. It is possible to further enhance the effect and storage stability. Note that the invention according to the present disclosure is not limited to these buffer solutions.
  • a substance having a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or a compound composed of the polyatomic monovalent cation is 1.0 to 10.0 mol/ L, more preferably added to a concentration of 1.7 to 5.0 mol/L.
  • chelating agents can include sodium citrate, trisodium citrate monohydrate, sodium borate, sodium fluoride, ethylenediaminetetraacetic acid, or combinations thereof. By adding these chelating reagents, it is possible to suppress the action of nucleolytic enzymes and further improve the storage stability of biological samples such as nucleic acids at room temperature. Note that the invention according to the present disclosure is not limited to these chelating reagents.
  • the chelating reagent is added so that the final biological sample preservative will have a concentration of 0.004 to 10.000 mol/L, more preferably 0.006 to 0.500 mol/L.
  • stabilizers include 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, aprotinin, E-64, leupeptin hemisulfate monohydrate, silicon carbide, 4-hydroxybenzoic acid, N,N- Dialkylpropanamide (N,N-dialkylpropanamide), 3-morpholinopropanesulfonic acid, polyethylene glycol, poly(oxyethylene) polymer, poly(oxyethylene) polymer, monoethylene glycol (1,2-ethanediol) (mono-ethylene glycol (1,2-ethanediol)), glutathione, lithium salt, chaotropic agent, guanidinium salt, guanidine hydrochloride, urea, polyamines, biuret, arginine, cosmo Various substances such as trope, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, arginine ethyl ester, glycine
  • stabilizing agents biological samples such as cells, proteins, and nucleic acids can be stabilized. Furthermore, among these, 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, aprotinin, E-64, leupeptin hemisulfate monohydrate or a combination thereof inhibits protease activity. , in particular the stability can be increased. It should be noted that the invention according to the present disclosure is not limited to these stabilizers. The amount of these stabilizers to be added can be appropriately adjusted according to the selected stabilizer. Or if a combination thereof is selected, it can be added at a concentration of 0.001 to 1.0 wt%, more preferably 0.01 to 0.10 wt%.
  • bactericidal and antimicrobial agents include amoxicillin trihydrate, cefotaxime sodium, clarithromycin, erythromycin, pyrethrins, metofruthrin, transfluthrin, sodium azide, 4-hydroxybenzoic acid, alcohols, surfactants or their Various things such as combinations can be used. It should be noted that the invention according to the present disclosure is not limited to these bactericidal/antibacterial agents. The amount of these bactericidal and antibacterial agents added can be appropriately adjusted according to the selected stabilizer, but it is added at a concentration of 0.001 to 1.0% by weight, more preferably 0.01 to 0.10% by weight. It is possible to
  • additives such as surfactants, pH adjusters, and colorants may be included as appropriate in addition to the above components.
  • Freeze-drying process For the biological sample preservative produced as described above, in consideration of the ease of storage and transportation of the biological sample preservative itself, it is further divided into dry form, solid form, powder form, anhydrous form, and granule form. It is also possible to process it into a given solid shape such as By subjecting the biological sample preservative (solution) produced as described above to a freeze-drying process, it is possible to obtain the biological sample preservative in these forms. Note that the freeze-drying step is not an essential step, and can be performed as desired.
  • Second addition step First, in the freeze-drying step, as the second addition step, an excipient is added to the biological sample preservative (solution) produced as described above and dissolved by stirring.
  • excipients include polyols, monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, amino acids, peptides, proteins, hydrophilic polymers or combinations thereof.
  • excipients preferably include lactose, glucose, sucrose, crystalline cellulose, calcium sulfate, calcium carbonate, talc, titanium oxide, erythritol, mannitol, sorbitol, trehalose, sucrose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxy Propylmethylcellulose, carmellose sodium, pullulan, dextrin, gum arabic, agar, gelatin, tragacanth, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, or combinations thereof are preferred, and calcium carbonate, dextrin, or combinations thereof are particularly preferred. is possible.
  • the invention according to the present disclosure is not limited to these excipients.
  • the amount of these excipients to be added can be appropriately adjusted according to the selected excipient, but it is preferable to add them at a concentration of 0.25 to 30% by weight, more preferably 0.1 to 10.0% by weight. It is possible.
  • the biological sample preservative produced as described above is a substance having a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + or a compound composed of the polyatomic monovalent cation, typically ammonium sulfate or Contains ammonium nitrate. For this reason, if the product is dehydrated and then frozen in the freeze-drying, the freezing point is rapidly reached, and there is a risk that ammonium sulfate and the like will explode in the freeze-drying apparatus. In the present disclosure, it is possible to prevent this explosion by adding a predetermined amount of excipient in advance in the freeze-drying step as described above.
  • freeze-drying process When the excipients are dissolved in the biological sample preservative, freeze-drying is performed on the solution in which the excipients are dissolved as the freeze-drying process.
  • a solution in which excipients are dissolved is degassed under vacuum conditions for a predetermined time (e.g., 60 minutes), and then at a predetermined temperature (e.g., , ⁇ 75° C.) for a predetermined time (for example, 60 minutes). Thereafter, the resulting biological sample preservative is slowly returned to normal temperature and normal pressure to obtain a freeze-dried biological sample preservative.
  • the freeze-drying process or the tableting process after the freeze-drying process can be processed into a desired form through a granulation process.
  • the biological sample preservative produced in the first addition step and stirring step of the dehydration step considering the convenience of storing and carrying the biological sample preservative itself, it is further divided into a dry form, a solid form, a powder form, and a powder form. It is also possible to process it into a given solid form such as anhydrous form, granular form and the like.
  • a given solid form such as anhydrous form, granular form and the like.
  • a necessary amount of container containing the biological sample preservative (solution) produced by the above steps is placed in a vacuum device and left for a predetermined time (for example, 24 hours). After that, the resulting biological sample preservative is slowly returned to normal pressure to obtain a dehydrated biological sample preservative. After the dehydration step, the tableting step can be processed into a desired form through a granulation step.
  • a desired biological sample preservative can be produced through the first addition step and stirring step, and optionally the freeze-drying step or dehydration step.
  • the biological sample preservative manufactured through the above manufacturing process contains the following components. That is, the biological sample preservative contains 1.0 to 10.0 mol/L, more preferably 1.7 to 5.0 mol/L of "a polyatomic monovalent cation represented by the chemical formula NH4 + " in a predetermined solvent. or a compound composed of said polyatomic monovalent cations.
  • the biological sample preservative optionally contains 0.004 to 10.000 mol/L, more preferably 0.010 to 5.000 mol/L "buffer”, 0.004 to 10.000 mol/L , more preferably 0.006-0.500 mol/L of a “chelating agent”, 0.001-1.0% by weight of a “stabilizer”, more preferably 0.01-0.10% by weight, and 0 0.001 to 1.0% by weight, more preferably 0.01 to 0.10% by weight of a "bactericidal/antibacterial agent”.
  • the biological sample preservation agent may contain 0.25-30% by weight, more preferably 0.1-10.0% by weight of "excipients".
  • the biological sample preservative produced through the above production process has a pH of 4.0 to 10.0, more preferably 6.0 to 8, by adding a pH adjuster or the like. .0. This makes it possible to further improve the storage stability of the biological sample.
  • additives such as surfactants, pH adjusters, and colorants may be included as appropriate, although not described in detail.
  • ⁇ Method of preserving biological samples using the biological preservatives for example, organs, tissues, cells (including cultured cells), body fluids, nucleic acids, proteins, or combinations thereof may be stored at room temperature.
  • the biological sample preservative produced by the first adding step and stirring step is dispensed into a predetermined container (eg, vial bottle, microtube, etc.).
  • a biological sample such as an organ, tissue, cell (including cultured cells), body fluid, nucleic acid, protein, or a combination thereof collected from a living body is immersed in the container and placed at room temperature (for example, 5 to 50 ° C.). , more preferably 10 to 40° C.). This makes it possible to store the collected biological sample at room temperature.
  • each component is dissolved in a predetermined solvent. It can be used after being dissolved so as to have the concentration of the biological sample preservative in the state (the concentration may be appropriately adjusted according to the amount of the solvent).
  • the solvent pure water is typically used, but filtered water treated by filtration, distillation, deionization, or a combination thereof, purified water, distilled water, deionized water, or a combination thereof. Water or water containing these treated water may be used.
  • a heat-resistant bottle with a predetermined capacity (2 L glass medium bottle (manufactured by Thermo Fisher Scientific)) is filled with pure water as a solvent, and a stirrer with temperature control (product name: hot stirrer REXIM RSH-4DN (manufactured by AS ONE)) is added. was set to 37° C. and stirred at a rotation speed of 60 rpm. Then, buffers as described in Tables 1-3 below were added and further stirred until the buffers were completely dissolved.
  • ammonium sulfate and other components listed in Tables 1 to 3 below are added at concentrations listed in Table 1 below, respectively, and stirred until each component is completely dissolved, and each biological sample preservative (Example 1 to Example 9) were produced.
  • Example 1 The biological sample preservative of Example 1 was dispensed from each heat-resistant bottle, and 1 mL each of the undiluted solution, the 1/2 diluted solution, and the 1/4 diluted solution were dispensed into 1.5 mL microtubes. was done. Then, as a biological sample, 1.3 mg of mouse liver was collected, placed in a microtube in which each biological sample preservative was dispensed, and immersed in the biological sample preservative. At this time, as a negative control, 1 mL of phosphate-buffered saline was dispensed into a 1.5-mL microtube, and 1.3 mg of mouse liver was similarly immersed in the phosphate-buffered saline. Then, each biological sample placed in each microtube was stored at 37° C. under normal pressure for 24 hours.
  • RNA extraction was performed using a commercially available RNA extraction kit (product name: RNeasy Plus Mini Kit (manufactured by QIAGEN)) according to the method specified by the kit. Then, the storage stability of the biological sample was evaluated by measuring the concentration of RNA obtained from each biological sample in each microtube. The concentration of RNA was measured using an electrophoresis system device (product name: Bioanalyzer 2100 (manufactured by Agilent)) according to the method specified by the device.
  • FIG. 1 shows the results of 24 hours at 37° C. of mouse liver in the stock solution, 1/2 dilution, 1/4 dilution, and phosphate-buffered saline prepared as a negative control of the biological sample preservative of Example 1. Images of each microtube after storage are shown.
  • Table 4 shows the concentrations of RNA obtained from mouse livers preserved in the stock solution, 1/2 dilution, 1/4 dilution, and phosphate-buffered saline of the biological sample preservative of Example 1. .
  • the storage condition of the stored biological sample deteriorates as the concentration of the components contained in each biological sample preservative decreases, such as the undiluted solution, the 1/2 diluted solution, and the 1/4 diluted solution. , it was confirmed that the solution of the biological sample preservative also causes turbidity.
  • the solution of the biological sample preservative also causes turbidity.
  • turbidity comparable to that of phosphate-buffered saline occurs.
  • each concentration of RNA collected from the biological sample after storage also increased according to the concentration of each component of the biological sample preservative.
  • concentration of RNA extracted from the biological sample was was equivalent to the concentration of RNA tested.
  • concentration of RNA extracted from the biological sample was lower than that of the RNA extracted from the biological sample preserved in phosphate-buffered saline. Compared with the concentration of , it showed a clearly high value.
  • the concentration of RNA extracted from the biological sample was compared with the concentration of RNA extracted from the biological sample preserved in phosphate-buffered saline. Then, it showed a very high numerical value (more than twice). That is, from these results, the effect of preserving a biological sample depends on the concentration of the biological sample preservative of Example 1, and from the undiluted solution and the 1/2 diluted solution of the biological sample preservative of Example 1, A very high preservation effect of the sample was confirmed.
  • Example 2 1 mL of each of the biological sample preservatives of Examples 1 to 9 was dispensed from each heat-resistant bottle and dispensed into a 1.5 mL microtube. Then, 40 mg of mouse liver was collected as a biological sample, placed in a microtube in which the biological sample preservatives of Examples 1 to 9 had been dispensed, and immersed in the biological sample preservatives. At this time, 1 mL of phosphate-buffered saline was dispensed into a 1.5-mL microtube as a subject, and 40 mg of mouse liver was similarly immersed in the phosphate-buffered saline. Then, each biological sample placed in each microtube was stored at 37° C. under normal pressure for 24 hours.
  • RNA extraction was performed in the same manner as in Experiment 1.
  • FIG. 2 shows images of microtubes after mouse liver was preserved at 37° C. for 24 hours in each biological sample preservative solution of Examples 1 to 9 and in phosphate-buffered saline prepared as a negative control. indicates
  • a positive control 40 mg of mouse liver was collected, frozen at ⁇ 80° C. in a microtube and stored, and the image was also taken in the same manner.
  • Table 5 also shows the concentrations of RNA obtained from mouse livers preserved in each of the biological sample preservatives of Examples 1-9 and in phosphate-buffered saline.
  • any of the biological samples stored at room temperature in each of the biological sample preservative solutions of Examples 1 to 9 maintained the same condition as the biological sample stored at ⁇ 80° C. prepared as a positive control. Also, turbidity of each biological sample preservative solution was not confirmed.
  • the biological sample preserved in phosphate-buffered saline prepared as a negative control clearly produced excessive turbidity compared to the biological samples of Examples 1-9. That is, it was confirmed that all of the biological sample preserving solutions of Examples 1 to 9 had an extremely good biological sample preserving effect even at room temperature.
  • each concentration of RNA extracted from biological samples stored at room temperature in each of the biological sample preservative solutions of Examples 1 to 9 was preserved in phosphate-buffered saline prepared as a negative control. All of the measured concentrations were 2.9 times or more higher than the concentration of RNA extracted from the biological sample.
  • the concentration of RNA extracted from a biological sample stored at room temperature in the biological sample preservative solution of Example 4 is equivalent to the concentration of RNA extracted from a biological sample frozen at -80°C and prepared as a positive control.
  • the concentration of RNA extracted from the biological sample stored at room temperature in the biological sample preservative solution of Example 9 exceeded 1.3 times. That is, from these results, it was confirmed that all of the biological sample preservatives of Examples 1 to 9 exhibited extremely high preserving effects on biological samples.

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Abstract

【課題】　生体試料の常温における保存を可能にする新規な生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキットを提供することを課題とする。【解決手段】　１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む、生体試料保存剤である。このような化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物は、例えば、硫酸アンモニウムや硝酸アンモニウムを用いることが可能である。

Description

生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキット
本開示は、生体試料を保存するための生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキットに関する。
ヒトなどの生物から採取される核酸、細胞及び組織等の様々な生体試料のための優れた保存技術は、従来から様々な産業分野で求められている。しかし、このような生体試料は、一般的には、時間と共に徐々に活性が失われる。そのため、生体試料を長期間保存する技術は極めて重要な技術となっている。例えば、特許文献１には、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールを含有することを特徴とする凍結保存液が記載されている。具体的には、生体の細胞や組織を平衡化液に浸漬した後に、ピペット等の細管状の治具を用いて、細胞又は組織を少量の平衡化液と共に取り出し、凍結保存液中に移動させる。そして、細胞又は組織を所定時間、凍結保存液中に浸漬させた後に、少量の凍結保存液と共に取り出し、細胞又は組織を凍結保存用治具が有するシート上に少量の凍結保存液と共に滴下付着させる。その後、細胞又は組織を載置したシートを液体窒素等の冷却媒体に浸漬させて凍結する。以上のような工程により特許文献１に記載の保存技術では生体の細胞や組織の保存が行われる。　
しかし、特許文献１の記載の保存技術では、生体の細胞や組織の保存において凍結保存液が用いられるため、保存をするまでに種々の工程が含まれるだけでなく、保存後も凍結環境を維持する必要があり、その取り扱いが煩雑であった。
特開２０２０－３９２６１公報
そこで、本開示は、生体試料の常温における保存を可能にする新規な生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキットを提供することを課題とする。
本開示者らは、上記課題を解決するために、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含むことで、常温における保存を可能にする生体試料保存剤を見出した。したがって、本開示の第１の局面は、（１）１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む、生体試料保存剤である。　
本開示の好適な態様は、（２）上記多原子一価陽イオンを有する物質又は上記多原子一価陽イオンから構成される化合物の濃度は、１．７～５．０ｍｏｌ／Ｌである、上記（１）に記載の生体試料保存剤である。　
本開示の好適な態様は、（３）上記多原子一価陽イオンを有する物質又は上記多原子一価陽イオンから構成される化合物は、硫酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムの少なくともいずれか一方を含む、上記（１）又は（２）に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（４）０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌのキレート試薬をさらに含む、上記（１）～（３）のいずれか一項に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（５）上記キレート試薬の濃度は、０．００６～０．５００ｍｏｌ／Ｌである、上記（４）に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（６）上記キレート試薬は、クエン酸ナトリウム及びクエン酸三ナトリウム一水和物の少なくともいずれか一方を含む、上記（４）に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（７）０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌの緩衝剤をさらに含む、上記（１）～（６）のいずれかに記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（８）上記緩衝剤の濃度は、０．０１０～５．０００ｍｏｌ／Ｌである、上記（７）に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（９）上記緩衝剤は、エチレンジアミン四酢酸である、上記（７）又は（８）に記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（１０）０．２５～３０重量％の賦形剤をさらに含む、上記（１）～（９）のいずれかに記載の生体試料保存剤、である。　
本開示の好適な態様は、（１１）凍結乾燥された粉末である、上記（１）～（１０）に記載の生体試料保存剤、である。　
また、本発明者らは、上記課題を解決するために、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含むことで常温における保存を可能にする生体試料保存剤の製造方法を見出した。したがって、本開示の他の局面は、（１２）所定の溶媒に、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を添加する第１の添加工程を含む、生体試料保存剤の製造方法、である。　
本開示の好適な態様は、（１３）第１の添加工程により得られた溶液に対して、０．２５～３０重量％の賦形剤をさらに添加する第２の添加工程をさらに含む、上記（１２）に記載の生体試料保存剤の製造方法、である。　
本開示の好適な態様は、（１４）前記第２の添加工程により得られた溶液に対して、－１０℃～－１００℃で凍結乾燥する凍結乾燥工程をさらに含む、上記（１３）に記載の生体試料保存剤の製造方法、である。　
本開示の好適な態様は、（１５）前記第１の添加工程により得られた溶液に対して加温条件下又は真空条件下で脱水をする脱水工程をさらに含む、上記（１２）に記載の生体試料保存剤の製造方法、である。　
また、本発明者らは、上記課題を解決するために、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤溶液を用いた生体試料保存方法を見出した。したがって、本開示の他の局面は、（１６）１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤溶液に、生体試料を浸漬して常温で保存する保存工程を含む、である。　
また、本発明者らは、上記課題を解決するために、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤を含む生体試料保存のためのキットを見出した。したがって、本開示の他の局面は、（１７）１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤を含む、生体試料保存のためのキット、である。
本開示は、生体試料の常温における保存を可能にする新規な生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法、生体試料保存方法及び生体試料保存のためのキットを提供することができる。
図１は、実施例１の生体試料保存剤の原液、１／２希釈液、１／４希釈液、及びネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水中でのマウスの肝臓を３７℃で２４時間保存したのちの各マイクロチューブの画像を示す図である。 実施例１～９の各生体試料保存剤溶液中、及びネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水中でのマウスの肝臓を３７℃で２４時間保存したのちの各マイクロチューブの画像を示す図である。
以下で本開示の生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法及び生体試料保存方法を実施するための形態を詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は、本開示を説明するための一例であり、本開示が当該実施形態のみに限定されるものではない。　
＜生体試料保存剤の製造＞　本開示において、生体試料保存剤は、例えば所定の溶媒に各成分を添加する工程と、必要に応じて凍結乾燥工程又は脱水工程を経て製造することが可能である。以下、その製造工程について具体的に説明する。　
ここで、本開示において、生体試料は、生体から採取されるか生体のために利用される試料であり、器官、組織、細胞（培養した細胞を含む）、体液、核酸、タンパク質又はそれらの組み合わせである。より好ましくは、生体試料としては核酸、タンパク質又はそれらの組み合わせが用いられる。なお、これらの生体試料には、生体から採取された試料のほかに、生体のために人工的に合成された試料を含みうる。また、本開示に係る発明が当然ここに例示したもののみに限定されるわけではない。　
また、製造される生体試料保存剤は、生体の保存時においては溶液の形態で提供されるのが好ましいが、乾燥形態、固体形態、粉末形態、無水形態、顆粒形態などのいずれの形態であってもよい。なお、生体試料保存剤は、溶液形態以外の場合は、所望の濃度になるように所定の溶媒によって溶解してから用いられるのが好ましい。また、本開示に係る発明がこれらのみの形態に限定されるわけではない。　
さらに製造される生体試料保存剤は、上記形態を有する保存剤や保存剤組成物として提供されてもよいし、当該生体試料保存剤に加えて、生体試料保存用の容器、生体試料採取具などを含む生体試料保存のためのキットとして提供されてもよい。　
１．第１の添加工程　本開示においては、第１の添加工程において、まず所定の溶媒が必要量容器に入れられ５～５０℃、より好ましくは１０～４０℃の常温において撹拌される。溶媒としては、典型的には純水が用いられるが、ろ過、蒸留、脱イオン又はそれらの組み合わせによって処理されたろ過水、精製水、蒸留水、脱イオン水又はそれらの組み合わせなどの処理水や、これらの処理水を含む水であればいずれでもよい。　
次いで、撹拌された溶媒に対して所定の濃度で緩衝剤が添加される。添加される緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリス－エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリス酢酸－エチレンジアミン四酢酸緩衝液、トリスホウ酸－エチレンジアミン四酢酸緩衝液、ＳＳＣ緩衝液、ＳＳＰＥ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、炭酸－重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液及びそれらの組み合わせなど、種々のものを利用することが可能である。これらのなかでも、緩衝剤としては、より好ましくはエチレンジアミン四酢酸緩衝液が利用される。ただし、本開示に係る発明がこれらのみの緩衝液に限定されるわけではない。また、当該緩衝液は、最終的に利用される生体試料保存剤において、０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１０～５．０００ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように添加される。　
次に、緩衝液が添加された溶液に、その他の主成分及び添加剤材料等の各材料が添加される。主な成分としては、化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物が含まれる。このような物質又は化合物は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。これらＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物、すなわちアンモニウムイオンを含む物質又は化合物を添加することによって生体試料等の常温での保存効果や保存安定性をより高めることが可能である。なお、本開示に係る発明がこれらのみの
緩衝液に限定されるわけではない。　
化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物は、最終的に利用される生体試料保存剤において、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．７～５．０ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように添加される。　
他の成分としては、キレート試薬が含まれることが可能である。このようなキレート試薬は、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム一水和物、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸又はそれらの組み合わせなど、種々のものを利用することが可能である。これらキレート試薬を添加することによって核酸分解酵素の働きを抑制し、核酸等の生体試料の常温における保存安定性をより高めることが可能である。なお、本開示に係る発明がこれらのみのキレート試薬に限定されるわけではない。キレート試薬は、最終的に利用される生体試料保存剤において、０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００６～０．５００ｍｏｌ／Ｌの濃度おとなるように添加される。　
他の成分としては、安定化剤が含まれることが可能である。このような安定化剤には、フッ化４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩、アプロチニン、Ｅ－６４、ロイペプチンヘミ硫酸塩一水和物、シリコンカーバイド、４ヒドロキシ安息香酸、Ｎ，Ｎ－ジアルキルプロパンアミド（Ｎ，Ｎ－ｄｉａｌｋｙｌｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）、ポリオキシチレン（ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ））ポリマー、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｌｙｌｅｎｅ））ポリマー、モノエチレングリコール（１，２－エタンジオール）（ｍｏｎｏ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ（１，２－ｅｔｈａｎｅｄｉｏｌ））、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、リチウム塩、カオトロピック剤、グアニジニウム塩、グアニジン塩酸塩、尿素、ポリアミン類、ビウレット、アルギニン、コスモトロープ、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、アルギニンエチルエステル、グリシン、アミノ酸アルキルエステル、アミノ酸アミド、グアニジニウム基を有する化合物、又はこれらの組み合わせなど、種々のものを利用することが可能である。これら安定化剤を添加することによって、細胞やタンパク質、核酸などの生体試料を安定化することが可能である。さらに、これらの中でも、フッ化４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩、アプロチニン、Ｅ－６４、ロイペプチンヘミ硫酸塩一水和物又はそれらの組み合わせであれば、プロテアーゼの活性を阻害することで、特に安定性を高めることが可能である。なお、本開示に係る発明がこれらのみの安定化剤に限定されるわけではない。これら安定化剤の添加量は選択した安定化剤に応じて適宜調整しうるが、フッ化４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩、アプロチニン、Ｅ－６４、ロイペプチンヘミ硫酸塩一水和物又はそれらの組み合わせを選択する場合、０．００１～１．０重量％、より好ましくは０．０１～０．１０重量％の濃度で添加することが可能である。　
他の成分としては、殺菌・抗菌剤が含まれることが可能である。このような殺菌・抗菌剤には、アモキシシリン三水和物、セフォタキシムナトリウム、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ピレトリン、メトフルトリン、トランスフルトリン、アジ化ナトリウム、4ヒドロキシ安息香酸、アルコール、界面活性剤又はそれらの組み合わせなど、種々のものを利用することが可能である。なお、本開示に係る発明がこれらのみの殺菌・抗菌剤に限定されるわけではない。これら殺菌・抗菌剤の添加量は、選択した安定化剤に応じて適宜調整しうるが、０．００１～１．０重量％、より好ましくは０．０１～０．１０重量％の濃度で添加することが可能である。　
他に特に詳細には記載しないものの、上記各成分に加えて、界面活性剤、ｐＨ調整剤、着色剤など、他の添加剤が適宜含まれてもよい。　
２．撹拌工程　上記のとおり第１の添加工程において各成分が添加された溶液が、必要量容器中で５～５０℃、より好ましくは１０～４０℃の常温において撹拌される。当該撹拌は、添加した各成分が完全に溶解するまで行われる。そして、添加した各成分が完全に溶解することによって、本開示に係る生体試料保存剤が溶液として得られる。このように、化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤を製造することによって、より保存安定性に優れた生体試料保存剤を得ることができる。　
３．凍結乾燥工程　上記のとおり製造された生体試料保存剤に対して、生体試料保存剤そのものの保存や持ち運びの簡便さなどを考慮して、さらに乾燥形態、固体形態、粉末形態、無水形態、顆粒形態などの所与の固形形状に加工することも可能である。そして、上記のとおり製造された生体試料保存剤（溶液）に対して凍結乾燥工程で処理することで、これらの形態の生体試料保存剤を得ることが可能である。なお、当該凍結乾燥工程は必須の工程ではなく、所望に応じて行うことが可能である。　
３－１．第２の添加工程　まず、凍結乾燥工程においては、第２の添加工程として、上記のとおり製造された生体試料保存剤（溶液）に対して、賦形剤が添加され、攪拌により溶解される。このような賦形剤には、ポリオール、単糖、二糖、多糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、親水性ポリマー又はそれらの組み合わせが用いられる。これらの中でも、賦形剤としては、好ましくは乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルメロースナトリウム、プルラン、デキストリン、アラビアゴム、寒天、ゼラチン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー、又はそれらの組み合わせが好ましく、炭酸カルシウム、デキストリン又はそれらの組み合わせが特に好ましく利用することが可能である。なお、本開示に係る発明がこれらのみの賦形剤に限定されるわけではない。　
これら賦形剤の添加量は、選択した賦形剤に応じて適宜調整しうるが、０．２５～３０重量％、より好ましくは０．１～１０．０重量％の濃度で添加することが可能である。　
ここで、上記のとおり製造された生体試料保存剤は、化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物、典型的には硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムを含む。そのため、凍結乾燥において脱水したのちに冷凍すると急激に氷点に達することによって、硫酸アンモニウム等が凍結乾燥の装置中で爆散する恐れがある。本開示においては、上記のとおり凍結乾燥工程においてあらかじめ賦形剤を所定量添加することで、この爆散を防止することが可能である。　
３－２．凍結乾燥工程　生体試料保存剤に対して賦形剤が溶解されると、凍結乾燥工程として、賦形剤が溶解された溶液に対して凍結乾燥処理が行われる。この凍結乾燥は種々の方法を用いることが可能であるが、一例としては、賦形剤が溶解された溶液が真空条件下で所定時間（例えば、６０分間）脱気され、その後所定温度（例えば、－７５℃）条件下に所定時間（例えば、６０分間）放置される。その後、得られた生体試料保存剤を常温常圧にゆっくり戻し、凍結乾燥された生体試料保存剤が得られる。なお、凍結乾燥工程又は凍結乾燥工程の後に打錠工程は顆粒化工程を経て所望の形態に加工することが可能である。　
４．脱水工程　第１の添加工程及び撹拌工程によって製造された生体試料保存剤に対して、生体試料保存剤そのものの保存や持ち運びの簡便さなどを考慮して、さらに乾燥形態、固体形態、粉末形態、無水形態、顆粒形態などの所与の固形形状に加工することも可能である。そして、上記のとおり製造された生体試料保存剤（溶液）が脱水工程処理されることで、これらの形態の生体試料保存剤を得ることが可能である。なお、当該脱水工程は必須の工程ではなく、所望に応じて行うことが可能である。　
上記工程によって製造された生体試料保存剤（溶液）が入った必要量容器が、真空装置に入れられ所定時間（例えば、２４時間など）放置される。その後、得られた生体試料保存剤が常圧下にゆっくり戻され、脱水された生体試料保存剤を得られる。なお、脱水工程の後に打錠工程は顆粒化工程を経て所望の形態に加工することが可能である。　
以上のとおり、第１の添加工程及び撹拌工程、また必要に応じて凍結乾燥工程又は脱水工程を通じて所望の生体試料保存剤を製造することが可能である。　
＜生体試料保存剤の構成＞　以上の製造工程を経て製造される生体試料保存剤は、以下の各成分を含む。すなわち、生体試料保存剤は、所定の溶媒に、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．７～５．０ｍｏｌ／Ｌの「化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物」を少なくとも含む。さらに、生体試料保存剤は、所望に応じて、０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１０～５．０００ｍｏｌ／Ｌの「緩衝剤」、０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００６～０．５００ｍｏｌ／Ｌの「キレート試薬」、０．００１～１．０重量％、より好ましくは０．０１～０．１０重量％の「安定化剤」、及び０．００１～１．０重量％、より好ましくは０．０１～０．１０重量％の「殺菌・抗菌剤」を含んでもよい。さらに、生体試料保存剤は、０．２５～３０重量％、より好ましくは０．１～１０．０重量％の「賦形剤」を含んでもよい。　
また、特に詳しくは説明しないが、以上の製造工程を経て製造される生体試料保存剤は、ｐＨ調整剤の添加などによって、ｐＨが４．０～１０．０、より好ましくは６．０～８．０に調製される。これにより、生体試料の保存安定性をより高めることが可能である。　
なお、特に詳しくは説明しないが、上記に記載した各成分に加えて、界面活性剤、ｐＨ調整剤、着色剤など、他の添加剤を適宜含んでもよい。　
＜生体試料の保存方法＞　上記生体保存剤を用いた保存方法においては、例えば器官、組織、細胞（培養した細胞を含む）、体液、核酸、タンパク質又はそれらの組み合わせを常温で保存するために用いられる。具体的には、第１の添加工程及び撹拌工程によって製造された生体試料保存剤が所定の容器（例えば、バイアル瓶、マイクロチューブなど）に分取される。そして、生体より採取された器官、組織、細胞（培養した細胞を含む）、体液、核酸、タンパク質又はそれらの組み合わせなどの生体試料が、当該容器中に浸漬され、常温（例えば、５～５０℃、より好ましくは１０～４０℃）下に静置される。これにより、採取された生体試料を常温で保存することが可能となる。　
なお、生体試料保存剤が、凍結乾燥工程又は脱水工程によって、乾燥形態、固体形態、粉末形態、無水形態、顆粒形態などの形態に加工されていた場合は、所定の溶媒に、各成分が溶液状態の生体試料保存剤の濃度になるように溶解し、用いることが可能である（濃度は溶媒の量に応じて適宜調整してもよい）。なお、溶媒としては、典型的には純水が用いられるが、ろ過、蒸留、脱イオン又はそれらの組み合わせによって処理されたろ過水、精製水、蒸留水、脱イオン水又はそれらの組み合わせなどの処理水や、これらの処理水を含む水であればいずれでもよい。　
以上のとおり、本開示によれば、生体試料の常温における保存を可能にする新規な生体試料保存剤、生体試料保存剤の製造方法及び生体試料
保存方法を提供することが可能となる。
以下、実施例により本開示を更に詳しく説明するが、本開示はそれらに限定されるものではない。　
＜生体試料保存剤の製造＞　
所定容量の耐熱瓶（２Ｌのガラスメジューム瓶（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））に溶媒として純水が入れられ、温度制御付きスターラー（製品名：ホットスターラーＲＥＸＩＭ　ＲＳＨ－４ＤＮ（アズワン社製））で３７℃に設定したうえで、６０ｒｐｍの回転数で撹拌された。その後、下記表１～３に記載のとおりの緩衝液が添加され、当該緩衝液が完全に溶解するまでさらに撹拌された。次いで、下記表１～３に記載した硫酸アンモニウム、及び他の成分がそれぞれ下記表１に記載の濃度で添加され、各成分が完全に溶解するまで撹拌され、溶液として各生体試料保存剤（実施例１～実施例９）が製造された。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜生体試料の保存効果の測定＞　上記のとおり製造された実施例１～９の各生体試料保存剤に対して以下のとおり生体試料保存効果の測定が行われた。　
［実験１］　実施例１の生体試料保存剤について、耐熱瓶からそれぞれ分取され、その原液、１／２希釈液及び１／４希釈液がそれぞれ１ｍＬずつ、１．５ｍＬのマイクロチューブに分注された。そして、生体試料として、マウスの肝臓が１．３ｍｇ採取され、各生体試料保存剤が分注されたマイクロチューブに入れられ、生体試料保存剤中に浸漬された。なお、このときネガティブコントロールとして１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水が１．５ｍＬのマイクロチューブに分注され、同様にマウスの肝臓１．３ｍｇが当該リン酸緩衝生理食塩水中に浸漬された。そして、各マイクロチューブに入れられた各生体試料が３７℃で２４時間常圧下に静置され保存された。　
２４時間経過後、各マイクロチューブから生体試料である肝臓が取り出され、ＲＮＡの抽出が行われた。ＲＮＡの抽出は、市販のＲＮＡ抽出キット（製品名：ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、当該キット指定の方法により行われた。そして、各マイクロチューブの生体試料について、各生体試料から得られたＲＮＡの濃度を測定することで、生体試料の保存安定性が評価された。ＲＮＡの濃度の測定は、電気泳動システム装置（製品名：バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製））を用いて、当該装置指定の方法により行われた。　
図１は、実施例１の生体試料保存剤の原液、１／２希釈液、１／４希釈液、及びネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水中でのマウスの肝臓を３７℃で２４時間保存したのちの各マイクロチューブの画像を示す。また、表４は、実施例１の生体試料保存剤の原液、１／２希釈液、１／４希釈液及びリン酸緩衝生理食塩水中で保存したマウスの肝臓から得らえたＲＮＡの濃度を示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
図１によれば、原液、１／２希釈液、１／４希釈液と、各生体試料保存剤中に含まれる成分濃度が少なくなるのに応じて、保存した生体試料の保存状態が悪化し、生体試料保存剤の溶液も濁りを生じることが確認された。特に、リン酸緩衝生理食塩水で保存した場合と比較すると、実施例１の生体試料保存剤の１／４希釈液で保存した場合には、リン酸緩衝生理食塩水と同程度の濁りを生じた。他方、実施例１の生体試料保存剤の原液及び１／２希釈液では、リン酸緩衝生理食塩水と比較すると、明らかに濁りは少なく、生体試料そのものの良好な保存状態が確認できた。特に実施例１の生体試料保存剤の原液では、濁りはほとんど見られず、また生体試料も保存前の状態をほぼ維持しており、極めて良好に生体試料を常温でも保存できることが確認できた。　
また、表４によれば、保存後の生体試料から採取されたＲＮＡの各濃度も、生体試料保存剤の各成分の濃度の応じて高くなることが確認された。具体的には、実施例１の生体試料保存剤の１／４希釈液で保存した場合には、生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度は、リン酸緩衝生理食塩水で保存した生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度と同等であった。しかし、実施例１の生体試料保存剤の１／２希釈液で保存した場合には、生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度は、リン酸緩衝生理食塩水で保存した生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度と比較すると、明らかに高い数値を示した。また、実施例１の生体試料保存剤の原液で保存した場合には、生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度は、リン酸緩衝生理食塩水で保存した生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度と比較すると、極めて高い数値（２倍以上）を示した。すなわち、これらの結果によって、生体試料の保存効果は、実施例１の生体試料保存剤の濃度に依存することや、実施例１の生体試料保存剤の原液及び１／２希釈液からは、生体試料の極めて高い保存効果が確認された。　
［実験２］　実施例１～９の各生体試料保存剤が、耐熱瓶からそれぞれ１ｍＬずつ分取され、１．５ｍＬのマイクロチューブに分注された。そして、生体試料として、マウスの肝臓が４０ｍｇ採取され、各実施例１～９の生体試料保存剤が分注されたマイクロチューブに入れられ、生体試料保存剤中に浸漬された。なお、このとき対象として１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水が１．５ｍＬのマイクロチューブに分注され、同様にマウスの肝臓４０ｍｇが当該リン酸緩衝生理食塩水中に浸漬された。そして、各マイクロチューブに入れられた各生体試料が３７℃で２４時間常圧下に静置され保存された。　
２４時間経過後、各マイクロチューブから生体試料である肝臓が取り出され、ＲＮＡの抽出が行われた。ＲＮＡの抽出は、実験１と同様の方法で行われた。　
図２は、実施例１～９の各生体試料保存剤溶液中、及びネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水中でのマウスの肝臓を３７℃で２４時間保存したのちの各マイクロチューブの画像を示す。なお、ここでは、ポジティブコントロールとしてマウスの肝臓４０ｍｇを採取後、マイクロチューブ内で－８０℃で凍結して保存したものを用意し、当該画像も同様に撮影した。また、表５は、実施例１～９の各生体試料保存剤中及びリン酸緩衝生理食塩水中で保存したマウスの肝臓から得らえたＲＮＡの濃度を示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
図２によれば、実施例１～９の各生体試料保存剤溶液で常温保存された生体試料のいずれにおいても、ポジティブコントロールとして用意した－８０℃で保存した生体試料と同等に状態を維持し、また各生体試料保存剤溶液の濁りも確認されなかった。他方、ネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水で保存した生体試料は、実施例１～９の生体試料と比較して明らかに過剰な濁りを生じた。すなわち、実施例１～９の生体試料保存溶液のいずれも、常温でありながら極めて良好な生体試料保存効果を有することが確認できた。　
また、表５によれば、実施例１～９の各生体試料保存剤溶液で常温保存された生体試料から抽出されたＲＮＡの各濃度は、ネガティブコントロールとして用意したリン酸緩衝生理食塩水で保存した生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度に比べて、いずれも２．９倍以上の高い濃度が測定された。特に、実施例４の生体試料保存剤溶液で常温保存された生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度は、ポジティブコントロールとして用意した－８０℃の凍結保存した生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度と同等、また実施例９の生体試料保存剤溶液で常温保存された生体試料から抽出されたＲＮＡの濃度は、１．３倍を超える濃度が測定された。すなわち、これらの結果によって、実施例１～９の生体試料保存剤のいずれにおいても、生体試料の極めて高い保存効果が確認された。  

Claims (17)

  1. １．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む、生体試料保存剤。　
  2. 前記多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物の濃度は、１．７～５．０ｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の生体試料保存剤。　
  3. 前記多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物は、硫酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムの少なくともいずれか一方を含む、請求項１又は２に記載の生体試料保存剤。　
  4. ０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌのキレート試薬をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の生体試料保存剤。　
  5. 前記キレート試薬の濃度は、０．００６～０．５００ｍｏｌ／Ｌである、請求項４に記載の生体試料保存剤。　
  6. 前記キレート試薬は、クエン酸ナトリウム及びクエン酸三ナトリウム一水和物の少なくともいずれか一方を含む、請求項４又は５に記載の生体試料保存剤。　
  7. ０．００４～１０．０００ｍｏｌ／Ｌの緩衝剤をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の生体試料保存剤。　
  8. 前記緩衝剤の濃度は、０．０１０～５．０００ｍｏｌ／Ｌである、請求項７に記載の生体試料保存剤。　
  9. 前記緩衝剤は、エチレンジアミン四酢酸緩衝液を含む、請求項７又は８に記載の生体試料保存剤。　
  10. ０．２５～３０重量％の賦形剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の生体試料保存剤。　
  11. 凍結乾燥された粉末である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の生体試料保存剤。　
  12. 所定の溶媒に、１．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を添加する第１の添加工程を含む、生体試料保存剤の製造方法。　
  13. 前記第１の添加工程により得られた溶液に対して、０．２５～３０重量％の賦形剤をさらに添加する第２の添加工程をさらに含む、請求項１２に記載の生体試料保存剤の製造方法。　
  14. 前記第２の添加工程により得られた溶液に対して、－１０℃～－１００℃で凍結乾燥する凍結乾燥工程をさらに含む、請求項１３に記載の生体試料保存剤の製造方法。　
  15. 前記第１の添加工程により得られた溶液に対して加温条件下又は真空条件下で脱水をする脱水工程をさらに含む、請求項１２に記載の生体試料保存剤の製造方法。　
  16. １．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤溶液に、生体試料を浸漬して常温で保存する保存工程を含む、生体試料保存方法。　
  17. １．０～１０．０ｍｏｌ／Ｌの化学式ＮＨ４＋で示される多原子一価陽イオンを有する物質又は前記多原子一価陽イオンから構成される化合物を含む生体試料保存剤を含む、生体試料保存のためのキット。
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