RU2738854C1 - Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом - Google Patents

Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом Download PDF

Info

Publication number
RU2738854C1
RU2738854C1 RU2020121910A RU2020121910A RU2738854C1 RU 2738854 C1 RU2738854 C1 RU 2738854C1 RU 2020121910 A RU2020121910 A RU 2020121910A RU 2020121910 A RU2020121910 A RU 2020121910A RU 2738854 C1 RU2738854 C1 RU 2738854C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
beta
genes
enterobacteria
urine
uropathogenic
Prior art date
Application number
RU2020121910A
Other languages
English (en)
Inventor
Татьяна Алексеевна Хуснутдинова
Елена Васильевна Шипицына
Кира Валентиновна Шалепо
Анна Александровна Крысанова
Ольга Викторовна Будиловская
Екатерина Николаевна Герасимова
Алевтина Михайловна Савичева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта"
Priority to RU2020121910A priority Critical patent/RU2738854C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2738854C1 publication Critical patent/RU2738854C1/ru

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483Physical analysis of biological material
    • G01N33/487Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом. Проводят исследование пробы мочи на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени и при выявлении клинически значимого количества энтеробактерий ≥5×105 ГЭ/мл проводят последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA. При обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий. Изобретение обеспечивает сокращение времени исследования и возможность применения в учреждениях, не располагающих условиями для бактериологических исследований, но выполняющих ПЦР-исследования. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной медицине, и может быть использовано для экспресс анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом.
Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к наиболее распространенным инфекционным заболеваниям в акушерстве и гинекологии. В отсутствие своевременной антибактериальной терапии ИМП могут приводить к появлению серьезных осложнений, таких как анемия, артериальная гипертензия, преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела. Возбудителями ИМП в подавляющем большинстве случаев являются уропатогенные энтеробактерии - бактерии семейства Enterobacteriaceae, главным образом, Escherichia coli и Klebsiella spp.
В настоящее время выявление значимой бактериурии и определение чувствительности выявленных уропатогенов к антибиотикам основываются на культивировании пробы мочи. Лечение ИМП начинается эмпирически и в последующем корректируется, если необходимо, на основании результатов культурального исследования мочи. Во время беременности выбор препаратов для терапии тяжелых форм ИМП (пиелонефрита и уросепсиса) ограничен бета-лактамными антибиотиками, такими как пенициллины и цефалоспорины. Однако, высокая резистентность энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам может приводить к неблагоприятным клиническим исходам, ввиду неэффективности применяемого антибиотика. Кроме того, широкое использование эмпирической терапии в условиях высокой резистентности к данным антибиотикам способствует дальнейшему росту резистентности. В связи с этим ограничение использования эмпирической терапии в пользу этиотропной (направленной на конкретного возбудителя) с учетом профиля его антибиотикорезистентности является актуальной клинической и эпидемиологической задачей.
Известен способ определения возбудителя ИМП и его чувствительности к антибиотикам, заключающийся в культуральном исследовании пробы мочи. Сначала производят количественный посев мочи в питательные среды для определения клинической значимости выявленного возбудителя и получения чистой культуры возбудителя для дальнейшего анализа. Далее осуществляют идентификацию выделенного возбудителя с применением биохимических, спектрометрических и других методов (в зависимости от возбудителя и возможностей лаборатории). После этого определяют чувствительность возбудителя к антибиотикам с применением диско-диффузионного метода или метода серийных разведений (Определение чувствительности к антимикробным препаратам. EUCAST 2018).
Недостатки культурального исследования мочи заключаются в трудоемкости и длительности - в целом, анализ занимает 48-72 часа. Кроме того, накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что прогнозирование клинической эффективности антимикробных препаратов на основе оценки фенотипа (антибиотикограммы) менее информативно, чем ее прогнозирование на основе выявления генотипа (набора генов резистентности) данного патогена. Существенным недостатком также является то, что в современных условиях повсеместного внедрения молекулярно-биологических исследований в клиническую лабораторную диагностику не все учреждения имеют лаборатории для бактериологических исследований.
Известен способ исследования мочи, получивший распространение в последние годы, в котором сначала производят количественный посев мочи в питательные среды для определения клинической значимости выявленного возбудителя. После этого исследуют культуру молекулярно-биологическими методами, например, методом ПЦР, для идентификации возбудителя и выявления генов резистентности. Данный способ позволяет сократить продолжительность анализа примерно на 24 часа (Tuite Ν, Reddington K, Barry Τ, Zumla A, Enne V. Rapid nucleic acid diagnostics for the detection of antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria: Is it time for a paradigm shift? Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2014; 69:1729-33). Данный способ исследования мочи мы взяли в качестве ближайшего аналога - прототипа изобретения.
Недостатком способа, тем не менее, остается значительная продолжительность анализа и наличие этапа количественного культурального исследования мочи.
Технический результат заявляемого способа заключается в исключении этапа культурального исследования мочи и, как следствие, значительном сокращении времени исследования, а также возможности применения в учреждениях, не располагающих условиями для бактериологических исследований, но выполняющих ПЦР-исследования.
Указанный технический результат достигается в способе экспресс анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом, включающем исследование мочи методом ПЦР, в котором проводят исследование пробы мочи на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени и при выявлении клинически значимого количества уропатогенных энтеробактерий ≥5×105 ГЭ/мл проводят ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA и при обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий.
Для выявления клинически значимого количества уропатогенных энтеробактерий использован метод количественной ПЦР. Сразу же после получения положительного результата количественного ПЦР-исследования производят ПЦР-анализ этого же образца ДНК на гены резистентности к бета-лактамным антибиотикам. Весь анализ занимает 3-4 часа.
Способ иллюстрируется чертежом, где представлен результат ROC-анализа способности количественного ПЦР-теста на ДНК энтеробактерий выявлять бактериурию ≥104 КОЕ/мл
Этапы разработки состояли из решения следующих задач. Сначала были разработаны критерии клинически значимого количества ДНК уропатогенных энтеробактерий, выявляемых при ПНР-исследовании. Для этого был использован статистический метод ROC-анализ (ROC - receiver operating characteristic). В качестве референтных положительных образцов использовали первичные пробы мочи с культурально подтвержденной значимой бактериурией (n=95). В качестве референтных отрицательных образцов использовали первичные пробы мочи (n=849) от пациенток без значимой бактериурии и без признаков ИМП. Все пробы мочи были параллельно протестированы методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием ранее опубликованных праймеров и зондов для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae (табл. 1).
Figure 00000001
Figure 00000002
Значимая бактериурия определяется как ≥104 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл при культуральном анализе (Bartoletti R, Johansen ТЕВ, Naber KG, Pickard RS, Tenke P, Wagenlehner F, et al. Guidelines on Urological Infections. European Association of Urology 2015:237-57).
Оптимальный порог ROC-кривой (чертеж) составил ≥5×105 геномных эквивалентов (ГЭ)/мл, эта величина была взята за показатель значимой бактериурии для ПЦР-исследования. Чувствительность и специфичность ПЦР-метода для определения значимой бактериурии с данным порогом в сравнении с количественным культуральным исследованием мочи составили 99% и 100%, соответственно.
Следующим этапом был фенотипический и генетический анализ на бета-лактамную резистентность. С применением фенотипического (диско-диффузионного) метода было протестировано 116 изолятов уропатогенных энтеробактерий. Эти же изоляты, а также все первичные пробы мочи, из которых их выделили, с применением метода ПЦР протестировали на гены бета-лактамаз, определяющих резистентность к амоксициллину/клавуланату и цефалоспоринам широкого спектра. ПЦР проводили с использованием опубликованных праймеров (табл. 1).
Figure 00000003
Figure 00000004
Фенотипически резистентность к амоксициллину/клавуланату и/или цефалоспоринам широкого спектра действия была выявлена у 32 изолятов -29 Е. coli, 2 К. pneumoniae и 1 K. oxytoca. В 31 из этих изолятов были выявлены гены исследуемых типов беталактамаз (СТХ-М, ТЕМ, DHA) по отдельности или в сочетаниях (табл. 2). Остальные генетические детерминанты резистентности не были обнаружены ни в одной исследуемой пробе. Совпадение результатов тестирования изолятов уропатогенов и первичных проб мочи составило 100%.
Из 32 штаммов с фенотипом резистентности к бета-лактамам в 31 были обнаружены гены резистентности (как минимум один из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA), и чувствительность, таким образом, составила 97% (табл. 3).
В 9 штаммах были обнаружены гены резистентности, но при этом фенотипически они были чувствительны к бета-лактамам. Таким образом, специфичность составила 89%.
Из 40 штаммов, содержащих гены резистентности, только 31 проявили резистентный фенотип к бета-лактамам, и прогностическая значимость положительных результатов составила 78%).
Прогностическая значимость отрицательных результатов была очень высокой (99%): из 76 штаммов, в которых генов резистентности не выявлялись, 75 не имели резистентного фенотипа.
Диагностические характеристики теста на присутствие генов беталактамаз для определения фенотипической резистентности уропатогенных энтеробактерий представлены в табл. 3.
Figure 00000005
Figure 00000006
Таким образом, на основании результата ПЦР-анализа на присутствие генов бета-лактамаз делается предположение об эффективности бета-лактамных антибиотиков:
1. Гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA не обнаружены - с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет эффективным;
2. Обнаружены гены бета-лактамаз СТХ-М и/или ТЕМ и/или DHA - с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет неэффективным.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
У беременных женщин с пиелонефритом берут пробу мочи и проводят исследование этой пробы на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием известных праймеров (табл.1). При выявлении клинически значимого количества энтеробактерий ≥5×105 ГЭ/мл проводят последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA и при обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий, что свидетельствует о том, что с большой долей вероятности лечение амоксициллином/клавулановой кислотой и цефалоспоринами будет неэффективным.
Способ подтверждается следующими примерами.
Пример 1. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлена ДНК Е. coli в количестве 5,2×105 ГЭ/мл (значимое количество). Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием соответствующих праймеров в табл. 1. Обнаружен резистентный генотип ТЕМ, что свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
Пример 2. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлена ДНК K. pneumoniae в количестве 5,0×105 ГЭ/мл (значимое количество). Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием праймеров в соответствии с табл. 1. Обнаружены гены СТХ-М и ТЕМ, свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
Пример 3. В пробе мочи методом количественной ПЦР выявлено 6,0×105 ГЭ/мл значимого количества Е. coli. Проведен последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA с использованием праймеров в соответствии с табл. 1. Обнаружен резистентный генотип DHA, свидетельствует о высокой вероятности того, что лечение бета-лактамными антибиотиками будет неэффективным.
Как указывалось ранее, из 116 изолятов уропатогенных энтеробактерий, исследованных заявляемым способом экспресс-анализа, в 32 случаях подтвердилась бета-лактамная резистентность, что позволило назначить своевременное эффективное лечение. Во всех случаях для экспресс анализа потребовалось от 3 до 4 часов.
Способ позволяет значительно сократить время исследования до 3-4 часов и может рассматриваться как экспресс-анализ. Способ не требует этапа культурального исследования мочи, может быть применен в учреждениях, не располагающих условиями для бактериологических исследований, но выполняющих ПЦР-исследования.

Claims (1)

  1. Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом, включающий исследование мочи методом ПЦР, отличающийся тем, что проводят исследование пробы мочи на ДНК энтеробактерий методом количественной ПЦР в реальном времени и при выявлении клинически значимого количества энтеробактерий ≥5×105 ГЭ/мл проводят последующий ПЦР-анализ той же пробы ДНК на гены бета-лактамаз СТХ-М, ТЕМ и DHA, и при обнаружении как минимум одного из генов СТХ-М, ТЕМ, DHA делают вывод о бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий.
RU2020121910A 2020-06-26 2020-06-26 Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом RU2738854C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020121910A RU2738854C1 (ru) 2020-06-26 2020-06-26 Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020121910A RU2738854C1 (ru) 2020-06-26 2020-06-26 Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2738854C1 true RU2738854C1 (ru) 2020-12-17

Family

ID=73834884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020121910A RU2738854C1 (ru) 2020-06-26 2020-06-26 Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2738854C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2608651C1 (ru) * 2015-12-21 2017-01-23 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЗД" Минздрава России) Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов
RU2629322C1 (ru) * 2016-11-08 2017-08-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ выявления возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций и маркеров их резистентности к бета-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных детей для оптимизации антибактериальной терапии

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2608651C1 (ru) * 2015-12-21 2017-01-23 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЗД" Минздрава России) Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов
RU2629322C1 (ru) * 2016-11-08 2017-08-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ выявления возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций и маркеров их резистентности к бета-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных детей для оптимизации антибактериальной терапии

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAVIGNE J.-P. et al. Virulence Potential of Escherichia coli Strains Causing Asymptomatic Bacteriuria during Pregnancy. J Clin Microbiol. 2011 Nov; 49(11): 3950-3953. ХУСНУТДИНОВА Т.А. и др. Определение значимой бактериурии у беременных женщин методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Ж. акуш. и жен. болезн. 2016. 4: 50-56. TUITE Ν. et al. Rapid nucleic acid diagnostics for the detection of antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria: Is it time for a paradigm shift? Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2014; 69(7): 1729-33. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Olomu et al. Elimination of “kitome” and “splashome” contamination results in lack of detection of a unique placental microbiome
Menard et al. Self-collected vaginal swabs for the quantitative real-time polymerase chain reaction assay of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis and the diagnosis of bacterial vaginosis
Schirm et al. Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR
CN108431237A (zh) 用于包括确定样品的异常状况,特别是健康状况和/或致病状况的基于核酸的诊断方法的方法和装置
CA3115287A1 (en) Microbial analysis without cell purification
Ouzounova‐Raykova et al. May Chlamydia trachomatis be an aetiological agent of chronic prostatic infection?
Rutanga et al. Clinical significance of molecular diagnostic tools for bacterial bloodstream infections: a systematic review
Wu et al. Fluorescence in situ hybridization rapidly detects three different pathogenic bacteria in urinary tract infection samples
Masha et al. Urogenital pathogens, associated with Trichomonas vaginalis, among pregnant women in Kilifi, Kenya: a nested case-control study
RU2362808C1 (ru) Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности
Pusterla et al. Diagnostic evaluation of real-time PCR in the detection of Rhodococcus equi in faeces and nasopharyngeal swabs from foals with pneumonia
Shigemura et al. Rapid detection and differentiation of Gram-negative and Gram-positive pathogenic bacteria in urine using TaqMan probe
McNEELEY et al. An evaluation of two rapid bacteriuria screening procedures
RU2738854C1 (ru) Способ экспресс-анализа мочи на гены бета-лактамной резистентности уропатогенных энтеробактерий у беременных женщин с пиелонефритом
Samarbaf-Zadeh1ADEFG et al. Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) for the detection of Helicobacter pylori
Hinata et al. Quantitative detection of Escherichia coli from urine of patients with bacteriuria by real-time PCR
RU2458993C1 (ru) Способ дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста
Jia et al. Enhancing urinary tract infection diagnosis for negative culture patients with metagenomic next-generation sequencing (mNGS)
Meyrier Sampling and evaluation of voided urine in the diagnosis of urinary tract infection in adults
Lee et al. Comparative of clinical performance between next-generation sequencing and standard blood culture diagnostic method in patients suffering from sepsis
Murgia et al. Management of urinary tract infections: problems and possible solutions
Lu et al. Use of Pyromark Q96 ID pyrosequencing system in identifying bacterial pathogen directly with urine specimens for diagnosis of urinary tract infections
RU2629322C1 (ru) Способ выявления возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций и маркеров их резистентности к бета-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных детей для оптимизации антибактериальной терапии
Vaughan et al. Concordance of urinary microbiota detected by 16S ribosomal RNA amplicon sequencing vs expanded quantitative urine culture
WO2019222222A2 (en) Methods for microbial identification in clinical specimens by differential ribosomal rna probe hybridization