CN102947266B - 分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式(I)化合物，其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或者R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。

Description

分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法
本发明涉及分析细胞或其它生物材料的方法，识别完整的和不完整的细胞的方法、所述方法的检测系统，以及涉及一些新的化合物和包括这些化合物和核酸的荧光复合物。本发明在细胞和其它生物材料的分析中具有广泛应用，尤其但不限于，涉及一种类型的不渗透细胞的荧光染料及其用途。
用于测定样本的细胞浓度和活力的方法(包括在非固定的细胞样品中识别细胞完整性，以及在固定的和可渗透的细胞样品中染色核材料)常规用于生命科学和医疗工业中。
鉴定与形态学、生物化学和分子变化(其倾向于、优先于以及伴随细胞死亡(例如坏死或凋亡))有关的过程的能力在生命科学具有广泛的关注。分子探针技术(其容易在流式细胞仪和显微镜平台上进行，允许在未接受先前固定的细胞样品中进行所述过程的细胞水平研究)尤其引起关注(Darzynkiewicz,Juan等.1997)。已经开发了多种基于荧光染料的染色方案，用于流式细胞和显微分析真核细胞和细菌的活力。
活/死细胞分析已经先前探索了完整的或代谢活性的细胞防止比色或荧光染料穿透至一个或多个细胞腔隙的能力。在高等真核生物中，该性质主要涉及质膜的完整性，而在低等真核生物、原核系统和植物中，细胞壁组成和破坏也可影响染料穿透和行为。已经公开了从活细胞状态至死细胞状态的过渡期，但其经常在不同类型的细胞和所涉及的过程的速度和形式之间存在差别。认为活的、完整的或有活力的细胞为如下细胞：其同时保留一定程度的代谢功能和质膜完整性，但不必然意味着具有增殖能力。质膜完整性的丧失，而非其它膜重组的过程，是细胞死亡过程中的临界点，并且导致细胞在细胞的内环境与外环境之间显示增强的或自由的分子(根据它们的具体性质)通道的可能。在细胞死亡过程中，膜重组的实例表现为膜联蛋白V分子与细胞表面的结合增强，但是需要与膜联蛋白V与具有破裂的膜的细胞(所述细胞代表了与不渗透细胞的染料的正染色有关的细胞死亡晚期)的结合相区别。
显示受损的膜完整性的细胞可以描述为无活力的或不完整的细胞，并且认为包括死的、可渗透的或死亡中的细胞，其显示了膜破裂的特征。该临界转变点可以通过不渗透活细胞的染料的进入增加得以鉴定，提供了细胞死亡的功能性定义和一种分析方法。优选地，所述染料具有结合至残留的细胞内结构的能力，因此优先蓄积在细胞群中的不完整的细胞内。应当理解，在细胞死亡过程中相对长期保留了携带残留核酸的结构，而细胞单位最终分解为多个碎片通常鉴定为残骸(debris)。
活体染料也可用于检测和因此选择细胞群。这特别有利于需要保留活的、非受损的细胞的功能的分析。一种方法为通过检测活跃的细胞代谢正面评价活力，所述细胞代谢可以通过渗透细胞的非-荧光底物在细胞内转化为强荧光产物测定，所述强荧光产物优先保留在完整的细胞内(例如通过细胞内非-特异性酯酶活性的醋酸荧光素代谢)，因此正识别有活力的部分。在该情况下，排除具有受损的完整性的细胞用于增强来自所述分析的信息的有效性。另一方面，不渗透活细胞的染料将进入膜受损的细胞中，所述细胞为死细胞或处于凋亡或细胞死亡的晚期。在不渗透细胞的DNA结合染料的情况下，染料进入和随后与细胞内残留的核酸的相互作用用于报道给定细胞的膜的受损状态。在该情况下，所述细胞内染料与残留的核酸(优选DNA)之间的‘复合物’为报道原理(reportingprinciple)。在该情况下，所述试剂不再被这些细胞排出，而且现在具有复合物形成的可及性，因此提供了对活力的负染色和对受损的细胞的正染色。
应当理解，细胞样品也可使用固定方法处理，以允许细胞特征的分析作为生命科学中所用的大量技术的一部分。所述固定方法和细胞渗透方法可以改变，但经常导致允许不渗透活细胞的染料进入的膜改变。
优选通过获取与染料高亲和力结合至细胞内核酸有关的荧光信号指示染料进入，并且常常认为染料进入得到结合后荧光增强协助。
不定地结合至核酸的不渗透细胞的(和渗透细胞的)荧光染料为一大类分子探针，其广泛用于生物科学，并可容易地获自商品供应商。这些试剂的所寻求的特征包括：核酸选择性、激发和发射特性、量子产率、结合后荧光增强的可能、在水性环境中的性能、从非受损的细胞排出的程度(对活力提供负染色，并对细胞死亡提供正染色)或对于完整的细胞分析的穿透至完整的细胞的速度。具体染料的选择通常由与掺入分析的其它荧光团的光谱重叠程度以及对选择性或最佳激发方便的光源的可用性来确定。
由于细胞死亡的过程常常包括细胞性质随扩展的期间时限(几分钟至几天)连续获得改变，因此有必要确保不渗透细胞的染料具有可忽略的毒性，使得给定染料的连续存在不会影响报道分析中活力的丧失。所述非-毒性的不渗透细胞的染料优选用于连续监测长期分析中的活力的丧失。
众所周知，在具有变化的结构完整性水平的细胞中，细胞染色质被渗透和非-渗透染料荧光染色的性质的程度复杂且不容易预测(Wlodkowic,Skommer等.2007)。发生细胞死亡过程的细胞(允许其它不渗透细胞的指示剂染料进入细胞)也发生了细胞结构变化(不仅是染色质构象)。经常观察到凋亡的细胞核被吸收阳离子染料深色染色，而对于许多DNA荧光染料凋亡的细胞核常常表现暗淡。目前的理解是，早期的凋亡细胞的染色质对阳离子染料的增强的亲和力与构象松弛而非DNA降解有关(Erenpreisa,Freivalds等.1997)。在晚期的凋亡细胞中，降解的DNA的非常致密的包装促进影响荧光性质的染料进一步聚集(Erenpreisa,Freivalds等.1997)。
靶向核酸的染料对细胞的荧光染色因此是细胞状态、渗透性质、染料结合特异性、染料结合方式以及染料-染料相互作用的复杂模型(complexmatrix)。为了在基于细胞的分析中消除该问题，常规方法已经倾向于高荧光增强和高量子产率的染料。在核酸染色中已经发现了大量不渗透细胞的染料的用途。最常使用的实例为碘化丙啶(PI)。
强荧光的PI信号具有检测简单和灵敏的优点，但当该荧光染料掺入多色分析中时具有缺点。另外，PI具有在UVA(例如365nm)波长和被蓝光(例如488nm)波长激发的能力，当有差别的激发用于区分荧光分析物或通过荧光探针检测的分析物时，其应用变得复杂。PI不具有用于方便分析细胞染色的比色特征。尤其是，在邻近分析PI的峰发射区域的可见光谱部分收集到的信号中，必须应用补偿，以解决‘溢出’。此外，PI的荧光发射可能处于以下光谱区域，在该区域中来自荧光分析物或者通过荧光探针检测的分析物的发射可能需要区分。PI提供了一些如同在红外区(redregion)和之外区域(例如>620nm波长)发射的不渗透活细胞的染料的光谱优点。
应当理解，结合至DNA的PI的高荧光强度经常需要以对数标度分析从细胞群中获得的荧光信号，其为鉴定细胞亚群提供了广阔的动态范围。
US5,057,413教导了使用渗透细胞的核酸染料LDS-751，其中基于发射出的荧光的量，对DNA的偏好区分了受损的和完整的细胞。在其它实例中，在白细胞标记(CD45)的表达的流式细胞的白血病/淋巴瘤评估中，使用染料7-AAD(具有低的完整细胞渗透性质)能够区分完整的和死的细胞，避免了非-特异性染色的缺陷(Shenkin,Babu等.2007)。在另一实例中，美国专利申请20070082377公开了使用不渗透细胞的DNA染料7-AAD作为多参数分析的组成部分，其也利用了作为膜染料的荧光探针，以及作为渗透细胞的凋亡-检测探针的荧光探针（其结合至活跃的半胱天冬酶）。所述方法允许了区分死的或坏死的细胞(使用活体染料7-AAD检测；当该染料结合或嵌入DNA时，其可例如经过与核酸结合后荧光增强的过程得以检测)和特征在于修饰的半胱天冬酶活性的凋亡的细胞。
利用渗透细胞的和不渗透细胞的染料的‘双重染料’分析是已知的(Giao,Wilks等,2009；Biggerstaff，LePuil等,2006；Lehtinen,Nuutila等2004；WlodkowicandSkommer,2007a；WlodkowicandSkommer,2007b)。常常优化所用染料的个别性能，并有效避免相互作用，使得细胞可以准确报道渗透特性。上面讨论的双重染料阵列分别地具有多种缺点和不利性质，其与应用的精确系统有关。然而，毫无例外地，在双重染料分析中也存在基本问题，即直接结合渗透细胞的核酸染料也将染色具有受损的或破裂的膜的细胞中的核酸。
获自如上所述的渗透细胞的和不渗透细胞的染料的信号的动态范围提供了方便的分析方法。
此外，存在持续的提高荧光染料分析细胞和其它生物材料的有用性质的需要。
在至少一些实施方式中，本发明解决了上述问题和需要。尤其是，在至少一些实施方式中，本发明提供了改进的不渗透细胞的染料，而且提供了能够使用不渗透细胞的和渗透细胞的染料进行活/死细胞识别的改进的系统。在一些实施方式中，本发明提供了在远红外(例如>660nm波长或>690nm波长)具有优选的发射并在橙色/红色光谱区域(例如>530<620nm波长)具有减少的发射的不渗透细胞的染料。
根据本发明的第一方面，提供式(I)化合物：
其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基(halogenoamino)、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且
(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；
或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。
优选地，m为1。
当用作分析细胞和其它生物材料的染料时，这些化合物的至少一些具有许多优点。所述优点包括：
·水溶性，用于在与基于细胞的分析常用的等渗缓冲条件相容的一系列浓度范围方便地掺入分析。
·化学纯度和稳定性，用于在多重分析内可重现的使用并方便保存。
·红色/远红荧光性质，用于方便地掺入多参数分析中，该多参数分析具有很少有光谱重叠或不具有光谱重叠的可见范围荧光或橙色荧光，以容易与红色荧光一起使用。
·高亲和力核酸结合性质，用于需要分析有核细胞的应用。
·结合核酸后非-增强的荧光，其确保荧光发射强度与DNA结合程度之间的已知程度的化学计量。
·低内源荧光，其提供未结合的染料的背景荧光的相对降低，对比于核结合后增强的信号(归因于结合的分子的集中的浓度)。
·不渗透细胞的性质，用于选择性和正性染色具有受损的膜或不能排出染料分子的细胞。
·在固定的细胞中识别细胞核的性质，其用作所有有核细胞的直接DNA染料，并且通过成像或流式细胞仪或其它检测平台检测荧光发射。
·对完整的细胞的低毒性，其使得染料可以在生物应用期间与细胞共同培养延长的时间，而无有害作用，例如抑制增殖。
·上述性质的组合，其允许了时间相关性分析细胞完整性的丧失，所述细胞完整性通过将细胞与不渗透细胞的染料培养不同的时间进行监测，以及允许了不定期取样相同细胞群，用于检测细胞染色。
本发明提供了季铵化的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可尤其用作荧光染料。季铵化的氨基烷基氨基取代基存在于至少1位。其它季铵化的氨基烷基氨基取代基可以存在于4、5或8位，或其组合。国际公布WO91/05824和WO99/65992(将它们二者的全部内容在此引入参考)公开了多种类型的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可用作合成本发明化合物的前体。
优选地，X1、X2和X3中至少一个为NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m。在尤其优选的实施方式中，X2(而非X1和X3)为NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m，即在1,5位被季铵化的氨基烷基氨基取代的蒽醌。
在另一优选的化合物类型中，X1(而非X2和X3)为NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m，即在1,4位具有季铵化的氨基烷基氨基取代基的蒽醌。1,8取代的类似物也可能存在。
有利地，X1和X3均为羟基。
在其它优选的实施方式中，X1和X3均为氢。
优选地，R1为氢，尽管可能使用其中在该位置的氨基部分为叔胺的化合物。在这些实施方式中，优选R1为C1-4烷基。
优选R2、R3和R4为C1-4烷基。有利地，R2、R3和R4为甲基。
在优选的实施方式中，A为(CH2)2。
在一个特别优选的实施方式中，所述化合物为式(IA)：
另一优选的化合物为式(IB)：
通过以下列出的化合物与合适的反阴离子(例如碘)的组合提供了本发明化合物的具体实例。
1-{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1-{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1-{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1-{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}5,8二羟基蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}5,8二羟基蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}5,8二羟基蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三乙基氨基)乙基]氨基}5,8二羟基蒽-9,10-二酮
1-{[2-(三甲基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮碘化物
1,8-双{[2-(三甲基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三甲基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三甲基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1-{[2-(三乙基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三乙基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三乙基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三乙基氨基)丙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}蒽-9,10-二酮
1,5-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,4-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
1,8-双{[2-(三乙基氨基)丁基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮
本发明化合物可以包括任何合适的反阴离子。反阴离子的实例为卤离子，例如氯离子、溴离子和碘离子，来自无机酸和有机酸的生理学上可接受的阴离子，所述无机酸例如磷酸和硫酸，所述有机酸例如乙酸、抗坏血酸、苯甲酸、柠檬酸、富马酸、葡糖酸、羟乙基磺酸(isethionic)、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、氨基磺酸和酒石酸。
本发明化合物可以通过将氨基烷基氨基前体化合物季铵化为式(I)化合物而方便地制备。所述季铵化方法可以包括烷基化所述前体(例如使用烷基卤试剂)或经过使用合适的有机酸或无机酸形成酸加成盐而季铵化。之前讨论的国际公布WO91/05824和WO99/65992涉及的氨基烷基氨基蒽醌化合物可以用作合适的前体化合物进行季铵化步骤。合成所述前体化合物(其被季铵化为本发明化合物)的其它途径将对本领域读者显而易见。
本发明还涉及包括上述式(I)化合物以及生理学上可接受的稀释剂或载体的组合物。
根据本发明的第二方面，提供了包括核酸和式(I)化合物的荧光复合物，所述式(I)化合物为：
其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且
(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；
或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。
所述核酸可为DNA，并且所述DNA可以存在于细胞中。所述DNA可以存在于不完整的细胞中。
根据本发明的第三方面，提供了分析细胞或含有核酸的其它生物材料的样品的方法，其包括以下步骤：
a)制备含有式(I)化合物的生物相容的溶液：
其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且
(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；
或者其中基团NR1被季铵化的衍生物；
b)用生物相容的溶液处理细胞或其它生物材料的样品；以及
c)检测与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。
有利地，与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发所述式(I)化合物，并检测放射出的荧光信号。可以测量在预定光谱区域的荧光强度，尽管也可使用其它检测方案，例如测量荧光寿命。
或者，所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质可为色度性质(colorimetricproperty)。
有利地，所述方法可以用于识别细胞样品中的细胞核，其中进行步骤b)使得细胞核中的核酸与所述式(I)化合物结合，并且细胞核的识别至少部分地基于步骤c)中检测的光谱学性质。
可以进行步骤b)，以便用式(I)化合物染色所述细胞样品。有利地，所述方法可为监测其中细胞死亡增加(accruement)的方法，其中在分析期之前或期间进行步骤b)，以确保在分析期期间连续或频繁读出细胞死亡增加。式(IA)化合物尤其优选用于这些方法。该方法利用了本发明的不渗透化合物的无毒性。这意味着可能包括式(I)化合物与细胞混合物，使得测试期间存在式(I)化合物。由于细胞死亡(例如因分析中测试化合物的影响)，所述细胞被式(I)化合物染色。所述式(I)化合物可以在任何可以导致细胞死亡的处理之前、期间或之后加入。这允许了在可连续进行的测试期间取样。
步骤c)可以包括通过流式细胞仪、细胞内定位检测(通过荧光显微镜检查)，或任何其它合适类型的基于荧光的技术检测个体细胞发射出的荧光。可以应用成像技术。应当理解，在待分析样本或样品内可以应用大量成像系统以分析荧光信号，包括但不限于荧光强度、偏振、荧光寿命、荧光光谱，以及所述性质的空间排列(spatialdisposition)。
在一些优选的实施方式中，分析了固定的或渗透化处理的细胞，其中所述细胞样品通过用固定剂或渗透剂处理得以固定。在固定的和渗透化的细胞中的细胞核的识别和染色为尤其优选的实施方式。
在其它优选的实施方式中，步骤b)还包括用至少一种其它荧光染料或发光化合物处理所述样品，并且步骤c)还包括检测与荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。
可以与式(I)化合物有关的步骤b)和c)同时或分别地进行与其它荧光染料或发光化合物有关的步骤b)和c)。
在一个特别优选的实施方式中，所述方法识别完整的和不完整的细胞，其中所述式(I)化合物不渗透细胞，步骤b)还包括用第二荧光染料或发光化合物(其可渗透细胞)处理所述样品，并且步骤c)还包括检测与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，其中与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在不完整的细胞相关联，并且与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在完整的细胞相关联。
理解不完整的细胞包括死细胞，以及具有受损的或破裂的膜的损伤的细胞。
有利地，所述第二荧光染料或发光化合物具有与在识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合潜能(其优选地，而非必须，与结合亲和力有关)，所述结合能力低于式(I)化合物的结合能力，并因此在式(I)化合物的存在下，较不有效地竞争结合识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述第二荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被式(I)化合物掩蔽(masked)。
在损伤的细胞中所述第二荧光染料或发光化合物被式(I)化合物的完全排除，提供了基于荧光发射的双重分析的最佳识别。此外，来自所述第二荧光染料或发光化合物的荧光信号在最佳标记有式(I)化合物的损伤的细胞中有效地消除，但是也可以通过简单改变式(I)化合物与所述第二荧光染料或发光化合物的比例而可以在衰减的水平得以检测，这提供了对通过上述的共同染色条件范围获得的荧光的比例分析。优选地，式(I)化合物与所述第二荧光染料或发光化合物的化合物摩尔比可为1:10至10:1的范围，更优选3:20。优选地，唯一报道存在所述第二荧光染料或发光化合物的完整的细胞的染色提供了测定细胞状态的有价值的额外信息，包括，但不限于：与总染料结合有关的细胞生物量，以及存在细胞内核酸作为有核细胞的正荧光识别物。优选地在发生长期增殖抑制或细胞周期停止的细胞分析中，细胞生物量变化的优选指征允许了在继续代谢发展的细胞之间进行区分，而不干预细胞分裂。
优选地，所述第二荧光染料或发光化合物为式(II)化合物：
或其N-氧化物衍生物；
其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2和R3独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；且
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3、卤代氨基、C1-4烷基氧基或C2-8烷酰基氧基。
在优选的实施方式中，所述式(II)化合物为1,5氨基取代的蒽醌，即X2为NR1-A-NR2R3但X1和X3不为NR1-A-NR2R3。
该类型的1,5氨基取代的蒽醌的尤其优选的实施方式为式(IIA)化合物：
有利地，完整的和不完整的细胞的识别在细胞样品暴露于为潜在毒性或者能够诱导细胞死亡的试剂后进行，以便监测所述试剂对细胞样品的影响。
在另一优选的实施方式中，步骤b)还包括用至少第三荧光染料或发光化合物处理所述样品，并且步骤c)还包括检测与至少所述第三荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，并将所述光谱学性质与完整的细胞和/或不完整的细胞的特征或性质关联。
检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质可与检测的所述式(I)化合物的光谱学性质相似，并且不同于检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与完整的细胞的特征或性质有关。
检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质可以与检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质相似，并且不同于检测的所述式(I)化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与不完整的细胞的特征或性质有关。
优选地，步骤c)中检测的光谱学性质为在电磁波谱的预定区域中的发射出的荧光，并且步骤c)包括用电磁辐射激发所述式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三以及任何其它荧光染料或发光化合物。
有利地，所述式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三荧光染料或发光化合物被单一来源的电磁辐射共同激发。
有利地，所述第三荧光染料或发光化合物的发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域，其i)与所述式(I)化合物的发射出的荧光的区域相似，优选位于红色和/或近IR区域，并且ii)不同于所述第二荧光染料或发光化合物的发射出的荧光的区域。所述第三荧光染料可为Qdot705nm发射纳米晶体。
有利地，所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域，其i)与所述第二荧光染料或发光化合物发射出的荧光的区域相似,优选位于橙色区域，并且ii)不同于所述式(I)化合物发射出的荧光的区域。
在其中所述方法识别完整的和不完整的细胞的实施方式中，步骤c)可以使用流式细胞仪，和或使用荧光显微镜进行，以提供荧光发射的细胞定位的信息。应当理解，在待分析的样本或样品内，大量成像系统可以应用于分析荧光信号，包括但不限于荧光强度、偏振、荧光寿命、荧光光谱，以及所述性质的空间排列。
步骤c)还包括测量来自细胞的光散射。然而，有用的结果也可以不需要进行光散射测量而获得。
可以进行长时间测量，以获得时间分辨点(timeresolveddate)，例如用于检查细胞完整性的累积的(accrued)变化或用于检查识别的完整细胞中的变化，如通过与存在所述第二和/或第三荧光染料或发光化合物有关的特性测得。
根据本发明的第四方面，提供了识别完整的和不完整的细胞的方法，包括以下步骤：
a)制备含有不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的生物相容的溶液；
b)制备含有渗透细胞的荧光染料或发光化合物的生物相容的溶液，该荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力(其优选地，而非必须地，与结合亲和力有关)，所述结合能力低于所述不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的结合能力,并因此在不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的存在下，较不有效地竞争结合至识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述渗透细胞的荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被不渗透细胞的荧光染料或发光化合物掩蔽；
c)用所述的一种或多种生物相容的溶液处理细胞样品；且
d)检测与不渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与不完整的细胞的存在关联，并检测与渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与完整的细胞的存在关联。
除了上述讨论的渗透细胞的染料外，可以使用以下染料作为渗透细胞的荧光染料或发光化合物(‘数字/数字’表示最大激发对比最大发射的波长，以nm计)：
亲和力比SYTOX染料低而且能够进入活细胞的渗透细胞的花青染料(SYTO核酸染料)优选但不限于40蓝荧光核酸染料、59红荧光核酸染料、60红荧光核酸染料、61红荧光核酸染料、62红荧光核酸染料、63红荧光核酸染料、64红荧光核酸染料、蓝色核酸染料、40蓝荧光核酸染料、41蓝荧光核酸染料、42蓝荧光核酸染料、45蓝荧光核酸染料、80橙色荧光核酸染料、81橙色荧光核酸染料、82橙色荧光核酸染料、83橙色荧光核酸染料、84橙色荧光核酸染料、85橙色荧光核酸染料、橙色核酸染料、10绿色荧光核酸染料、9绿色荧光核酸染料、BC绿色荧光核酸染料、蓝色死细胞染料、绿色核酸染料、21绿色荧光核酸染料、24绿色荧光核酸染料、25绿色荧光核酸染料、11绿色荧光核酸染料、12绿色荧光核酸染料、13绿色荧光核酸染料、14绿色荧光核酸染料、16绿色荧光核酸染料，以及17红荧光核酸染料。
DAPI：UV可激发的DNA结合荧光染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐(DAPI)(Ex358/Em46)或4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸盐(DAPI，二乳酸盐)
小沟结合Hoechst染料优选但不限于Hoechst34580、Hoechst33258(双-苯甲亚胺)，作为五水合物，其为蓝荧光(Ex352/Em461)AT-选择性的、小沟-结合dsDNA-选择性荧光染料、Hoechst33342：作为三盐酸盐、三水合物，其为蓝荧光(Ex350/Em461)AT-选择性的、小沟-结合dsDNA-选择性结合
LDS751为核酸染料：(Ex543/Em712)(DNA)(Ex590/Em607)(RNA)
7-氨基放线菌素D(7-AAD；Ex546/Em647)
吖啶橙，其显示对细胞的异染性染色，对RNA具有偏向红色的发射且对DNA具有偏向绿色的发射
除了上面讨论的不渗透细胞的染料，还可以使用以下染料作为不渗透细胞的荧光染料或发光化合物(‘数字/数字’表示最大激发对比最大发射的波长，以nm计)：
TOTO家族花青二聚体染料的花青二聚体，优选但不限于碘化物(514/533)、碘化物(515/531)、碘化物(642/660)
TO-PRO家族染料的花青单体，优选但不限于YO-PRO-1(Ex491/Em509)、TO-PRO-1(Ex515/Em531)、碘化物(642/661)、碘化物(745/770)、碘化物(491/509)、碘化物(491/509)、碘化物(612/631)、碘化物(612/631)。
核酸SYTOX染料，优选但不限于SYTOX蓝(Ex445/Em470)、SYTOX绿(Ex504/Em523)和SYTOX橙(Ex547/Em570)。
碘化丙啶(PI；Ex530/Em625)和不渗透细胞的溴化乙啶(EthBr；Ex518/Em605)
7-氨基放线菌素D(7-AAD；Ex546/Em647)
吖啶橙，其对细胞异染性染色，对RNA具有偏向红色的发射且对DNA具有偏向绿色的发射。
应当理解，大量检测系统可用于分析使用本发明获得的不同荧光信号，包括但不限于荧光强度、偏振、荧光寿命、荧光光谱。还应当理解，在待分析的样本或样品内，细胞成像方法还可以提供所述性质的空间排列和动态分析。
根据本发明的第五方面，提供了用于根据本发明的第三或第四方面的方法的检测系统，所述系统包括：
一个或多个电磁辐射源，其用于激发在所述方法中使用的荧光染料和发光化合物；
多个检测器，其用于检测与荧光染料和发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质；和
检测器分析系统，其适于将检测的光谱学性质与完整的和不完整的细胞的存在关联，因此识别完整的和不完整的细胞。
优选地，所述检测器为荧光检测器。
极其有利地，所述检测系统可以具有单一来源的电磁辐射，用于共同激发荧光染料和发光化合物。
极其有利地，多个检测器为一对检测器的形式，其检测所有荧光染料和发光化合物的光谱学性质。
本发明还应用于在多种细胞类型和应用中研究细胞完整性。当在本文提及细胞或细胞类型时，优选所述细胞或细胞类型为活的真核细胞。本发明可以与所有细胞类型组合使用。所述细胞可以选自但不限于以下细胞类型：
动物细胞，包括人和哺乳动物细胞，其来自活组织检查样本(例如，通过细针抽吸)、组织外植体、原代培养物(例如，人皮肤成纤维细胞)、转化细胞系(例如，SV40转化成纤维细胞)、永生化细胞系(例如，用人端粒酶逆转录酶[hTERT]永生化的细胞系)或确立的肿瘤细胞系。
植物细胞和细菌细胞。
人肿瘤细胞系，包括代表治疗、诊断和分析目标的具体位点和疾病的那些细胞系，优选能够表明在基底上贴壁生长的那些细胞系，例如：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞癌)、白血病、肺癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(非-黑素瘤)、甲状腺癌。此外，对于药物筛选方法目的常规可获得的人肿瘤细胞系，例如USNationalCancerInstitute肿瘤细胞系组NCI-60中指出那些细胞系(参考：http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html)：
根据对具体分子实体的功能性表达选择的人肿瘤细胞系，所述具体分子实体例如异型生物质分子的转运子(例如，在肺癌细胞系H522M、A549和EKVX中表达的ABCA3药物转运子)，以及因在基因转移研究中的方便进行而选择的人肿瘤细胞(例如，U2-OS人骨肉瘤细胞)。
在功能基因组研究中使用的哺乳动物细胞系(例如，NIH3T3鼠类细胞系)
脊椎动物的单细胞形式(例如，胚胎的组分、幼虫形式或源自斑马鱼[Brachydanio]的分散的细胞制品的细胞)。
用于ADME/Tox(吸收、分布、代谢、消除/毒性)筛选方案的细胞系(例如，肝细胞衍生的细胞系，例如HepG2)。
来自人或鼠来源的胚胎干细胞。
成体干细胞
中枢神经系统的神经元和/或支持细胞(例如星形细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和Schwann细胞).
永生体细胞杂种，包括分泌抗体的杂种(例如杂交瘤)。
干细胞对比非-干细胞
有核细胞血液成分
衰老的、非-衰老的、粘附的、非-粘附的、静止的以及非-静止的细胞。
应用可以选自但不限于以下研究领域：
由于细胞的生理学改变(例如，分化或生长期的改变)导致的细胞完整性的改变。
由于细胞响应于疾病过程的改变导致的细胞完整性的改变。
传染物(包括细菌和病毒)诱导的细胞完整性的改变。
寄生虫诱导的细胞完整性的改变。
由于细胞响应于物理因子(例如，电离和非-电离辐射)的改变导致的细胞完整性的改变。
由于掺入光学活性物理因子(例如，携带量子阱的纳米颗粒)或有色染料导致的细胞完整性的改变。
由于细胞响应于已知的或未知的生物活性剂而改变导致的细胞完整性的改变，用于以下目的：
细胞完整性的改变，其作为环境感知毒素(例如，重金属污染)的监测。
纳米颗粒毒性的细胞完整性的改变，其具有以下优点：携带毒性颗粒负载的细胞可以与荧光染料位于同一位置（co-located），用于使用电子显微镜或其它高分辨率成像方法进行明确的分析。
用于检测毒素的细胞完整性的改变(例如，生物安全性的内毒素感知)。
用于检测毒性或有害物质的细胞完整性的改变，用于安全监测目的和快速诊断。
用于监测发酵过程的进程的细胞完整性的改变(例如，酿造应用中的酵母生命周期)。
用于监测生物药物制备过程的进程的细胞完整性的改变(例如，细胞因子生产)。
用于识别与细胞死亡有关的状态转换(凋亡或坏死)的细胞完整性的改变。
用于在生理和病理系统中分析细胞周期进程的细胞完整性的改变。
药效学响应的分析，用于药物筛选或发现目的。
细胞完整性的改变，其用于研究调节细胞结构和功能的细胞系统，因为它们在内部程序的影响下或在干扰剂(例如，细胞骨架或染色质调节剂)的强迫下发生状态改变。
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虽然已经在上面公开了本发明，但是扩展至任何上述特征，或以下说明书、附图或权利要求的发明组合。例如，本发明的一个方面的要素可以掺入本发明的另一方面的要素中。
现将参考附图说明本发明的化合物、荧光复合物、方法和检测系统的实施方式，其中：
图1为(a)许多染料、(b)式(IIA)化合物和(c)式(IA)化合物的激发图和荧光光谱；
图2为使用本发明的渗透细胞的染料和不渗透细胞的染料组合连同(a)活细胞和(b)死细胞获得的荧光图；
图3为各种多色染料组合的荧光谱图，其基于本发明的渗透细胞的染料/不渗透细胞的染料的组合，具体(a)在活细胞中显示三参数、两色检测方案，(b)对死细胞显示三参数、两色检测方案，以及(c)显示多色检测方案；
图4为从使用式(IA)化合物和膜联蛋白V组合的检测系统获得的荧光图；
图5为从使用式(IA)化合物/化合物(IIA)染料组合的检测系统获得的荧光图；
图6为从两色三荧光染料检测系统获得的荧光图；
图7为从三色四荧光染料检测系统获得的荧光图；
图8显示了式(IA)化合物的吸光度和发射光谱；
图9显示了从使用膜联蛋白V-FITC与(a)碘化丙啶(PI)（其中PI荧光强度显示为对数尺度）、(b)式(IA)化合物(其中式(IA)化合物的荧光强度显示为线性尺度)，以及(c)式(IA)化合物(其中式(IA)化合物的荧光强度显示为对数尺度)的组合的实验中获得的荧光；
图10显示了使用式(IA)化合物对固定的U-2OS人骨肉瘤细胞的显著核染色；
图11显示了使用式(IA)化合物对具有受损的膜的细胞的染色；
图12显示了培养人B细胞淋巴瘤细胞的效果，其揭示了式(IA)化合物的低毒性；
图13显示了在响应于星形孢菌素的人Jurkat细胞死亡中的早期细胞死亡和相应的线粒体和质膜完整性的丧失；以及
图14显示了用共靶向荧光探针化合物(IA)(死细胞)和化合物(IIA)(活细胞)组合追踪细胞状态。
本发明提供了使用可渗透染料和不可渗透染料的组合标记活细胞和死细胞的方法。这种染料的组合可以基本上相互排斥，意味着可渗透染料的检测可以与活细胞的存在有关，且不渗透细胞的染料的检测可以与死细胞的存在有关。该原理示于下面的表1：
细胞状态 染料B渗透的 染料A不渗透的
活的 + -
死的 - +
表1.通过检测渗透细胞的染料/不渗透细胞的染料正标记活/死细胞。
因此，本发明提供了将活细胞与来自渗透细胞的染料的荧光联系起来的能力，以及将死细胞与来自不渗透细胞的染料的荧光联系起来的能力，因为染料之间存在很少或不存在“跨通道”干扰。应当理解，这提供了进行多个有利的两色、两种-荧光染料实验的机会。此外，本发明者已经意识到该类型的染料组合还提供使用一种或多种其它荧光染料进行大量有利的实验的平台。表2显示了该类型的检测系统的非限制性实例，其关于式(IIA)化合物/式(IA)化合物的具体的渗透细胞的/不渗透细胞的染料的组合。
表2.荧光探针的实例，所述荧光探针可以与渗透细胞的染料/不渗透细胞的染料的组合一起使用并预测正或负染色方式。
现将参考图1至9更详细地公开这些可能的检测系统和其它检测系统。图1以一般术语(即图表地)显示了式(IIA)化合物(B)的激发和荧光光谱(Ex/Em峰位于518/615nm)，以及式(IA)化合物(A)的激发和荧光光谱(Ex/Em峰在620/660nm)。因此，式(IIA)化合物的荧光通常在可见光谱的橙色部分，而化合物(IA)的荧光通常在可见光谱的远红外部分。图1b显示了式(IIA)化合物单独的荧光光谱。式(IIA)化合物为渗透细胞的染料，因此预期荧光标记B将与活细胞或死细胞有关。图1c显示化合物(IA)单独的荧光标记A。化合物(IA)为不渗透细胞的染料，因此荧光标记A仅观察到与死细胞或死亡中的细胞有关而非活细胞。图2a显示当渗透细胞的染料(例如式(IIA)化合物)与不渗透细胞的染料(例如化合物(IA))的某种组合与活细胞结合使用时获得的荧光。如可能预期到的，仅观察到与渗透细胞的染料有关的荧光标记B。图2b显示了当使用渗透细胞的/不渗透细胞的染料的一些组合(例如式(IIA)化合物/化合物(IA)的组合)时，本发明提供的完全令人惊奇的效果。可能预期到观察到的荧光的显著贡献将源自式(IIA)化合物染料。然而，已经发现对于死细胞，观察到很少或没有荧光来自式(IIA)化合物染料。相反，所有或实际上所有观察到的荧光是由于不渗透细胞的染料，化合物(IA)。因此，化合物(IA)染料表现出抑制(quench)式(IIA)化合物信号。非常有趣的是，式(IIA)化合物信号的所述抑制表现为跨域整个细胞而发生，而非只在细胞核中。不希望受限于任何具体理论，认为本发明提供的令人吃惊的抑制效果可能是由于不渗透细胞的染料对死细胞中的核酸和可能的其它大分子材料具有结合亲和力，该结合亲和力高于渗透细胞的染料。然而，其它机理也可能起作用。结果是，可能提供“交通灯”系统用于指示细胞的状态，其中在一个光谱区域A的荧光与死细胞有关，而且在另一光谱区域B的荧光与活细胞有关。
该系统的一个有用的结果在于可以在光谱区域A和B使用两色检测提供第三检测通道。图3显示了如何可提供涉及具体的渗透细胞的/不渗透细胞的染料组合式(IIA)化合物/化合物(IA)的三通道、两色检测系统的一些实例。图3a显示了使用光谱范围A和B在活细胞中检测的荧光。在范围B的荧光与来自式(IIA)化合物的发射有关，如前所述。在该方案中，式(IIA)化合物与化合物(IA)以及另一种红色染料或发光剂组合使用，该另一种红色染料或发光剂优选与完整细胞相关，例如Qdot705nm发射纳米晶体。该系统探索了如下事实，提供正的式(IIA)化合物信号的细胞在红色区域不展示信号（由于化合物(IA)），并且可以肯定地鉴定为活细胞。本发明了解到活细胞(其已经在橙色区域以此方式经式(IIA)化合物荧光“标记”)在红色区域A具有潜在的检测通道，其不受化合物(IA)发射的干扰。图3b描述了如下检测方案：其探索了在橙色区域B的死细胞中潜在的检测通道的存在，其在基本不受式(IIA)化合物荧光的干扰。如图3b所示，化合物(IA)荧光在红色光谱区域A的存在有效地“标记”细胞为死细胞。如果使用了第二橙色染料，则可以获得例如图3b所示的荧光光谱，其中所述第二橙色染料可以用于提供关于死细胞的进一步的信息。非常容易使用该类型的三荧光染料、两色检测系统，因为使用相对简单的检测系统即可提取大量信息。然而，本发明包括使用多色染料组合，其在电磁波谱的多于两个区域利用荧光。图3c描述了普通的多色染料荧光方案，其中使用一种或多种在不同于光谱区域A和B的光谱区域发出荧光的染料。
图4显示可从利用化合物(IA)与膜联蛋白V测试(例如膜联蛋白V-FITC，其在绿色光谱区域发出荧光)的组合的检测系统获得的结果。该染料组合提供了对细胞死亡的阶段以及凋亡的增强的识别。如图4所示，低的化合物(IA)/低的膜联蛋白V信号指示正常细胞。通过增加的膜联蛋白V信号与低的化合物(IA)信号的组合指示凋亡的细胞。通过同时存在高的膜联蛋白V信号和受限制的化合物(IA)信号指示细胞死亡的开始。通过包括低的膜联蛋白V信号和高的化合物(IA)信号的通道提供了其它识别，其指示细胞细胞残骸。
图5为与图4所示相同的基本类型的图，其在本情况下在利用式(IIA)化合物/化合物(IA)染料组合的检测系统中显示了荧光强度。再次，在细胞进展至细胞死亡中观察到识别的水平。更特别地，当报道了低的化合物(IA)荧光信号时，可以鉴定三种不同的“通道”。对式(IIA)化合物在橙色区域的正信号与低的化合物(IA)信号的组合指示正常细胞，而增强的式(IIA)化合物信号指示阻滞的细胞。请注意，化合物(IA)和式(IIA)化合物二者的负信号指示细胞残骸。正化合物(IA)信号组合负的式(IIA)化合物信号指示死细胞。本领域读者思考图5后将理解潜在地可用两种其它通道，即高红色信号与高橙色信号或增强的橙色信号的组合。由于所述高或增强的橙色信号与活细胞的存在有关，因此不可能获得高化合物(IA)信号与这些橙色信号的组合。事实上，可能利用在红色区域发出荧光的第三荧光染料(例如Qdot705nm发射纳米晶体)，用于提供两色、三荧光染料分析系统。该系统的一个优点在于可用使用单一激光色彩激发所有的三种荧光染料，例如使用来自Ar-离子激光器的488nm辐射。
图6为与图5所示相同的基本类型的图，其描述了使用Qdot705nm发射纳米晶体组合化合物(IA)和式(IIA)化合物的两色、三荧光染料分析系统。可以看出，在两种通道中观察到来自Qdot纳米晶体的在红色光谱区域的荧光，其由于不存在源自活细胞的化合物(IA)荧光而实现。
图7显示了从基于式(IIA)化合物/化合物(IA)的渗透细胞的/不渗透细胞的染料组合的三色系统获得的结果。在该实施方式中，使用了在光谱的红色区域发出荧光的第三荧光染料(例如Qdot705nm发射纳米晶体)，用于通过检测式(IIA)化合物荧光探测已经正标记的活细胞。此外，还使用第四荧光染料(例如膜联蛋白V-FITC)，其在光谱的绿色区域进行检测。该检测设置的特征可为双激光三色四荧光染料分析技术。如图7所示，可以使用三坐标系呈现可以从该系统获得的结果，以表示在三色范围获得的荧光。因此，获得的结果可以关于数据的三维体积理解，其在细胞从正常状态经凋亡和细胞死亡的进展中提供增强水平的识别。尤其是，低的化合物(IA)信号、增强的式(IIA)化合物信号和高的膜联蛋白V-FITC信号的组合指示阻滞的和凋亡的细胞二者，而高的化合物(IA)信号、低的式(IIA)化合物信号和高的膜联蛋白V-FITC信号的组合指示死细胞。可以看出，该系统可以提供大量关于细胞过程的信息。应当注意，所有细胞均出现在图7描述的检测体积中。可以进行合适的多色分析，以便解释结果。可以使用荧光染料的其它组合，以便提供不同的或进一步程度的识别和信息。原则上，仍可以利用其它荧光染料，以便提供其它信息。其它荧光染料可在不同的光谱或区域发出荧光，以便提供额外的颜色通道，或者可能地，可以使用在橙色或绿色光谱区域发出荧光的荧光染料，只要所述额外的荧光染料的检测特性不干扰式(IIA)化合物或膜联蛋白V-FITC检测通道。可以使用绿色和/或青色染料，以便追踪细胞变化过程。
实施例1.式(IIA)化合物[1,5-双{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮]和式(IB)化合物[1,5-双{N-[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮碘化物]的合成
根据WO99/65992的实施例1合成1,5-双{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮。将氯仿(2mL)加入1,5-双{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}蒽-9,10-二酮(58mg,0.152mmol)中。向该深紫色的溶液中加入MeCN(1mL)，然后加入碘甲烷(95μl,1.524mmol)。搅拌10分钟后，形成沉淀。搅拌4小时后，将挥发物蒸发。将残余物在氯仿(5ml)中研磨，通过过滤收集，并用二氯甲烷(20ml)和乙醚(10ml)洗涤。分离得到深粉色固体(0.09g,0.135mmol,89%产率)。1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ：9.69(2H,t),7.72(2H,dd),7.52(2H,dd),7.30(2H,dd),3.91(4H,q),3.62(4H,t),3.18(18H,s)。
实施例2.式(IA)化合物[1,5-双{[2-(三甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮碘化物]的合成
根据WO99/65992的实施例1合成1,5-双{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮。将氯仿(2mL)加入1,5-双{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-5,8-二羟基蒽-9,10-二酮(44mg,0.107mmol)中。向该深紫色溶液中加入MeCN(2mL)，然后加入碘甲烷(66.6μl,1.067mmol)。搅拌1分钟后形成沉淀。搅拌4小时后，将挥发物蒸发。将残余物在氯仿(5ml)中研磨，通过过滤收集，并用二氯甲烷(20ml)和乙醚(10ml)洗涤。分离得到深蓝色固体。产出=173-012(0.05g,0.068mmol,63.9%产率)。1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ：13.97(2H,s),9.77(2H,brt),7.49(2H,d),7.40(2H,d),3.96(4H,brq),4.09(4H,t),3.19(18H,s)。
实施例3.化合物(IA)的光谱性质
使用实施例2所述原理合成化合物(IA)并保存在+4°C作为5mM化合物(IA)稀释于缓冲液中的储备溶液。吸光度光谱使用光谱仪和试剂溶解于PBS的20μM溶液获得，并在1cm路径的硅石英比色皿中测量。通过在633、589、534、488nm激发测定20μM化合物(IA)的溶液在1cm路径长度半微量石英比色皿中的荧光光谱。在狭缝宽度设定为10nm的PerkinElmerLS50荧光分光光度计上进行荧光测量。所述荧光分光光度计配备有红色-灵敏的光电倍增管(R928型；HamamatsuPhotonicsKK,Japan)。积累数据并导出至电子数据表中，以校正缓冲液对照并测定最大发射。结果示于图8。化合物(IA)可以被从488nm(在流式细胞仪中)到高达647nm(Exλmax646nm)的波长次最优化地激发。典型地，对于细胞成像，在633nm或647nm波长进行激发。发射光谱独立于激发波长，即，所有发射光谱均相同，不论激发波长。
实施例4.在诱导细胞死亡的膜联蛋白V测试中，应用化合物(IA)的不渗透细胞的性质区分活细胞和死细胞
该实施例涉及与磷脂酰丝氨酸分子从人B细胞淋巴瘤(DoHH2)细胞(其已经暴露于细胞毒性药物(VP-16))中的质膜内部(细胞质)小叶易位有关的晚期细胞死亡。使用流式细胞仪进行剂量依赖性诱导凋亡的检测。
我们已寻求证明化合物(IA)作为细胞活力标记的应用，该标记根据细胞增强的膜渗透性（由于依托泊苷(VP-16)诱导的凋亡）测定无活力的部分，其包括使用深红色荧光探针区别于其它常用荧光染料的光谱优点（通过使用选择性激发）。
化合物IA能够以与碘化丙啶相似的准确性检测无活力的部分。该部分显示随着依托泊苷的剂量增加而剂量依赖性增加。进行了定时的摄取以优化化合物(IA)标记。还进行了剂量改变以测定化合物(IA)的优化浓度。
试剂
VP-16(VP-16-213；VEPESID；依托泊苷)提供为34mM储备溶液(BristolMeyersPharmaceuticals,Syracuse,NY)并保存在4°C。结合荧光素的膜联蛋白V(膜联蛋白V-FITC)购自Pharmingen(BectonDickinsonUK,Oxford,UK.)。碘化丙啶(PI)获得为1mg/ml水溶液(MolecularProbesEurope,Leiden,TheNetherlands)。将化合物(IA)在水中配制为5mM溶液并保存在4°C。
细胞培养和药物处理：将人滤泡B-淋巴瘤细胞系用于本研究。DoHH2获赠自DrJCKluin-Nelemans[Leiden,TheNetherlands]。将DoHH2常规维持在补充有5%FCS和100Uml-1青霉素、100μgml-1链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。将细胞每周传代两次，开始密度为5×104细胞ml-1，培养在37°C增湿的5%CO2/95%空气的气氛中。将细胞暴露在VP-16剂量范围(0-2.5μM)，以诱导凋亡[PaulJ.Smith,MarieWiltshire,SharonDavies,Suet-FeungChin,AnthonyK.Campbell,andRachelJ.Errington(2002).DNAdamage-induced[Zn2+]itransients:correlationwithcellcyclearrestandapoptosisinlymphomacells.AmJPhysiolCellPhysiol283(2):609-622]。将人Jurkat细胞以相似方式培养。
用于膜联蛋白-V标记的样品制备；制备样品用于检测表面结合至发生凋亡变化的细胞的膜联蛋白V-FITC，并用PI或化合物(IA)共同染色，以检测质膜完整性的丧失。根据Vermes等制备样品。简言之，将细胞样品(4x105细胞/ml)用冷的PBS洗涤，并以2x105细胞/ml的浓度再次悬浮在1X结合缓冲液(10mMHepes/NaOH，pH7.4、140mMNaCl、2.5mMCaCl2)中。对于每份样品，将100μl该溶液转移至聚苯乙烯圆底流量管(Falcon)中，根据需要向其中加入5μl膜联蛋白V-FITC和10μlPI(50μg/ml储液)。必要时假处理对照样品。轻轻搅拌样品，然后在暗处在室温培养15分钟。加入400μl的1X结合缓冲液至各个管中，并将样品保持在冰上最长1小时，然后通过流式细胞仪分析。
流式细胞仪：使用FACSVantage流式细胞仪(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,CA)，其配备具有488nm和多线UV(351-355nm)输出的CoherentEnterpriseII氩离子激光器(Coherent,Inc.,SantaClara,CA)。将EnterpriseII激光器的功率调节至30mW(在多线UV输出上监测)。使用CELLQuest软件(BectonDickinsonImmunocytometrySystems)进行信号采集和分析。获得了线性模式的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。以对数模式在光电倍增管(其检测通过滤光片光谱性选择的发射)中检测源自488nm激发的FITC和PI荧光信号；以对数或线性模式检测源自488nm激发的化合物(IA)信号，但也可使用方便地掺入光学系统的第三激光器在633nm激发后检测。同时以对数或线性模式检测源自488nm激发的式(IIA)化合物信号。使用前向光散射参数作为主要信号，对10,000个细胞收集前向和侧向散射和荧光的信号。改善荧光信号的脉冲分析和荧光补偿设定以在本领域容易理解的多荧光染料组合中改进细胞亚群的识别。数据表示为平均荧光强度(FI)值，并示于图9中。
实施例5.通过荧光显微镜检测的式(IA)化合物对固定的U-2OS人骨肉瘤细胞的显著核染色。
我们已寻求化合物(IA)有效靶向核DNA的性质。
细胞培养：在补充有10%胎牛血清(FCS)、1mM谷氨酰胺和抗生素的McCoy's5a培养基中培养人骨肉瘤细胞U-2OS(ATCCHTB-96)细胞(粘附的)，并在5%CO2的空气气氛中在37℃培养。对于荧光成像实验，在盖玻片下面的腔室(Nunc,2WellLab-TekII,FisherScientific)中将细胞以1x105细胞ml-1的密度生长为单层。
成像：24小时后，将细胞用在PBS中的4%多聚甲醛固定，在室温持续15-30分钟。不需要清洗步骤。将化合物(IA)在任何处理后以适于最终染色操作的方式使用。将20μM化合物(IA)直接加入粘附细胞的0.5mlPBS覆盖物中。使用宽视野荧光显微镜直接观察细胞。将腔室放在Axiovert100显微镜(CarlZeiss,WelwynGardenCity,UK并使用40x、1.3NA油浸平面复消色差透镜(oilimmersionplanapochromatlens))上。使用ORCA-ERCCD照相机(Hamamatsu,Reading,UK)和MetaMorph(MDS,USA)采集软件拍摄荧光图像(Ex：620/60nm；Em700/75nm)。细胞显示出高浓度的化合物(IA)在核中聚集。使用简单阈值算法将核的化合物(IA)染色分段（segmented），该算法描述该核并且提供各核(对象)定位的二元或掩模信息（maskinformation）。显示了原始和分段后化合物(IA)的核定位。结果示于图10。
实施例6.式(IA)化合物对具有受损的膜的细胞的染色允许了通过负染色完整的细胞进行识别。
该实施例显示了在流式细胞仪分析的人Jurkat细胞群中通过星形孢菌素诱导的细胞死亡的分析。我们已寻求证明化合物(IA)作为细胞活力标记的应用，其测定由于细胞增强的膜渗透性（星形孢菌素诱导的死亡导致）而产生的无活力的部分。
细胞培养和药物处理：将Jurkat细胞系用于本研究。将Jurkat培养物常规维持在补充有10%FCS和100Uml-1青霉素、100μgml-1链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。将细胞每周传代两次，开始密度为5×104细胞ml-1，培养在37°C增湿的5%CO2/95%空气的气氛中。将细胞设定在0.5x105细胞/ml，5ml每瓶。在标准培养条件下，将细胞暴露在0和2μM星形孢菌素中24小时，以诱导细胞死亡。将来自5mM储备溶液的化合物(IA)(3μM)加入至各个样品中，并通过流式细胞仪分析。
流式细胞仪：使用FACSVantage流式细胞仪(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,CA)，其配备具有488nm和多线UV(351-355nm)输出的CoherentEnterpriseII氩离子激光器(Coherent,Inc.,SantaClara,CA)。将EnterpriseII激光器的功率调节至30mW(在多线UV输出上监测)。使用CELLQuest软件(BectonDickinsonImmunocytometrySystems)进行信号采集和分析。获得了线性模式的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。以对数模式在FL3695LP检测源自488nm激发的化合物(IA)荧光信号。使用前向光散射参数作为主要信号，对10,000个细胞收集前向和侧向散射和荧光的信号。数据表示为化合物(IA)的荧光强度(695LP)相对前向散射信号的等高线图，以指明细胞大小。结果示于图11。
实施例7.用式(IA)化合物培养人B细胞淋巴瘤(SU-DHL-4)细胞的效果证明了不渗透细胞的染料的低毒性，指示了用于掺入长期活细胞培养研究(其测定与给定处理有关的细胞死亡的自然增长(accrual))的有利的性质。
细胞培养和处理：将人滤泡B-淋巴瘤细胞系用于本研究。将SU-DHL-4常规维持在补充有10%FCS和100Uml-1青霉素、100μgml-1链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。将细胞每周传代两次，开始密度为5×104细胞ml-1，培养在37°C增湿的5%CO2/95%空气的气氛中。将细胞设定在0.5x105细胞/ml，5ml每烧瓶。在标准培养条件下，将各个培养物连续暴露在三种化合物(IA)剂量(0、3和10μM)之一中96小时。在时间(t)0、24、48、72和96小时，通过Coulter从各个烧瓶计数0.4ml样品而测定细胞密度。数据表示为对于给定浓度的化合物(IA)，对比时间(小时)的相对细胞数量增加(Nt/N0)(695LP)。结果示于图12中。
实施例8.与丧失线粒体膜电位(响应于凋亡诱导剂星形孢菌素)有关的人Jurkat细胞死亡的早期。
将优选的不渗透细胞的染料(式(IA)化合物)掺入至典型的使用其它荧光试剂的多参数分析中，所述荧光试剂具有感兴趣的报道细胞完整性的丧失的性质，并具有共同掺入分析的优点，以提供区分完整的和损伤的细胞的方法。
在该实施例中，染料JC-1(5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑-羰花青碘化物)为掺入线粒体膜的亲脂性荧光阳离子，其中其可以由于生理性维持线粒体膜电位而形成聚集物。聚集改变了JC-1的荧光性质，导致由绿色偏移至橙色荧光。流式细胞仪或成像用于监测橙色荧光的降低和绿色荧光的增加，使得凋亡的细胞与非-凋亡的细胞得以区分。此处另外掺入具有红色而非橙色荧光性质的优选的不渗透细胞的染料使得已经处于细胞死亡的晚期(与膜完整性的丧失有关)的那些细胞共同识别，其提供了之前达不到的对细胞的死亡阶段更细的分辨。
细胞培养和药物处理：将Jurkat细胞系用于本研究。将Jurkat培养物常规维持在补充有10%FCS和100Uml-1青霉素、100μgml-1链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。将细胞每周传代两次，开始密度为5×104细胞ml-1，培养在37°C增湿的5%CO2/95%空气的气氛中。对于所述分析，将细胞设定在0.5x105细胞/ml，每孔1ml。将细胞暴露在0(对照条件)和1μM星形孢菌素中4小时。将细胞洗涤，并暴露在JC-1(RPM)中。将来自5mM储备溶液的化合物(IA)(3μM)加入至各个样品中。然后将其通过流式细胞仪分析或放置在Nunc,2WellLab-TekII(FisherScientific)中并通过三通道共焦显微镜分析。
星形孢菌素处理的细胞的多参数流式细胞法：使用FACSVantage流式细胞仪(如上所述)。以线性模式采集前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。以对数模式检测源自488nm激发的JC-1两参数荧光信号。使用FL1(530/30nm发射)检测绿色J-单体；使用FL2(585/42nm发射)检测橙色J-聚集物。以对数模式以FL3在695LP检测同样源自488nm激发的化合物(IA)荧光信号。使用前向光散射参数作为主要信号，对10,000个细胞收集前向和侧向散射和荧光的信号。结果示于图13(A-C)。JC-1数据显示为J-聚集物的荧光强度(585/42nm)对比J-单体的荧光强度(530/30nm)的等高线图(contourplot)。将它们另外分段，以得出具有高线粒体膜电位的细胞(上部区域)和具有低线粒体膜电位的细胞(下部区域)。用化合物(IA)在这两部分中同时描述了细胞活力。上部区域主要由活细胞组成，且下部区域由无活力细胞和活细胞二者组成，化合物(IA)功能性可以描述这些子部分(早期(化合物(IA)阴性)和晚期凋亡(化合物(IA)阳性和可渗透的)。
多参数成像星形孢菌素处理的细胞。扫描单元为连接至NikonEclipseTE300倒置显微镜的BioRadRadianceMP系统(BioRadMicroscience,HemelHempstead,UK)，其使用planapo60x/1.4NA油浸镜头。使用共焦配置(关闭针孔)收集三通道、三维(3D)(x,y,z)图像。同时收集所有的绿色(在488nm激发在500-530nm发射的J-单体)；橙色(在488nm激发在590/70发射的J-聚集物)；以及红色(化合物(IA))(在637nm激发在660LP发射的无活力的细胞标记)通道。所述3D图像顺序被处理为单个最大投影图像，并且所有三通道显示为J-单体、J-聚集物和DNA核细胞。结果示于图13(D)。
我们寻求探索多荧光染料应用，用于探索优选的不渗透细胞的染料与第二优选的渗透细胞的染料之间通过靶点竞争消灭信号的概念。所述光谱分离在任意给定的细胞内提供了仅来自一种染料的独特信号，因此允许它们简单整合至现有的多荧光染料分析中，并具有本领域容易理解的更高水平的多色分析。
实施例9.细胞状态的组合追踪。用式(IA)化合物加化合物(IIA)标记细胞群，以证明没有共同标记用VP-16处理的DOHH2培养物的亚群，得出说明有活力的/阻滞的(化合物(IIA)阳性)和损伤的(化合物(IA)阳性)细胞的测试。
细胞培养和药物处理：将人滤泡B-淋巴瘤细胞系用于本研究。将DoHH2常规维持在补充有5%FCS和100Uml-1青霉素、100μgml-1链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。将细胞每周传代两次，开始密度为5×104细胞ml-1，培养在37°C增湿的5%CO2/95%空气的气氛中。将细胞设定为5x105细胞/ml，并暴露于VP-16剂量(0.25μM)以诱导凋亡。将20μM化合物(IIA)和4μM化合物(IA)加入至1ml细胞中，并在标准培养条件下培养10分钟。将样品通过流式细胞仪分析。
使用FACSVantage流式细胞仪(如上所述)。以线性模式在FL2（对于化合物(IIA)(585/42nm滤片)）检测源自488nm激发的化合物(IIA)和化合物(IA)荧光信号；以线性模式在具有695LP滤片和FL1/2560nmSP二色性SP的FL3检测源自488nm的化合物(IA)信号，以确定散射性质。使用前向光散射参数作为主要信号，对10,000个细胞收集前向和侧向散射和荧光的信号。数据表示为等高线图，如图14所示。侧向散射对比前向散射的等高线图描绘了两种细胞群。化合物(IIA)和化合物(IA)的加入提供了这些培养物的功能性状态。首先，使用这两种共同靶向的荧光团在测试中解释(accounted)所有细胞。化合物(IA)鉴定了不完整的细胞部分，而化合物(IIA)阳性细胞代表了活细胞(有活力)部分。请注意，该有活力的部分具有两种群，其进一步描述阻滞的(G2)群的自然增长。此外，化合物(IIA)部分代表了具有较高前向散射性质(即细胞大小)的独特部分，而化合物(IA)群显示了较低的平均前向散射性质。

Claims (47)

1.式(I)化合物
其中：A为C2-8亚烷基；R1选自氢、C1-4烷基或C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代；
R2、R3和R4独立地选自C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且
其中X2，而非X1和X3，为NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m，
(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；
或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。
2.权利要求1的化合物，其中X1和X3均为羟基。
3.权利要求1的化合物，其中X1和X3均为氢。
4.权利要求1的化合物，其中R1为氢。
5.权利要求1的化合物，其中R2、R3和R4为C1-4烷基。
6.权利要求1的化合物，其中R2、R3和R4为甲基。
7.权利要求1的化合物，其中A为(CH2)2。
8.式(IA)化合物
9.式(IB)化合物
10.荧光复合物，其包含核酸和如权利要求1定义的式(I)化合物。
11.权利要求10的复合物，其中所述核酸为DNA。
12.权利要求11的复合物，其中所述DNA存在于细胞内。
13.权利要求12的复合物，其中所述DNA存在于不完整的细胞内。
14.一种分析细胞或含有核酸的其它生物材料的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备含有如权利要求1定义的式(I)化合物的生物相容的溶液；
b)用所述生物相容的溶液处理细胞或其它生物材料的样品；和
c)检测与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。
15.权利要求14的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发所述式(I)化合物，并检测放射出的荧光信号。
16.权利要求14的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为色度性质。
17.权利要求14的方法，其用于识别细胞样品中的细胞核，其中进行步骤b)以使得细胞核中的核酸被所述式(I)化合物结合，且细胞核的识别至少部分地基于步骤c)中检测的光谱学性质。
18.权利要求14的方法，其中进行步骤b)以将细胞样品用式(I)化合物染色。
19.权利要求18的方法，其中监测到细胞死亡增加，其中在测试期之前或期间进行步骤b)，因此使得在测试期期间连续或频繁地读出细胞死亡增加。
20.权利要求15或从属于权利要求15的权利要求16至19中任一项的方法，其中步骤c)包括通过流式细胞仪检测个体细胞发射出的荧光。
21.权利要求15或从属于权利要求15的权利要求16至19中任一项的方法，其中步骤c)包括通过荧光显微镜进行细胞内定位检测。
22.权利要求14的方法，其用于分析固定的或渗透化处理的细胞，其中所述细胞的样品通过使用固定剂或渗透剂处理而固定。
23.权利要求14的方法，其中步骤b)还包括用至少一种其它荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与该荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。
24.权利要求23的方法，其用于识别完整的细胞和不完整的细胞，其中所述式(I)化合物不渗透细胞，步骤b)还包括用渗透细胞的第二荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在不完整的细胞相关联，且所述与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在完整的细胞相关联。
25.权利要求24的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力，该结合能力低于式(I)化合物的结合能力，并因此在式(I)化合物的存在下，较不有效地竞争结合识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述第二荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被式(I)化合物掩蔽。
26.权利要求24的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物为式(II)化合物：
或其N-氧化物衍生物；
其中：A为C2-8亚烷基；R1、R2和R3独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；且
X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3、卤代氨基、C1-4烷基氧基或C2-8烷酰基氧基。
27.权利要求26的方法，其中X2，而非X1和X3，为NR1-A-NR2R3。
28.权利要求24的方法，其中在将细胞样品暴露于为潜在毒性或者能够诱导细胞死亡的试剂后，进行完整的和不完整的细胞的识别，以监测所述试剂对细胞样品的影响。
29.权利要求24的方法，其中步骤b)还包括使用至少第三荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与所述至少第三荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，并将所述光谱学性质与完整的细胞和/或不完整的细胞的特征或性质关联。
30.权利要求29的方法，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与检测的所述式(I)化合物的光谱学性质相似，且不同于检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与完整的细胞的特征或性质有关。
31.权利要求29的方法，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质相似，且不同于检测的所述式(I)化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与不完整的细胞的特征或性质相关联。
32.权利要求24的方法，其中步骤c)中检测的光谱学性质为电磁波谱的预定区域中的发射荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三和任何其它荧光染料或发光化合物。
33.权利要求32的方法，其中所述式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三荧光染料或发光化合物被单一来源的电磁辐射共同激发。
34.权利要求33的方法，当从属于权利要求30时，其中所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域内，其i)与所述式(I)化合物发射出的荧光的区域相似，和ii)不同于所述第二荧光染料或发光化合物发射出的荧光的区域。
35.权利要求34的方法，其中所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的红色和/或近IR区域。
36.权利要求33的方法，当从属于权利要求31时，其中所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域内，其i)与所述第二荧光染料或发光化合物发射出的荧光的区域相似，和ii)不同于所述式(I)化合物发射出的荧光的区域。
37.权利要求36的方法，其中所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的橙色区域。
38.权利要求24的方法，其中步骤c)使用流式细胞仪进行。
39.权利要求24的方法，其中步骤c)还包括测量来自细胞的光散射。
40.一种识别完整的和不完整的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备含有如权利要求1定义的化合物的生物相容的溶液；
b)制备含有渗透细胞的荧光染料或发光化合物的生物相容的溶液，该荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力，该结合能力低于不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的结合能力，并因此在不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的存在下，较不有效地竞争结合至识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述渗透细胞的荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被不渗透细胞的荧光染料或发光化合物掩蔽；
c)用所述的一种或多种生物相容的溶液处理该细胞样品；和
d)检测与不渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与不完整的细胞的存在关联，并检测与渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与完整的细胞的存在关联。
41.检测装置，其用于权利要求24的方法，所述装置包括：
一个或多个电磁辐射源，用于激发所述方法中使用的荧光染料和发光化合物；
多个检测器，用于检测与荧光染料和发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质；以及
检测器分析系统，适于将检测的光谱学性质与完整的和不完整的细胞的存在关联，因此识别完整的和不完整的细胞。
42.权利要求41的检测装置，其中所述检测器为荧光检测器。
43.权利要求41的检测装置，其具有单一来源的电磁辐射，用于共同激发所述荧光染料和发光化合物。
44.权利要求41的检测装置，其中所述多个检测器为一对检测器的形式，其检测所有荧光染料和发光化合物的光谱学性质。
45.组合物，其包含权利要求1的化合物与至少一种第二荧光染料或发光化合物的混合物。
46.试剂盒，其用于进行权利要求14至39中任一项的方法，其包括权利要求1的化合物，以及有关的容器和试剂。
47.制备权利要求1的化合物的方法，其包括以下步骤：提供式(I)化合物的氨基烷基氨基前体化合物；并季铵化所述氨基烷基氨基前体化合物。
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