KR20130083836A - 핵산을 포함하는 세포 또는 다른 생물학적 재료의 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따르면, 하기 식 (I)의 화합물 또는 NR1기가 4급화된(quaternarised) 유도체가 제공된다:
(I)
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임).
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임).
Description
본 발명은 세포 또는 다른 생물학적 재료의 분석 방법, 무손상 세포와 손상 세포를 식별하는 방법, 이것의 검출 시스템에 관한 것이며, 또한 신규 화합물 및 이 화합물들과 핵산을 포함하는 형광 복합체에 관한 것이다. 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니나, 특히 세포 불투과성 형광 염료 및 이것의 용도와 관련하여, 세포들 및 다른 생물학적 재료를 분석하는데 광범위하게 적용된다.
비고정 세포 샘플에서 세포 무결성(cellular integrity)의 식별과 고정 및 투과성 세포 샘플에서 핵 재료의 염색을 포함하여, 시료의 생존 능력 및 세포 농도를 측정하는 방법이 생명과학 및 의료 업계에서 일반적으로 사용되고 있다.
세포 사멸(즉 괴사 또는 세포자살)의 경향이 있고, 선행하며, 이를 수반하는 형태학적, 생화학적, 및 분자적 변화와 관련된 과정을 확인하는 능력에 대해 생명 과학 분야에서 광범위하게 관심을 기울이고 있다. 세포 샘플에서 상기 과정의 세포 수준의 연구가 사전에 고정되지 않도록 하는, 유세포 측정기(flow cytometry) 및 현미경 플랫폼 상에 손쉽게 배치된 분자 프로브 기술이 특히 매력적이다 (Darzynkiewicz, Juan et al. 1997). 진핵세포 및 세균 생존능의 유세포 측정과 현미경 분석을 위해, 일부 형광 염료-기반 염색 프로토콜이 개발되어 있다.
생세포 대 죽은 세포 분석법은, 무손상 세포 또는 대사 활성성 세포의 능력을 활용하여, 하나 이상의 세포 구획으로 비색 또는 형광 염료들이 침투되지 않도록 한다. 고등 진핵생물에서, 이러한 특성은 일차적으로 혈장막의 무결성과 관련이 있지만, 하등 진핵생물, 원핵계 및 식물에서는, 세포벽 조성과 붕괴가 염색의 침투와 방식에 영향을 미칠 수 있다. 살아있는 세포 상태로부터 죽은 세포 상태로의 상전이(transition phase)가 설명되고 있으나, 상이한 형태의 세포들 사이에서, 그리고 관련된 과정의 형태와 속도에 따라 종종 달라진다. 살아있는, 무손상 또는 생존가능한 세포들은, 반드시 증식 능력을 나타내지 않지만, 대사 기능과 혈장막의 무결성 모두를 보유하는 세포들로 이해된다. 다른 막 재조직의 과정에 비해, 혈장 막 무결성의 상실은 세포 사멸 과정에서 결정적인 요인이며, 세포의 내부 환경과 외부 환경 간에 특정 성질에 따라서 향상된 또는 더욱 자유로운 분자 이동을 보이는 세포들의 전위를 불러 일으킨다. 세포 사멸 과정에서 막 재조직의 예로는 아넥신(Annexin) V 분자의 세포 표면에 대한 향상된 결합을 들 수 있으나, 세포 불투과성 염료에 의한 양성 염색과 관련된 세포 사멸에서 후속 단계를 대표하는, 붕괴된 막을 가지는 세포들에 대한 아넥신 V의 결합과는 구별될 필요가 있다.
약화된(compromised) 막 무결성을 나타내는 세포들은 생존 불가능하거나 손상 세포들로 설명될 수 있으며, 막 붕괴의 특성을 보이는 죽었거나, 투과성이거나 죽어가는 세포들을 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 전이 임계점은, 세포 사멸의 기능적인 정의 또는 분석 방법을 제공하는 살아있는 세포 불투과성 염료의 유입 증가를 통해 확인할 수 있다. 바람직하게는 상기 염료들은 잔류 세포 내 구조에 대한 결합 능력을 가지고 있어서, 우선적으로 집단 내 손상 세포들의 분획 내부에 축적된다. 종종 파편(debris)으로서 확인되는 다수 분획으로의 세포 단위의 최종적인 분해 상태(dissembly) 및 세포 사멸 중의 구조를 보유하는 잔류 핵산을 상대적으로 장기간 유지하는 것으로 이해된다.
생체 염색이 사용되어, 세포 집단을 검출하여, 선택할 수 있다. 이것은 약화되지 않은(non-compromised) 살아있는 세포들의 기능의 유지를 요하는 분석에서 특히 바람직하게 이용된다. 하나의 접근법은, 세포 투과성 무형광 기질을 무손상 세포들 내부에 우선적으로 보존될 수 있는 고형광 산물로 세포내 전환하여(예컨대, 세포내 비특이적 에스테라제 활성에 의한 플루오레세인 디아세테이트 대사), 생존 가능한 분획을 양성적으로 확인함으로써, 규명될 수 있는 활성 세포 대사의 검출을 통하여 생존 능력을 양성적으로 평가하는 것이다. 그러한 경우에, 무결성이 약화된 세포들의 배제가, 분석으로부터 도출된 정보의 유효성이 증가하도록 작용한다. 한편, 살아있는 세포-불투과성 염색이 죽은 세포나 세포자살 또는 세포 사멸의 후속 단계에 있는 막-약화된 세포들에 유입될 것이다. 세포 불투과성 DNA 결합 염료의 경우, 염료 유입 및 세포 내 잔류 핵산과의 후속 작용이 이용되어, 주어진 세포 막의 약화된 상태를 보고한다. 그 경우 세포 내 염료 및 잔류 핵산, 바람직하게는 DNA 간의 '복합체'가 보고 원리이다. 이 경우에, 시약은 더 이상 세포들로부터 배제되지 않으며, 복합체 형성에 대한 접근성을 가지게 되어, 생존 능력에 대해서는 음성 염색을, 약화된 세포들에 대해 양성 염색을 제공한다.
세포 샘플들은 또한 생명 과학에서 사용되는 광범위한 기술의 일부로서 세포 특성의 분석을 가능하게 하는 고정 방법을 사용하여 가공될 수 있다. 고정 방법 및 세포 투과성 방법은 변할 수 있으나, 종종 살아있는 세포 투과성 염료의 유입이 가능하도록 하는 막 변화를 초래한다.
염료 유입은 바람직하게는 세포내 핵산들에 대한 염료의 고 친화 결합과 관련된 형광 신호의 포착에 의해 나타나며, 예외없이 결합에 따른 형광 증대(fluorescence enhancement)에 의해 지원받을 수 있는 것으로 여겨진다.
핵산들에 가변적으로 결합하는 세포-불투과성 (및 세포-투과성) 형광 염료들은 생명과학에서 광범위하게 사용되고 상업적으로 용이하게 입수가능한 분자 프로브의 거대 그룹이다. 이러한 제품들의 요구되는 특성은 핵산 선택성, 여기 및 방출 특성, 양자 수율(quantum yield), 결합에 따른 형광 증대 가능성, 수성 환경에서의 성능, 약화되지 않은 세포들로부터의 배제 정도 (생존 능력에 대해서는 음성 염색, 세포 사멸에 대해서는 양성 염색을 제공함) 또는 무손상 세포 분석을 위한 무손상 세포들로의 침투 속도를 포함한다. 특정 염료의 선택은, 분석에 혼입되는 다른 형광단과의 스펙트럼 중첩 정도 및 선택적이거나 최적의 여기(excitation)를 위해 일반적인 광원의 입수 가능성에 의해 종종 결정된다.
세포 사멸 과정은 연장된 시간-프레임 (수분 내지 수일)에 걸쳐서 세포적 특성에서 순차적인 변화의 습득과 관련되기 때문에, 무시할만한 독성을 가져, 주어진 염료의 지속적인 존재가 분석 내 생존능력의 상실 보고에 영향을 미치지 않는 세포 불투과성 염료가 필요하다. 그러한 비독성 세포 불투과성 염료가 장기간 분석에서 생존능력의 손실을 지속적으로 모니터링하는데 바람직하다.
투과성 및 불투과성 염료들에 의해, 구조적 무결성의 수준이 변하는 세포들에서 세포 크로마틴의 형광 염색성의 범위는 복잡하며, 쉽게 예측되지 않는 것으로 인식되고 있다 (Wlodkowic, Skommer et al. 2007). 그 외 세포 불투과성 지시 염료의 세포 유입을 허용하는, 세포 사멸 과정을 경험한 세포들은 적어도 크로마틴 형태가 아닌, 세포 구조에서 변화를 겪게 된다. 자살세포 핵이 종종 다수의 DNA 형광 색소들로 흐릿하게 나타나는 동안, 흡수성 양이온 염료를 사용한 세포자살 핵의 과염색이 빈번하게 관찰된다.
양이온 염료들에 대한 초기 자살세포들의 크로마틴 친화력의 증대는 DNA 분해(degradation)보다는 형태적 완화와 관련이 있는 것으로 최근 이해되고 있다 (Erenpreisa, Freivalds et al. 1997). 후기 자살세포들에서, 분해된 DNA의 매우 밀집된 패키징이, 형광 특성에 영향을 미치는 (Erenpreisa, Freivalds et al. 1997) 부가적인 염료 응집체를 증대시킨다 (Erenpreisa, Freivalds et al. 1997).
따라서 핵산 표적 염료를 사용한 세포들의 형광 염색은, 세포 상태, 투과성, 염료 결합 선택성, 염료 결합 방식 및 염료-염료 상호작용의 복합체이다. 세포 기반 분석에서 그러한 문제를 상쇄시키기 위해서, 전통적인 접근법은 고 형광 증대 및 고 양자 수율 염료를 선호해 왔다. 광범위한 세포 불투과성 염료들은 핵산 염색에서 적용법을 발견하였다. 가장 빈번하게 사용되는 예가 프로피디움 요오드화물(PI)이다.
격렬한 형광 PI 신호는 단순하고 민감한 검출의 이점이 있으나, 형광 색소가 다색성 분석에 포함되면, 난점이 있다. 또한 PI는 UVA (예를 들어 365 nm) 파장에서 청색광 (예를 들어 488 nm) 파장에 의해, 여기되는 능력을 가져, 형광 분석물질 또는 형광 프로브에 의해 검출되는 분석물질을 식별하는데 서로 다른 여기 상태가 되는 경우, 그 적용이 복잡하다. PI는 세포 염색의 통상적인 분석을 위한 비색 신호를 가지지 않는다. 특히 '스필 오버(spill over)'의 이유가 되는, PI에 대해 분석되는 피크 방출 영역에 인접한 가시 스펙트럼 부분에 집중된 신호들에 대해 보정(compensation)이 적용되어야 한다. 더욱이 PI의 형광 방출은, 형광 분석물질 또는 형광 프로브에 의해 검출되는 분석물질로부터 유래된 방출이 서로 구별될 필요가 있는 스펙트럼 영역을 차지할 수 있다. PI는 적색역(red region) 및 그 너머로 (예를 들어 > 620 nm 파장) 방출하는 살아있는 세포 불투과성 염료로서 일부 스펙트럼적 이점을 제공한다.
DNA에 결합되는 PI의 고 형광 강도는, 확인 세포의 부차 집단에 대한 광범위한 동작 범위(dynamic range)를 제공하는 로그 스케일(logarithmic scale) 상에서 세포 집단으로부터 획득된 형광 신호의 분석을 자주 필요로 하는 것으로 이해된다.
미국 특허 제5,057,413호는, DNA에 대한 선호도가 방출된 형광 양에 기초하여 약화된 세포와 무손상 세포 사이에서 상이할 때, 세포 투과성 핵산 염료 LDS-751의 사용을 개시하고 있다. 다른 예로서, 무손상 세포들과 죽은 세포들 사이의 식별은, 비특이적 염색의 위험성을 피하기 위하여 백혈구 마커(CD45) 발현의 유세포 측정 백혈병/림프종 평가에서 (무손상 세포 투과성이 낮은) 염료 7-AAD를 사용하여 가능하다 (Shenkin, Babu et al. 2007). 또 다른 예로서, 미국 특허 출원 제20070082377호는, 활성 카스파제 효소에 결합하는 세포-투과성 세포자살-탐지 프로브인 형광 프로브, 및 막 염료인 형광 프로브를 사용하는 멀티파라미터(multiparametric) 분석의 성분으로서 세포 불투과성 DNA 염료 7-AAD의 사용을 개시하고 있다. 이러한 접근법들은, 변형된 카스파제 활성을 특징으로 하는 자살 세포들 및 사멸 또는 괴사 세포들 (생체 염료 7-AAD을 사용하여 검출; 이 염료가 DNA와 결합하거나 DNA 사이에 끼어들 때, 이것은 예를 들어, 핵산에 결합함에 따른 형광 증대 과정을 통하여, 검출가능하게 된다) 간의 식별이 가능하도록 한다.
세포 투과성 및 세포 불투과성 염료들을 사용하는 '듀얼 다이(dual dye)' 분석법이 알려져 있다 (Giao, Wilks et al, 2009; Biggerstaff, Le Puil et al, 2006; Lehtinen, Nuutila et al 2004; Wlodkowic and Skommer, 2007a; Wlodkowic and Skommer, 2007b). 사용되는 염료들은 언제나 개개의 성능이 최적화되고, 상호작용을 효과적으로 피하도록 하여 세포들이 투과성을 정확하게 보고할 수 있도록 한다. 전술한 듀얼 다이 분석은, 적용되는 정밀 시스템과 관련하여 바람직하지 못한 특성과 여러 가지 부작용을 각각 가진다. 그러나 듀얼 다이 분석의 근본적인 문제점은, 예외 없이, 직접 결합 세포-투과성 핵산 염색이 약화되거나 붕괴된 막을 가진 세포들의 핵산도 염색할 수 있다는 점이다.
전술한 바와 같이 세포 투과성 및 세포 불투과성 염료들로부터 얻어진 신호들의 동작 범위는 통상적인 분석 방법을 가능하게 한다.
또한 세포들 및 다른 생물학적 재료의 분석용 형광 염료의 유용성을 개선하기 위한 지속적인 필요성이 대두되고 있다.
적어도 일부 구현예에서, 본 발명은 전술한 문제점과 필요성에 부응하기 위한 것이다. 특히, 본 발명은 적어도 일부 구현예에서, 개선된 세포 불투과성 염료들을 제공하고, 또한 세포 불투과성 및 세포 투과성 염료를 사용하여 생존/사멸 세포 식별을 위해 사용될 수 있는 개선된 시스템을 제공한다. 일부 예에서, 본 발명은 원적외 영역 (예를 들어 > 660 nm 파장 또는 > 690 nm 파장)에서 바람직한 방출을 나타내고, 오렌지/레드 스펙트럼 영역 (예를 들어 > 530 < 620 nm 파장)에서 감소된 방출을 보이는 세포 불투과성 염료들을 제공한다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 하기 식 (I)의 화합물 또는 NR1기가 4급화된(quaternarised) 유도체를 제공한다:
식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 이때 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온이다.
바람직하게는 m은 1이다.
세포들 및 다른 생물학적 재료의 분석용 염료로서 사용될 때, 이 화합물들의 적어도 일부와 관련하여 다양한 이점이 있다.
상기 이점은 다음을 포함한다:
- 세포 기반 분석에 통상 사용되는 등장성 완충액의 상태와 호환가능한 농도 범위에서 분석에 쉽게 혼입되기 위한 수용해성
- 다양한 분석 및 편리한 저장의 한도 내에서 재생가능한 전개를 위한 화학적 순도 및 안정성
- 스펙트럼 중첩이 거의 또는 전혀 없이 가시 범위의 형광을 이용한 멀티파라미터 분석에 쉽게 혼입되기 위한 적/원적외 형광 특성, 또는 적색 형광과 함께 통용되는 오렌지 형광
- 유핵 세포들의 분석을 필요로 하는 적용을 위한 고친화적 핵산 결합 특성
- DNA 결합 정도 및 형광 방출 강도 사이에 알려진 화학량론을 가능하게 하는, 핵산 결합에 따른 비 형광증대
- 결합된 분자의 국소 농도에 기여할 수 있는 핵 결합에 따른, 증가된 신호 대 비결합 염료의 배경 형광의 상대적인 감소를 대비하는 저 자기형광(intrinsic fluorescence)
- 염료 분자를 배제할 수 없는 능력을 가지거나, 약화된 막을 가진 세포들의 선택적 양성 염색을 위한 세포 불투과성
- 이미지화 또는 유세포 측정 또는 기타 검출 플랫폼으로 형광 방출을 검출하는 모든 유핵 세포들에 대해 DNA 직접 염료로서 사용하기 위한 고정된 세포들에서의 핵 식별 능력
- 증식 억제와 같은 유해한 효과 없이 생물학적 적용 동안에 연장된 기간 동안, 염료가 세포들과 코-인큐베이션할 수 있도록 무손상 세포들에 대한 저독성
- 세포 염색의 검출을 위해 동일한 집단의 에피소드 샘플링 및 가변적인 기간에 걸쳐 세포 불투과성 염료와 세포들의 인큐베이션에 의해 모니터되는 세포 무결성의 손실의 시간 의존적 분석이 가능하도록 하는, 상기 특성들의 조합
본 발명은 특히 형광 염료로서 사용될 수 있는 4급(quaternarised) 아미노알킬아미노 안트라퀴논 화합물을 제공한다. 4급 아미노알킬아미노 치환체는 적어도 1번 위치에 존재한다. 또한 4급 아미노알킬아미노 치환체들은 4, 5, 또는 8 위치에 존재할 수 있다. 국제공개공보 WO91/05824 및 WO99/65992 (이 문헌들은 원용에 의해 그 전문이 본 발명에 포함된다)는 본 발명의 화합물의 합성에 전구체로서 사용될 수 있는 다양한 종류의 아미노알킬아미노 안트라퀴논 화합물을 개시하고 있다.
바람직하게는, X1, X2 및 X3 중 적어도 하나가 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m이다. 특히 바람직한 구현예에서, X2 (단 X1 및 X3는 아님)는 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 즉 1,5 위치에서 4급 아미노알킬아미노기로 치환된 안트라퀴논이다.
다른 바람직한 화합물의 분류로는, X1 (단 X2 및 X3는 아님)는 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm-)1/m, 즉 1,4 위치에서 4급 아미노알킬아미노 치환체들을 가지는 안트라퀴논이다. 또한 1,8 치환된 유사체가 가능하다.
유리하게는, X1 및 X3는 모두 하이드록실이다.
다른 바람직한 구현예에서, X1 및 X3는 모두 수소이다.
바람직하게는, 이 위치에서 아미노 성분이 3급 아민인 화합물을 사용할 수도 있지만, R1은 수소이다. 이 구현예에서, R1은 바람직하게는 C1 -4 알킬이다.
바람직하게는 R2, R3 및 R4는 C1 -4 알킬이다. 더욱 바람직하게는, R2, R3 및 R4는 메틸이다.
바람직한 구현예에서, A는 (CH2)2이다.
특히 바람직한 구현예에서, 화합물은 하기 식(IA)의 화합물이다:
다른 바람직한 화합물은 하기 식(IB)의 화합물이다:
본 발명의 화합물의 구체적인 예로서 요오드화물과 같은 적합한 반대 음이온(counter-anion)과 결합하는, 후술하는 화합물을 들 수 있다.
1-{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1-{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리메틸아미노)에틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1-{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1-{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}5,8디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}5,8디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}-5,8디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리에틸아미노)에틸]아미노}-5,8디하이드록시안트라센-9,10-디온
1-{[2-(트리메틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온 요오드화물
1,8-비스{[2-(트리메틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리메틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리메틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1-{[2-(트리에틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리에틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리에틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리에틸아미노)프로필]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}안트라센-9,10-디온
1,5-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,4-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
1,8-비스{[2-(트리에틸아미노)부틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온
본 발명의 화합물은 임의의 적절한 반대 음이온을 포함할 수 있다. 반대 음이온의 예로는 염화물, 브롬화물 및 요오드화물과 같은 할라이드, 인산 및 황산과 같은 무기산, 및 아세트산, 아스코르브산, 벤조산, 시트르산, 푸마르산, 글루콘산, 이세티온산(isethionic), 락트산, 말레산, 말산, 메탄 설폰산, 옥살산, 숙신산, 설팜산 및 타르타르산과 같은 유기산으로부터 유도된 생리학적으로 허용가능한 음이온이 있다.
본 발명의 화합물은 통상적으로 아미노알킬아미노 전구체 화합물을 식(I)의 화합물로 4급화(quaternarisation)하여 제조될 수 있다. 4급화 공정은 전구체의 알킬화 (예를 들어 알킬 할라이드 시약을 사용) 또는 적절한 유기산이나 무기산을 사용한 산부가염의 형성을 통한 4급화를 포함할 수 있다. 국제공개공보 WO91/05824 및 WO99/65992와 관련하여 전술한 아미노알킬아미노 안트라퀴논 화합물은 4급화 과정에 적절한 전구체 화합물로서의 역할을 할 수 있다. 4급화되어 본 발명의 화합물을 제조하는 전구체 화합물의 합성을 위한 기타 경로가 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
본 발명의 범위는 생리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 상기 정의된 식(I)의 화합물을 포함하는 조성물로 확장된다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 핵산 및 하기 식(I)의 화합물 또는 NR1기가 4급화된 유도체를 포함하는 형광 복합체가 제공된다:
식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 이때 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온이다.
핵산은 DNA일 수 있고, DNA는 세포 내에 존재할 수 있다. DNA는 손상 세포 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는 핵산 함유 세포들 또는 다른 생물학적 재료의 샘플을 분석하는 방법이 제공된다:
a) 하기 식(I)의 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하는 단계:
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 이때 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임)
b) 상기 생물학적으로 호환가능한 용액으로 세포들 또는 다른 생물학적 재료의 샘플을 처리하는 단계; 및
c) 상기 식(I)의 화합물에 의해 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 단계.
바람직하게는, 상기 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성은 형광이며, 상기 단계 c)는 식(I)의 화합물을 전자기 방사선으로 여기시키는 단계, 및 방출된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 형광 수명과 같은 다른 검출법을 이용할 수 있지만, 미리 정해진 스펙트럼 영역에서 형광 강도를 측정할 수 있다.
대안적으로, 상기 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성은 비색성일 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 세포들의 샘플에서 세포 핵의 식별을 위해 사용될 수 있으며, 여기서 단계 b)는 식(I)의 화합물에 의한 세포핵 내 핵산의 결합을 야기하여 수행되고, 세포핵의 식별은 적어도 부분적으로 상기 단계 c)에서 검출된 스펙트럼 특성에 기초한다.
단계 b)는 세포 샘플을 식(I)의 화합물로 염색함으로써 행해질 수 있다. 바람직하게는 상기 방법은 세포 사멸 증가율이 모니터될 수 있으며, 여기서 단계 b)는 분석 전 또는 중에 행해져서, 분석 기간 동안 세포 사멸 증가율의 지속적이거나 빈번한 판독이 가능하도록 한다. 식(IA)의 화합물이 이 방법에서 특히 바람직하게 사용된다. 이 접근법은 본 발명의 불투과성 화합물의 비독성을 활용한다. 이것은 세포 혼합물과 함께 식(I)의 화합물을 포함하여, 식(I)의 화합물이 시험 중에 존재할 수 있도록 한다는 것을 의미한다. 세포가 죽으면(예를 들어 분석 중 시험 화합물의 영향으로), 세포는 식(I)의 화합물로 염색되게 된다. 상기 식(I)의 화합물은 세포 사멸을 유도할 수 있는 임의의 처리 전, 동안 또는 후에 추가될 수 있다. 이것이 지속적인 기준으로 수행될 수 있는 시험 동안에 샘플링을 가능하게 한다.
단계 c)는 유세포 측정기, 형광 현미경에 의한 세포내 위치 검출법, 또는 임의의 기타 적절한 종류의 형광 기반 검출 기술에 따라 개별 세포들에 의해 방출된 형광을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이미지화 기술이 사용될 수 있다. 형광 강도, 편광(polarisation), 형광 수명, 형광 스펙트럼, 및 분석될 표본 또는 샘플 내에서 그러한 특성들의 공간적인 배열을 포함하나 이에 제한되지 않는, 형광 신호 분석을 위한 다양한 이미지화 시스템이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
특정 바람직한 구현예에서, 고정되거나 투과성화된 세포들이 분석되며, 여기서 세포 샘플은 고정액 또는 투과성 제제로 처리하여 고정된다. 고정 및 투과성화 세포들 내 세포핵의 식별 및 염색이 특히 바람직한 구현예이다.
다른 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 적어도 하나의 다른 형광 색소 또는 발광 화합물로 상기 샘플을 처리하는 것을 추가로 포함하며, 단계 c)는 형광 색소 또는 발광 화합물에 의해 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 것을 추가로 포함한다.
다른 형광 색소 또는 발광 화합물과 관련된 단계 b) 및 c)는 식(I)의 화합물과 관련된 단계 b) 및 c)와 동시에, 또는 개별적으로 수행될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하며, 여기서 식(I)의 화합물은 세포 불투과성이고, 단계 b)는 세포 투과성인 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물로 샘플을 처리하는 것을 추가로 포함하고, 단계 c)는 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물로 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성의 검출은 손상 세포들의 존재와 연관되고, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성의 검출은 무손상 세포들의 존재와 연관된다.
손상 세포들은 약화되거나 붕괴된 막을 가진 죽은 세포들과 손상된 세포들을 포함하는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물은 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 기타 거대 분자 물질에 대해 (반드시 그러한 것은 아니나 바람직하게는 결합 친화력과 관련된) 결합력(binding potential)을 가지되, 상기 결합력은 식(I)의 화합물의 결합력보다 낮아서, 결과적으로 식(I)의 화합물의 존재 하에서 상기 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 결합하기 위해 낮은 효율로 경쟁하여, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물이 손상 세포들에 대한 결합에서 실질적으로 배제되거나, 식(I)의 화합물에 의해 마스킹된다(masked).
손상된 세포들에서 식(I)의 화합물에 의한 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 바람직한 완전한 배제가, 형광 방출의 듀얼 분석을 기반으로 한 최적의 식별을 가능하게 한다. 또한 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물로부터의 형광 신호는 식(I)의 화합물로 최적으로 표지된 손상된 세포들에서 효과적으로 제거되지만, 전술한 공동 염색 조건 범위로 얻어진 형광의 비율 측정식(ratiometric) 분석을 가능하게 하는, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물에 대한 식(I)의 화합물의 비를 단순히 변화시켜, 약화된 수준에서 검출가능할 수 있다. 바람직하게는 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물에 대한 식(I)의 화합물의 몰비는 1:10 내지 10:1 범위 이내, 더욱 바람직하게는 3:20일 수 있다. 바람직하게는, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 존재만을 배타적으로 보고하는 무손상 세포들의 염색이, 유핵 세포들에 대한 양성 형광 식별자로서 세포내 핵산의 존재 및 전체 염료 결합과 관련된 세포 바이오매스를 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포 상태를 결정하는데 있어서 가치있는 부가 정보를 제공한다. 세포 바이오매스 변화의 바람직한 지표가, 바람직하게는 세포 사이클 휴지 또는 증식의 장기간 억제를 경험한 세포의 분석에서 세포 분열을 방해하지 않으면서, 계속해서 대사를 진행하는 세포들 간에 구별이 가능하도록 한다.
바람직하게는, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물은 하기 식(II)의 화합물 또는 그의 N-옥사이드 유도체이다:
식 중, A는 C2-8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1-4 알킬, 및 C2-4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 이때 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2-6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3, 할로게노 아미노, C1-4 알킬옥시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 식(II)의 화합물은 1,5 아미노 치환된 안트라퀴논으로, 즉 X2는 NR1-A-NR2R3이지만, X1 및 X3은 NR1-A-NR2R3이 아니다.
이러한 부류의 1,5 아미노 치환된 안트라퀴논의 특히 바람직한 구현예는 하기 식(IIA)의 화합물이다:
바람직하게는 잠재적으로 세포독성이거나 다르게 세포 사멸을 유도할 수 있는 제제의 세포의 샘플에 대한 영향을 모니터하기 위하여, 세포의 샘플을 상기 제제에 노출시킨 후, 무손상 및 손상 세포들 사이의 식별을 행한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 단계 b)는 적어도 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물로 샘플을 처리하는 단계를 추가로 포함하고, 단계 c)는 적어도 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 단계, 및 상기 스펙트럼 특성을 무손상 세포들 및/또는 손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관시키는 단계를 추가로 포함한다.
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 식(I)의 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과 유사하고, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과는 상이할 수 있으며, 여기서 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 무손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관성이 있다.
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과 유사하고, 식(I)의 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과는 상이할 수 있으며, 여기서 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관성이 있다.
바람직하게는, 단계 c)에서 검출된 스펙트럼 특성은 전자기 스펙트럼의 예정된 영역에서 방출된 형광이며, 단계 c)는 전자기 방사선으로 식(I)의 화합물, 제2의, 선택적으로, 제3 및 그 이상의, 형광 색소 또는 발광성 화합물을 여기시키는(exciting) 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 식(I)의 화합물, 제2의, 선택적으로, 제3 및 그 이상의, 형광 색소 또는 발광성 화합물은 단일 전자기 방사선원(single source)에 의해 함께 여기 상태가 된다.
바람직하게는, 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광은 i) 바람직하게는 적색 및/또는 IR 인접 영역에서, 식(I)의 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 유사하고, ii) 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 상이한, 전자기 스펙트럼의 예정된 영역 내에 있다. 제3의 형광 색소는 Qdot 705 nm 방출 나노결정체이다.
바람직하게는, 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광은 i) 바람직하게는 오렌지 영역에서, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 유사하고, ii) 식(I)의 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 상이한, 전자기 스펙트럼의 예정된 영역 내에 있다.
무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하는 방법의 일 구현예에서, 단계 c)는 유세포 측정기를 사용하거나, 형광 현미경을 사용하여 형광 방출의 세포 위치 정보를 제공함으로써, 행해질 수 있다. 형광 강도, 편광, 형광 수명, 형광 스펙트럼, 및 분석될 표본 또는 샘플 내에서 그러한 특성들의 공간적인 배열을 포함하나 이에 제한되지 않는, 형광 신호 분석을 위한 다양한 이미지화 시스템이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
단계 c)는 세포들로부터의 광산란을 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러나 수행될 광산란 측정을 필요로 하지 않아도 유용한 결과가 얻어질 수 있다.
시간 분해 일자(time resolved date)를 얻기 위하여, 예를 들어 제2의 및/또는 제3의 형광 색소들 또는 발광 화합물의 존재와 연관된 특성들에 의해 확인된 것과 같이, 식별된 무손상 세포들의 변화를 관찰하거나 세포 무결성의 경과 변화를 관찰하기 위하여 장기간 측정이 행해질 수 있다.
본 발명의 제4 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는 무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하는 방법이 제공된다:
a) 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하는 단계;
b) 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 대해 (반드시 그러한 것은 아니나 바람직하게는 결합 친화력과 관련된) 결합력을 가지는 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하되, 상기 결합력이 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물의 결합력보다 낮아서, 결과적으로 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물의 존재 하에서 상기 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 결합하기 위해 낮은 효율로 경쟁하여, 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물이 손상 세포들에 대한 결합에서 실질적으로 배제되거나, 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의해 마스킹되는, 단계
c) 상기 생물학적으로 호환가능한 용액 또는 용액들로 세포의 샘플을 처리하는 단계; 및
d) 상기 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하고, 이것을 손상 세포들의 존재와 연관시키는 단계, 및 상기 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하고, 이것을 무손상 세포들의 존재와 연관시키는 단계.
전술한 세포 투과성 염료들 이외에, 하기 염료들이 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물로서 사용될 수 있다 ('숫자/숫자'는 최대 여기(max Excitation) 대 최대 방출(max Emission)에 대한 파장(nm)을 의미한다):
세포-투과성 사이아닌 염료들 (SYTO 핵산 염료들): SYTO® 40 블루 형광 핵산 염료 SYTO® 59 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 60 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 61 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 62 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 63 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 64 레드 형광 핵산 염료, SYTO® 블루 핵산 염료, SYTO® 40 블루 형광 핵산 염료, SYTO® 41 블루 형광 핵산 염료, SYTO® 42 블루 형광 핵산 염료, SYTO® 45 블루 형광 핵산 염료, SYTO® 80 오렌지 형광 핵산 염료, SYTO® 81 오렌지 형광 핵산 염료, SYTO® 82 오렌지 형광 핵산 염료, SYTO® 83 오렌지 형광 핵산 염료, SYTO® 84 오렌지 형광 핵산 염료, SYTO® 85 오렌지 형광 핵산 염료, SYTOX® 오렌지 핵산 염료, SYTO® 10 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 9 그린 형광 핵산 염료, SYTO® BC 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 블루 사멸 세포 염료, SYTOX® 그린 핵산 염료, SYTO® 21 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 24 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 25 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 11 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 12 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 13 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 14 그린 형광 핵산 염료, SYTO® 16 그린 형광 핵산 염료, 및 SYTO® 17 레드 형광 핵산 염료를 포함하나, 이것에 한정되지 않는, 살아 있는 세포들에 유입될 수 있고, SYTOX 염료들보다 친화성이 낮은 염료들
DAPI : UV-여기성(excitable) DNA 결합 형광 색소 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드 (DAPI) (Ex358/Em46) 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디락테이트 (DAPI, 디락테이트)
마이너 그루브 결합 훽스트 ( Minor groove binding Hoechst ) 염료들: 비제한적 예로서 바람직하게는, 훽스트 34580, 훽스트 33258 (비스-벤즈이미드): 블루 형광 (Ex352/Em461) AT-선택성, 마이너 그루브-결합 dsDNA-선택성 형광 색소인 펜타하이드레이트, 훽스트 33342: 블루 형광 (Ex350/Em461) AT-선택성, 마이너 그루브-결합 dsDNA-선택성 결합인 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트
핵산 염료인 LDS 751: (Ex543/Em712) (DNA) (Ex590/Em607) (RNA)
7- 아미노액티노마이신 D (7-AAD; Ex546/Em647)
아크리딘 오렌지: RNA에 대해 레드 편향된(biased) 방출과 DNA에 대해 그린 편향된 방출을 나타내는 세포들의 이염색성을 보임
전술한 세포 불투과성 염료들 이외에, 하기 염료들이 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물로서 사용될 수 있다 ('숫자/숫자'는 최대 여기 대 최대 방출에 대한 파장(nm)을 의미한다):
TOTO 패밀리 사이아닌 다이머 염료들의 사이아닌 다이머: 비제한적 예로서 바람직하게는 TOTO®-1 요오드화물 (514/533), TO-PRO®-1 요오드화물 (515/531), TOTO®-3 요오드화물 (642/660)
TO-PRO 패밀리 염료들의 사이아닌 모노머: 비제한적 예로서 바람직하게는 YO-PRO-1 (Ex491/Em509), TO-PRO-1 (Ex515/Em531), TO-PRO®-3 요오드화물 (642/661), TO-PRO®-5 요오드화물 (745/770), YOYO®-1 요오드화물 (491/509), YO-PRO®-1 요오드화물 (491/509), YOYO®-3 요오드화물 (612/631), YO-PRO®-3 요오드화물 (612/631).
핵산 SYTOX 염료들: 비제한적 예로서 바람직하게는 SYTOX 블루 (Ex445/Em470), SYTOX 그린 (Ex504/Em523) 및 SYTOX 오렌지 (Ex547/Em570).
프로피디움 요오드화물 (PI; Ex530/Em625) 및 세포-불투과성 브롬화 에티듐 (EthBr; Ex518/Em605)
7- 아미노액티노마이신 D (7-AAD; Ex546/Em647)
아크리딘 오렌지: RNA에 대해 레드 편향된(biased) 방출과 DNA에 대해 그린 편향된 방출을 나타내는 세포들의 이염색성을 보임
형광 강도, 편광, 형광 수명, 형광 스펙트럼을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 발명을 사용하여 얻어진 상이한 형광 신호 분석을 위한 다양한 검출 시스템이 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 또한 세포 이미지화 방법은 분석될 표본 또는 샘플 내에서 그러한 특성들의 공간적인 배열과 동적 해석을 추가로 제공하는 것으로 이해된다.
본 발명의 제5 측면에 따르면, 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 방법에서 사용되는 검출 시스템이 제공되며, 상기 시스템은,
상기 방법에 사용되는 형광 색소들 및 발광 화합물을 여기시키기 위한 하나 이상의 전자기 방사선원;
형광 색소들 및 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하기 위한 다수의 검출기; 및
상기 검출된 스펙트럼 특성을 무손상 및 손상 세포들의 존재와 연관시켜, 무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하도록 적용된 검출기 분석 시스템을 포함한다.
바람직하게는, 상기 검출기는 형광 검출기이다.
가장 바람직하게는, 상기 검출 시스템은 형광 색소들 및 발광 화합물을 함께 여기시키기 위한 단일 전자기 방사선원을 가질 수 있다.
가장 바람직하게는, 다수의 검출기가 형광 색소들 및 발광 화합물 전부의 스펙트럼 특성을 검출하는 한 쌍의 검출기 형태이다.
본 발명은 다양한 범위의 세포 유형 및 응용에서 세포 무결성을 조사하는데 적용될 수 있다. 본 명세서에서 세포 또는 세포 유형을 언급할 때, 세포 또는 세포 유형은 살아있는 진핵 세포이다. 본 발명은 모든 세포 유형들과 함께 사용될 수 있다. 세포들은 비제한적으로 하기 세포 유형들로부터 선택될 수 있다:
생체 표본 (예를 들어, 미세 바늘 흡인물(aspirates)에 의함), 조직 외식편, 원발성 배양 (예를 들어, 인간 피부 섬유아세포), 형질전환 세포주 (예를 들어, SV40 형질전환된 섬유아세포), 불멸화된 세포주 (예를 들어, 인간 텔로머라제 역전사효소 [hTERT]로 불멸화된 세포주), 또는 확립된 종양 세포주로서, 유래된 인간 및 포유동물 세포들을 포함하는 동물 세포들.
식물 세포들 및 세균 세포들.
예를 들어 뇌암, 방광암, 유방암, 결장 및 직장 암, 자궁내막암, 신장암 (신장 세포), 백혈병, 폐암, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 피부암 (비-흑색종), 갑상선암과 같이, 바람직하게는 기질 상에서 부착 성장을 입증할 수 있는, 특정 부위 및 치료, 진단 및 분석될 질환을 대표하는 종양 세포주를 포함하는, 인간 종양 세포주. 또한 미국 국립 암 연구소 종양 세포주 패널 NCI-60에 나타난 종양 세포주와 같이, 약물 스크리닝 방법론을 목적으로 일상적으로 사용가능한 인간 종양 세포주 (ref: http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html):
제노바이오틱 물질의 전달체 (예를 들어, 폐암주 H522M, A549, 및 EKVX을 발현하는 ABCA3 약물 전달체)와 같은 특정 분자체의 기능적 발현을 위해 선택된 인간 종양 세포주 및 유전자 전달 연구에서 간편한 수행을 위해 선택된 인간 종양 세포들 (예를 들어, U2-OS 인간 골육종 세포들).
기능적인 게놈 연구에서 사용되는 포유류 세포주 (예를 들어, NIH 3T3 뮤린 세포주).
척추동물의 단일 세포 형태 (예를 들어, 제브라피시 다니오 [브라키다니오] 레리오(rerio)의 해리성 세포 조제물로부터 유래된 배아, 유충 형 또는 세포들의 성분들).
프로토콜을 스크리닝하는 ADME/Tox(흡수, 분포, 대사, 배설/독성)에 사용되는 세포주 (예를 들어, HepG2와 같은 간세포 유래 세포주).
인간 또는 뮤린 유래의 배아 줄기세포들.
성체 줄기세포들.
중추신경계의 뉴런 및/또는 지지 세포들 (예를 들어 성상세포, 올리고덴드로사이트, 미세아교세포 및 시반세포).
항체를 분비하는 하이브리드를 포함하는 불멸의 체세포 하이브리드 (예를 들어 하이브리도마).
줄기세포 대 비 줄기세포
유핵 세포 혈액 성분들
노화, 비노화, 부착, 비부착, 휴지(quiescent) 및 비휴지 세포들.
본 발명은 비제한적인 예로서 하기에서 선택되는 조사 영역에 적용될 수 있다:
세포들의 생리적 변화로 인한 세포 무결성의 변화 (예를 들어, 증식기의 변화 또는 분화)
질병 과정에 따른 세포들의 변화로 인한 세포 무결성의 변화
박테리아 및 바이러스를 포함하는 감염 물질에 의해 유도된 세포 무결성의 변화
기생충에 의해 유도된 세포 무결성의 변화
물리적 물질(예를 들어, 이온화 및 비이온화 방사선)에 따른 세포들의 변화로 인한 세포 무결성의 변화
광학 활성 물리적 물질 (예를 들어, 양자우물(quantum-well) 수용 나노입자) 또는 크로마틱(chromatic) 염료들의 혼입으로 인한 세포 무결성의 변화
목적으로 하는 공지 또는 비공지 생리활성 물질에 따른 세포들의 변화로 인한 세포 무결성의 변화
독소 (예를 들어, 중금속 오염)의 환경적인 감지를 위한 모니터로서 세포 무결성의 변화
입자의 독소 하중을 수용하는 세포들이 전자 현미경 또는 다른 고해상도 영상 접근법을 이용하는 정확한 분석을 위한 형광 염료들과 함께 위치될 수 있는 이점을 가지는, 나노입자 독성의 세포 무결성의 변화
독소의 검출을 위한 (예를 들어, 생물학적 안정성을 위한 내독소 감지) 세포 무결성의 변화
보안 모니터링 목적 및 신속한 진단을 위해 독성이거나 해로운 물질의 검출을 위한 세포 무결성의 변화
발효 공정의 진행(예를 들어, 양조 적용에서 효모의 생활 주기)을 모니터하기 위한 세포 무결성의 변화
생물 약제학적 제조 공정의 진행 (예를 들어, 사이토카인 생성)을 모니터하기 위한 세포 무결성의 변화
세포 사멸 (세포자살 또는 세포괴사)와 연관된 상태 변환을 파악하기 위한 세포 무결성의 변화
생리적 및 병리적 시스템에서 세포 주기 진행의 분색을 위한 세포 무결성의 변화
약물 스크리닝 또는 발견을 목적으로 약역학적 반응의 분석
교란 물질(perturbing agent) (예를 들어, 세포골격 또는 크로마틴 조절제)에 의해 강요되거나 내부 프로그램의 영향 하에서 상태 변화를 경험함에 따라, 세포 구조와 기능을 조절하는 세포계의 연구를 위한 세포 무결성의 변화
인용된 참고 문헌:
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Giao, M. S., S. A. Wilks, et al. (2009). "Validation of SYTO 9/propidium iodide uptake for rapid detection of viable but noncultivable Legionella pneumophila." Microb Ecol 58(1): 56-62.
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본 발명은 상기 기술되었으나, 본 발명의 범위는 상기 또는 하기 기재, 도면 또는 특허청구범위에 기재된 특징들의 임의의 진보된 조합까지 확장된다. 예를 들어, 본 발명의 일 측면의 구성요소들이 다른 측면의 구성요소들과 결합될 수 있다.
이하에서는, 본 발명에 따른 화합물, 형광 복합체, 방법 및 검출 시스템의 실시예가 첨부된 도면을 참조하여 기술될 것이다.
도 1은 (a) 다수의 염료들, (b) 식(IIA)의 화합물, (c) 식(IA)의 화합물에 대한 여기 및 형광 스펙트럼의 도표이다;
도 2는 (a) 살아 있는 세포들 및 (b) 죽은 세포들과 함께 본 발명의 세포 투과성 및 세포 불투과성 염료들의 조합을 사용하여 얻어진 형광의 도표이다;
도 3은 본 발명의 세포 투과성/세포 불투과성 염료 조합에 기초한 다양한 다색 염료 조합에 대한 형광 스펙트럼의 도표이며, 특히 (a)는 살아있는 세포들에서 3개 파라미터, 2색 검출 기법을 보여주고, (b)는 죽은 세포들에 대한 3개 파라미터, 2색 검출 기법을 보여주며, (c)는 다색 검출 기법을 보여준다;
도 4는 식(IA)의 화합물 및 아넥신 V 조합을 사용한 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 5는 식(IA)의 화합물/화합물 (IIA) 염료 조합을 사용한 검출 시스템을 통하여 얻어진 형광의 도표이다;
도 6은 2색 3개의 형광 색소 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 7은 3색 4개의 형광 색소 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 8은 식(IA)의 화합물에 대한 흡광 및 방출 스펙트럼을 보여준다;
도 9는 (a) 로그 모드로 나타낸 PI 형광 광도를 가지는 프로피디움 요오드화물 (PI), (b) 선형 모드로 나타낸 식(IA)의 화합물 형광 강도를 가지는 식(IA)의 화합물, (c) 로그 모드로 나타낸 식(IA)의 화합물 형광 강도를 가지는 식(IA)의 화합물과 조합한 아넥신 V-FITC를 사용한 실험으로부터 도출된 형광을 보여준다;
도 10은 식(IA)의 화합물을 이용한 고정된 U-2 OS 인간 골육종 세포의 현저한 핵 염색을 보여준다;
도 11은 식(IA)의 화합물을 이용한 약화된(compromised) 막을 가진 세포들의 염색을 보여준다;
도 12는 식(IA)의 화합물의 저독성을 밝혀주는 인간 B 세포 림프종 세포들의 인큐베이션의 효과를 보여준다;
도 13은 스타우로스포린에 대한 반응으로서의 인간 Jurkat 세포 사멸에서 초기 단계의 세포 사멸과 이에 상응하는 혈장 막 무결성 및 미토콘드리아의 상실을 보여준다;
도 14는 공동 표적의(co-targeted) 형광 프로브 화합물 (IA) (죽은 세포들) 및 화합물 (IIA) (살아있는 세포들)을 이용한 세포 상태의 조합 트랙킹(combination tracking)을 보여준다.
도 2는 (a) 살아 있는 세포들 및 (b) 죽은 세포들과 함께 본 발명의 세포 투과성 및 세포 불투과성 염료들의 조합을 사용하여 얻어진 형광의 도표이다;
도 3은 본 발명의 세포 투과성/세포 불투과성 염료 조합에 기초한 다양한 다색 염료 조합에 대한 형광 스펙트럼의 도표이며, 특히 (a)는 살아있는 세포들에서 3개 파라미터, 2색 검출 기법을 보여주고, (b)는 죽은 세포들에 대한 3개 파라미터, 2색 검출 기법을 보여주며, (c)는 다색 검출 기법을 보여준다;
도 4는 식(IA)의 화합물 및 아넥신 V 조합을 사용한 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 5는 식(IA)의 화합물/화합물 (IIA) 염료 조합을 사용한 검출 시스템을 통하여 얻어진 형광의 도표이다;
도 6은 2색 3개의 형광 색소 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 7은 3색 4개의 형광 색소 검출 시스템으로부터 얻어진 형광의 도표이다;
도 8은 식(IA)의 화합물에 대한 흡광 및 방출 스펙트럼을 보여준다;
도 9는 (a) 로그 모드로 나타낸 PI 형광 광도를 가지는 프로피디움 요오드화물 (PI), (b) 선형 모드로 나타낸 식(IA)의 화합물 형광 강도를 가지는 식(IA)의 화합물, (c) 로그 모드로 나타낸 식(IA)의 화합물 형광 강도를 가지는 식(IA)의 화합물과 조합한 아넥신 V-FITC를 사용한 실험으로부터 도출된 형광을 보여준다;
도 10은 식(IA)의 화합물을 이용한 고정된 U-2 OS 인간 골육종 세포의 현저한 핵 염색을 보여준다;
도 11은 식(IA)의 화합물을 이용한 약화된(compromised) 막을 가진 세포들의 염색을 보여준다;
도 12는 식(IA)의 화합물의 저독성을 밝혀주는 인간 B 세포 림프종 세포들의 인큐베이션의 효과를 보여준다;
도 13은 스타우로스포린에 대한 반응으로서의 인간 Jurkat 세포 사멸에서 초기 단계의 세포 사멸과 이에 상응하는 혈장 막 무결성 및 미토콘드리아의 상실을 보여준다;
도 14는 공동 표적의(co-targeted) 형광 프로브 화합물 (IA) (죽은 세포들) 및 화합물 (IIA) (살아있는 세포들)을 이용한 세포 상태의 조합 트랙킹(combination tracking)을 보여준다.
본 발명은 투과성 염로 및 불투과성 염료의 조합을 사용하여 살아있는 세포들 및 죽은 세포들을 표지하는 수단을 제공한다. 이 염료들의 조합은 투과성 염료의 검출은 살아있는 세포들의 존재와 관련될 수 있고, 세포 불투과성 염료의 검출은 죽은 세포들의 존재와 관련될 수 있다는 점에서, 실질적으로 상호 배타적일 수 있다. 이 원칙은 하기 표 1에 나타낸다:
| 세포 상태 | 염료 B투과성( permeant ) | 염료 A불투과성( non - permeant ) |
| 생존 | + | - |
| 사멸 | - | + |
따라서 염료들 간의 "교차 채널" 간섭이 거의 또는 전혀 없기 때문에, 본 발명은 살아있는 세포를 세포 투과성 염료로부터의 형광과 상호 연관시키고, 죽은 세포를 세포 불투과성 염료로부터의 형광과 연관시키는 능력을 제공한다. 이것은 매우 유용한 2색성, 2개-형광 색소 시험을 수행하는 기회를 제공하는 것으로 인식될 것이다. 또한 본 발명자들은, 이러한 타입의 염료 조합이 하나 이상의 형광 색소들을 사용하는 유용한 실험을 수행하기 위한 플랫폼을 제공한다는 것을 인식하였다. 표 2는 식(IIA)의 화합물/식(IA)의 화합물의 특정 세포 투과성/세포 불투과성 염료 조합과 관련하여 비제한적인 예로서 이러한 타입의 검출 시스템을 보여준다.
| 식(IIA)의 화합물 분석과 결합된 화합물 (IA)에 의해 결정되는 세포 상태 | 조합 염색 패턴 |
중첩 스펙트럼 특성을 가진 불소의 포접(Inclusion of fluors) | 상이한 스펙트럼 특성을 가진 불소의 포접(Inclusion of fluors) | |||
| 식(IIA)의 화합물 (530 nm에서) 염색 |
원적외 (>695 nm) 영역에서 화합물 (IA) 염색 | 무손상 세포들의 분석물에 대한 레드 프로브 (예를 들어 Qdot 705 nm 방출 나노입자 표지된 세포) |
손상 세포들의 분석물에 대한 오렌지 프로브 (예를 들어 붕괴된 세포막 특성에 대한 Alexa 568 염료-태그 항체) | 무손상 세포들에 대한 그린 프로브 (예를 들어 아넥신 V-FITC) | 분석을 위해 스펙트럼적으로 상이한 기타 불소들, 예를 들어 세포 표면 분석물 | |
| 살아 있는 세포 염색성 | + | - | + | - | + 또는 - | + 또는 - |
| 죽은 세포 염색성 | - | + | - | + | + 또는 - | + 또는 - |
이러한 가능한 검출 시스템 등은 이하에서 도 1 내지 9를 참조하여 더욱 상세하게 기술할 것이다. 도 1은 식(IIA)의 화합물 (B) (518/615nm에서 Ex/Em 피크) 및 식(IA)의 화합물 (A) (620/660nm에서 Ex/Em 피크)의 여기 및 형광 스펙트럼을 일반적으로(즉, 도표로 나타내어) 보여준다. 식(IIA)의 화합물 형광은 통상 가시 스펙트럼의 오렌지 영역에 존재하는데 반해, 화합물 (IA)의 형광은 통상 가시 스펙트럼의 원적외 영역에 존재한다. 도 1b는 식(IIA)의 화합물 단독의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 식(IIA)의 화합물은 세포 투과성 염료이므로, 형광 신호 B는 살아있는 세포나 죽은 세포와 관련된 것으로 예상된다. 도 1c는 화합물 (IA) 단독의 형광 신호 A를 보여준다. 화합물 (IA)는 세포 불투과성 염료이므로, 형광 신호 A는 죽은 세포 또는 죽어가면서 살아있지 않은 세포와 관련하여서만 관찰될 수 있다. 도 2a는 세포 투과성 염료 (예. 식(IIA)의 화합물) 및 세포 불투과성 염료 (예. 화합물 (IA))의 특정 조합이 살아있는 세포들과 관련하여 사용될 때, 얻어지는 형광을 나타낸 것이다. 예상되는 바와 같이, 세포 투과성 염료와 관련하여 형광 신호 B만이 관찰되었다. 도 2b는 식(IIA)의 화합물/화합물 (IA)의 조합과 같은, 세포 투과성/세포 불투과성 염료들의 특정 조합이 사용될 때, 본 발명에 따라 제공되는 놀라운 효과를 보여준다. 관찰된 형광의 유효한 기여는 식(IIA)의 화합물 염료로부터 나오는 것으로 예상될 수 있다. 그러나 죽은 세포와 관련하여, 식(IIA)의 화합물 염료로부터 관찰되는 형광은 거의 또는 전혀 없는 것으로 밝혀졌다. 오히려 관찰된 형광의 전부 또는 거의 전부가 세포 불투과성 염료인 화합물 (IA)로 인한 것이다. 따라서 화합물 (IA) 염료는 식(IIA)의 화합물 신호를 퀀치(quench)하는 것으로 여겨진다. 매우 놀랍게도, 이러한 식(IIA)의 화합물 신호의 퀀칭은 단지 세포 핵 내에서만이 아니라 세포 전체에 걸쳐서 나타나는 것으로 보인다. 특정 이론에 구애받는 것은 아니나, 본 발명에 의해 제공되는 놀랄만한 퀀칭 효과는, 세포 불투과성 염료의 결합 친화성보다 더욱 강력한, 죽은 세포들 내의 핵산, 및 가능하게는 다른 기대분자 물질에 대한 결합 친화성을 가지는 세포 불투과성 염료에 원인이 있을 수 있다. 그러나 다른 메커니즘도 작용할 수 있다. 결국 하나의 스펙트럼 영역 A에서의 형광은 죽은 세포들과 관련되고, 다른 스펙트럼 영역 B에서의 형광은 살아있는 세포들과 관련된, 세포의 상태를 표시하는 "교통 신호등" 시스템을 제공할 수 있다.
이 시스템의 유용성은, 스펙트럼 영역 A 및 B에서 2색 검출을 사용한 제3의 검출 채널을 제공할 수 있다는 점이다. 도 3은, 3개 채널의 2색 검출 시스템이 특정 세포 투과성/세포 불투과성 염료 조합인 식(IIA)의 화합물/화합물 (IA)와 관련하여 어떻게 제공될 수 있는지를 보여주는 일부 예를 나타낸 것이다. 도 3a는 스펙트럼 범위 A 및 B를 사용하여 살아있는 세포들에서 검출되는 형광을 보여준다. 범위 B의 형광은 앞서 설명한 바와 같이 식(IIA)의 화합물로부터의 방출과 관련이 있다. 이 도표에서, 식(IIA)의 화합물은 화합물 (IA), 및 바람직하게는 Qdot 705nm 방출 나노결정과 같은 무손상 세포들과 관련된, 발광제 또는 추가적인 레드 염료와 조합하여 사용된다. 이 시스템은, 식(IIA)의 화합물의 양성 신호를 제공하는 세포들이 화합물 (IA)로 인한 레드 영역의 신호를 나타내지 않으며, 살아있는 세포로서 양성으로 확인될 수 있다는 사실을 이용한 것이다. 본 발명은, 오렌지 영역에서 식(IIA)의 화합물의 형광을 통하여 이러한 방식으로 "태그된(tagged)" 살아있는 세포들은 화합물 (IA) 방출로부터의 간섭이 없는 레드 영역 A에서 잠재적인 검출 채널을 가지는 것으로 이해된다. 도 3b는 식(IIA)의 화합물의 형광으로부터의 간섭이 실질적으로 없는 오렌지 영역 B에서 죽은 세포들 내 잠재적인 검출 채널의 존재를 이용하는 검출 도표를 도시한 것이다. 도 3b에 나타난 바와 같이, 레드 스펙트럼 영역 A에서의 화합물 (IA) 형광의 존재가 세포를 죽은 세포로서 "태그"한다. 만약 제2의 오렌지 염료가 사용되면, 도 3b에 도시된 것과 같은 형광 스펙트럼이 얻어질 수 있으며, 이때 제2의 오렌지 염료는 죽은 세포들과 관련된 추가적인 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 상대적으로 간단한 검출 시스템을 사용하여 다량의 정보가 도출될 수 있기 때문에, 이러한 타입의 3가지 형광 색소의 2색 검출 시스템을 사용하는 것은 매우 편리하다. 그러나 본 발명은 전자기 스펙트럼의 2개 이상의 영역에서 형광을 사용하는 다색 염료 조합의 사용을 포함한다. 도 3c는 일반화된 다색 염료 형광 도표를 도시한 것으로서, 이때 스펙트럼 영역 A 및 B와 상이한 스펙트럼 영역에서 형광을 내는 하나 이상의 염료들이 사용된다.
도 4는 그린 스펙트럼 영역에서 형광을 내는 아넥신 V-FITC와 같은 아넥신 V 분석과 결합하여 화합물 (IA)을 사용하는 검출 시스템으로부터 얻어질 수 있는 결과를 보여준다. 염료들의 이러한 조합은 세포자살과 관련된 세포 사멸 단계에 대한 개선된 식별법을 제공한다. 도 4에 나타난 바와 같이, 낮은 화합물 (IA)/낮은 아넥신 V 신호는 정상 세포들을 의미한다. 자살 세포들은 낮은 화합물 (IA) 신호와 결합하여 증가된 아넥신 V 신호에 의해 표시된다. 세포 사멸의 개시는, 높은 아넥신 V 신호 및 제한된 화합물 (IA) 신호의 존재에 의해 표시된다. 세포 파편(debris)을 의미하는 낮은 아넥신 V 신호 및 높은 화합물 (IA) 신호를 포함하는 채널에 의해 추가적인 식별이 제공된다.
도 5는 도 4에 나타낸 것과 동일한 형태의 플롯으로서, 식(IIA)의 화합물/화합물 (IA) 염료 조합을 사용하는 검출 시스템에서 형광 강도를 보여주는 일예를 도시한 것이다. 여기서도 또한 식별 수준이, 세포 사멸에 이르기까지의 세포 진행에서 관찰된다. 더욱 구체적으로, 낮은 화합물 (IA) 형광 신호가 보고될 때, 3가지 상이한 "채널"이 확인될 수 있다. 낮은 화합물 (IA) 신호와 결합된 식(IIA)의 화합물에 대한 오렌지 영역에서의 양성 신호는 정상 세포들을 표시하는 것이나, 증대된 식(IIA)의 화합물 신호는 휴지(arrested) 세포들을 표시하는 것이다. 화합물 (IA) 및 식(IIA)의 화합물 모두에 대해 음성 신호는 세포 파편을 나타내는 것이다. 음성 식(IIA)의 화합물 신호와 조합된 양성 화합물 (IA) 신호는 죽은 세포들을 표시한다. 당업자라면, 도 5를 고려하여, 2가지 추가적인 채널, 즉, 높은 레드 신호와 높은 오렌지 또는 증대된 오렌지 신호와의 조합이 잠재적으로 이용가능하다는 점을, 인식할 수 있을 것이다. 높은 또는 증대된 오렌지 신호는 살아있는 세포들의 존재와 관련이 있기 때문에, 이러한 오렌지 신호들의 조합에서 높은 화합물 (IA) 신호를 얻는 것은 불가능하다. 그 대신, Qdot 705 nm 방출 나노결정과 같은, 레드 영역에서 형광을 내는 제3의 형광 색소를 사용하여, 2색성 3개 형광 색소 분석 시스템을 사용할 수 있다. 상기 시스템의 이점은, 단일 레이저 컬러가, 예를 들어 Ar-이온 레이저로부터의 488nm 방사선을 사용하여, 모든 3개 형광 색소들을 여기시키는데 사용될 수 있다는 점이다.
도 6은 도 5에 나타낸 것과 동일한 형태의 플롯으로서, 화합물 (IA) 및 식(IIA)의 화합물과 조합하여 Qdot 705 nm 방출 나노결정을 사용하는 2색성 3개 형광 색소 분석 시스템을 도시한 것이다. Qdot 나노결정으로부터 레드 스펙트럼 영역에서의 형광은, 살아있는 세포들로부터의 화합물 (IA) 형광이 부재하기 때문에 이용가능한 2개 채널에서 관찰되는 것으로 볼 수 있다.
도 7은 식(IIA)의 화합물/화합물 (IA)의 세포 투과성/세포 불투과성 염료 조합에 기초한 3색 시스템으로부터 도출될 수 있는 결과를 나타낸 것이다. 본 구현예에서, 스펙트럼의 레드 영역에서 형광을 내는 Qdot705 nm 방출 나노결정과 같은, 제3의 형광 색소는, 식(IIA)의 화합물의 형광 검출을 통해 양성으로 표지된 살아있는 세포들을 탐침하기 위해서 사용된다. 또한 스펙트럼의 그린 영역에서 형성되는 검출을 보이는, 아넥신 V-FITC와 같은 제4의 형광 색소가 사용된다. 이러한 검출 방식은 2개 레이저 3색성 4개 형광 색소 분석 기술로서 특성화될 수 있다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, 상기 시스템으로부터 도출된 결과는 3색 범위에서 얻어진 형광을 나타내는 3축 시스템을 사용하여 제공될 수 있다. 따라서 상기 얻어진 결과는, 정상 상태로부터 세포자살 및 세포 사멸에 이르기까지의 세포 진행에서 증대된 식별 수준을 제공하는, 3차원 용적 데이터와 관련된 것으로 이해될 것이다. 특히, 낮은 화합물 (IA) 신호, 증대된 식(IIA)의 화합물 신호 및 높은 아넥신 V-FITC 신호의 조합이 휴지 및 세포자살 상태의 세포들을 표시하는 반면, 높은 화합물 (IA) 신호, 낮은 식(IIA)의 화합물 신호 및 높은 아넥신 아넥신 신호의 조합은 죽은 세포들을 표시한다. 이 시스템은 세포 과정에 대한 다량의 정보를 제공할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 모든 세포들은 도 7에 도시된 검출 용적에 존재한다는 점을 주의해야 한다. 결과를 해석하기 위하여 적절한 다색(multi-colour) 분석이 수행될 수 있다. 다르거나 추가적인 수준의 식별과 정보를 제공하기 위하여, 형광 색소들의 다른 조합이 사용될 수 있다. 원칙적으로 추가의 형광 색소들이 추가 정보를 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 추가의 형광 색소들의 검출 특성이 식(IIA)의 화합물 또는 아넥신 V-FITC 검출 채널을 간섭하지 않는다면, 추가적인 컬러 채널을 제공하는 상이한 스펙트럼 또는 영역에서 형광을 내는 추가의 형광 색소들, 또는 가능하게는 오렌지 또는 그린 스펙트럼 영역에서 형광을 내는 형광 색소가 사용될 수 있다. 그린 및/또는 시안(cyan) 염료들이 세포 변화 과정을 추적하기 위해 사용될 수 있다.
실시예
1. 식(
IIA
)의 화합물인 [1,5-비스{[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-
디온
] 및 식(
IB
)의 화합물인 [1,5-비스{N-[2-(
트리메틸아미노
)에틸]아미노} 안트라센-9,10-
디온
요오드화물]의 합성
1,5-비스{[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온을 WO99/65992의 실시예 1에 따라 합성하였다. 클로로포름 (2mL)을 1,5-비스{[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}안트라센-9,10-디온 (58 mg, 0.152 mmol)에 가하였다. 암자색 용액에 MeCN (1mL)을 가한 다음, 메틸 요오드화물 (95 ㎕, 1.524 mmol)을 가하였다. 10분간 교반한 후, 침전을 형성하였다. 4시간 동안 교반한 후, 휘발물을 증발시켰다. 클로로포름 (5ml)으로부터 분말화하고(triturated), 여과에 의해 수집한 잔여물을 디클로로메탄 (20ml) 및 디에틸에테르 (10ml)로 세척하였다. 짙은 분홍색 고체를 분리하였다 (0.09 g, 0.135 mmol, 89 % 수율). 1H NMR (400MHz, d6-DMSO) δ: 9.69 (2H, t), 7.72 (2H, dd), 7.52 (2H, dd), 7.30 (2H, dd), 3.91 (4H, q), 3.62 (4H, t), 3.18 (18H, s)
실시예
2.
식(
IA
)의 화합물인 [1,5-비스{[2-(
트리메틸아미노
)에틸]아미노}-5,8-디
하이드록시안트
라센-9,10-
디온
요오드화물]의 합성
1,5-비스{[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10- 디온을 WO99/65992의 실시예 1에 따라 합성하였다. 1,5-비스{[2-(디메틸아미노)에틸]아미노}-5,8-디하이드록시안트라센-9,10-디온 (44 mg, 0.107 mmol)에 클로로포름 (2mL)을 가하였다. 암자색 용액에 MeCN (2mL)을 가한 다음, 메틸 요오드화물 (66.6 ㎕, 1.067 mmol)을 가하였다. 1분간 교반한 후, 침전을 형성하였다. 4시간 동안 교반한 후, 휘발물을 증발시켰다. 클로로포름 (5ml)으로부터 분말화하고, 여과에 의해 수집한 잔여물을 디클로로메탄 (20ml) 및 디에틸에테르 (10ml)로 세척하였다. 짙은 청색의 고체를 분리하였다. 수율 = 173-012 (0.05 g, 0.068 mmol, 63.9 % 수율) 1H NMR (400MHz, d6-DMSO) δ: 13.97 (2H, s), 9.77 (2H, br t), 7.49 (2H, d), 7.40 (2H, d), 3.96 (4H, br q), 4.09 (4H, t), 3.19 (18H, s).
실시예
3. 화합물 (
IA
)의 스펙트럼 특성
화합물 (IA)를 실시예 2에 기재된 원리를 사용하여 합성하고, 완충액 중에 희석하는 5 mM 화합물 (IA)의 원액으로서 +4℃에서 저장하였다. 1 cm 경로의 석영 실리카(quartz silica) 큐벳에서 측정되고 PBS에 용해된 물질의 20 μM 용액 및 분광기를 사용하여 흡광 스펙트럼을 도출하였다. 1 cm 경로 길이의 세미마이크로 석영 큐벳에서 20 μM 화합물(IA)의 용액에 대한 형광 스펙트럼을 633, 589, 534, 488 nm에서 여기상태에서 산출하였다. 슬릿 너비를 10 nm로 설정한 Perkin Elmer LS50 분광형광계 상에서 형광을 측정하였다. 상기 분광형광계는 레드-민감성 포토멀티플라이어 관(Type R928; Hamamatsu Photonics KK, Japan)을 장착하였다. 데이터를 모아서 스프레드 시트로 전환 발송하여, 버퍼 제어를 위해 수정하고 최대 방출을 측정하였다. 결과는 도 8에 나타낸다. 화합물 (IA)는 488 nm (유세포 측정기 이용)로부터 647 nm (Exλmax 646 nm)까지의 파장으로 준최적으로 여기시킬 수 있다. 전형적으로, 세포 이미지화를 위해, 633 nm 또는 647 nm 파장으로 여기하였다. 방출 스펙트럼은 여기 파장과는 별개인데, 다시 말해서 방출 스펙트럼은 여기 파장과 무관하게 동일하다.
실시예
4. 세포 사멸 유도에 대한
아넥신
V 분석에서 살아있는 세포와 죽은 세포를
구분하는데 있어
화합물의 세포 불투과성 이용
본 실시예는 세포독성 약물 (VP-16)에 노출된 적 있는 인간 B 세포 림프종 (DoHH2)에서의 내부 (세포질) 엽상부로부터 포스파티딜세린 분자의 전위와 관련된 후기 세포 사멸에 관한 것이다. 용량-의존적인 세포자살 유발은 유세포 측정기를 이용하여 검출하였다.
본 출원인은, 선택적인 여기를 이용함으로써 통상적으로 사용되는 다른 형광색소들로부터, 심홍색 형광 프로브를 이용하는 스펙트럼 이점을 비롯하여, 에토포시드 (VP-16)를 이용한 세포자살 유도 결과로서 강화된 세포막 투과성화로 인한 비-생존성 분획을 확인하는 세포 생존성 마커로서의 화합물 (IA)의 용도를 입증하고자 하였다.
화합물 IA는 프로피디움 요오드화물과 유사한 정확성으로 비-생존 분획을 검출할 수 있다. 이 분획은 에토포시드의 용량 증가에 따라 용량 의존적인 양상으로 증가되었다. 화합물 (IA) 표지를 최적화하기 위해 일정 간격의 흡수를 수행하였다. 또한, 용량도 수정하여 화합물 (IA)의 최적 농도를 결정하였다.
시약
VP-16 (VP-16-213; VEPESID; 에토포시드(Etoposide))은 34 mM 원액(Bristol Meyers Pharmaceuticals, Syracuse, NY)으로 입수하여, 4℃에 보관하였다. 플루오레세인-접합된 아넥신 V (아넥신 V-FITC)는 Pharmingen (Becton Dickinson UK, Oxford, UK.)에서 구입하였다. 프로피디움 요오드화물 (PI)은 1 mg/ml 수용액 (Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands)으로 입수하였다. 화합물 (IA)는 5 mM 수용액으로서 제형화하여, 4℃에 보관하였다.
세포 배양 및 약물 처리: 인간 여포 B-림프종 세포주를 본 실험에 사용하였다. DoHH2는 JC Kluin-Nelemans [Leiden, The Netherlands] 박사로부터 친절하게 제공받았다. DoHH2는 5% FCS와 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2/95% 공기의 가습 분위기에서 출발 밀도 5 x 104 세포/ml로 시작하여 매주 2번 계대 배양하였다. 세포는 다양한 용량의 VP-16 (0-2.5 μM)에 노출시켜, 세포자살을 유도하였다 [Paul J. Smith, Marie Wiltshire, Sharon Davies, Suet-Feung Chin, Anthony K. Campbell, and Rachel J. Errington (2002). DNA damage-induced [Zn2+]i transients: correlation with cell cycle arrest and apoptosis in lymphoma cells. Am J Physiol Cell Physiol 283 (2): 609-622]. 인간 Jurkat 세포도 비슷한 방식으로 배양하였다.
아넥신 -V 표지용 샘플 준비; 세포자살 변화를 겪고 있는 세포에 결합하는 아넥신 V-FITC를 검출하기 위한 샘플을 준비하고, PI 또는 화합물 (IA)로 공-염색하여, 원형질막(plasma membrane)의 완전성의 상실을 검출하였다. 샘플은 Vermes et al 에 따라 준비하였다. 간략하게는, 세포 샘플 (4 x 105 세포/ml)을 차가운 PBS로 헹구고, 1X 결합 완충액 (10 mM Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 2 x 105 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 이 용액 100 ㎕를 샘플 당 둥근 바닥의 폴리스티렌 플로우 튜브 (Falcon) 1개에 넣고, 여기에 아넥신 V-FITC 5 ㎕와 PI (50 ㎍/ml 원액) 10 ㎕를 필요에 따라 첨가하였다. 대조군 샘플은 필요에 따라 모의-처리하였다. 샘플은 살살 볼텍싱한 다음, 암조건에서 15분간 실온에서 인큐베이션하였다. 1X 결합 완충액 400 ㎕를 각 튜브에 첨가하고, 샘플을 최대 1시간 동안 얼음 위에 둔 다음, 유세포 측정으로 분석하였다.
유세포 측정: Coherent Enterprise II 아르곤 이온 레이저 488 nm 및 멀티라인 UV (351 - 355 nm) 출력 (Coherent, Inc., Santa Clara, CA)이 장착된 FACS Vantage 유세포 측정기 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 사용하였다. Enterprise II 레이저의 전력은 30 mW (멀티라인 UV 출력에서 모니터링함)로 조절하고, 신호 입수 및 분석에는 CELLQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems)를 사용하였다. 정방향 산란(Forward scatter: FSC) 및 측면 산란 (side scatter: SSC)을 선형 모드에서 획득하였다. 488 nm 여기로부터 파생되는 FITC 및 PI 형광 신호를 광전자 증배관에서 로그 모드로 검출하여, 광학 필터에 의해 스펙트럼에 따라 선정되는 방출을 검출하였고; 488 nm 여기에서 파생되는 화합물 (IA) 신호는 로그 또는 선형 모드에서 검출하였고, 광학 시스템에 편리하게 통합된 제3 레이저를 이용한 633 nm에서의 여기 후에도 검출할 수 있었다. 488 nm 여기 시 발생되는 식 (IIA)의 화합물 신호는 로그 또는 선형 모두 둘 다에서 검출하였다. 정방향 및 측면 산란 신호와 형광 신호는 정방향 광 산란 파라미터를 마스터 신호로 이용하여 10,000개의 세포에서 수집하였다. 당해 기술 분야에서 쉽게 인지되는 바와 같이, 형광 신호의 펄스 분석과 형광 보상 설정을 변경하여, 멀티-형광 조합물내 세포 서브세트에 대한 인지를 개선시켰다. 데이타는 평균 형광 강도 (IF) 수치로 표시하였고, 도 9에 나타낸다.
실시예
5. 형광 현미경에 의해 검출되는 식 (
IA
)의 화합물에 의한, 고정된 U-2
OS
인간 골육종 세포의 현저한 핵 염색
본 출원인은 화합물 (IA)가 핵 DNA를 효과적으로 표적하는 특성을 확인하고자 하였다.
세포 배양: 인간 골육종 세포인 U-2 OS (ATCC HTB-96) 세포 (부착형)는 10% 소 태아 혈청 (FCS), 1 mM 글루타민 및 항생제가 첨가된 맥코이 5a 배지에서 배양하고, 37℃, 5% CO2 공기 분위기에서 인큐베이션하였다. 형광 이미지화 실험을 위해, 세포를 커버글래스 바닥의 챔버 (Nunc, 2 Well Lab-Tek II, Fisher Scientific) 안에서 단층으로서 1 x 105 세포/ml의 밀도로 배양하였다.
이미지화: 24시간 후, 세포를 PBS 중에서 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 15-30분간 고정하였다. 세척 단계는 필요하지 않았다. 화합물 (IA)는, 임의의 처리 후, 최종 염색 공정까지 적절한 방식으로 사용하였다. 화합물 (IA)는 부착된 세포 위 0.5 ml PBS로 20 μM로 직접 첨가하였다. 세포는 와이드-필드 형광 현미경을 이용하여 직접 검경하였다. 챔버를 Axiovert 100 현미경 (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, UK, 유침 평면 에퍼크로매트 렌즈 사용)에 두고, 형광 이미지 (Ex: 620/60nm; Em 700/75nm)를 ORCA-ER CCD 카메라 (Hamamatsu, Reading, UK)와 MetaMorph (MDS, USA) 취득 소프트웨어로 포착하였다. 세포에서 화합물 (IA)가 핵내에 높은 수준으로 국지화되는 것으로 나타났다. 핵의 화합물 (IA) 염색은 단순 역치 알고리즘을 이용하여 분할하여, 핵을 표시하고, 각 핵(목표) 국지성에 대한 바이너리 및 마스크 정보를 제공하였다. 오리지날 화합물 (IA)의 핵 국지성은 분할화 후 확인되었다. 결과는 도 10에 나타낸다.
실시예
6.
약화된
막을 가진 세포를 식 (
IA
)의 화합물로 염색함으로써
무손상
세포의 염색 음성에 의해 식별할 수 있다.
본 실시예는 유세포 측정으로 분석한 인간 Jurkat 세포 집단에서의 스타우로스포린에 의한 세포 사멸 유도 분석을 보여준다. 본 출원인은, 스타우로스포린으로 유도된 세포 사멸로 인한 세포의 막 투과성 증가에 따라 비-생존 분획을 측정하는, 세포 생존 마커로서의 화합물 (IA)의 용도를 입증하고자 하였다.
세포 배양 및 약물 처리: 본 분석에서는 Jurkat 세포주를 사용하였고, Jurkat 배양물은 10% FCS와 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 통상적으로 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2/95% 공기의 가습 분위기에서 출발 밀도 5 x 104 세포/ml로 시작하여 매주 2번 계대 배양하였다. 세포는 0.5 x 105 세포/ml의 밀도로 플라스크 당 5 ml로 설정하였다. 세포를 표준 배양 조건 하에서 24시간 동안 0 및 2 μM 스타우로스포린에 노출시켜, 세포 사멸을 유도하였다. 5 mM 스톡으로부터 화합물 (IA)을 (3 μM)로 각 샘플에 첨가하고, 유세포 측정으로 분석하였다.
유세포 측정: Coherent Enterprise II 아르곤 이온 레이저 488 nm 및 멀티라인 UV (351 - 355 nm) 출력 (Coherent, Inc., Santa Clara, CA)이 장착된 FACS Vantage 유세포 측정기 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)를 사용하였다. Enterprise II 레이저의 전력은 30 mW (멀티라인 UV 출력에서 모니터링함)로 조절하고, 신호 입수 및 분석에는 CELLQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems)를 사용하였다. 정방향 산란(Forward scatter: FSC) 및 측면 산란 (side scatter: SSC)을 선형 모드에서 획득하였다. 488 nm 여기로부터 파생되는 화합물 (IA) 형광 신호를 정방향 및 측면 산란에 대해 FL3 695LP 시그널에서 로그 모드로 검출하고, 정방향 광 산란 파라미터를 마스터 신호로 이용하여 10,000개의 세포에서 형광을 수집하였다. 데이타는, 세포 크기를 나타내기 위해, 정방향 산란 신호에 대한 화합물 (IA)의 등고선도 형광 세기 (695LP)로서 표시하였다. 결과는 도 11에 나타낸다.
실시예
7.
저독성의
세포 불투과성 염료인 것으로 확인되며, 소정의 처리와 관련된 세포 사멸의 증가를 결정하기 위한 살아있는 세포의 장기간의
인큐베이션에
투입하는데 유익한 특성인 것으로 시사되는, 식 (
IA
)의 화합물의, 인간 B 세포 림프종 (
SU
-
DHL
-4) 세포의
인큐베이션에
대한 효과.
세포 배양 및 약물 처리: 인간 여포 B-림프종 세포주를 본 실험에 사용하였다. SU-DHL-4는 10% FCS와 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 통상적으로 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2/95% 공기의 가습 분위기에서 출발 밀도 5 x 104 세포/ml로 시작하여 매주 2번 계대 배양하였다. 세포는 0.5 x 105 세포/ml의 밀도로 플라스크당 5 ml로 설정하였다. 각 배양물을 화합물 (IA)의 3가지 농도 (0, 3 및 10 μM) 중 한가지 농도에 96시간 동안 표준 배양 조건 하에 계속적으로 노출시켰다. 시간 (t) 0, 24, 48, 72 및 96 시간째에, 각 플라스크로부터 샘플 0.4 ml을 위하여 Coulter 카운팅에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 데이타는 소정의 농도의 화합물 (IA)에 대한 경시적인(시간) 상대적인 세포수 증가 (Nt/N0) (695LP)로 나타내었다. 그 결과는 도 12에 나타낸다.
실시예
8. 세포자살
유도제인
스타우로스포린에
대한 반응으로서의 미토콘드리아 막 전위 상실과 연관된 인간
Jurkat
세포 사멸의 초기 단계
무손상 세포와 손상 세포를 구분하기 위한 수단을 제공하기 위한, 분석에 공동-도입하는데 유익한 세포 완전성 상실에 대한 정보를 표시하는 것과 관련된 특성을 가진 기타 형광시약을 이용한 전형적인 다변수 분석에서의, 바람직한 세포 불투과성 염료 (식 (IA)의 화합물)의 혼용.
본 실시예에서는, 염료 JC-1 (5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸-카보시아닌 아이오다이드)은 미토콘드리아 막에 병합되어, 미토콘드리아의 생리학적 유지 막 전위로 인해 응집(aggregate)을 형성할 수 있는, 친지성의 양이온성 형광 물질이다. 응집은 JC-1의 형광 특성을 변형시켜, 그린에서 오렌지로 형광이 바뀐다. 유세포 측정 또는 이미지화를 이용하여 오렌지 형광의 감소와 그린 형광의 증가를 모니터링하여, 비-세포자살 세포들로부터 세포자살 세포를 구분할 수 있다. 그래서, 바람직한 세포 불투과성의 오렌지가 아닌 적색 형광 특성을 가진 염료를 추가적으로 도입함으로써, 막 완전성 상실로 인한 세포 사멸 후기에 이미 그러한 세포를 공동-동정할 수 있으며, 이전에는 달성할 수 없었던 세포 사멸 단계들에서 세밀한 해상력을 제공할 수 있다.
세포 배양 및 약물 처리: 본 분석에서는 Jurkat 세포주를 사용하였고, Jurkat 배양물은 10% FCS와 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 통상적으로 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2/95% 공기의 가습 분위기에서 출발 밀도 5 x 104 세포/ml로 시작하여 매주 2번 계대 배양하였다. 분석을 위해, 세포는 0.5 x 105 세포/ml의 밀도로 플라스크 당 1 ml로 설정하였다. 세포를 4시간 동안 0 (대조군 조건) 및 1 μM 스타우로스포린에 노출시켰다. 세포를 세척하고, JC-1 (RPM)에 노출시켰다. 5 mM 스톡으로부터 화합물 (IA)를 (3 μM)로 각 샘플에 첨가하였다. 그런 후, 유세포 측정으로 분석하거나, 또는 Nunc, 2 Well Lab-Tek II, (Fisher Scientific)로 옮겨 3 채널 공초점 현미경으로 분석하였다.
스타우로스포린 처리 세포에 대한 다변수 유세포 측정: FACS Vantage 유세포 측정기(상기 예로 같음). 정방향 산란 (FSC) 및 측면 산란 (SSC)은 선형 모드로 입수하였다. 488 nm 여기로부터 JC-1 2 파라미터 형광 신호가 파생되었으며, 이를 로그 모드에서 검출하고, 그린 J-모노머는 FL1 (530/30 nm 방출)으로 검출하고; 오렌지 J-응집은 FL2 (585/42 nm 방출)를 이용하여 검출하였다. 또한, 488 nm 여기에서 파생되는 화합물 (IA)의 형광 신호를 FL3 695LP에서 로그 모드로 검출하였다. 정방향 및 측면 산란 신호와 형광 신호는 정방향 광 산란 파라미터를 마스터 신호로 이용하여 10,000개의 세포에서 수집하였다. 결과는 도 13 (A-C)에 나타낸다. JC-1 데이타는 J-모노머에 대한 형광 세기 (530/30 nm)에 대한 J-응집체에 대한 등고선도 형광 세기 (585/42 nm)로서 나타낸다. 이를 추가적으로 미토콘드리아 막 전위가 높은 세포 (상단)와 미토콘드리아 막 전위가 낮은 세포 (하단)로 나누었다. 화합물 (IA)를 이용하여 이들 2가지 분획들에서 세포 생존성을 동시에 표시하였다. 상단은 주로 살아있는 세포로 구성되며, 하단은 비-생존 세포와 생존 세포 둘다로 구성되며, 화합물 (IA)의 기능성(functionality)은 이들 서브-분획들 (초기 (화합물 (IA) 음성) 및 후기 세포자살 (화합물 (IA) 양성 및 투과성))에서 나타날 수 있다.
스타우로스포린 처리 세포의 다변수 이미지화. 스캐닝 유닛은 planapo 60x/1.4 NA 유침 렌즈를 적용한 Nikon Eclipse TE300 도립 현미경과 연계된 BioRad Radiance MP system (BioRad Microscience, Hemel Hempstead, UK)을 사용하였다. 3중 채널, 3차원 (3D) (x,y,z) 이미지를 공초점 구성 (핀홀 닫음)으로 수집하였다. 모든 채널들, 그린 (J-모노머, 488 nm에서 여기, 500-530 nm에서 방출); 오렌지 (J-응집체, 488 nm에서 여기, 590/70에서 방출); 레드 (화합물 (IA)) (비생존 세포 마커, 637 nm에서 여기, 660LP에서 방출)을 동시에 수집하였다. 3D 이미지 시퀀스는 하나의 최대 프로젝션 이미지로 처리하였고, 3가지 채널 모두 J-모노머, J-응집체 및 DNA 핵 세포로서 표시되었다. 결과는 도 13(D)에 나타낸다.
본 출원인은 바람직한 세포 비투과 염료와 제2 바람직한 세포 투과 염료 간의 타겟 경쟁에 의한 신호 소멸 컨셉을 이용하는 멀티-형광색소 활용법을 개발하고자 하였다. 스펙트럼 분리는 임의의 소정의 세포내에서의 오직 하나의 염료로부터 발생하는 신호만을 제시하며, 따라서 당해 분야에서 쉽게 용인되는 다색 분석 수준이 높은 기존의 멀티-형광색소 분석에 이렇듯 단순하게 혼용할 수 있다.
실시예
9. 세포 상태의 조합
트랙킹
(
combination
tracking
). 생존/휴지 세포 (화합물 (
IIA
) 양성) 및 손상 (화합물 (
IA
) 양성) 세포를 측정하는 분석을 도출하기 위해,
VP
-16으로 처리된
DOHH2
배양물에서 서브-집단의 공동-표지가 없음을 입증하기 위한, 식 (
IA
)의 화합물 + 화합물 (
IIA
)을 이용한 세포 집단의 표지.
세포 배양 및 약물 처리: 인간 여포 B-림프종 세포주를 본 실험에 사용하였다. DoHH2는 5% FCS와 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 통상적으로 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO2/95% 공기의 가습 분위기에서 출발 밀도 5 x 104 세포/ml로 시작하여 매주 2번 계대 배양하였다. 세포는 5 x 105 세포/ml로 설정하고, 세포에 VP-16 (0.25 μM)을 노출시켜, 세포자살을 유도하였다. 20 μM 화합물 (IIA)와 4 μM 화합물 (IA)를 세포 1 ml에 첨가하여, 표준 배양 조건 하에 10분간 인큐베이션하였다. 샘플을 유세포 측정으로 분석하였다.
FACS Vantage 유세포 측정기 (상기 실시예에서와 같음)를 사용하였다. 화합물 (IIA)와 화합물 (IA)의 488 nm 여기에서의 형광 신호는, 화합물 (IIA)의 경우 FL2 (585/42 nm 필터)에서 선형 모드로 검출하였고; 488 nm에서의 화합물 (IA)의 신호는 695LP 필터와 FL1/2 560 nm SP 2색성 SP로 FL3에서 선형 모드로 검출하여, 산란 특성을 측정하였다. 정방향 및 측면 산란 신호와 형광 신호는 정방향 광 산란 파라미터를 마스터 신호로 이용하여 10,000개의 세포에서 수집하였다. 데이타는 등고선도로 표시하여, 도 14에 나타낸다. 측면 대 정방향 산란 등고선도는 세포의 2가지 집단을 나타낸다. 화합물 (IIA) 및 화합물 (IA)의 첨가는 이들 배양물의 기능적인 상태를 알려준다. 먼저, 세포들 모두 이들 2가지 공동-타겟팅 형광발색단을 이용한 분석에서 확인된다. 화합물 (IA)는 무손상 세포 분획을 식별하며, 화합물 (IIA) 양성 세포는 살아있는 세포 (생존) 분획을 표시한다. 이러한 생존 분획은 2가지 집단을 포함하며, 휴지기 (G2) 집단의 증가를 추가로 나타낸다. 아울러, 화합물 (IIA) 분획은 높은 정방향 산란 특성 (즉, 세포 크기)을 가진 고유 분획을 나타내는 반면, 화합물 (IA) 집단은 보다 낮은 평균적인 정방향 산란 특성을 나타내었다.
Claims (47)
- 하기 식 (I)의 화합물 또는 NR1기가 4급화된(quaternarised) 유도체:
(I)
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임). - 제1항에 있어서,
X1, X2 및 X3 중 하나 이상은 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m인 화합물. - 제2항에 있어서,
X2는 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m이고, X1 및 X3는 NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m가 아닌 화합물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
X1 및 X3는 하이드록실인 화합물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
X1 및 X3는 수소인 화합물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
R1은 수소인 화합물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
R2, R3 및 R4는 C1 -4 알킬인 화합물. - 제7항에 있어서,
R2, R3 및 R4는 메틸인 화합물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
A는 (CH2)2인 화합물. - 하기 식(IA)의 화합물:
(IA)
- 하기 식(IB)의 화합물:
(IB)
- 핵산 및 하기 식(I)의 화합물 또는 NR1기가 4급화된 유도체를 포함하는 형광 복합체:
(I)
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임). - 제12항에 있어서,
상기 핵산은 DNA인 복합체. - 제13항에 있어서,
DNA는 세포 내에 존재하는 복합체. - 제14항에 있어서,
DNA는 손상(non-intact) 세포 내에 존재하는 복합체. - a) 하기 식(I)의 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하는 단계:
(I)
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3R4+ (Zm -)1/m, 할로게노 아미노, C1 -4 알콕시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택되고;
(Zm -)1/m는 전하 m의 음이온임)
b) 상기 생물학적으로 호환가능한 용액으로 세포 또는 다른 생물학적 재료의 샘플을 처리하는 단계; 및
c) 상기 식(I)의 화합물에 의해 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 단계를 포함하는,
핵산을 포함하는 세포 또는 다른 생물학적 재료의 샘플을 분석하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성은 형광이며, 상기 단계 c)는 식(I)의 화합물을 전자기 방사선으로 여기시키는 단계, 및 방출된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성은 비색성(colorimetric property)인 방법. - 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 세포의 샘플에서 세포 핵의 식별을 위한 것으로서, 여기서 단계 b)는 상기 식(I)의 화합물에 의해 세포핵 내 핵산이 결합하도록 수행하고, 세포핵의 식별은 적어도 부분적으로 상기 단계 c)에서 검출된 스펙트럼 특성에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)는, 상기 세포의 샘플이 상기 식(I)의 화합물로 염색되도록 수행하는 방법. - 제20항에 있어서,
세포 사멸 증가율을 모니터하며, 여기서 단계 b)는 분석 기간 전 또는 중에 행해져서, 분석 기간 동안 세포 사멸 증가율의 지속적이거나 빈번한 판독이 가능한 방법. - 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 유세포 측정기로 개별 세포에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 포함하는 방법. - 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 형광 현미경에 의한 세포내 위치 검출을 포함하는 방법. - 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 고정되거나 투과성화된(permeabilised) 세포들을 분석하기 위한 것이며, 여기서 세포의 샘플은 고정액 또는 투과성 제제(permeabilising agent)로 처리하여 고정하는 방법. - 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)는 하나 이상의 다른 형광 색소 또는 발광 화합물로 상기 샘플을 처리하는 것을 추가로 포함하며, 단계 c)는 형광 색소 또는 발광 화합물에 의해 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법. - 제25항에 있어서,
상기 방법은 무손상(intact) 및 손상(non-intact) 세포들 사이를 식별하기 위한 것이며, 여기서 식(I)의 화합물은 세포 불투과성이고, 단계 b)는 세포 투과성인 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물로 샘플을 처리하는 것을 추가로 포함하고, 단계 c)는 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물로 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 것을 추가로 포함하되, 식(I)의 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성의 검출은 손상 세포들의 존재와 연관되고, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성의 검출은 무손상 세포들의 존재와 연관되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물은 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 대해 결합력(binding potential)을 가지되, 상기 결합력은 식(I)의 화합물의 결합력보다 낮아서, 결과적으로 식(I)의 화합물의 존재 하에서 상기 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 결합하기 위해 낮은 효율로 경쟁하여, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물이 손상 세포들에 대한 결합에서 실질적으로 배제되거나, 식(I)의 화합물에 의해 마스킹되는(masked) 것을 특징으로 하는 방법. - 제26항 또는 제27항에 있어서,
제2의 형광 색소 또는 발광 화합물은 하기 식(II)의 화합물 또는 이의 N-옥사이드 유도체인 방법:
(II)
(식 중, A는 C2 -8 알킬렌기이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, C1 -4 알킬, 및 C2 -4 디하이드록시알킬로부터 선택되며, 여기서 질소 원자에 부착된 탄소 원자는 하이드록실기를 가지지 않고, 탄소 원자는 2개의 하이드록실기로 치환되어 있지 않거나, 또는 R2 및 R3는, R2 및 R3가 부착된 질소 원자와 함께 헤테로사이클환을 형성하는, C2 -6 알킬렌기를 형성하고;
X1, X2 및 X3는 독립적으로 수소, 하이드록실, NR1-A-NR2R3, 할로게노 아미노, C1-4 알킬옥시 및 C2 -8 알카노일옥시로부터 선택됨). - 제28항에 있어서,
X2는 NR1-A-NR2R3이고, X1 및 X3는 NR1-A-NR2R3가 아닌 방법. - 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
잠재적으로 세포독성이거나 다르게 세포 사멸을 유도할 수 있는 제제의 세포의 샘플에 대한 영향을 모니터하기 위하여, 세포의 샘플을 상기 제제에 노출시킨 후, 무손상 및 손상 세포들 사이의 식별을 행하는 방법. - 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)는 적어도 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물로 샘플을 처리하는 단계를 추가로 포함하고, 단계 c)는 적어도 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하는 단계, 및 상기 스펙트럼 특성을 무손상 세포들 및/또는 손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관시키는 단계를 추가로 포함 - 제31항에 있어서,
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 식(I)의 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과 유사하나, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과는 상이하며, 여기서 상기 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 무손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관성이 있는 것을 특징으로 하는 방법. - 제31항에 있어서,
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과 유사하나, 식(I)의 화합물의 검출된 스펙트럼 특성과는 상이하며, 여기서 상기 제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 검출된 스펙트럼 특성은 손상 세포들의 특징 또는 성질과 연관성이 있는 것을 특징으로 하는 방법. - 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)에서 검출된 스펙트럼 특성은 전자기 스펙트럼의 예정된 영역에서 방출된 형광이며, 단계 c)는 전자기 방사선으로 식(I)의 화합물, 제2의, 선택적으로, 제3 및 그 이상의, 형광 색소 또는 발광성 화합물을 여기시키는(exciting) 것을 포함하는 방법. - 제34항에 있어서,
상기 식(I)의 화합물, 제2의, 선택적으로, 제3의, 형광 색소 또는 발광성 화합물은 단일한 전자기 방사선원에 의해 함께 여기되는(co-excited) 방법. - 제35항에 있어서,
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광은 i) 바람직하게는 적색 및/또는 IR 인접 영역에서, 식(I)의 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 유사하고, ii) 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 상이한, 전자기 스펙트럼의 예정된 영역 내에 있는 방법. - 제35항에 있어서,
제3의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광은 i) 바람직하게는 오렌지 영역에서, 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 유사하고, ii) 식(I)의 화합물의 방출된 형광의 전자기 스펙트럼과 상이한, 전자기 스펙트럼의 예정된 영역 내에 있는 방법. - 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 유세포 측정기를 사용하여 행해지는 방법. - 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 세포들로부터의 광산란(light scattering)을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법. - a) 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하는 단계;
b) 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 대해 결합력을 가지는 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물을 포함하는 생물학적으로 호환가능한 용액을 제조하되, 상기 결합력이 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물의 결합력보다 낮아서, 결과적으로 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물의 존재 하에서 상기 식별된 세포들 내의 핵산 및/또는 다른 거대 분자 물질에 결합하기 위해 낮은 효율로 경쟁하여, 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물이 손상 세포들에 대한 결합에서 실질적으로 배제되거나, 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의해 마스킹되는, 단계;
c) 상기 생물학적으로 호환가능한 용액 또는 용액들로 세포의 샘플을 처리하는 단계; 및
d) 상기 세포 불투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하고, 이것을 손상 세포들의 존재와 연관시키는 단계, 및 상기 세포 투과성 형광 색소 또는 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하고, 이것을 무손상 세포들의 존재와 연관시키는 단계를
포함하는 무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하는 방법. - 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용되는 검출 시스템으로서, 상기 시스템은,
상기 방법에 사용되는 형광 색소들 및 발광 화합물을 여기시키기 위한 하나 이상의 전자기 방사선원;
형광 색소들 및 발광 화합물에 의한 전자기 방사선의 흡수와 관련된 스펙트럼 특성을 검출하기 위한 다수의 검출기; 및
상기 검출된 스펙트럼 특성을 무손상 및 손상 세포들의 존재와 연관시켜, 무손상 및 손상 세포들 사이를 식별하도록 적용된 검출기 분석 시스템을 포함하는 검출 시스템. - 제41항에 있어서,
상기 검출기는 형광 검출기인 검출 시스템. - 제41항 또는 제42항에 있어서,
형광 색소들 및 발광 화합물을 함께 여기시키기(co-exciting) 위한 단일 전자기 방사선원을 가지는 검출 시스템. - 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
다수의 검출기가 형광 색소들 및 발광 화합물 전부의 스펙트럼 특성을 검출하는 한 쌍의 검출기 형태인 검출 시스템. - 적어도 제2의 형광 색소 또는 발광 화합물과 제1항에 따른 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물.
- 제1항에 따른 화합물과 관련 용기 및 시약을 포함하는, 제16항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 성분 키트(kit of parts).
- 아미노알킬아미노 전구체 화합물을 식(I)의 화합물로 제공하는 단계; 및 상기 아미노알킬아미노 전구체 화합물을 4급화(quaternarising)하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 화합물의 제조 방법.
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