CN110494739A - 荧光图像中靶分子密度的确定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种图像分析系统(100)，其被配置用于确定组织样品中靶分子的密度，所述确定包括：‑接收(202)载玻片(150)的数字图像(130)，所述载玻片包括组织样品(152)、靶点(TD)和荧光点(FD)，所述荧光点包括已知密度(114)的荧光诱导分子(408)，所述靶点包括已知密度(116)的靶分子(402)，所述组织样品和所述靶点已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色，所述数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值(122)和所述荧光点的强度值(120)，所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合所述靶分子；‑接收(204)：‑所述图像中描绘的所述荧光点的像素强度(120)；‑所述图像中描绘的所述靶点的像素强度(122)；‑所述图像中描绘的所述组织样品的区域(154)的像素强度(118)；‑荧光诱导分子密度信息(114)，其指示所述荧光点中所述荧光诱导分子的已知密度；‑靶分子密度信息(116)，其指示所述靶点中所述靶分子的已知密度；‑根据所接收的像素强度和所接收的分子密度信息来计算(206)所述组织样品的所述区域(154)中的所述靶分子密度。

Description

荧光图像中靶分子密度的确定
技术领域
本发明涉及图像分析领域，尤其涉及基于荧光图像的靶分子量化领域。
背景技术
荧光显微镜通常用于研究已经用荧光标记的抗体或其他荧光标记的蛋白质标记的特定细胞，以便检测特定感兴趣分子的出现并至少粗略地检测其数量。例如，荧光显微镜图像通常被生成和分析，以便确定细胞中是否存在特定生物标记(作为生理状态的指标，例如疾病，特别是癌症或癌症亚型)以及存在的量。
典型地，荧光强度和生物标记表达是正相关的，并且荧光信号的强度被用作生物标记量的指标。
然而，由于各种仪器因素，同一样品在不同时间在两台显微镜上成像，甚至在同一台显微镜上成像，可能会产生相差甚远的读数。其次，结合生物标记的抗体分子的比率和/或结合抗体分子的荧光染料分子的比率可能强烈依赖于染色过程的过程参数(例如温度、培养时间、缓冲液、荧光团分子的类型等)。因此，荧光图像中的荧光强度信号通常不允许精确确定细胞中表达的生物标记分子的数量，因此不允许精确比较已经通过荧光显微镜在不同染色程序中染色的两个组织样品的表达水平。
美国专利US 9,395,283 B1描述了均质细胞块(即FFPE和非FFPE)的产生，用于使用细胞块的切片作为基于组织的生物标记研究的阳性对照。FFPE单元部分具有限定数量和限定比率的单元。所述细胞块用作组织学测定中灵敏度和特异性评估的标准，但是它们不用于校准用于定量组织样品中靶分子的荧光信号。
欧洲专利EP 1774292 B1描述了一种用于荧光检测仪器的校准载玻片及其制备方法。
US 2004/0060987 A1描述了一种使用结合部分阵列检测分析物的方法。所述阵列附着在载玻片上。通过数字图像相减方法分析从载玻片获得的荧光信号。所述载玻片可以包括已知量的荧光球体(FluoSphere)的校准点。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的图像分析方法和图像分析系统，用于确定荧光图像中描述的组织样品中靶分子的密度，如独立权利要求所述。从属权利要求中给出了本发明的实施方案。如果本发明的实施方案不是相互排斥的，它们可以自由地相互结合。
一方面，本发明涉及一种用于确定荧光图像中描绘的组织样品中靶分子密度的图像分析方法。所述方法包括：
-通过图像分析系统接收载玻片的数字图像，所述载玻片包括组织样品、靶点和荧光点，所述荧光点包括已知密度的荧光诱导分子，所述靶点包括已知密度的靶分子；所述组织样品和所述靶点已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色；所述数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值和所述荧光点的强度值；所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合所述靶分子；
-由所述图像分析系统接收：
o所述图像中描绘的所述荧光点的像素强度；
o所述图像中描绘的所述靶点的像素强度；
o所述图像中描绘的所述组织样品的区域的像素强度；
o荧光诱导分子密度信息，其指示所述荧光点中所述荧光诱导分子的已知密度；
o靶分子密度信息，其指示所述靶点中所述靶分子的已知密度；
-根据所述荧光点的像素强度、所述靶点的像素强度、所述组织样品区域的像素强度、所述荧光诱导分子密度信息和所述靶分子密度信息，由所述图像分析系统来计算所述组织样品区域中的所述靶分子密度。
本发明的实施方案可以具有以下优点：通过使用如上所述的包括荧光点和靶点的新形式的载玻片，并且通过使用相应点中荧光诱导分子或靶分子的密度信息，现在可以校准荧光图像的强度信息，使得荧光图像中描绘的组织样品中靶分子的绝对数量可以通过图像分析方法完全自动准确地确定。
在一个方面，所述方法允许通过提取图像采集系统的光学部件的影响来标准化所采集的强度信息，例如当荧光穿过透镜和显微镜的其他部件时发生的强度损失，其可能导致对靶分子数量的低估。
在另一个有利的方面，所述方法允许通过去除刺激荧光团发射荧光的光源的不良质量的影响来标准化所获得的强度信息。例如，在第一显微镜的光源强于第二显微镜的光源的情况下，第一显微镜对于特定载玻片和特定组织样品获得的荧光信号将强于第二显微镜对于相同载玻片获得的荧光信号。然而，由于这些因素以与组织样品中荧光诱导分子相同的方式影响荧光点中的荧光诱导分子，这种影响可以通过计算消除。
在另一个有益的方面，所述方法允许通过计算消除染色方案的参数对荧光强度的影响。例如，荧光显微镜可用于确定特定癌症患者是否受益于特定治疗方案。为了测试抗癌药物的效率，在用于产生第一荧光图像的治疗之前，可以用荧光染色剂标记患者的第一活检样品的一个或多个肿瘤标记。然后，在几周的治疗后，患者的第二活检样品的相同的一个或多个肿瘤标记可以用相同的荧光染色剂标记，并用于产生第二荧光图像。由于结合到特定肿瘤标记物(即靶蛋白的一种形式)的荧光团分子的数量可能取决于染色步骤的温度和持续时间、染色缓冲液的化学组成和其他因素，因此目前不可能精确量化特定抗癌药物对肿瘤标记物表达水平的影响，因为其他因素(与样品处理和制备程序、染色方案、显微镜硬件等相关)也对荧光信号的强度有显著影响。
然而，通过使用两个“校准点”，即靶点和荧光点，以及各自已知的分子密度，可以通过从计算上消除所述误差源对荧光强度的影响，并且通过从计算上确定载玻片上也包括靶点和荧光点的特定组织样品中包含的靶分子的“真实”数量。将两个校准点和实际分析的组织样品包含在同一载玻片上可能具有以下好处：两个点和样品中的分子经历相同的染色过程，并且载玻片的组织样品区域接收的像素强度由与校准点的像素强度相同的图像采集硬件接收。
本发明的实施方案结合了来自不同领域的知识，例如图像处理、显微术(特别是荧光成像)和湿式实验室程序，以能够更精确地评估样品中包含的靶分子的量。
根据实施方案，组织区域中靶分子密度的计算包括：
-根据以下公式计算所述荧光点的像素强度的平均强度IFlD_AVG：
-根据以下公式计算所述靶点的像素强度的平均强度ITaD_AVG：
-根据以下公式计算所述靶点中每个靶分子的荧光诱导分子比率R：
-根据以下公式计算所述组织样品的区域中所述靶分子的密度δTarget_In_Tissue：
其中δTarget_In_Target_dot是所述靶点中靶分子的密度。
例如，平均强度IFlD AVG和/或ITaD AVG可以计算为算术平均值或为各个点接收的像素强度值的中值。
根据实施方案，所述方法还包括用靶分子涂布载玻片的区域，从而产生靶点。
例如，可以通过用预定数量的靶分子涂布载玻片的一个区域来进行涂布，从而产生靶点。然后存储预定义的数量。例如，可以执行涂布程序，以确保每mm2有限定数量的分子附着到载玻片上。已知的分子密度可以印刷或书写在载玻片上，和/或可以以数字形式存储在数据库中，与载玻片的标识符相关联，或与以相同涂布程序或根据相同涂布方案涂布的一组载玻片的标识符相关联。书写或印刷到载玻片上的分子也可以由用户(例如实验室工作人员)输入数据库。通过使用具有已知所得分子密度的涂布技术，靶点中靶分子的密度也是“已知的”，即图像分析系统可用的，例如以存储在数字存储介质中的数据值的形式。
或者，可以通过用未知数量的靶分子涂布载玻片区域来进行涂布，从而产生靶点，然后测量靶点中靶分子的密度。例如，可以对大量载玻片，例如几百或几千或甚至几万个载玻片，执行特定的单次涂布过程。然后，对所述载玻片之一或所述载玻片的小子集的靶点中的靶分子密度进行经验分析，例如通过质谱分析，以确定所述少数分析载玻片中的实际靶分子密度。如果靶分子是特定的DNA或RNA序列，靶点中的靶分子密度可以通过定量PCR来确定。然后将获得的靶分子密度印刷或书写在载玻片上和/或以数字形式存储在数据库中，与载玻片的标识符相关联或与在所述单次涂布过程中涂布的所有载玻片的标识符相关联，如已经针对替代涂布方法所述。
根据实施方案，将构成靶点的载玻片区域的涂布使用蛋白质微阵列技术来执行。
根据实施方案，所述方法进一步包括生成靶点。靶点的产生包括将参比细胞均匀地附着到载玻片的区域，从而产生靶点。参比细胞表达或包含已知数量的靶分子。
例如，参比细胞中靶分子的数量可以凭经验确定，例如通过质谱、细胞计量术、定量PCR(如果靶分子是感兴趣的DNA或RNA序列)等。例如，已知数量的参比细胞可以附着到载玻片上，未知数量的参比细胞可以附着到要形成靶点的载玻片区域上，并且已经成功附着到载玻片上的参比细胞的密度在创建靶点之后确定。
根据实施方案，所述方法进一步包括，在参比细胞附着到载玻片之前：实验性地确定在一组参比细胞(已知包含靶分子)中表达或包含的靶分子的平均数量；以及计算附着到靶点的细胞数量。
所述方法可能是有益的，因为在用靶分子涂布靶点之前，可能不需要提取和纯化特定的靶分子，通常是生物标记，例如特定的蛋白质或特定的RNA或DNA序列。相反，可以用已知包含(例如表达)靶分子的参比细胞直接涂布靶点。
参比细胞可以通过涂布技术或通过产生均匀的参比细胞块附着到载玻片上，如美国专利US 9,395,283中所述，并将参比细胞块作为靶点附着到载玻片上。
根据实施方案，实验性地确定包括处理参比组织样品，用于将参比组织样品转化为参比细胞的均匀悬浮液；以及实验性地确定悬浮液中参比细胞或悬浮液中参比细胞亚群中包含的靶分子的平均数量。此外，靶点的每mm2的细胞数量由经验确定。然后，根据靶点中经验确定的参比细胞密度和每个参比细胞中包含的经验确定的靶分子平均数量来计算靶点中的靶分子密度。
所述方法可能是有益的，因为一些靶蛋白不能从细胞中提取和纯化，或者提取非常复杂。通过用已知包含靶分子的参比细胞涂布载玻片的区域，基本上包含在至少一种已知类型的细胞中的任何类型的分子都可以用于产生靶点。此外，通过用包含靶点的参比细胞涂布载玻片的区域来产生靶点可以更接近地代表载玻片的组织样品为荧光诱导分子与靶分子的相互作用提供的环境。
根据实施方案，实验确定包括执行质谱分析或流式细胞分析，用于定量确定参比细胞中靶分子的数量。这可能是有益的，因为所述程序是用于量化细胞或任何其他物质环境中特定分子类型的成熟技术。尽管这两种方法都趋向于复杂，但是越来越多的半自动或自动系统存在，其允许精确定量例如特定细胞或细胞组中的特定蛋白质。应该考虑的是，对于代表性的参比细胞子集，这种方法只需要进行一次，并且可以使用相同的细胞悬浮液来产生具有各自靶点的大量组织载玻片。因此，对用作靶点的细胞的参比细胞进行一次定量分析允许确定大量组织样品中靶分子的“真实”数量，而无需分别对每个所述组织样品进行质谱或流式细胞分析。因此，可以提供定量组织样品中靶分子的精确方法，所述方法不一定需要针对每个单独的组织样品的复杂分析程序，例如质谱或流式细胞术。
根据实施方案，在所述染色过程中结合到单个靶分子的荧光诱导分子的比率是未知的，并且取决于所述染色方案的一个或多个参数。例如，在染色过程中或在为染色方案准备组织样品时使用的持续时间、温度或溶剂可能对该比率有影响，并且可能是基于荧光信号强度确定靶分子密度的障碍。
根据实施方案，染色方案是酪胺信号放大染色方案(“TSA测定”)。
免疫组织化学(IHC)荧光标记的灵敏度取决于用于检测的荧光团的性质和抗体结合位点上存在的荧光团的量。酪胺信号放大(TSA，TSA测定)是一种相对较新的酶促放大程序，在抗体结合位点沉积额外的荧光团分子，从而降低IHC抗原检测限制。TSA可用于单个或多个IHC应用，并可与量子点耦合。
传统的酶促IHC检测方法利用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的能力将显色底物转化为在酶活性位点沉淀的有色反应产物(Roth和Baskin，2005；Roth和Perry，2005)。使用增加与初级抗体相关的酶分子数量的过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)或抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)等“分层”技术可以提高HRP或AP检测的灵敏度。然而，有几个因素限制了这些传统酶促放大程序的灵敏度和实用性。特别是，多边标记的选择和敏感性可能有限。
相反，TSA测定(相应的试剂盒例如可从Perkin-Elmer,Waltham,MA获得)更敏感，也支持多标记。TSA基于HRP在低浓度H2O2存在下将标记的含酪胺底物转化成氧化的高活性自由基的能力，该自由基可以共价结合HRP处或附近的酪氨酸残基(Bobrow等人，1992；Adams，1992年；Shindler和Roth，1996)。酪胺用荧光团或半抗原预先标记，荧光团在沉积时可直接观察到，半抗原在随后的步骤中用与荧光团或可用于沉积色原的酶分子相连的半抗原特异性试剂检测。与传统的荧光IHC检测方法(利用荧光团标记的次级抗体)相反，TSA导致比次级抗体更多的荧光分子沉积。然而，这种放大的缺点是放大程度取决于许多参数，例如TSA测定的参数，如温度、染色持续时间等，因此给定数量的靶分子的荧光信号强度在不同的TSA测定中可能有很大的不同。
本发明的实施方案在TSA测定的环境中可能特别有用，因为TSA测定的信号放大和多重标记能力可以在不降低靶分子密度确定的准确性的情况下使用，因为通过还考虑两个校准点的荧光强度和两个点中已知的分子密度，TSA测定参数对荧光信号强度的影响可以在计算上消除。
根据实施方案，荧光诱导分子与单个靶分子的结合可以是以下选项之一：
-与所述靶分子或连接到所述靶分子的一个或多个中间分子的共价或离子结合；例如，各种共价和非共价结合的分子(初级和/或次级抗体、亲和素、生物素和其他)可以用于在靶分子附近选择性地诱导荧光信号；
-偶极-偶极相互作用、范德瓦尔斯相互作用或与所述靶分子或连接到所述靶分子的一个或多个中间分子结合的氢；
-抗原抗体结合；例如，荧光诱导分子可以共价结合初级抗体，初级抗体可以选择性地结合靶蛋白；根据另一个例子，荧光诱导分子可以共价结合次级抗体，次级抗体可以共价结合初级抗体，初级抗体可以选择性结合靶蛋白；事实上，如果靶点已经包含生物标记分子和结合到所述生物标记分子的一种或多种初级抗体的分子复合物，并且如果每mm2靶点的所述分子复合物的数量以及生物标记蛋白与初级抗体(或任何其他中间分子)的比率是已知的，则整个分子复合物构成本发明实施方案意义上的靶分子。
-核酸序列的杂交。
根据实施方案，荧光诱导分子是荧光团(例如，用荧光团标记的抗体)。
根据备选实施方案，荧光诱导分子是在空间上靠近荧光诱导分子的其他分子触发荧光信号发射的酶(例如，辣根过氧化物酶-HRP-酶：单独，HRP酶，或其缀合物是不可见的；必须使用底物使其可见，当用过氧化氢作为氧化剂被HRP氧化时，产生荧光信号)。
所述特征可能是有利的，因为存在多种市售试剂盒用于用不同的荧光染料标记不同的生物标记。例如，初级-次级抗体标记系统的使用允许简单地通过使用不同的初级抗体对多种不同的生物标记物使用特定荧光染料的良好建立的染色方案，所述不同的初级抗体都充当与荧光团偶联的次级抗体的特异性结合配偶体。
根据实施方案，荧光点包括至少一种进一步类型的荧光诱导分子的进一步的荧光诱导分子的已知密度。组织样品和靶点都已经被进一步的荧光诱导分子染色。所述方法包括：
-接收所述载玻片的进一步的数字图像，所述进一步的数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值和所述荧光点的强度值，所述荧光点、所述靶点和所述组织样品的强度值与所述荧光点、所述靶点和所述组织点中的进一步的荧光诱导分子的数量相关，所述进一步的荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合到所述靶分子；
-接收：
o在所述进一步的图像中描绘的所述荧光点的进一步的像素强度；
o在所述进一步的图像中描绘的所述靶点的进一步的像素强度；
o在所述进一步的图像中描绘的所述组织样品的区域的进一步的像素强度；
o指示所述荧光点中所述进一步的荧光诱导分子的已知密度的进一步的荧光诱导分子密度信息；
-根据所述荧光点、所述靶点、所述组织样品区域的所述进一步的像素强度，所述进一步的荧光诱导分子的进一步的密度信息和所述靶分子密度信息，来计算所述组织样品区域中靶分子的进一步的密度。
例如，强度信息的接收可以如下实现：光源可以发射不同激发波长的光，其选择性地诱导另一荧光诱导分子的荧光信号，而不是第一荧光诱导分子的荧光信号。因此，获得了两个不同的数字图像，如前所述对其进行分析，以便从其中一个数字图像中确定各自的靶分子密度，该数字图像的像素强度由第一或进一步的荧光诱导分子中相应的一个发射的荧光信号产生。
或者，可以使用多光谱光源，但是可以使用不同的荧光滤光器；例如，图像采集系统可以使用第一荧光滤光器来接收第一数字图像，该第一数字图像选择性地包括第一荧光诱导分子的荧光信号(已经使用第一荧光诱导分子进行染色过程的整个载玻片的荧光信号，第一图像包括荧光点、靶点和由第一荧光诱导分子发射的组织样品的荧光信号)；图像采集系统可以使用第二荧光滤光器来接收第二数字图像，该第二数字图像选择性地包括进一步的(“第二”)荧光诱导分子的荧光信号(整个载玻片(也)已经使用第二荧光诱导分子进行了相同或不同的染色过程，第二数字图像包括荧光点、靶点和由进一步的荧光诱导分子发射的组织样品的荧光信号)。
根据染色方案和所使用的初级抗体，两个图像可用于两次定量相同类型的靶分子(例如，基于使用两种不同荧光标记的两种独立染色方法，获得对靶分子密度的更精确估计，或者用于同时定量同一组织中的多个不同靶分子。
像第一荧光诱导分子的密度信息一样，指示荧光点中进一步的荧光诱导分子的已知密度的进一步的荧光诱导分子密度信息可以由图像分析系统接收，例如通过从存储介质，例如非易失性存储介质读取相应的数据值。
因此，多个生物标记可以用不同的荧光团染色，通常在同一的染色方案中。
所述特征可能是有利的，因为荧光点包括两种或多种类型的荧光诱导分子的载玻片可以允许精确确定多种不同靶分子类型的密度，只要所述不同靶分子类型用荧光点中包含的荧光诱导分子标记。
或者，载玻片的靶点和组织样品中的相同类型的靶分子可以用不同的荧光诱导分子染色。
根据实施方案，所述方法进一步包括计算以下各项的平均值：
-根据本文所述任一实施方案计算的组织样品区域中靶分子的密度，以及
-根据本文所述任一实施方案计算的组织样品区域中靶分子的进一步密度。
因此，通过对两种或多种荧光诱导分子类型中的每一种分别用两个校准点进行强度校准，然后例如计算平均靶分子密度值，可以实现对特定组织样品中靶分子数量的更精确的确定。
根据实施方案，靶分子选自包括以下各项的组：
-生物标记分子；
-能够以预定的分子比率选择性地结合所述生物标记分子的初级抗体；
-能够以预定的分子比率选择性地结合所述初级抗体的次级抗体。
在进一步的方面，本发明涉及一种图像分析系统，其被配置用于确定荧光图像中描绘的组织样品中的靶分子的密度。该系统包括存储介质和一个或多个处理器，被配置用于：
-接收载玻片的数字图像，所述载玻片包括组织样品、靶点和荧光点，所述荧光点包括已知密度的荧光诱导分子，所述靶点包括已知密度的靶分子，所述组织样品和所述靶点已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色，所述数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值和所述荧光点的强度值(120)，所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合所述靶分子；
-接收：
o所述图像中描绘的所述荧光点的像素强度；
o所述图像中描绘的所述靶点的像素强度；
o所述图像中描绘的所述组织样品的区域的像素强度；
o荧光诱导分子密度信息，其指示所述荧光点中所述荧光诱导分子的已知密度；
o靶分子密度信息，其指示所述靶点中所述靶分子的已知密度；
-根据所述荧光点的像素强度、所述靶点的像素强度、所述组织样品区域的像素强度、所述荧光诱导分子密度信息和所述靶分子密度信息来计算所述组织样品区域(154)中的所述靶分子密度。
在进一步的方面，本发明涉及包含组织样品、靶点和荧光点的载玻片，荧光点包含已知密度的荧光诱导分子，靶点包含已知密度的靶分子。
根据实施方案，具有组织样品和靶点的载玻片已经在相同的染色程序中用荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子进行了染色。荧光诱导分子适于在染色过程中直接或间接结合靶分子(已知包含在靶点中，并且怀疑包含在组织样品的细胞中)。
根据实施方案，载玻片的荧光点包括至少一种进一步类型的荧光诱导分子的进一步的荧光诱导分子的已知密度。进一步的荧光诱导分子适于在染色过程中直接或间接结合靶分子。
这种类型的载玻片可用于计算组织样品中的靶分子密度，作为针对不同荧光诱导分子单独获得的靶分子密度的平均值。本文所用的“不同”荧光诱导分子是具有可区分荧光发射光谱的荧光诱导分子。
根据其他实施方案，载玻片的荧光点包括至少一种进一步类型的荧光诱导分子的进一步的荧光诱导分子的已知密度。进一步的荧光诱导分子适于在染色过程中直接或间接结合到进一步的靶分子类型的进一步的靶分子上。此外，靶点进一步包括已知密度的进一步的靶分子。例如，第一和进一步的(“第二”)靶分子可以是两种不同的生物标记。
根据实施方案，所述靶点是所述载玻片上涂布有已知数量的所述靶分子或涂布有已知数量的细胞的区域，所述细胞表达或包含已知数量的所述靶分子。
这里使用的“图像分析系统”是电子系统，例如计算机，被配置用于通过数字图像处理技术从数字图像中提取有意义的信息。图像分析任务可以包括颜色去卷积、连接成分分析、图像分割和/或边缘检测，用于识别点、组织样品、单个细胞、细胞类型(肿瘤或基质细胞、不同类型的免疫细胞)等。在一些实施方案中，图像分析系统可以进一步包括或可操作地耦合到图像采集系统，例如显微镜。
本文所用的“靶分子”是一种分子、分子部分(例如基因组DNA中包含的基因序列)或分子复合物(例如与一种或多种中间分子结合的表位，中间分子是荧光诱导分子的实际结合配偶体)，其在组织样品中的量应当确定。例如，靶分子可以是生物标记或生物学标记，即某种生物状态或状况的指示。生物标记通常被测量和评估，以检查正常的生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应。已知密度的靶分子附着在载玻片的一个区域，这里称为“靶点”。本文所用的靶分子也可以是特别感兴趣的核酸分子的特定子序列，例如，DNA分子中的基因序列。
本文所用的“荧光诱导分子”是本身能够响应于吸收光或其他电磁辐射而发射荧光的分子(“荧光团”，例如与荧光素偶联的抗体)，或者是能够在其空间邻近的特定其他分子中诱导荧光的分子(例如HRP复合体)。在大多数情况下，发射的光比吸收的辐射具有更长的波长，因此能量更低。许多荧光染色剂是为一系列生物分子设计的。其中一些是小分子，本质上是荧光的，并结合感兴趣的生物分子。这些的主要例子是核酸染色剂，如DAPI和Hoechst(由UV波长光激发)和DRAQ5和DRAQ7(由红光最佳激发)，它们都与DNA的小凹槽结合，从而标记细胞核。其他的是结合特定细胞结构的药物或毒素，并且是用荧光信使衍生的。这类荧光染色剂的一个主要例子是用来染色哺乳动物细胞中肌动蛋白纤维的鬼笔环肽。有许多称为荧光团或荧光染料的荧光分子，例如荧光素、Alexa Fluors或DyLight 488，它们可以化学连接到不同的分子上，该分子直接或间接结合到样品中和靶点内感兴趣的靶分子上。
本文所用的“荧光显微镜”是一种光学显微镜，它使用荧光和磷光来代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。“荧光显微镜”是指使用荧光产生图像的任何显微镜，也称为“数字荧光图像”，无论是像外荧光显微镜那样较简单的设置，还是像共焦显微镜那样较复杂的设计，其使用光学切片来获得更好的荧光图像分辨率。
本文所用的“组织样品”是从生物体(例如哺乳动物，例如人)体内收集的物质。组织样品可以是例如肿瘤组织样品、血液涂片样品、皮肤组织样品等。组织样品可以用荧光或其他染色剂染色，并且可以附着到显微镜载玻片上，以使图像采集系统能够生成可以分析的样品的数字图像。可以执行图像分析，例如，以帮助医疗诊断和/或治疗指示的评估过程、进一步的医疗测试或其他过程。
这里使用的“荧光图像”是一种数字图像，其像素具有指示由荧光显微镜或另一种基于荧光的图像采集系统捕获的荧光信号的像素强度。
这里使用的“点”是载玻片的一个区域。该点可以具有任何形状，例如矩形、正方形或圆形。
这里使用的点中分子的“密度”是给定面积单位(例如mm2)中的分子数量。“已知”分子密度是指当执行用于量化组织样品中靶分子的图像分析方法时，已经知道相应分子类型的密度。例如，分子密度可以在载玻片上创建特定校准点之前或期间预先凭经验确定。
这里使用的“载玻片”是用于组织样品的载体结构，其用于生成组织样品的数字图像，特别是荧光图像。优选地，载玻片是显微镜载玻片。切片可以是例如载玻片，其可以涂布有一层或多层，该层有助于或能够将靶分子、荧光诱导分子和/或参比细胞粘附到载玻片上。
“酪胺信号放大染色方案”，也称为“TSA测定法”或“CARD”(催化信使沉积法)，是一种酶介导的检测方法，其利用酶(通常是辣根过氧化物酶-HRP)的催化活性原位产生靶蛋白或核酸序列的高密度标记。据报道，与常规抗生物素蛋白-生物素化酶复合物(ABC)程序相比，TSA可将检测灵敏度提高100倍。此外，对于活体的或固定的细胞或组织中靶的多参数检测，TSA可以与其他几项重要技术相结合，包括我们的核酸标记试剂盒、初级和次级抗体、抗生物素蛋白和凝集素缀合物、细胞骨架染色剂等。根据优选实施方案，TSA标记是至少三个基本过程的组合，通常包括：a)通过免疫亲和(蛋白质)或杂交(核酸)将探针结合到靶上，然后用HRP标记的抗体或链霉亲和素缀合物对探针进行二次检测。其他靶向蛋白如凝集素和受体配体的过氧化物酶缀合物可能适合标记靶，内源性过氧化物酶活性也是如此；b)通过HRP激活标记的酪酰胺衍生物的多个复制；通常，使用荧光或生物素化的酪胺；c)在HRP-靶相互作用位点附近，所得高活性、短寿命酪胺基团共价偶联至残基(主要是蛋白质酪氨酸残基的苯酚部分)，导致与扩散相关的信号定位损失最小。在TSA测定中使用带有荧光点和靶点的载玻片可能特别有利，因为TSA测定的信号强度增加通常伴随着信号放大强度的高度可变性，因此组织样品中包含的靶的实际量具有很大的不确定性。在TSA测定中使用带有荧光点和靶点的载玻片可以受益于TSA方案的高灵敏度，同时能够估计样品中靶分子的量。
附图说明
在本发明的以下实施方案中，仅通过举例的方式，参照附图更详细地解释，其中：
具体实施方式
图1是组织载玻片的框图；
图2是被配置用于分析载玻片的荧光图像的图像分析系统的框图；
图3是用于量化组织样品中靶分子的荧光图像分析方法的流程图；
图4描述了三种不同的酪胺信号放大测定；
图5是根据本发明实施方案的载玻片的荧光图像。
图1示出了载玻片150，其包括荧光点FD、靶点TD和组织样品。载玻片可以是例如玻璃组织载玻片。在本文称为“荧光点”的第一区域FD中，载玻片被已知分子密度的荧光诱导分子覆盖。在本文称为“靶点”的第二区域TD中，载玻片被已知分子密度的靶分子覆盖。在载玻片的第三区域，载玻片包括例如哺乳动物的组织样品152，例如患者肿瘤组织的组织样品。
通常，载玻片用于检查特定类型的感兴趣分子的位置，在此称为“靶分子”，并用于确定组织样品中靶分子的密度(例如，如果靶分子是蛋白质，则为“表达水平”)。例如，靶分子可以是特定肿瘤亚型的生物标记，例如Her2、BRCA1、BRCA2等。
靶点TD包括已知密度的靶分子。几种不同的方法可以用于产生具有已知靶分子密度的靶点。例如，载玻片可以涂布有限定数量的分离的靶分子，或者涂布有限定数量的已知靶分子浓度的参比细胞。例如，靶分子浓度和参比细胞可以通过对已知包含靶分子的参比组织进行均质化、产生参比细胞悬浮液、根据经验确定参比细胞中靶蛋白的量来确定，例如通过质谱或荧光细胞计量术或其他合适的技术手段。然后，或者将限定数量的参比细胞附着到载玻片150的表面，或者将参比细胞的悬浮液用于将未知数量的参比细胞附着到载玻片的表面，并且随后计数已经成功附着到载玻片表面的每平方毫米的参比细胞的数量。这种计数可以通过能够自动识别和计数细胞的图像分析技术手动或自动进行。参比细胞的相同均匀悬浮液可用于涂布多张载玻片，例如几百张、几千张甚至更多张载玻片。由于参比细胞的均匀悬浮液被用于涂布组织载玻片，仅几个载玻片的靶点中的参比细胞密度的确定可能足以确定和“知道”基于相同的均匀参比细胞悬浮液涂布的所有其他载玻片的靶点的参比细胞密度。由于每个参比细胞中的平均靶分子浓度也是根据经验在参比细胞中确定的，因此可以确定和计算靶点TD中的靶分子密度。这种“已知的”靶分子密度可以任选地印刷在载玻片150上和/或存储在存储介质中。
荧光点FD包括已知密度的荧光诱导分子分子。几种不同的方法可以用于产生具有已知荧光诱导分子密度的荧光点。例如，载玻片可以涂布有限定数量的分离荧光诱导分子。或者，大量载玻片可以涂布有相同的荧光诱导分子的均匀悬浮液(或溶液)。实际上牢固地附着在载玻片上以形成荧光点的荧光诱导分子的密度可以随后根据经验确定，例如通过质谱或其他合适的分析方法。如果荧光诱导分子的相同悬浮液/溶液用于涂布载玻片，仅在几个载玻片和相应的荧光点上凭经验确定计数荧光诱导分子密度就足够了。这种“已知的”荧光诱导分子密度可以任选地印在载玻片150上和/或存储在存储介质中。
优选地，荧光点实际上包括两种或多种不同类型的荧光诱导分子的混合物，由此每个不同类型的荧光诱导分子的密度是已知的(所述不同类型的分子的密度可以相同也可以不同)。这可以允许用户在市场上可买到的多种不同的荧光染料中灵活地选择用于对感兴趣的靶分子染色的特定荧光染料。因此，用户不限于用于产生荧光点的单一特定荧光染料或荧光诱导分子。此外，包含具有两种或多种不同荧光诱导分子类型的荧光点的载玻片的用户可以执行多色荧光图像分析，并且可以在单个实验过程中染色和定量多种不同类型的靶分子。例如，用户可以使用不同的荧光滤光器，或者可以使用具有限定激发光谱的光源，通过荧光点(以及载玻片的靶点和组织样品)中的特定荧光诱导分子选择性地诱导荧光信号的发射，从而产生选择性地指示该特定荧光诱导分子(以及其选择性附着的任何靶蛋白)存在的荧光图像。
对带有靶点、荧光点和组织样品的整个载玻片进行染色过程，在染色过程中，包含在荧光点中的相同荧光诱导分子选择性地附着于靶起始物中的靶分子和组织样品152中的靶分子(如果有的话)。尽管附着到单个靶分子上的荧光诱导分子的实际数量可能是未知的，例如，因为该附着比率强烈依赖于染色过程的特殊性，可以安全地假设靶点中的靶分子与组织样品152中的靶分子的附着比率相同。由于靶点中的靶分子密度和荧光点中的荧光诱导分子是已知的，并且由于靶起始物、荧光点和组织样本152的荧光信号强度已经被相同的图像采集系统(例如，相同的荧光显微镜)捕获，所以靶点和荧光点可以用于校准为组织样本获得的强度信息，并且可以用于精确地确定组织样本152中的靶分子密度。
为了产生如图1所示的一个或多个载玻片的靶点，参比组织取自已知或怀疑包含特定靶分子的组织。例如，组织活检可以制备成福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。FFPE预制品可以在室温下无限期储存，使得核酸(包括DNA和RNA)可以在几十年后被回收和分析。
为了产生靶点，将来自FFPE参比样品的切片或穿刺去石蜡化，并从参比样品中产生对一种或多种类型的靶分子(例如角蛋白、波形蛋白或特定的DNA/RNA序列)染色的参比细胞悬浮液。然后将流式细胞术应用于悬浮液中所有或部分参比细胞，以确定参比细胞中靶分子的数量。任选地，悬浮液中的参比细胞可以被分选以除去不包含靶蛋白或不包含所需量范围内的靶蛋白的细胞。例如，商业上可获得的系统和方法，例如DEPArray系统的基于图像的分选，可以用于选择性地获得在期望的量范围内表达靶蛋白的参比细胞。因此，可以从FFPE组织样品中回收具有已知靶分子密度的高纯度参比细胞集合，并且可以用于用参比细胞涂布组织载玻片的特定区域。实际上变得牢固地附着到靶点的参比细胞的密度可以从相同涂布条件下的先前涂布过程中凭经验得知，或者可以通过手动或自动计数细胞随后为一个或多个生成的靶点确定。因此，靶点中的靶分子密度是根据经验确定的参比细胞中的靶分子浓度和牢固附着于载玻片上从而形成靶点的参比细胞的密度计算的(因此是“已知的”)。例如，在美国专利US 9,395,283 B1中描述了均质细胞块的产生和所述细胞块在载玻片上的附着，例如为了在免疫组织化学实验中提供生物标记的阳性对照，该专利在此全文引入作为参考。
例如，已知包含感兴趣的特定靶分子的参比细胞被预处理并用荧光染料或其他荧光诱导分子染色。然后，根据经验确定细胞块中的靶分子密度。通过调节用于形成细胞块的模具的尺寸来控制最终块内参比细胞的密度，以便产生包括特定数量/密度/数量的靶分子的细胞的靶点，其中靶点包括特定数量的参比细胞。参比细胞块具有限定的尺寸和长度，以控制每个块中参比细胞的数量，从而产生靶点，该靶点包括特定数量(即预先指定的“已知”数量)的参比细胞，该参比细胞具有各自靶分子的已知密度(或浓度)。
制造靶点(即细胞块)的方法中的步骤包括：a)使参比细胞通过细胞收集装置，其中所述参比细胞为悬浮液、固定丸或未固定丸形式；b)进行参比细胞计数；c)在PBS中将细胞固定在包含多聚甲醛的组合物中，以产生“细胞丸”或“细胞块”；d)准备模具；在PBS中重新悬浮细胞；并将悬浮液在受控温度下固定；e)在受控的温度下将细胞悬浮液注射到预定尺寸和形状的制备好的模具中；f)用石蜡处理器冷却和处理细胞；以及，g)进行分子定量，例如，DNA提取和定量或质谱；此外，在该步骤期间获得的信息可以用于检查和验证参比细胞在单元块中均匀分布。
上述制备细胞块的方法中的细胞块制备步骤包括：a)使参比细胞通过一种装置，以产生固定化细胞的均匀混合物；b)将均匀的参比细胞混合物注入模具A(“第一模具”，例如半径为4mm、长度为145mm的模具)，并从模具中取出产生的参比细胞块；以及，c)用石蜡处理细胞块，从石蜡中除去单个细胞块，并将处理过的细胞块嵌入模具B(“第二模具”，例如2cm×2cm×2cm的立方体石蜡模具)。细胞块用石蜡薄膜包裹，并保持在4℃的气密箱中，直到它们被分成多个组织块部分，这些组织块部分附接到载玻片上并分别用作靶点。
根据实施方案，通过将参比细胞悬浮液与琼脂糖(例如3％琼脂糖)混合，产生特定的已知参比细胞密度的参比细胞块，由此选择琼脂糖的量，使得待填充到第二模具中的所得参比细胞/琼脂糖混合物具有所需的参比细胞密度。
优选地，附着在载玻片上的参比细胞均匀分布在靶点上。同质性的检测可以使用细胞计数来进行，例如通过数字免疫组织化学装置(例如Aperio扫描镜)。同质性的检测也可以通过从每个细胞块部分提取和定量核酸来确认，以确定每个块中核酸的量和块中细胞混合物的比率。DNA提取和定量的方法是，例如，PCR、数字PCR和/或测序方法。
也可以使用产生靶点的替代方法：例如，如果靶分子是可用的蛋白质或可以纯化形式制备的蛋白质，用于产生蛋白质微阵列的蛋白质涂布技术可以用于将所需量的蛋白质牢固地附着在载玻片表面上。将蛋白质附着到载玻片表面的几种技术已被公开，例如Birgit Guilleaume等人的论文“Systematic comparison of surface coatings forprotein microarrays”，Proteomics 2005,5,4705–4712 4705,WILEY-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，其全部内容通过引用结合于此。描述用可用于产生靶的特定蛋白质涂布改性载玻片的方法的其他文献有，例如：
·Peluso,P.,Wilson,D.S.,Do,D.,Tran,H.等人,Anal.Biochem.2003,312,113–124.
·Zhu,H.,Klemic,J.F.,Chang,S.,Bertone,P.等人,Nature,Genet.2000,26,283–289.
·Mac Beath,G.,Schreiber,S.L.,Science 2000,289,1760–1763.
·Stillman,B.A.,Tonkinson,J.L.,Biotechniques 2000,29.630–635.)。
以上引用的文献主要涉及蛋白质通过与表面偶联的不同官能团共价连接。最常用的官能团是环氧、醛和羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。相反，氨基硅烷涂层通过静电力固定蛋白质。
根据所述方法的一些实施方案，所述方法包括通过用荧光诱导分子涂布载玻片的区域来产生荧光点。
例如，美国专利US 2003/0015668公开了一种通过蒸发或溶胶-凝胶工艺在非荧光载体上沉积极薄层Cy3、Cy5或其他荧光染料掺杂玻璃的方法，该专利通过引用整体并入本专利说明书。
根据另一个例子，荧光点可以通过EP 1774292B1中描述的任何一种校准点创建方法来创建，该专利说明书通过引用整体结合在此。所述文献描述了用于荧光微阵列扫描仪校准的稀土离子掺杂无机阵列及其制造方法。表面活性剂或分散剂用于帮助涂布的无机磷光体在水悬浮液中均匀分散。表面活性剂的任何合适的一种或混合物，例如吐温-20、特里顿-100、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酸钠(PAA)可以用于无机磷光体的悬浮液中。所述表面活性剂的量可以是0.1％～10％，更优选0.1-5％。优选地，在无机磷光体的所述悬浮液中加入点样剂，例如二甲基亚砜(DMSO)或甘油。载玻片可通过以下方法制备：用接触式打印机或旋涂和丝网印刷技术在载玻片上点荧光点。荧光斑点的直径可以例如在100～500μm的范围内，更优选120～300μm，但是它也可以具有任何其他尺寸。
荧光点和靶点可以被施加在标准显微镜载玻片上，该载玻片具有例如75.6mm x25mm x 1mm的尺寸。载玻片的表面可以是未修改的或修改的。例如，承载荧光点的载玻片可以通过化学方法进行全局或局部修饰，即氨基修饰载玻片、醛修饰载玻片、环氧修饰载玻片、硫醇修饰载玻片或聚合物膜修饰载玻片，即PVA膜、琼脂糖膜或PVA和琼脂糖膜的混合。可以在载玻片表面上沉积非常薄的层，以保护包含所述无机磷光体的荧光点。因此，可以产生具有低荧光背景的聚二甲基硅氧烷(PDMS)或PVA的透明薄膜，由此薄膜的厚度优选小于50μm。EP 1774292B1中描述了所述方法的进一步细节。根据所使用的荧光诱导分子，该方案可以适用于相应荧光诱导分子的特定性质。
图2是根据本发明实施方案的图像分析系统100的框图。该系统包括一个或多个处理器104、主存储器106和非易失性存储介质108。存储介质包括计算机可解释指令110、126，其被配置为执行用于确定组织样品152中靶分子密度的图像分析方法，如本文针对本发明的实施方案所述以及如图3的流程图所示。所述系统可以可选地包括或耦合到图像采集系统124，例如相机，用于接收载玻片150的荧光图像130，如图1所示。此外，或者可选地，荧光图像130存储在存储介质108上。存储介质108可以包括用于点检测逻辑126的指令，所述点检测逻辑被配置用于执行荧光载玻片的整个载玻片图像130的图像分析，以自动检测数字图像130中对应于荧光点、靶点和组织样品152的区域。此外，或者可替换地，两个校准点的坐标可以被预先配置并存储在存储介质中，并且可以用于快速和准确地识别数字图像中对应于相应校准点的像素。
因此，在步骤202中，图像分析系统100可以直接经由相机124或者通过从存储介质108读取现有荧光图像130来检索载玻片150的数字荧光图像130。
然后在步骤204中，接收对应于靶点、荧光点或组织样品的图像的不同区域的像素强度。例如，点检测逻辑126自动识别对应于荧光点、靶起始物和组织样品的像素区域。然后，图像分析逻辑110可以计算对应于靶点的像素的平均强度122、对应于荧光点的像素的平均强度120以及组织样品内感兴趣区域154的平均强度118。感兴趣区域154可以是单个像素(其强度值被用来代替“平均”强度值)，或者可以是一组像素，其组合分析仍然被认为足够详细以提取感兴趣的生物医学信息。构成感兴趣区域154的像素数量可以取决于特定的实验设置和医学问题，但是通常包括比包含在通常对应于单元大小的像素区域中更少的像素。优选地，分析和校准对应于组织样品的所有像素的荧光强度值，使得可以确定相应组织样品区域中靶分子的真实数量。因此，靶分子密度区域154的确定仅被描述为根据本发明的实施方案用于演示如何分析组织样品像素的总数的示例。获得的强度信息122、120和118可以可选地存储在存储介质108中。
然后，图像分析逻辑110读取指示靶点TD中的靶分子密度的已知密度信息116和指示荧光点FD中的荧光诱导分子密度的已知密度信息114。
然后在步骤206中，图像分析方法110根据测量的强度值1至2、120和118以及相应校准点TD、FD的“已知”分子密度114、116来计算感兴趣区域154中的靶分子密度。
图4描述了三种不同的酪胺信号放大测定，其各自的试剂盒是市售的。酪胺信号放大(参见例如美国专利5731158、5583001和5196306)在许多应用中放大荧光信号。TSA可用于在任何允许在其方案中加入辣根过氧化物酶(HRP)的应用中提高灵敏度，例如免疫组织化学、原位杂交、ELISA和基于微阵列的差异基因和蛋白质表达研究。HRP用于催化标记(例如生物素、DNP或其他标记部分)酪胺在组织切片或细胞制剂上的沉积和结合，所述组织切片或细胞制剂包含靶分子，通常是生物标记，例如蛋白质如CD20、CD4、CD45RO、CD68、FOXP3、panCK和其他定制靶。该结合是共价的，因为该反应与表面结合的内源性蛋白质上的酪氨酸残基中间二聚化。然后这些标签可以通过标准荧光技术检测。由于添加的标记仅沉积在酶位点附近，荧光信号选择性地指示靶分子的存在和量。如果荧光点包括两种或更多种不同类型的荧光诱导分子，并且如果载玻片150用两种或更多种各自的荧光诱导分子标记，则支持在同一样品中的多靶检测。使用TSA的进一步有益方面是，可以保持未放大的检测水平，同时使用少1000倍的初级抗体。
TSA放大试剂是一种酚类化合物，当被HRP激活时，会转化为一种短寿命的、反应性极强的自由基中间体。这种自由基中间体与相邻蛋白质的富电子区(主要是酪氨酸残基)快速反应并共价结合。这种结合发生在与HRP酶结合的位点附近。HRP催化荧光团或半抗原标记的TSA底物在包含靶分子的组织切片上的沉积和共价结合。在图4中，抗原(Ag 402)可以代表感兴趣的靶分子的表位。靶分子可以例如通过粘合剂层410直接附着到载玻片150上，例如在靶点TD中，或者可以作为细胞(例如靶点中的参比细胞或组织样品中的组织细胞)的元件附着到载玻片上。黑色抗体404代表选择性结合抗原的初级抗体。灰色抗体406是次级抗体，其与HRP酶一起形成次级抗体/HRP缀合物。“T”是一种带有荧光标记的酪胺，用于可视化。荧光团标记的TSA底物可以是例如生物素-酪酰胺缀合物、花青素-3-酪酰胺缀合物或DNP(二硝基苯酚)-酪酰胺缀合物。
通过将灵敏度提高10-200倍于标准ICC/IHC/ISH方法，在包含靶点和荧光点的载玻片上应用TSA测定，并应用本文针对本发明实施方案所述的图像分析方法，允许精确量化甚至低丰度的靶。
图5示出了根据本发明实施方案的载玻片的荧光图像502。像素区域504对应于靶点TD，像素区域506对应于荧光点FD，组织样品像素区域508对应于组织样品152。例如，像素区域504、506和508可以通过各种图像分析技术自动识别，例如斑点检测、图像分割和/或边缘检测法。通过改变荧光滤光器或激发光源以及各自的激发波长，可以产生进一步的荧光图像，其强度指示用不同荧光诱导分子标记的不同靶蛋白，或者其强度指示用不同荧光诱导分子标记的相同靶蛋白。

Claims (20)

1.一种用于确定荧光图像中描绘的组织样品中靶分子密度的图像分析方法，所述方法包括：
-通过图像分析系统(100)接收(202)载玻片(150)的数字图像(130)，所述载玻片包括组织样品(152)、靶点(TD)和荧光点(FD)，所述荧光点包括已知密度(114)的荧光诱导分子(408)，所述靶点包括已知密度(116)的靶分子(402)，所述组织样品和所述靶点已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色，所述数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值(122)和所述荧光点的强度值(120)，所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合所述靶分子；
-由所述图像分析系统接收(204)：
-所述图像中描绘的所述荧光点的像素强度(120)；
-所述图像中描绘的所述靶点的像素强度(122)；
-所述图像中描绘的所述组织样品的区域(154)的像素强度(118)；
-荧光诱导分子密度信息(114)，其指示所述荧光点中所述荧光诱导分子的已知密度；
-靶分子密度信息(116)，其指示所述靶点中所述靶分子的已知密度；
-根据所述荧光点的像素强度、所述靶点的像素强度、所述组织样品区域的像素强度、所述荧光诱导分子密度信息和所述靶分子密度信息来计算(206)所述组织样品区域(154)中的所述靶分子密度。
2.根据权利要求1所述的图像分析方法，所述组织区域(154)中所述靶分子密度的计算包括：
-根据以下公式计算所述荧光点的像素强度(120)的平均强度IFlD_AVG：
-根据以下公式计算所述靶点的像素强度(122)的平均强度ITaD_AVG：
-根据以下公式计算所述靶点中每个靶分子的荧光诱导分子比率R：
-根据以下公式计算所述组织样品的区域(154)中所述靶分子的密度δTarget_In_Tissue：
其中δTarget_In_Target_dot是所述靶点中靶分子的密度。
3.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，其进一步包括：
用所述靶分子涂布载玻片的一个区域，从而产生所述靶点。
4.根据权利要求3所述的图像分析方法，所述载玻片的所述区域的涂布使用蛋白质微阵列技术进行。
5.根据前述权利要求1至2中任一项所述的图像分析方法，其进一步包括生成所述靶点，所述生成包括：
-将参比细胞均匀地附着到所述载玻片的一个区域，从而产生所述靶点，所述参比细胞表达或包含已知数量的所述靶分子。
6.根据权利要求5所述的图像分析方法，所述方法进一步包括，在进行所述参比细胞的附着之前：
-在附着所述参比细胞之前，实验性地确定在一组参比细胞中表达或包含的靶分子的平均数量；并且
-计算附着到所述靶点的细胞数量。
7.根据权利要求6所述的图像分析方法，所述实验确定包括：
-处理参比组织样品，特别是FFPE组织样品，用于将所述参比组织样品转化为参比细胞的均匀悬浮液；
-实验性地确定所述悬浮液中所述参比细胞或悬浮液中所述参比细胞亚群中包含的靶分子的平均数量。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的图像分析方法，所述实验确定包括执行质谱分析或执行流式细胞分析，以定量确定所述参比细胞中的靶分子。
9.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，其中在所述染色过程中结合到单个靶分子的荧光诱导分子的比率是未知的，并且取决于所述染色方案的一个或多个参数。
10.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，其中所述染色方案是酪胺信号放大染色方案。
11.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，所述荧光诱导分子与单个靶分子的所述结合选自包括以下各项的组：
-与所述靶分子或连接到所述靶分子的一个或多个中间分子的共价或离子结合；
-偶极-偶极相互作用、范德瓦尔斯相互作用或与所述靶分子或连接到所述靶分子的一个或多个中间分子结合的氢；
-抗原抗体结合；
-核酸序列的杂交。
12.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，所述荧光诱导分子是荧光团或酶，所述荧光团或酶通过空间上靠近所述荧光诱导分子的其他分子触发荧光信号的发射。
13.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，所述荧光点包括已知密度的至少一种进一步类型的荧光诱导分子的进一步的荧光诱导分子，所述组织样品和所述靶点都已经被所述进一步的荧光诱导分子染色，所述方法包括：
-接收所述载玻片的进一步的数字图像，所述进一步的数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值(122)和所述荧光点的强度值(120)，所述荧光点、所述靶点和所述组织样品的强度值与所述荧光点、所述靶点和所述组织点中的进一步的荧光诱导分子的数量相关，所述进一步的荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合到所述靶分子；
-接收：
-在所述进一步的图像中描绘的所述荧光点的进一步的像素强度；
-在所述进一步的图像中描绘的所述靶点的进一步的像素强度；
-在所述进一步的图像中描绘的所述组织样品的区域(154)的进一步的像素强度；
-指示所述荧光点中所述进一步的荧光诱导分子的已知密度的进一步的荧光诱导分子密度信息；
-根据所述荧光点、所述靶点、所述组织样品区域的所述进一步的像素强度，所述进一步的荧光诱导分子的进一步的密度信息和所述靶分子密度信息，来计算所述组织样品区域(154)中靶分子的进一步的密度。
14.根据权利要求13所述的图像分析方法，其进一步包括：
-计算以下各项的平均值：
-根据前述权利要求1至12中任一项计算的所述组织样品区域(154)中所述靶分子的密度，以及
-根据权利要求13计算的所述组织样品区域(154)中所述靶分子的进一步密度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的图像分析方法，所述靶分子选自包括以下各项的组：
-生物标记分子；
-能够以预定的分子比率选择性地结合所述生物标记分子的初级抗体；
-能够以预定的分子比率选择性地结合所述初级抗体的次级抗体。
16.一种图像分析系统(100)，其被配置用于确定荧光图像(130)中描绘的组织样品中的靶分子的密度，所述系统包括存储介质(108)和一个或多个处理器(104)，被配置用于：
-接收(202)载玻片(150)的数字图像(130)，所述载玻片包括组织样品(152)、靶点(TD)和荧光点(FD)，所述荧光点包括已知密度(114)的荧光诱导分子(408)，所述靶点包括已知密度(116)的靶分子(402)，所述组织样品和所述靶点已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色，所述数字图像包括所述组织样品的强度值、所述靶点的强度值(122)和所述荧光点的强度值(120)，所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合所述靶分子；
-接收(204)：
-所述图像中描绘的所述荧光点的像素强度(120)；
-所述图像中描绘的所述靶点的像素强度(122)；
-所述图像中描绘的所述组织样品的区域(154)的像素强度(118)；
-荧光诱导分子密度信息(114)，其指示所述荧光点中所述荧光诱导分子的已知密度；
-靶分子密度信息(116)，其指示所述靶点中所述靶分子的已知密度；
-根据所接收的所述荧光点的像素强度、所述靶点的像素强度、所述组织样品区域的像素强度、所述荧光诱导分子密度信息和所述靶分子密度信息来计算(206)所述组织样品区域(154)中的所述靶分子密度。
17.一种载玻片(150)，其包括组织样品(152)、靶点(TD)和荧光点(FD)，所述荧光点包括已知密度(114)的荧光诱导分子(408)，所述靶点包括已知密度(116)的靶分子(402)。
18.根据权利要求17所述的载玻片，具有所述组织样品和所述靶点的所述载玻片已经在相同的染色过程中用所述荧光点中包含的相同类型的荧光诱导分子染色，所述荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合到所述靶分子。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的载玻片，所述载玻片的荧光点包括已知密度的至少一种进一步类型的荧光诱导分子的进一步的荧光诱导分子，所述进一步的荧光诱导分子适于在所述染色过程中直接或间接结合到所述靶分子。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的载玻片，所述靶点是所述载玻片上涂布有已知数量的所述靶分子或涂布有已知数量的细胞的区域，所述细胞表达或包含已知数量的所述靶分子。
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