CN101688838A - 一种用于双色微阵列荧光系统的可靠的荧光校正方法 - Google Patents

Abstract

本文所介绍的发明提供双色微阵列芯片测量系统中可靠测量荧光信号的方法和仪器。在双色荧光实验中使用两种荧光团标记样品时，所提供的方法和仪器可以使用户校正FRET干扰和荧光串扰。此发明中包含校正的方法、计算校正所需系统因子的方法、配套荧光扫描仪和适用于校正过程的微阵列芯片。这些方法通过在Cy5与Cy3之间存在FRET作用的微阵列芯片所证实。

Description

一种用于双色微阵列荧光系统的可靠的荧光校正方法

技术领域

[0001]这项发明是关于一种用于双色荧光标记系统的测量荧光发射光的可靠方法和体系，以及一种用于双色荧光标记系统的校正荧光共振能量转移与荧光串扰的简单方法。

背景技术

[0002]微阵列是一项普遍和有效的分子生物学研究技术，广泛用于基因表达谱分析、基因组分析和药物开发。在需要检测特定靶标分子(如DNA或RNA序列)的应用领域中，微阵列技术广为人知，同时在微阵列的制作和使用方法方面，已积累了许多的研究基础。微阵列芯片上的信息读取可以通过多种不同的方式，但最为便利并且选择性最高的方法是通过荧光检测，因为需要检测的靶标分子通常具有较低的荧光背景，而且荧光检测工具易于实现自动化。

[0003]微阵列方法通过荧光强度分析，可以并行地分析样品中不同靶标分子(例如核酸和蛋白)的相对数量。典型的应用包括使用cDNA微阵列芯片进行表达谱分析(Duggan，et al.，Nature Genetics Supplement，21：10-14，1999；Yang，etal.，Nature Review Genetics，3：579-588，2002)。微阵列芯片上固定的探针通常是已知结构的分子，用以检测样品中能与探针结合的靶标分子数量。芯片上的某些特定探针分子与样品中的某些特定靶标分子具有较强的亲和力。如果这些靶标分子存在于样品中，它们将与探针结合，并固定在芯片上。那么基于微阵列芯片上的荧光强度分析，将可以同时检测样品中大量不同靶标分子的相对数量。

[0004]使用微阵列技术时，可以选择两种方案：单色方案和双色方案。单色方案中，只使用一种荧光团标记：不同的样品分别标记后，与不同的芯片杂交。而双色方案中，使用两种荧光团(例如Cy3和Cy5)分别标记两个样品(处理样品和对照样品)。在单色方案中，通过荧光强度来测量单一样品中的靶标数量。在双色方案中，两个不同样品中相同靶标的相对数量可以同时测量，其前提是两种荧光团的测量互不干扰。

[0005]双色微阵列芯片的制作流程中，首先通过在薄板、芯片或载玻片上点制探针分子(例如cDNA片段、寡核苷酸、蛋白或组织)制作微阵列。通常，尺寸适合于样品自动处理和商业化荧光扫描仪检测的载玻片或薄板用作刚性的基底。其表面经过修饰后，包覆了聚赖氨酸或氨基，用于固定不同类型的探针分子。两组不同的样品(处理样品和对照样品，或阳性对照和阴性对照)分别使用不同的荧光团标记(例如标记处理样品的Cy5和标记对照样品的Cy3)。将标记后的样品混合，与固定有可寻址探针的微阵列芯片进行亲和反应。之后，洗去未与芯片结合的荧光标记的靶标分子，使用荧光扫描仪的双通道分别读取两种荧光的强度。通过分析来自双通道的合成的微阵列图像，可以进行背景校正，计算和归一化每个探针点上荧光团的数量比率(如Cy5/Cy3)。通过数据的解释，获取定量的生物信息，并分析实验的置信度。

[0006]然而，在双色微阵列系统中，两种荧光团之间可能会相互影响。当两种荧光团存在光谱重叠，并且同时存在于处理样品和对照样品的相同靶标结合到芯片上的同一探针区域时，两种荧光团之间可能发生非辐射的相互作用，例如FRET(称为荧光共振能量转移或福斯特共振能量转移)。由于FRET是一种距离依赖性的荧光团相互作用，因此当两种荧光距离较远时，不会发生FRET作用。但是实际情况下，很难确定两个荧光团之间的距离。同时，由于一种荧光团可能被另一种荧光团的激发光所激发，并且一种荧光团的发射荧光可能就进入另一种荧光团的检测通道，这被称作荧光串扰。FRET和荧光串扰的产生与荧光的光谱属性和检测仪器的配置有关。因此，在双标记实验中，荧光信号的采集将可能受到FRET和荧光串扰的干扰。

[0007]当一种荧光团(受体)的激发光谱与另一种荧光团(配体)的发射光谱存在重叠，并且这两种荧光团之间的距离小于10nm时，这两个荧光团之间可能发生非辐射的FRET作用。配体(如Cy3)和受体(如Cy5)称为FRET荧光对。配体较受体具有更短的激发和发射波长，以及更高的能量。当FRET发生时，配体的测量信号不能准确反应配体的真实数量：FRET将减少配体的直接荧光发射，而将配体的部分能量非辐射的转移给受体，从而干扰配体数量的测量。若同时检测受体荧光时，受体荧光的测量信号也将受到干扰，因为受体除了被激发光源激发外，还将接受因FRET作用从配体传递的能量。

[0008]为了消除因FRET而带来的测量干扰，需要选择合适光谱属性的荧光团，或者控制荧光团之间的距离超越FRET作用范围，例如使荧光团之间的距离大于10nm。但是，在一些实验系统中，不可能严格控制荧光团之间的距离，甚至在某些实验中，需要两种荧光团之间相互靠近。

[0009]荧光串扰的发生通常是因为荧光团的激发和发射光谱与测量仪器激发和发射波长的重叠。例如，某些情况下，使用配体通道中的配体激发光可以激发受体，而受体的发射光可以进入到配体的检测通道(当受体的吸收光谱与配体通道的配体激发光存在重叠)。同样，一些情况下，使用受体通道中的受体激发光可以激发配体，而配体的发射光可以进入到受体的检测通道中。

[0010]在一个理想的微阵列芯片平台上(包含特定的荧光团和荧光扫描仪组合)，FRET和荧光串扰都应该得到避免，这样，测量得到的荧光强度将正比于芯片上荧光团的数目。

[0011]然而双色微阵列平台上的常用荧光团满足FRET发生的光谱条件，同时，芯片上荧光团之间的距离难以控制，因此FRET或荧光串扰难以完全避免。当FRET存在时，需要对测量的配体荧光信号进行校正，达到通过荧光信号准确地确定荧光团数目的目的。过去的微阵列实验中，两种荧光团的强度分别通过荧光扫描仪的两个通道(通常为Cy3通道和Cy5通道)直接测量，没有进行FRET校正与荧光串扰校正。

[0012]当两种荧光团(例如Cy3与Cy5)同时存在与芯片上的同一个探针点上时，具有更高能量的荧光团(例如Cy3)可被看作配体。高能量的荧光团可以提供能量，去激发低能量的荧光团；而低能量的荧光团却不能提供足够的能量去激发高能量的荧光团。

[0013]当芯片上的配体与受体发生FRET时，配体荧光信号将降低，因此部分的配体能量将会通过非辐射途径传递给受体，而非以光子的形式进入荧光检测通道。而只有配体发射波长的荧光光子才能够被配体通道的检测器接收，而受体发射波长的荧光光子与配体非辐射的能量无法被配体通道的检测器接收，因此通过配体的荧光强度将低估芯片上的配体数量。

[0014]本发明提供了一种用于双色微阵列实验的可靠的利用三通道荧光扫描仪的荧光强度测量方案。扫描仪的每个通道分别接收特定的荧光发射信号，整合三个通道的荧光信号可以进行FRET校正与荧光串扰校正。这种可靠的荧光测量方法可以准确测量微阵列芯片上的荧光强度，为后续的微阵列分析提供可靠的数据。

[0015]配体通道指使用配体激发波长激发，通过配体发射波长检测；受体通道指使用受体激发波长激发，通过受体发射波长检测；FRET通道指使用配体激发波长激发，通过受体发射波长检测。

发明内容

总论

[0016]此发明提供了包含FRET校正和荧光串扰校正的可靠荧光测量的技术和设备。我们首先描述FRET校正方案，然后考虑荧光串扰的校正。主要包含三个步骤：

a)确定实验系统参数(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)

b)获取配体通道荧光发射、受体通道荧光发射和FRET通道荧光发射。其中配体通道用于观察配体荧光，受体通道用于观察受体荧光，FRET通道用于观察受体因FRET激发而产生的敏化发射。

c)通过确定的系统参数和测量的荧光发射强度，通过此发明的公式计算完全的荧光强度。

荧光信号的FRET校正

[0017]配体和受体荧光团可以是任意合适的荧光团组合。它们可以是商业化的荧光染料，包括cyanine染料、Alexa染料、Cy5_26_6、Cy5T1、Cy5T6、Cy5T7、Cy5T8、Sq5T5、Sq5T7’、Sq5T8、Sq5T6、Cy5.5T8、Cy5.5T7、Sq5T2、Sq5T1、Sq5T4、Sq5T3、Sq5T10、Sq5、Cy5.5T9、Cy5.5T5、Cy5.5T10、Cy5.5、Cy5.5T12和Cy5.5T6。这些荧光染料的结构参见Tu等的论文(Nucleic Acids Research，26：2797-2802，1998)。这些染料的发射光波长范围为630-700nm。其他可用的染料包括DY-630、DiD、Dy-635、DY-640、Bodipy630/650、ATTO 655和ATTO 680，这些染料的结构参见Buschmann等的论文(Bioconjugate Chemisty，14：195-204，2003)。在一些实验中，使用Cy3(配体)和Cy5(受体)染料，它们是常见的花氰染料，包含不同的烷基和苯环，其结构如下所示：

[0018]我们定义I_{TotalAcceptor}为(假设不存在配体时)受体的全部发射荧光，而I_TotalDonor为(假设不存在受体时)配体的全部发射荧光。当荧光团的量子产率保持不变时，I_{TotalAcceptor}和I_TotalDonor分别正比于配体的数量和受体的数量。当样品中只存在一种荧光团时，不存在FRET作用，可通过荧光强度定量荧光丰度(液相中，丰度指浓度；固相上，丰度指密度)。当微阵列芯片的探针点上同时存在两种荧光团，FRET干扰或荧光串扰可能存在。除非实验中能够完全排除FRET干扰或荧光串扰，为了准确测量荧光信号，都需要进行FRET校正和荧光串扰校正。我们首先不考虑系统的荧光串扰，只进行FRET校正。

[0019]当微阵列实验中使用的荧光团光谱满足FRET发生的条件(受体的激发光谱与配体的发射光谱存在较大重叠)，并且两个不同的荧光团相互靠近(距离小于10nm)，可能发生FRET作用。受体通道的测量值M_AA等于全部受体发射荧光I_{TotalAcceptor}，但配体通道的测量值M_DD将因FRET作用而降低，从而小于全部配体发射荧光I_TotalDonor。我们使用M_DA表示FRET通道的测量值。

[0020]为了进行FRET校正，我们定义了校正因子G。校正因子G在给定的系统中(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)为常数。校正因子G可使用下式定义：

$G=\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{I_{\mathrm{FretDonor}}^{\mathrm{post}}-I_{\mathrm{FretDonor}}}---\left(1\right)$

其中，I_FretDonor ^post和I_FretDonor分别表示受体淬灭后和淬灭前，参与FRET作用的直接配体发射荧光。I_{SensitizedAcceptor}表示受体因FRET作用而产生的敏化荧光。

[0021]通常情况下，双标记样品中同时存在参与FRET作用的配体和不参加FRET作用的配体。我们称前者在配体通道的发射荧光为I_FretDonor，称后者在配体通道的发射荧光为I_noFretDonor。因此，I_TotalDonor可以使用下式表示：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{noFretDonor}}+I_{\mathrm{FretDonor}}^{\mathrm{post}}---\left(2\right)$

[0022]综合公式1与公式2，我们可以得到公式3：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{noFretDonor}}+I_{\mathrm{FretDonor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(3\right)$

其中，I_noFretDonor与I_FretDonor之和等于实际的直接配体发射荧光，用I_Donor表示。I_{SensitizedAcceptor}是实际受体敏化荧光，G在一个特定的实验系统中(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)为常数。因此，不论配体与受体荧光团是否发生FRET作用，全部配体发射荧光I_TotalDonor可用公式3计算，而全部受体发射荧光I_{TotalAcceptor}等于实际的直接受体发射荧光I_Acceptor。

荧光串扰校正

[0023]为了全面的校正荧光测量中的干扰，需要对荧光串扰进行校正。荧光串扰源于配体与受体的光谱重叠。为了校正荧光串扰，I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor可用公式4-5计算，此方面为Gordon等提出(Biophysical Journal，74：2702-2713，1998)：

$I_{\mathrm{Acceptor}}=M_{\mathrm{AA}}\·\frac{\mathrm{\α}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}-M_{\mathrm{DA}}\·\frac{\mathrm{\α}\·\mathrm{\φ}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}---\left(6\right)$

其中，α等于只包含受体的探针点上受体通道的荧光强度与FRET通道荧光强度的比值，β等于只包含配体的探针点上配体通道的荧光强度与FRET通道的荧光强度比值，φ等于只包含配体的探针点上受体通道的荧光强度与FRET通道的荧光强度比值，

等于只包含受体的探针点上配体通道的荧光强度与FRET通道荧光强度比值。这四个系统因子被称为荧光串扰因子，在一个特定的实验系统中(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)为常数。

[0024]因为以上这些系统因子与系统因子γ提供了足够的信息用于FRET校正，此发明提供了一种新颖的微阵列芯片，此芯片上包含了FRET校正所需的特定标准探针点。标准探针点1仅含有配体荧光团，标准探针点2仅含有受体荧光团，标准探针点3含有相同数量的配体和受体荧光。标准探针点1与标准探针点2可能具有相同数目的荧光团。标准探针点3中含有的配体与受体数目也可分别同标准探针点1中的配体和标准探针点2中的受体数目相同。配体与受体称为FRET荧光对，例如Cy3可作为配体，Cy5可作为受体。

确定系统因子G

[0025]当前存在一些方法用于确定校正因子G。Chen等(Biophysical Journal，91：39-41，2006)提出了一种确定校正因子G，这个方法要求使用两组同时包含配体和受体的复合物，这两组复合物中的配体与受体之间距离必须不同，从而其FRET效率不同。其他的确定校正因子G的方法存在各种不同的缺点，例如，有的方法需要特殊的测量仪器(一种方法需要测量荧光量子产率)，有的方法需要制备多组同时包含有配体与受体的复合物。本文提出两种新的确定校正因子G的方法，无需合成这类复合物，并且能够直接使用荧光扫描仪测量，因此适合微阵列平台的使用。

[0026]我们定义系统的响应因子γ为配体在配体通道的检测荧光强度与相同数目的受体在受体通道的检测荧光强度的比值。响应因子γ在一个特定的实验系统中(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)为常数。响应因子γ可用下列公式计算：

$\mathrm{\γ}=\frac{I_{\mathrm{acc}}}{I_{\mathrm{don}}}---\left(7\right)$

其中，I_acc和I_don分别代表配体在配体通道的检测荧光强度和相同数目的受体在受体通道的检测荧光强度。

[0027]因此改写公式3，可以通过公式8计算校正因子G：

$G=\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}}{\mathrm{\γ}}-{I^{\′}}_{\mathrm{Donor}}}---\left(8\right)$

其中I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Acceptor和I′_Donor分别表示标准探针点3(受体与配体数目相同，并发生FRET作用)上实际的敏化受体发射荧光、实际的直接受体发射荧光和实际的直接配体发射荧光。

用于确定发生FRET时的全部配体发射荧光。如果标准探针点3上无FRET作用存在，那么公式8的分子与分母均接近0，将给计算带来较大误差。I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Acceptor和I′_Donor可以使用公式4-6计算。

[0028]为了确定一个特定实验系统中(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)的校正因子G和荧光串扰因子，需要制备三个标准探针点，包括只含有配体的标准探针点1、只含有受体的标准探针点2和含有相同数目配体与受体的标准探针点3。因为校正因子G十分重要，此发明提供了一个微阵列芯片的设计，在此芯片上设计了一种含有相同数目配体与受体的标准探针点，受体与配体可以通过混合或绑定结合的形式存在。一些实例中，为了构建这类标准探针点，可将配体与受体等量混合，其数量的差异不能大于10％，最好小于5％。

[0029]微阵列芯片的标准探针点3上包含相同数目的配体与受体。这类标准探针点可以通过预先制备、绑定一种分子(同时标记有两个荧光团)或绑定一种复合物(复合物中包含有等量的配体与受体)实现，也可以通过在同一探针点上制备等量的配体与受体实现，还可以通过将等量配体标记分子与受体标记分子的混合物同芯片上互补分子绑定结合的方式实现。一些实例中，可以将标记了其中一种荧光团的分子固定在芯片表面，然后将标记了另一种荧光团的分子与芯片上固定的分子绑定结合。通过分子的结合，使得探针点上两种荧光团的数目相同。

[0030]另一种制备标准探针点3的方法是，将配体标记的分子与受体标记的互补分子通过两种分子的亲和力一对一的绑定结合，结合后的复合物包含等量的配体与受体。这种绑定结合反应可以在溶液中进行，然后将结合后的复合物通过传统的方法固定到芯片表面。

[0031]另一种制备标准探针点3的方法是点制或绑定双标记的复合物到芯片上。这种复合物可以通过本文所介绍的制作Cy5-dsDNA-Cy3-NH₂芯片的方式产生，也可以通过合成的方式产生。

[0032]另一种制备标准探针点3的方法是将配体标记的分子与受体标记的相同分子混合后点制到芯片上，或将配体标记的分子与受体标记的相同分子混合后与芯片上固定的互补分子绑定结合。混合样品中，配体标记的分子与受体标记的分子等量，因此芯片探针点上的配体与受体的数量相同，如本文的Cy5/Cy3-dsDNA-NH2芯片制作过程。

[0033]确定了一个特定实验系统(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数1的组合)的校正因子G以后，我们可以通过以下的方法确定另一个特定实验系统(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数2的组合)的校正因子G。

[0034]由于荧光串扰因子β等于仅含有配体的探针点上配体通道的荧光信号与FRET通道的荧光信号之比，因此可以用以下的公式表示：

$\mathrm{\β}=\frac{P_D^{\mathrm{Donor}}\·{\mathrm{\η}}_D\·\∫(S_D\·F_D)}{P_D^{\mathrm{FRET}}\·{\mathrm{\η}}_A\·\∫(S_D\·F_A)}---\left(9\right)$

而校正因子G可以用下列公式表示(Zal，et al.，Biophysical Journal，86：3923-3939，2004)：

$G=\frac{P_D^{\mathrm{FRET}}\·{\mathrm{\φ}}_A\·{\mathrm{\η}}_A\·\∫(S_A\·F_A)}{P_D^{\mathrm{Donor}}\·{\mathrm{\φ}}_D\·{\mathrm{\η}}_D\·\∫(S_D\·F_D)}---\left(10\right)$

[0035]这里，P_D ^Donor和P_D ^FRET分别表示配体通道的激发光强和FRET通道的激发光强；η_D和η_A分别表示配体通道和FRET通道的接收效率(分别与配体通道和FRET通道的探测器增益有关)；φ_D和φ_A分别表示配体与受体的量子产率；S_D和S_A分别表示归一化的配体发射光谱和受体发射光谱；F_D和F_A分别表示配体通道滤光片组的传递系数与FRET通道滤光片组的传递系数。因此，校正因子G与荧光串扰因子β的关系可用下式表示：

$G=\frac{{\mathrm{\φ}}_A}{{\mathrm{\φ}}_D}\·\frac{\∫(S_A\·F_A)}{\∫(S_D\·F_A)}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}---\left(11\right)$

其中，校正因子G与荧光串扰因子β成正比关系。

[0036]由于参数φ_D、φ_A、S_D、S_A、F_D和F_A在一个特定实验系统(包含特定的荧光团和荧光扫描仪的组合)中保持不变，与扫描仪的扫描参数(包含激发光强和发射光检测器增益)无关。因此，比例系数H(也就是

)在一个特定实验系统(包含特定的荧光团和荧光扫描仪的组合)中保持不变，与扫描仪的扫描参数无关。

[0037]我们通过已知的G和

计算比例系数H，一旦H确定后，只要荧光团和荧光扫描仪的组合不变，只改变扫描参数时，G即可通过β的测量而计算。因此，若只改变扫描参数，微阵列芯片上只需要制备两个标准探针点，即可测量G和所有荧光串扰因子。两个标准探针点包括只含有配体的标准探针点1和只含有受体的标准探针点2。标准探针点2上的受体数目无需与标准探针点1上的配体数目相同。这种方法简化了确定G的过程。在某些实例中，为了方便和灵活处理，标准探针点2上的受体数目与标准探针点1上的配体数目相同。

FRET干扰与荧光串扰的校正

[0038]在通常的双色微阵列实验中，两种荧光团(配体与受体)分别标记两组样品，例如使用Cy3作为配体，Cy5作为受体。当配体标记的样品靶标与受体标记的样品靶标与芯片上同一探针点上的探针反应时，不同分子之间会出现随机的接近现象。因此，即使配体和受体分别结合在不同分子上，FRET也可能发生。常用的商业化扫描仪中，配体通道不能检测到受体荧光，而受体通道也不能检测配体荧光，因此φ和

均为0，这种条件下，校正因子G可以使用下式计算：

$G=\frac{{M^{\′}}_{\mathrm{DA}}-{M^{\′}}_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-{M^{\′}}_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}}{\frac{{M^{\′}}_{\mathrm{AA}}}{\mathrm{\γ}}-{M^{\′}}_{\mathrm{DD}}}---\left(12\right)$

其中，M′_DA、M′_AA和M′_DD分别表示标准探针点3上FRET通道的荧光信号、受体通道的荧光信号和配体通道的荧光信号。标准探针点3上配体与受体的数目相同，并且配体与受体之间发生FRET作用。

[0039]样品检测探针点上I_TotalDonor和I_{TotalAcceptor}可通过下式计算：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=M_{\mathrm{DD}}+\frac{M_{\mathrm{DA}}-M_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-M_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}}{G}---\left(13\right)$

I_{TotalAcceptor}＝M_AA    (14)

其中，M_DA、M_AA和M_DD分别表示样品检测探针点上FRET通道的荧光信号、受体通道的荧光信号和配体通道的荧光信号。

[0040]在某些实例中，此发明提供了一种微阵列芯片设计，芯片上包含一些探针点，用于微阵列系统或仪器的标定。微阵列芯片可以包含一个或多个用于检测靶标的样品检测探针点以及至少两个用于系统标定的标准探针点。一个实例中，芯片包含两个标准探针点，用于本文所介绍的标定方法。这两个标准探针点即为只含有配体的标准探针点和只含有受体的标准探针点。这两个标准探针点上的荧光团数量可以相同，也可以不同。

[0041]在另一些实例中，此发明提供了一种包含三个标准探针点的微阵列芯片设计。这三个标准探针点用于可靠的荧光信号测量，包括仅含有配体的标准探针点1、仅含有相同数量受体的标准探针点2以及含有等量配体与受体的标准探针点3。

[0042]这些微阵列芯片可以用于测量系统因子(例如G、H、γ、α、β、φ和

)，并用本文所介绍的方法校正双色微阵列平台上的荧光信号。这类微阵列芯片的设计和制备这类微阵列芯片的方法属于本发明的范围。

[0043]对于含有等量配体与受体的标准探针点3，配体与受体可以先后放置到同一探针点上，也可以混合后同时放置到同一探针点上。一种特别简便的方法是将一种荧光团标记的分子首先固定到芯片表面，然后将另一种荧光团标记的互补分子与芯片上固定的分子结合。通过这种方式，芯片上将固定等量配体与受体。

[0044]标准探针点1可以通过两种方式构建：点制配体标记的分子到芯片(也就是通过已知方法固定配体标记分子到芯片上)，或者将配体标记的分子与芯片上无标记的互补分子绑定结合。

[0045]标准探针点2可以通过两种方式构建：点制受体标记的分子到芯片(也就是通过已知方法固定受体标记分子到芯片上)，或者将受体标记的分子与芯片上无标记的互补分子绑定结合。

[0046]微阵列芯片可以包含一个或多个用于检测靶标的样品检测探针点以及至少两个用于系统标定的标准探针点。在一个实例中，当含有标准探针点和样品检测探针点的芯片与不同荧光团标记的样品混合物反应，即可用于特定的实验与分析。如果样品中的靶标与样品检测探针点上的探针结构互补，样品中标记的靶标即可绑定到样品检测探针点上，然后使用三通道扫描仪测量芯片上的荧光信号，并使用本文介绍的方法进行计算。这类微阵列芯片可以是专门对系统进行标定的芯片，也可以是包含样品检测探针点和3个标准探针点的芯片。

[0047]一旦微阵列芯片制作完成，即可使用三通道荧光扫描仪读取芯片上的荧光信号，通过标准探针点确定校正所需的系统因子，并进行FRET校正。这样的操作，可以让使用者在采集样品检测探针点荧光信号的同时，采集用于FRET校正和荧光串扰校正的标准探针点的荧光信号。使用者也可以使用一张不含样品检测探针点而仅含有标准探针点的微阵列芯片独立进行校正所需系统因子的测量与计算，然后使用另一张含有样品检测探针点的微阵列芯片进行样品分析。系统因子的测量可以在样品检测前或检测后进行，也可以在样品检测的同时进行。一旦得到了校正所需的系统因子和样品检测探针点的信号强度，即可使用本发明所描述的方法校正样品检测探针点上的信号强度，消除FRET干扰和荧光串扰干扰，获得能够反应实际靶标数量的荧光信号强度。此方法包括使用本文所描述的方法计算每个样品检测探针点上的两种校正后的荧光强度，消除FRET干扰和荧光串扰干扰。

[0048]在一些实例中，荧光标记的靶标分子可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、mRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。同样，固定在芯片上的探针分子也可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、mRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。

[0049]此发明所涉及的荧光扫描仪是一种能够读取二维平面上的荧光信号的仪器。在某些方面，此发明所提供的一种三通道荧光扫描仪包含：

第一个荧光观察通道中配置了适合第一种荧光团激发波长的激发光和适合第一种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。

第二个荧光观察通道中配置了适合第二种荧光团激发波长的激发光和适合第二种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。

第三个荧光观察通道中配置了适合第一种荧光团激发波长的激发光和适合第二种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。为方便理解，这里使用了第一种荧光团和第二种荧光团的概念代替了配体和受体的概念，第三个通道即为配体激发波长激发，受体发射波长检测。在一个实例中，扫描仪包括一张含有两个标准探针点或三个标准探针点的微阵列芯片，用于确定系统因子。

[0050]此发明提供了一种用于计算配体校正后荧光强度的方法，包含了校正所需系统因子的计算以及随后的样品检测探针点荧光信号的校正。准确的配体荧光强度可以使用下式计算：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{Donor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(15\right)$

I_{TotalAcceptor}＝I_Acceptor    (16)

其中，I_TotalDonor表示样品检测探针点上全部配体荧光强度，I_{TotalAcceptor}表示样品检测探针点上全部受体荧光强度，I_{SensitizedAcceptor}表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度，I_Donor表示样品检测探针点上实际的直接配体发射荧光，I_Acceptor表示样品检测探针点上实际的直接受体发射荧光，G可以使用下式计算得到：

$G=\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}}{\mathrm{\γ}}-{I^{\′}}_{\mathrm{Donor}}}---\left(17\right)$

其中，I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Donor和I′_Acceptor分别表示含有等量配体与受体的标准探针点3上实际敏化受体荧光、实际的直接配体发射荧光和实际的直接受体发射荧光强度。γ为系统响应因子，可以用下式表示：

$\mathrm{\γ}=\frac{I_{\mathrm{acc}}}{I_{\mathrm{don}}}---\left(18\right)$

其中，I_acc是仅含有受体的标准探针点2的受体发射荧光强度，I_don是仅含有等量配体的标准探针点1的配体发射荧光强度。

[0051]另一方面，此发明提供了一种方法用于在双色微阵列分析中对荧光串扰的校正，至少包含以下步骤：

(1)提供仅包含配体的标准探针点1和仅含有受体的标准探针点2。

(2)使用这两个标准探针点确定串扰校正因子φ、β、

和α。其中，φ等于标准探针点1在受体通道的信号与在FRET通道的信号之比，β等于标准探针点1在配体通道的信号与在FRET通道的信号之比，

等于标准探针点2在配体通道的信号与在FRET通道的信号之比，α等于标准探针点2在受体通道的信号与在FRET通道的信号之比。用户在采集每个样品检测探针点上的荧光信号后，利用这四个参数可实现荧光串扰校正。

[0052]这些方法也可以包括使用标准探针点3进行G的计算。

[0053]用户可以通过下面的公式校正每个样品检测探针点上实际的发射荧光，消除荧光串扰对测量的影响：

$I_{\mathrm{Acceptor}}=M_{\mathrm{AA}}\·\frac{\mathrm{\α}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}-M_{\mathrm{DA}}\·\frac{\mathrm{\α}\·\mathrm{\φ}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}---\left(20\right)$

其中，I_{SensitizedAcceptor}表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度，I_Donor表示样品检测探针点上实际的直接配体发射荧光，I_Acceptor表示样品检测探针点上实际的直接受体发射荧光。

[0054]如果芯片上不仅存在荧光串扰，还可能发生FRET，那么可以使用含有三个标准探针点的微阵列芯片(标准探针点1、标准探针点2和标准探针点3)取代含有两个标准探针点的微阵列芯片(标准探针点1和标准探针点2)，标准探针点3用语确定FRET校正因子G。

[0055]当FRET可能发生时，对标准探针点3测量得到的荧光信号包括：配体通道荧光信号M′_DD、受体通道荧光信号M′_AA和FRET通道荧光信号M ′_DA。这些测量值通过下列公式对荧光串扰进行校正：

${I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}={M^{\′}}_{\mathrm{AA}}\·\frac{\mathrm{\α}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}-{M^{\′}}_{\mathrm{DA}}\·\frac{\mathrm{\α}\·\mathrm{\φ}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}---\left(23\right)$

其中，I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Donor和I′_Acceptor分别表示含有等量配体与受体的标准探针点3上实际敏化受体荧光、实际的直接配体发射荧光和实际的直接受体发射荧光强度。这些校正值将用于计算校正因子G。

[0056]在一些实例中，荧光串扰现象并不显著，因此可以将校正的步骤进行简化。当仅含有配体的样品在受体通道中没有信号，同时仅含有受体的样品在配体通道中没有信号时，荧光串扰因子φ和

接近0。在这种情况下，样品检测探针点上实际的发射荧光可以通过下式计算：

$I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}=M_{\mathrm{DA}}-M_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-M_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}---\left(25\right)$

I_Acceptor＝M_AA    (26)

I_Donor＝M_DD         (27)

标准探针点3上实际的发射荧光可以通过下式计算：

${I^{\′}}_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}={M^{\′}}_{\mathrm{DA}}-{M^{\′}}_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-{M^{\′}}_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}---\left(28\right)$

I′_Acceptor＝M′_AA   (29)

I′_Donor＝M′_DD      (30)

其中，I_{SensitizedAcceptor}、I_Donor和I_Acceptor分别表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度、实际的直接配体发射荧光强度和实际的直接受体发射荧光强度。M_DA、M_DD和M_AA分别表示样品检测探针点上FRET通道、配体通道和受体通道的荧光信号测量值。I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Donor和I′_Acceptar分别表示含有等量配体与受体的标准探针点3上实际敏化受体荧光强度、实际的直接配体发射荧光强度和实际的直接受体发射荧光强度。M′_DA、M′_DD和M′_AA分别表示标准探针点3上FRET通道、配体通道和受体通道的荧光信号测量值。因此，用户可以使用上述的公式对样品检测探针点进行荧光串扰和FRET干扰的校正。

[0057]例如，一个熟练操作者可以使用上述方法计算的I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor来校正FRET干扰和荧光串扰，获得配体的全部发射荧光和受体的全部发射荧光。当仅含有配体的样品在受体通道中没有信号，同时仅含有受体的样品在配体通道中没有信号时，荧光串扰因子φ和

接近0。因此，实际的发射荧光I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor可以通过公式25-27计算，从而校正FRET干扰和荧光串扰，获得样品检测探针点上配体的全部发射荧光和受体的全部发射荧光。

[0058]另一方面，此发明提供了一种确定校正因子G的方法，此因子与实验系统有关。通过公式17、22、23、24计算得到的标准探针点3上实际的发射荧光I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Acceptor和I′_Donor后，计算校正因子G。确定校正因子G后，可通过公式15计算校正后的全部发射荧光。同样，当仅含有配体的样品在受体通道中没有信号，同时仅含有受体的样品在配体通道中没有信号时，荧光串扰因子φ和

接近0。这时，可以通过公式28-30计算得到的标准探针点3上实际的发射荧光I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Acceptor和I′_Donor后，可利用公式17计算校正因子G。

[0059]同时，本发明提供了一种新的确定校正因子G的方法。这种方法适用于实验系统中扫描仪和荧光团没有改变，而仅有扫描仪的扫描参数改变的情况。当荧光团属性、扫描仪以及扫描参数都没有改变时，校正因子G保持不变。当扫描参数改变时，校正因子G改变。然后，当使用扫描仪的扫描参数2时，校正因子G的值可以通过扫描参数1时校正因子G的值(G_parameter1)计算。这样可以避免重新计算新的扫描参数下校正因子G。改变扫描参数后，无需重新计算校正因子G。

[0060]我们定义G_parameter2为扫描参数2时校正因子G的值，它可以通过下式计算：

$G_{\mathrm{parameter}2}=\frac{H}{{\mathrm{\β}}_{\mathrm{parameter}2}}---\left(31\right)$

其中，β_parameter2表示扫描参数2时仅含配体的标准探针点上配体通道荧光信号与FRET通道荧光信号的比值，H为比例系数，可通过下式计算：

H＝β_parameter1·G_parameter1            (32)

其中，β_parameter1表示扫描参数1时仅含配体的标准探针点上配体通道荧光信号与FRET通道荧光信号的比值，G_parameter1表示扫描参数1时校正因子G的值，可通过公式17或其他方法确定。扫描参数1与扫描参数2的区别可以是激发光的光强，也可以是荧光检测器的增益。当激发光的光强或荧光检测器的增益改变时，校正因子G均会发生变化。为了确定新扫描参数下的校正因子G，可以通过公式32首先计算H，然后使用H和公式31计算新的G值。

[0061]此发明的方法可以用于任意的具有较大激发波长与发射波长差异的荧光对。荧光团之间应具有较大的荧光属性差异(包括激发波长和发射波长)，以便于荧光团的单独激发与检测。在一些实例中，配体的发射波长和激发波长均比受体激发波长至少小30nm。在一些实例中，配体的发射波长比受体的激发波长至少小50nm。配体和受体可以分别是Cy3和Cy5，也可以是微阵列分析中使用到的其他荧光团。

附图说明

[0062]图1显示了(oligo-2)-NH₂分子作为探针固定到微阵列芯片上的点阵模式图。包含八个不同浓度的子阵，D1：0.05μM，D2：0.1μM，D3：0.2μM，D4：0.4μM，D5：0.8μM，D6：1.6μM，D7：3.2μM，D8：6.4μM。

[0063]图2(a)-(i)为Cy5-dsDNA-NH₂芯片、Cy3-dsDNA-NH₂芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-NH₂芯片的微阵列图像。分别使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道扫描获得。本实例中，仅使用一个子阵(探针浓度为1.6μM)计算系统因子。扫描仪532nm激发光和640nm激发光强度均设为80，570nm和675nm荧光发射光检测器增益均设为650。

[0064]图3(a)-(c)为Cy5/Cy3-dsDNA-NH₂芯片的微阵列图像。分别使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道扫描获得。八个子阵的信号点用来计算Cy5与Cy3的信号强度比。扫描仪532nm激发光和640nm激发光强度均设为80，570nm和675nm荧光发射光检测器增益均设为650。

[0065]图4为Cy5/Cy3-dsDNA-NH₂芯片上Cy5与Cy3的信号强度比。未校正的Cy3信号与校正后的Cy3信号分别用于计算校正前后Cy5与Cy3的信号强度比。

具体实施方式

[0066]这项发明将实施方式进一步进行描述。

[0067]若无特殊说明，这里用到的术语使用它们的原始含义。微阵列和荧光扫描仪已被广泛使用。通常，微阵列上包含有许多探针点，这些探针点以一定的模式或网格的形式分布在固相基底表面。固相基底可以是任意合适的材料，如玻璃、塑料、尼龙膜或硅片。探针可以使用传统的方法放置到芯片表面，如点制、印刷、原位杂交或其他合适的方式。

[0068]芯片或薄板上的点是一组不连续的网格状探针点。探针点可以是用于样品中靶标检测的探针点，也可以是用于标定的质控探针点或标准探针点。通常情况下，一张微阵列芯片上存在96个探针点，也可以存在超过1000个的探针点。每个探针点的直径在1μm到1mm之间。技术上，印刷的探针点直径在10μm到500μm之间。

[0069]本申请所述的结合配对分子指2个分子，它们之间具有结合的亲和力。每个分子称为配对成员，每个配对成员被认为是另一个的补充，两者能够紧密结合。它们之间的亲和力可使得它们反应后能形成一种稳定的复合物。例如，亲和素(avidin或streptavidin)和生物素(biotin)可以作为一组配对成员，亲和素和生物素之间具有较强的亲和力。5-50bp长度的核酸序列与其互补序列杂交后也可以形成稳定复合物，因此它们也可以作为一组配对成员。配对成员可以作为中介，依靠其亲和力，将不同分子绑定成稳定复合物。配对成员之一可以与第一种分子(荧光团1)结合形成第一种化合物，另一配对成员可以与第二种分子(荧光团2)结合形成第二种化合物。这两种化合物可以通过配对成员之间的亲和力连接，从而将第一种分子与第二种分子结合在一起，形成更大的复合物。这个实例中，荧光团1和荧光团2通过过配对成员之间的绑定结合而靠近。

[0070]为了校正双色微阵列芯片实验中的荧光强度，我们首先需要确定系统因子，试验中使用Cy5和Cy3作为标记荧光团，微阵列扫描仪作为荧光检测仪器。然而，任意的具有较好激发波长与发射波长分辨差异的荧光对均可使用。然后，使用确定的系统因子，我们校正了微阵列芯片上的荧光强度。在此芯片上Cy5与Cy3通过杂交结合于同一探针点上。最后我们比较了校正前后的Cy5与Cy3的信号比值。

寡核苷酸合成

[0071]所有的寡核苷酸均由TaKaRa公司(宝生物工程有限公司，大连，中国)合成。其细节如下表所示。

表1实验中所用的寡核苷酸

实验中使用的荧光团包括Cy3(最大激发波长为550nm，最大发射波长为570nm，配体)和Cy5(最大激发波长为649nm，最大发射波长为670nm，受体)。

[0072]第一组寡核苷酸(oligo-1)序列均为5′-TCCGTCATCGCTCAAG-3′，但标记不同。3′末端标记Cy5的版本称为(oligo-1)-Cy5，3′末端标记Cy3的版本称为(oligo-1)-Cy3，3′末端标记Cy3而5′末端标记Cy5的版本称为Cy5-(oligo-1)-Cy3。

[0073]第二组寡核苷酸为5′-CTTGAGCGATGACGGATTTTTTTTTTTTTTTT-3′-NH₂，简称为(oligo-2)-NH₂。其3′末端含有氨基，用于同芯片上的醛基反应，将探针固定于芯片上。5′端的16个碱基于第一组寡核苷酸互补。3′端的16个T碱基作为尾巴，将5′端的序列支撑起来，以利于与oligo-1杂交。

芯片的构建

[0074](oligo-2)-NH₂分子溶解于DNA点样缓冲液(博奥生物有限公司，北京，中国)，配制8个浓度梯度(0.05μM到6.4μM)，配制的浓度梯度溶液按图1所示的排布点制到微阵列芯片上，点制的微阵列芯片称为(oligo-3)-NH₂芯片。点样使用SmartArrayer-48微阵列芯片点样仪(博奥生物有限公司)，基片采用醛基芯片(博奥生物有限公司)。

[0075](oligo-1)-Cy5、(oligo-1)-Cy3和Cy5-(oligo-1)-Cy3分别溶解于微阵列杂交缓冲液(5×Denhardt’s solution，0.2％SDS，3×SSC)，浓度均为1.0μM，各取12μL的溶液分别与(oligo-2)-NH₂芯片杂交，构建的芯片称为Cy5-dsDNA-NH₂芯片，Cy3-dsDNA-NH₂芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-NH₂芯片。同时，我们将(oligo-1)-Cy5与(oligo-1)-Cy3按1∶1混合(两种分子的终浓度均为1.0μM)，取12μL的溶液与(oligo-2)-NH₂芯片杂交，构建的芯片称为Cy5/Cy3-dsDNA-NH₂芯片。

[0076]在42℃水浴条件下，经过2小时的杂交，使用洗液I(0.2％SDS，2×SSC)和洗液II(0.2×SSC)先后清洗芯片，清洗时间均为4min，洗液温度为42℃。清洗完毕后，使用1600rpm离心1min。离心后的芯片使用改造的LuxScan-10K/A微阵列芯片扫描仪(博奥生物有限公司)扫描。我们通过增加了一组激发光与发射滤光片的组合，使得此微阵列芯片扫描仪可以用于检测FRET信号。改造后的芯片扫描仪具有三个荧光采集通道，包括Cy3通道(激发光为532nm，检测的发射光为570nm)、Cy5通道(激发光为635nm，检测的发射光为675nm)和FRET通道(激发光为532nm，检测的发射光为675nm)。微阵列图像使用LuxScan 3.0分析软件(博奥生物有限公司)提取探针点的荧光强度信息。由此，将微阵列图像数据转换为信号强度矩阵。

确定微阵列芯片平台的系统因子

[0077]从图2b和2d中可以看到，仅含有Cy3的芯片在Cy5通道没有荧光信号，仅含有Cy5的芯片在Cy3通道也没有荧光信号，因此φ和

等于0。实验中，相同浓度的(oligo-1)-Cy5与(oligo-1)-Cy3分别与(oligo-2)-NH₂杂交，从而构建了Cy5-dsDNA-NH₂芯片和Cy3-dsDNA-NH₂芯片。因为(oligo-1)-Cy5与(oligo-1)-Cy3的序列相同，并且杂交条件相同，因此Cy5-dsDNA-NH₂芯片上的Cy5数目与Cy3-dsDNA-NH₂芯片上的Cy3数目大致相同。系统响应因子γ可以通过Cy5-dsDNA-NH₂芯片在Cy5通道的荧光信号(Figure 2a)与Cy3-dsDNA-NH₂芯片在Cy3通道的荧光信号(Figure 2e)的比值确定。荧光串扰因子β可以通过Cy3-dsDNA-NH₂芯片上FRET通道(Figure 2f)与Cy3通道(Figure 2e)的信号强度比值确定。同样荧光串扰因子α可以通过Cy5-dsDNA-NH₂芯片上FRET通道(Figure 2c)与Cy5通道(Figure 2a)的信号强度比值确定。

[0078]公式12-14中所用到的测量值可以通过荧光扫描仪的Cy3通道、Cy5通道和FRET通道分别读取。

[0079]为了确定校正因子G，需要制备标准探针点，此探针点上配体与受体数目相同，并且发生明显FRET作用。我们可以通过FRET通道的信号强度来判断是否发生了FRET作用。实验中，我们将Cy5-(oligo-1)-Cy3与(oligo-2)-NH₂芯片杂交，构建了Cy5-dsDNA-Cy3-NH₂芯片。通过DNA圆柱模型计算，单个探针上的Cy5与Cy3之间的距离小于10nm，因此存在FRET作用。芯片扫描图如图2g-2i所示。理论上，芯片的每个探针点上含有相同数目的Cy3与Cy5。荧光串扰校正后，存在较强的FRET信号。我们使用公式12和测量的信号值计算校正因子G。确定了G和β后，即可计算G与

的比例系数H。因此，当我们改变扫描参数时，新的G值可通过新的β值和比例系数H确定。而新的β值可通过仅含Cy3的探针点上FRET通道荧光与Cy3通道荧光的比值确定。

双色DNA微阵列芯片实验中的荧光测量

[0080]确定了系统因子后，即可测量样品检测探针点的荧光信号。微阵列芯片实验中，通常Cy5标记的靶标分子与Cy3标记的相同靶标分子会结合到芯片上的相同样品检测探针点上。由于连接于相邻DNA上的Cy3与Cy5之间可能产生分子间FRET作用，Cy3的荧光测量值将会收到干扰。试验中，我们将Cy5-(oligo-1)与Cy3-(oligo-1)的相同浓度混合物同(oligo-2)-NH₂芯片杂交，从而构建了Cy5/Cy3-dsDNA-NH₂芯片。芯片扫描图如图3a-3c所示。由于混合物中(oligo-1)-Cy5与(oligo-1)-Cy3浓度相同，因此每个探针点上Cy5的数目与Cy3的数目大致相同。当探针浓度变化时，Cy5与Cy3的强度比值应保持不变。然而从图4可以看到，Cy5与Cy3的强度比值随着探针浓度的升高而增大。这是因为，随着探针浓度的升高，分子间的FRET作用增强。通过公式13和14进行荧光校正后，在探针浓度变化时Cy5与Cy3的强度比值基本保持不变。结果显示我们的方法可以消除双色微阵列芯片实验中的FRET干扰，获取准确的荧光信号。

实例

[0081]我们利用下列实例，进一步解释说明本发明。但本发明并不仅仅局限于此实例。

用于基因表达谱分析的微阵列芯片

[0082]DNA微阵列是一种有效而常用的高通量分析基因数目的方法，可用于细胞中的基因表达谱分析。这项技术可以通过荧光信号分析两组样品中mRNA的丰度差异。在双色微阵列实验方案中，处理样品和对照样品分别使用Cy5和Cy3标记，混合后与同一张芯片杂交。

[0083]在基因表达谱分析中，通过在芯片表面点制cDNA片断、点制预先合成的寡核苷酸或原位合成寡核苷酸的方法构建微阵列芯片。从处理样品和对照样品中分别提取的mRNA经纯化、反转录、扩增等操作后，cDNA样品分别利用配体-dUTP(例如，Cy3-dUTP标记对照样品)或受体-dUTP(例如，Cy5-dUTP标记处理样品)进行标记。配体与受体标记的样品混合后变性。去除游离的dCTP后，样品混合物与芯片杂交。杂交后的芯片通过清洗和干燥处理，通过荧光扫描仪的两个通道采集荧光信号。如果两组样品在相同的条件下进行的标记，并且标记效率相同，那么就可以通过荧光信号的强度来比较两组样品中相同靶标的相对丰度。荧光图像经数据提取和归一化处理后，通过聚类分析寻找基因表达差异的信息。

[0084]在这个应用中，处理样品的cDNA和对照样品的cDNA都将与芯片上的cDNA探针或寡核苷酸探针杂交。当来自于处理样品和对照样品的靶标cDNA结合到芯片上的同一探针点上，并且结合后的探针点上荧光密度足够高时，配体荧光(Cy3)信号将受到FRET作用的干扰。因此，在确定了特定实验系统的(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)系统因子后，应使用微阵列扫描仪的三个通道采集荧光信号，包括配体通道(如Cy3通道)、受体通道(如Cy5通道)和FRET通道(如Cy3激发波长激发，Cy5发射波长接收)使用我们所提出的荧光测量方法，Cy3通道的荧光信号得以校正。然后我们即可以计算和归一化两种荧光信号比值，执行后续的聚类分析。

[0085]以上的实例只是对本发明的说明，本发明并不仅局限于此实例。

参考文献

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Claims (18)

1、一种用于双色荧光测量系统的微阵列芯片，包含用于确定荧光测量校正因子的三种标准探针点，即：

标准探针点1，仅含配体，而不含受体；

标准探针点2，仅含受体，而不含配体，其数量与标准探针点1上的配体数量相同；

标准探针点3，含有等数量的配体与受体。

2、如权利要求1所述的的芯片，其配体为Cy3，受体为Cy5。

3、一种用于双色荧光测量系统的微阵列芯片，包含用于确定荧光测量校正因子的两种标准探针点，即：

标准探针点1，仅含配体，而不含受体；

标准探针点2，仅含受体，而不含配体。

4、如权利要求3所述的的芯片，其配体为Cy3，受体为Cy5。

5、一种使用双色荧光测量系统，确定微阵列芯片上探针点荧光强度的方法，包含使用权利要求1的微阵列芯片确定与测量系统相关的校正因子G、系统响应因子γ以及荧光串扰因子α、β、φ和

6、一种使用双色荧光测量系统，确定微阵列芯片上探针点荧光强度的方法，包含使用权利要求2的微阵列芯片确定与测量系统相关的荧光串扰因子α、β、φ和

7、如权利要求5所述的方法中，双色荧光测量系统使用一组FRET荧光对，包含一个配体和一个受体，配体是Cy3，受体是Cy5。

8、一种制作如权利要求1所述微阵列芯片的方法，包括制备标准探针点3的过程：首先固定一个包含有配体和配对成员的化合物到芯片上，然后将一个包含有受体和另一配对成员的化合物与芯片反应。这两种化合物可以通过配对成员之间的亲和力连接，从而将等数量的配体与受体结合在一起。

9、一种微阵列芯片扫描仪，用于能够读取二维平面上的荧光信号的仪器，包含：

第一个荧光观察通道，提供适合第一种荧光团激发波长的激发光和适合第一种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。

第二个荧光观察通道，提供适合第二种荧光团激发波长的激发光和适合第二种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。

第三个荧光观察通道，提供适合第一种荧光团激发波长的激发光和适合第二种荧光团发射波长的检测器(包含发射滤光片)。

10、如权利要求9所述的扫描仪，第一种荧光团是FRET荧光对的配体，第二种荧光团是FRET荧光对的受体，第一种荧光团可以是Cy3，第二种荧光团可以是Cy5。

11、一种使用双色荧光测量系统准确地分析微阵列芯片上探针点荧光信号的方法，包括使用如权利要求9所述的扫描仪测量标准探针点1、2和3或样品检测探针点，利用荧光信号的测量值，通过下列公式计算每个样品检测探针点上准确的荧光强度I_TotalDonor和I_{TotalAcceptor}：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{Donor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(33\right)$

I_{TotalAcceptor}＝I_Acceptor    (34)

其中，I_TotalDonor为样品检测探针点上配体的全部发射荧光，I_{TotalAcceptor}为样品检测探针点上受体的全部发射荧光，I_{SensitizedAcceptor}表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度，I_Donor表示样品检测探针点上实际的直接配体发射荧光，I_Acceptor表示样品检测探针点上实际的直接受体发射荧光，G可通过下列公式计算：

$G=\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}}{\mathrm{\γ}}-{I^{\′}}_{\mathrm{Donor}}}---\left(35\right)$

其中，I′_{SEnsitizedAcceptor}表示标准探针点3上实际敏化受体荧光，I′_Donor表示标准探针点3上实际的直接配体发射荧光，I′_Acceptor表示标准探针点3上实际的直接受体发射荧光强度，系统响应因子γ可以用下式计算：

$\mathrm{\γ}=\frac{I_{\mathrm{acc}}}{I_{\mathrm{don}}}---\left(36\right)$

其中，I_acc是标准探针点2的受体发射荧光强度，I_don是标准探针点1的配体发射荧光强度。

标准探针点1、2和3是芯片上的标准点，可以在同一张芯片上，也可以在不同芯片上。标准探针点1仅含有配体，不含受体；标准探针点2仅含有受体，不含配体，其数量与标准探针点1上的配体数量相同；标准探针点3，含有等数量的配体与受体。

12、一种在使用配体与受体的双色微阵列测量中校正荧光串扰的方法，包括

(1)测量仅含配体的标准探针点1的荧光强度和仅含受体的标准探针点2的荧光强度；

(2)计算荧光串扰因子φ、β、

和α，其中，φ等于标准探针点1在受体通道的信号与在FRET通道的信号之比，β等于标准探针点1在配体通道的信号与在FRET通道的信号之比，

等于标准探针点2在配体通道的信号与在FRET通道的信号之比，α等于标准探针点2在受体通道的信号与在FRET通道的信号之比；

(3)测量芯片上样品测量探针点的配体通道信号M_DD、受体通道信号M_AA和FRET通道信号M_DA；测量标准探针点3的配体通道信号M′_DD、受体通道信号M′_AA和FRET通道信号M′_DA；

(4)校正荧光串扰，计算每个样品检测探针点的直接发射荧光：

$I_{\mathrm{Acceptor}}=M_{\mathrm{AA}}\·\frac{\mathrm{\α}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}-M_{\mathrm{DA}}\·\frac{\mathrm{\α}\·\mathrm{\φ}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}---\left(38\right)$

校正荧光串扰，计算标准探针点3的直接发射荧光：

${I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}={M^{\′}}_{\mathrm{AA}}\·\frac{\mathrm{\α}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}-{M^{\′}}_{\mathrm{DA}}\·\frac{\mathrm{\α}\·\mathrm{\φ}}{(\mathrm{\α}-\mathrm{\φ})}---\left(41\right)$

其中，I_{SensitizedAcceptor}表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度，I_Donor表示样品检测探针点上实际的直接配体发射荧光，I_Acceptor表示样品检测探针点上实际的直接受体发射荧光，I′_{SensitizedAcceptor}表示标准探针点3上实际敏化受体荧光，I′_Donor表示标准探针点3上实际的直接配体发射荧光，I′_Acceptor表示标准探针点3上实际的直接受体发射荧光强度。

13、如权利要求12所述的的方法中，当标准探针点1在受体通道中没有信号，并且标准探针点2在配体通道中没有信号时，荧光串扰因子φ和

接近0，此时样品检测探针点上实际的直接发射荧光可通过下式计算，消除荧光串扰的影响：

$I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}=M_{\mathrm{DA}}-M_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-M_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}---\left(43\right)$

I_Acceptor＝M_AA        (44)

I_Donor＝M_DD           (45)

标准探针点3上实际的直接发射荧光可通过下式计算，消除荧光串扰的影响：

${I^{\′}}_{\mathrm{SensitzedAcceptor}}={M^{\′}}_{\mathrm{DA}}-{M^{\′}}_{\mathrm{DD}}\·\frac{1}{\mathrm{\β}}-{M^{\′}}_{\mathrm{AA}}\·\frac{1}{\mathrm{\α}}---\left(46\right)$

I′_Acceptor＝M′_AA    (47)

I′_Donor＝M′_DD       (48)

其中I_{SensitizedAcceptor}表示样品检测探针点上实际敏化受体荧光强度，I_Donor表示样品检测探针点上实际的直接配体发射荧光，I_Acceptor表示样品检测探针点上实际的直接受体发射荧光，M_DA为样品检测探针点上FRET通道信号测量值，M_DD表示样品检测探针点上配体通道信号测量值，M_AA样品检测探针点上受体通道信号测量值，I′_{SensitizedAcceptor}表示标准探针点3上实际敏化受体荧光，I′_Donor表示标准探针点3上实际的直接配体发射荧光，I′_Acceptor表示标准探针点3上实际的直接受体发射荧光强度，M′_DA表示标准探针点3上FRET通道信号测量值、M′_DD表示标准探针点3上配体通道信号测量值，M′_AA分别表示标准探针点3上受体通道信号测量值。

14、如权利要求12所述的方法中，包含使用实际的发射荧光I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor消除FRET干扰和荧光串扰，并通过下列公式计算每个样品检测探针点上配体的全部发射荧光I_TotalDonor和受体的全部发射荧光I_{TotalAcceptor}：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{Donor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(49\right)$

I_{TotalAcceptor}＝I_Acceptor    (50)

15、如权利要求13所述的方法中，当仅含配体的样品在受体通道中没有信号，并且仅含受体的样品在配体通道中没有信号时，荧光串扰因子φ和

接近0，进一步包含使用实际的发射荧光I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor消除FRET干扰和荧光串扰，并通过下列公式计算每个样品检测探针点上配体的全部发射荧光I_TotalDonor和受体的全部发射荧光I_{TotalAcceptor}：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{Donor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(51\right)$

I_{TotalAcceptor}＝I_Acceptor               (52)

16、一种确定与测量系统相关的校正因子G的方法，包括使用标准探针点3上实际的发射荧光I′_{SensitizedAcceptor}、I′_Acceptor和I′_Donor，通过下列公式计算校正因子G：

$G=\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{\frac{{I^{\′}}_{\mathrm{Acceptor}}}{\mathrm{\γ}}-{I^{\′}}_{\mathrm{Donor}}}---\left(53\right)$

其中，I′_{SensitizedAcceptor}表示标准探针点3上实际敏化受体荧光，I′_Donor表示标准探针点3上实际的直接配体发射荧光，I′_Acceptor表示标准探针点3上实际的直接受体发射荧光强度，系统响应因子γ可以用下式计算：

$\mathrm{\γ}=\frac{I_{\mathrm{acc}}}{I_{\mathrm{don}}}---\left(54\right)$

其中，I_acc是标准探针点2的受体发射荧光强度，I_don是标准探针点1的配体发射荧光强度。

标准探针点1、2和3是芯片上的标准点，可以在同一张芯片上，也可以在不同芯片上。标准探针点1仅含有配体，不含受体；标准探针点2仅含有受体，不含配体，其数量与标准探针点1上的配体数量相同；标准探针点3，含有等数量的配体与受体。

17、如权利要求16所述的方法，包含利用每个样品检测探针点上实际的发射荧光I_{SensitizedAcceptor}、I_Acceptor和I_Donor消除FRET干扰和荧光串扰，并通过下列公式计算每个样品检测探针点上配体的全部发射荧光I_TotalDonor和受体的全部发射荧光I_{TotalAcceptor}：

$I_{\mathrm{TotalDonor}}=I_{\mathrm{Donor}}+\frac{I_{\mathrm{SensitizedAcceptor}}}{G}---\left(55\right)$

I_{TotalAcceptor}＝I_Acceptor              (56)

18、一种确定校正因子G_parameter2的方法，G_parameter2指在双色微阵列测量中，使用扫描仪的扫描参数2时的校正因子的数值，可通过下列公式计算：

$G_{\mathrm{parameter}2}=\frac{H}{{\mathrm{\β}}_{\mathrm{parameter}2}}---\left(57\right)$

其中，β_parameter2表示扫描参数2时仅含配体的标准探针点上配体通道荧光信号与FRET通道荧光信号的比值，H为比例系数，可通过下式计算：

H＝β_parameter1·G_parameter1           (58)

其中，β_parameter1表示扫描仪的扫描参数为扫描参数1时仅含配体的探针点上配体通道荧光信号与FRET通道荧光信号的比值，G_parameter1表示扫描参数1时校正因子G的值。每组扫描参数包括选择配体激发波长的激发光强度、配体发射波长的荧光检测器增益和受体发射波长的荧光检测器增益。

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