CN101055251A - 测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法 - Google Patents

Abstract

一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，包括下列步骤：①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数；②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP蛋白与YFP蛋白浓度之比。本发明方法的测量结果表明：校正了CFP和YFP荧光的串扰，校正了由于FRET的发生而引起的CFP荧光的减少和YFP荧光的增加，测量的结果稳定，标准误差比较小。

Description

测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法

技术领域

本发明涉及活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白，特别是一种利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，以下简称为FRET)测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法。

背景技术

FRET是一种无辐射的能量转移过程，是处于激发态的荧光团(供体)通过长程的偶极子—偶极子的相互作用把能量转移给另一个分子(受体)，导致供体荧光的淬灭和受体发光的增强的过程。参见【G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements usingfluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】。为了便于FRET的发生，实验中需要合理的控制供体与受体的浓度之比，然而在活细胞内测量供体与受体的浓度之比是比较困难的事情，目前青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，简称为CFP蛋白)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，简称为YFP蛋白)是最常用的FRET供体-受体对，测量活细胞内CFP与YFP浓度之比是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，

本发明的技术解决方案如下：

一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，更确切地说是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白(cyan fluorescentprotein，简称为CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，简称为YFP)浓度之比的方法。

推导三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP与YFP浓度比的公式：

表观荧光共振能量转移效率E_app可以表述如下式【参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gatedca²⁺ channels revealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985】：

          E_app＝E×D_b＝[1-S_CFP(DA)_before/S_CFP(DA)_after]    (1)

这里，E指FRET效率，D_b指发生FRET的CFP分子数与总的CFP分子数的比例，

S_CFP(DA)_before和S_CFP(DA)_after指YFP荧光蛋白被漂白前后，CFP荧光蛋白的平均荧光强度。

同时，表观的FRET效率E_app又可以表述如下【参见T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939】，

$E_{\mathrm{app}}=\frac{F_C}{F_C+G\×\mathrm{CFP}}---\left(2\right)$

这里，CFP指CFP通道的平均荧光强度，F_C为净FRET值，其表达式如下【参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】，

      F_C＝FRET-a×YFP-b×CFP        (3)

这里，FRET指FRET通道的平均荧光强度，YFP指YFP通道的平均荧光强度，CFP指CFP通道的平均荧光强度。a和b分别为YFP和CFP荧光漏到FRET通道内的比例系数，表述如下【参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescencemicroscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】，

       a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)                     (4)

       b＝I_FRET(C)/I_CFP(Y)                     (5)

这里I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。

有效的FRET效率E_EFF可以表述如下【参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca²⁺ channelsrevealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985】，

$E_{\mathrm{EFF}}=E\×A_b=(\mathrm{FR}-1)\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}---\left(6\right)$

$\mathrm{FR}=\frac{\mathrm{FRET}-b\×\mathrm{CFP}}{a\×\mathrm{YFP}}---\left(7\right)$

这里，E指FRET效率，A_b指发生FRET的受体与总的受体的比例，ε_YFP(440)/ε_CFP(440)指在440nm波长光激发时YFP与CFP的吸收系数之比，其值为0.094【参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T Yue，Preassociation of calmodulinwith voltage-gated ca²⁺ channels revealed by FRET in single living cells.Neuron31(2001)973-985】。将式(6)与式(1)相除可以得到，

$\frac{E_{\mathrm{EFF}}}{E_{\mathrm{app}}}=\frac{E\×A_b}{E\×D_b}=\frac{\left[\mathrm{DA}\right]/\left[A\right]}{\left[\mathrm{DA}\right]/\left[D\right]}=\frac{\left[D\right]}{\left[A\right]}---\left(8\right)$

这里，[DA]，[A]和[D]分别表示供体-受体复合体、受体和供体的浓度。同时，将式(6)和式(2)相除又可以得到，

$\frac{E_{\mathrm{EFF}}}{E_{\mathrm{app}}}=\frac{(\mathrm{FR}-1)\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}}{\frac{F_C}{F_C+G\×\mathrm{CFP}}}---\left(9\right)$

把式(7)的FR带入式(9)，可以得到

$\frac{E_{\mathrm{EFF}}}{E_{\mathrm{app}}}=\frac{(F_C+G\×\mathrm{CFP})}{a\×\mathrm{YFP}}\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}---\left(10\right)$

由于式(8)和式(10)相等，我们就可以得到CFP与YFP浓度之比，

$\frac{\left[D\right]}{\left[A\right]}=\frac{(F_C+G\×\mathrm{CFP})}{a\×\mathrm{YFP}}\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}---\left(11\right)$

这里，G的值为5.40，ε_YFP(440)/ε_CFP(440)指在440nm激发时YFP与CFP的吸收系数之比，这个值为0.094【参见M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca²⁺ channels revealed by FRET insingle living cells.Neuron 31(2001)973-985】，a为YFP荧光漏到FRET通道内的比例系数，见等式(4)，F_C为净FRET值，见等式(3)，CFP和YFP分别表示CFP和YFP通道内的平均荧光强度。

本发明技术解决方案如下：

一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，特征在于该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，青色荧光蛋白以下简称为CFP蛋白，黄色荧光蛋白以下简称为YFP蛋白，包括下列步骤：

①测量三通道荧光共振能量转移显微镜(以下简称为三通道显微镜)漏过系数：

在中国仓鼠卵巢癌细胞，简称为CHO细胞，内分别表达CFP蛋白和YFP蛋白，分别测量表达YFP蛋白的CHO细胞在荧光共振能量转移通道，简称为FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算漏过系数a，

a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)

分别测量表达CFP蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，根据下式计算漏过系数b，

b＝I_FRET(C)/I_CFP(Y)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度；

②利用三通道显微镜测量活细胞内CFP蛋白与YFP蛋白浓度之比：

在CHO细胞内共表达CFP和YFP，共表达CFP和YFP的CHO细胞用三通道荧光共振能量转移显微镜分别记录CFP通道、YFP通道和FRET通道内的平均荧光强度，根据下式，计算三CHO细胞内的CFP蛋白和YFP蛋白浓度之比：

$\frac{\left[D\right]}{\left[A\right]}=\frac{(F_C+G\×\mathrm{CFP})}{a\×\mathrm{YFP}}\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}$

式中：F_C为净FRET值，F_C＝FRET-a×YFP-b×CFP

G称为G参数，

ε_YFP(440)/ε_CFP(440)指在440nm波长的光激发时，YFP蛋白与CFP蛋白的吸收系数之比，其值为0.094，

CFP和YFP分别表示CFP通道和YFP通道内的平均荧光强度。

所述的G参数的测量方法的步骤如下(详见：发明名称：测量三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的方法，申请号：200710039414.5，申请日期：2007年4月12日。)

①测量三通道显微镜漏过系数：

在中国仓鼠卵巢癌(CHO)细胞内分别表达CFP和YFP蛋白，利用三通道荧光共振能量转移显微镜分别测量表达YFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，分别测量表达CFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算计算漏过系数a，b：

      a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)

      b＝I_FRET(C)/I_CFP(C)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。

②用三通道显微镜测量CFP-YFP融合蛋白在CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度，三通道荧光共振能量转移显微镜G参数：

在CHO细胞内表达CFP-YFP融合蛋白，表达CFP-YFP融合蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度为CFP，YFP和FRET；

③计算三通道显微镜的G参数：

计算F_C＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)

FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)

G＝[1-(FR-1)×0.094]×F_C/[(FR-1)×0.094×CFP]。

所述的G参数的值为5.40。

本发明的技术效果：

利用三通道显微镜在活细胞内测量了CFP与YFP浓度之比，我们的测量结果校正了CFP和YFP荧光的串扰，校正了由于FRET的发生而引起的CFP荧光的减少和YFP荧光的增加，我们测量的结果稳定，标准误差比较小。

具体实施方式：

下面用一个实施例进一步说明本发明，但不应以此限制本发明的保护范围。

实施例如下：

1.细胞培养和转染：

CHO细胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液培养，细胞培养在含5％CO₂的37℃培养箱中。实验采用了瞬时转染的方法，CHO细胞生长到80-90％的汇合度的时候进行转染，每个12孔板中的单孔加CFP和YFP质粒各0.5μg，LipofectAMINE2000(GIBCO)1μl，具体实验方法参考LipofectAMINE 2000使用说明书。

2.三通道显微镜：

成像是利用配备了40倍物镜和Cascade512F(Roper)CCD的Olympus IX71倒置显微镜实现的。此显微镜配备了三个成像通道，分别是CFP通道(激发，440/21nm；发射，480/30nm)，YFP通道(激发，500/25nm；发射，545/35nm)和FRET通道(激发，440/21；发射，535/26nm)。激发光是采用75W的氙灯。成像是利用1×1bining模式和100-200ms的曝光时间。成像控制和数据分析是采用5.0.1版本的Image-proplus软件(Media Cybernetics)。

3.测量三通道显微镜漏过系数：

CHO细胞接种到放置在12孔板内8×8mm²大小的玻璃盖玻片，瞬时转染CFP或YFP质粒。24小时之后，接种有细胞的盖玻片转移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作缓冲液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸没细胞。表达CFP荧光蛋白的CHO细胞用三通道显微镜分别记录CFP和FRET通道内的平均荧光强度。表达YFP荧光蛋白的CHO细胞用三通道显微镜分别记录YFP和FRET通道内的平均荧光强度。根据等式(4)和(5)就可以得到漏过系数a和b。

4.利用三通道显微镜测量活细胞内CFP与YFP的浓度之比：

CHO细胞接种到放置在12孔板内8×8mm²大小的玻璃盖玻片，瞬时共转染CFP和YFP质粒。24小时之后，接种有细胞的盖玻片转移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作缓冲液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸没细胞。在CHO细胞内共表达CFP和YFP，共表达CFP和YFP的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度，根据等式(11)，计算三CHO细胞内的CFP和YFP浓度之比。利用三通道显微镜我们测量了CHO细胞内CFP与YFP浓度之比，这个比值为1.69±0.20(平均值±标准误差，样品数量＝34)。

本发明方法的测量结果表明：校正了CFP和YFP荧光的串扰，校正了由于FRET的发生而引起的CFP荧光的减少和YFP荧光的增加，测量的结果稳定，标准误差比较小。

Claims (3)

1、一种测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，特征在于该方法是利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，青色荧光蛋白以下简称为CFP蛋白，黄色荧光蛋白以下简称为YFP蛋白，包括下列步骤：

①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数：

在中国仓鼠卵巢癌细胞，简称为CHO细胞，内分别表达CFP蛋白和YFP蛋白，分别测量表达YFP蛋白的CHO细胞在荧光共振能量转移通道，简称为FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算漏过系数a，

a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)

分别测量表达CFP蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，根据下式计算漏过系数b，

b＝I_FRET(C)/I_CFP(Y)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度；

②利用三通道荧光共振能量转移显微镜测量活细胞内CFP蛋白与YFP蛋白浓度之比：

在CHO细胞内共表达CFP和YFP，共表达CFP和YFP的CHO细胞用三通道荧光共振能量转移显微镜分别记录CFP通道、YFP通道和FRET通道内的平均荧光强度，根据下式，计算三CHO细胞内的CFP蛋白和YFP蛋白浓度之比：

$\frac{\left[D\right]}{\left[A\right]}=\frac{(F_C+G\×\mathrm{CFP})}{a\×\mathrm{YFP}}\×\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{YFP}}\left(440\right)}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{CFP}}\left(440\right)}$

式中：F_C为净FRET值，F_C＝FRET-a×YFP-b×CFP

      G称为G参数，

ε_YFP(440)/ε_CFP(440)指在440nm波长的光激发时，YFP蛋白与CFP蛋白的吸收系数之比，其值为0.094，

CFP和YFP分别表示CFP通道和YFP通道内的平均荧光强度，

FRET为FRET通道的平均荧光强度。

2、根据权利要求1所述的测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，其特征在于所述的G参数的值由下列公式计算：

G＝[1-(FR-1)×0.094]×F_C/[(FR-1)×0.094×CFP]

式中：FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)。

3、根据权利要求1或2所述的测量活细胞内青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白浓度比的方法，其特征在于所述的G参数的值为5.40。