CN101042345A - 测量三通道荧光共振能量转移显微镜g参数的方法 - Google Patents

Abstract

一种三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的测量方法，该方法的步骤如下：①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数；②用三通道荧光共振能量转移显微镜测量CFP－YFP融合蛋白在CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度；③计算三通道荧光共振能量转移显微镜G参数。本发明在活细胞内测量了三通道FRET显微镜G参数，并且测量结果的标准误很小，表明测量的精度很好。

Description

测量三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的方法

技术领域

本发明属于光电子学、生物技术和生命科学的交叉领域。是一种测量三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的方法。

背景技术

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，简称FRET)是一种无辐射的能量转移过程，在其间处在激发态的荧光团(供体)通过长程的偶极子一偶极子的相互作用把能量转移给另一个分子(受体)，导致供体荧光的淬灭和受体发光的增强的过程。参见【G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescencemicroscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】。在FRET研究过程中，对于FRET的大小的衡量主要有表观FRET效率和FRET指数两种。对于表观FRET效率的计算往往采用受体漂白的方法，但是这种方法不适合活细胞的研究。为了能够在活细胞内测量表观FRET效率，Zal等研究人员【T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939】提出利用三通道显微镜在活细胞内测量表观FRET效率的方法。利用这种方法测量表观FRET效率需要测量系统的G参数，Zal等研究人员利用受体部分漂白的方法测量了系统的G参数。G参数是指发生FRET时，FRET通道内荧光强度的增加量与供体通道内荧光强度的减小量的比值，G参数的定义如下式【G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】，

$G=\frac{Q{Y}_a{\mathrm{\Φ}}_a{T}_F}{Q{Y}_d{\mathrm{\Φ}}_d{T}_D}---\left(1\right)$

式中：QY_a和QY_d分别表示受体和供体分子的量子产率，Φa和Φd分别表示受体荧光透过FRET通道内的发射滤光片的百分比和供体荧光透过供体通道内的发射滤光片的百分比，T_F和T_D分别表示受体荧光透过FRET通道内的中等灰度滤光片的百分比和供体荧光透过供体通道内的中等灰度滤光片的百分比。对于给定的系统和荧光分子，G参数是个常数。

Zal等研究人员利用受体部分漂白来测量系统G参数的大致方法是这样的：

1.构建青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的融合蛋白(cyan fluorescent protein-yellow fluorescent protein，简称为CFP-YFP)的融合表达质粒，然后在细胞内表达CFP-YFP融合蛋白；

2.固定表达CFP-YFP融合蛋白的细胞，利用三通道显微镜成像来记录部分漂白前细胞分别在三个通道内的平均荧光强度；

3.利用受体通道部分漂白受体的荧光，利用三通道显微镜成像来记录部分漂白后细胞分别在三个通道内的平均荧光强度；

4.根据下面的公式计算G参数【参见T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939】：

$G=\frac{(\mathrm{FRET}-a\×\mathrm{YFP}-b\×\mathrm{CFP})-({\mathrm{FRET}}^{\mathrm{post}}-a{\×\mathrm{YFP}}^{\mathrm{post}}-b\×{\mathrm{CFP}}^{\mathrm{post}})}{{\mathrm{CFP}}^{\mathrm{post}}-\mathrm{CFP}}---\left(2\right)$

式中：a和b分别是YFP和CFP荧光漏到FRET通道内的比例系数。FRET，YFP，CFP分别表示部分漂白之前细胞在FRET，YFP和CFP通道中的平均荧光强度。FRET^post，YFP^post，CFP^post分别表示部分漂白之后细胞在FRET，YFP和CFP通道中的平均荧光强度。

然而利用部分漂白方法测量G参数有两个不足之处：

1.需要固定细胞，固定细胞环境下和活细胞环境下的CFP和YFP荧光蛋白发光特性可能会有所不同，这样固定细胞环境下测量的G值可能不能代表活细胞环境下的G值。

2.用受体部分漂白的方法，一般需要较长时间的受体荧光漂白，这样受体的荧光会变得很弱，不容易在三通道FRET显微镜成像，而且成像的信噪比也很低，这样再计算G参数，计算的误差也就很大。

发明内容

本发明的目的在于为了弥补上述现有的方法的不足，提出一种在活细胞内测量三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的方法。

本发明的技术解决方案如下：

本发明测量三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的方法，使用的荧光分子为青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein，YFP)。

三通道FRET显微镜漏过系数的表达式：

对于三通道FRET显微镜系统，YFP和CFP荧光漏到FRET通道内的比例系数表述如下【参见G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitativefluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】，

a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)    (3)

b＝I_FRET(C)/I_CFP(C)    (4)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。

推导三通道FRET显微镜G参数的表示式：

对于净FRET值F_C的公式【参见文献G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurementsusing fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713】，

                   F_C＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)    (5)

其中：FRET指FRET通道的平均荧光强度，YFP指YFP通道的平均荧光强度，CFP指CFP通道的平均荧光强度。表观的FRET效率E_app可以表述如下【T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939】，

                   E_app＝F_C/(F_C+G×CFP)    (6)

E_app又可以表述如下【M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca²⁺ channels revealed by FRET in singleliving cells.Neuron 31(2001)973-985】，

           E_app＝E×Db＝[1-S_CFP(DA)before/S_CFP(DA)after]    (7)

其中：E指FRET效率，Db指发生FRET的CFP分子数与总的CFP分子数的比例，S_CFP(DA)before和S_CFP(DA)after指YFP荧光蛋白被漂白前后CFP荧光蛋白的平均荧光强度。

有效的FRET效率可以表述如下【M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca²⁺ channels revealed byFRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985】，

            E_EFF＝E×Ab＝(FR-1)×[ε_YFP(440)/ε_CFP(440)]    (8)

            FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)                    (9)

这里，E指FRET效率，Ab指发生FRET的受体与总的受体的比例，ε_YFP(440)/ε_CFP(440)指在440nm激发时YFP荧光团与CFP荧光团的吸收系数之比，在我们的系统这个值为0.094。

对于CFP-YFP这样的融合蛋白，由于其供体和受体是连接在一起的，而且其数目之比是1∶1，这样就有Db＝Ab＝1。根据等式(7)和(8)，我们可以得到，

               E_EFF＝E×Ab＝E        (10)

               E_app＝E×Db＝E        (11)

这样就有E_EFF＝E_app，因此可以得到，

(FR-1)×[ε_YFP(440)/ε_CFP(440)＝[1-S_CFP(DA)before/S_CFP(DA)after]  (12)

又根据等式(6)和(7)，有

        F_C/(F_C+G×CFP)＝[1-S_CFP(DA)before/S_CFP(DA)after]      (13)

根据等式(12)和(13)，我们可以得到，

        (FR-1)×[ε_YFP(440)/ε_CFP(440)]＝F_C/(F_C+G×CFP)       (14)

G参数的表达式，

        G＝[1-(FR-1)×0.094]×F_C/[(FR-1)×0.094×CFP]         (15)

式中：F_C＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)

      FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)

这样，根据等式(15)我们就可以确定我们三通道FRET显微镜的G参数，这里所用的荧光团为CFP和YFP。

本发明三通道FRET显微镜G参数的测量方法如下：

1、一种三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的测量方法，其特征在于该方法的步骤如下：

①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数：

在中国仓鼠卵巢癌(CHO)细胞内分别表达CFP和YFP蛋白，利用三通道荧光共振能量转移显微镜分别测量表达YFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，分别测量表达CFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算计算漏过系数a，b：

        a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)

        b＝I_FRET(C)/I_CFP(C)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。

②用三通道荧光共振能量转移显微镜测量CFP-YFP融合蛋白在CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度，三通道荧光共振能量转移显微镜G参数：

在CHO细胞内表达CFP-YFP融合蛋白，表达CFP-YFP融合蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度为CFP，YFP和FRET；

③计算三通道荧光共振能量转移显微镜G参数：

计算F_C＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)

    FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)

    G＝[1-(FR-1)×0.094]×F_C/[(FR-1)×0.094×CFP]

式中0.094是本发明使用的系统在440nm激发时YFP荧光团与CFP荧光团的吸收系数之比。

本发明的技术效果：

在活细胞内测量了三通道FRET显微镜G参数，并且测量结果的标准误很小，表明测量的精度很好。

具体实施方式

质粒：

CFP-YFP融合表达质粒是由浙江大学医学院神经生物教研室罗建红教授惠赠。

细胞培养和转染：

CHO细胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液培养，细胞培养在含5％CO₂的37℃培养箱中。实验采用了瞬时转染的方法，CHO细胞生长到80-90％的汇合度的时候进行转染，每个12孔板中的单孔加CFP-YFP质粒0.5μg，LipofectAMINE2000(GIBCO)1μl，具体实验方法参考LipofectAMINE 2000使用说明书。

三通道FRET显微镜：

成像是利用配备了40倍物镜和Cascade512F(Roper)CCD的Olympus IX71倒置显微镜实现的。此显微镜配备了三个成像通道，分别是CFP通道(激发，440/21nm；发射，480/30nm)，YFP通道(激发，500/25nm；发射，545/35nm)和FRET通道(激发，440/21；发射，535/26nm)。激发光是采用75W的氙灯。成像是利用1×1bining模式和100-200ms的曝光时间。成像控制和数据分析是采用5.0.1版本的Image-proplus软件(Media Cybernetics)。

测量三通道FRET显微镜漏过系数：

CHO细胞接种到放置在12孔板内8×8mm²大小的玻璃盖玻片，瞬时转染CFP或YFP质粒。24小时之后，接种有细胞的盖玻片转移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作缓冲液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸没细胞。表达CFP荧光蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP和FRET通道内的平均荧光强度。表达YFP荧光蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录YFP和FRET通道内的平均荧光强度。根据等式(3)和(4)就可以得到漏过系数a和b。对于我们三通道FRET显微镜系统，a＝0.09±0.01(mean±s.e.m，n＝22))，b＝0.75±0.01(mean±s.e.m，n＝12)。

测量三通道FRET显微镜G参数：

CHO细胞接种到放置在12孔板内8×8mm²大小的玻璃盖玻片，瞬时转染CFP-YFP质粒。24小时之后，接种有细胞的盖玻片转移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作缓冲液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸没细胞。表达CFP-YFP荧光蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度。根据等式(15)，我们可以计算我们三通道显微镜的G值。

Claims (1)

1、一种三通道荧光共振能量转移显微镜G参数的测量方法，其特征在于该方法的步骤如下：

①测量三通道荧光共振能量转移显微镜漏过系数：

在中国仓鼠卵巢癌细胞内分别表达青色荧光蛋白CFP和黄色荧光蛋白YFP，利用三通道荧光共振能量转移显微镜分别测量表达YFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和YFP通道内的平均荧光强度，分别测量表达CFP荧光蛋白的CHO细胞在FRET通道和CFP通道内的平均荧光强度，利用下列公式计算计算漏过系数a，b：

a＝I_FRET(Y)/I_YFP(Y)

b＝I_FRET(C)/I_CFP(C)

式中：I_FRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_YFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道内的平均荧光强度，I_FRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道内的平均荧光强度，I_CFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道内的平均荧光强度。

②用三通道荧光共振能量转移显微镜测量CFP-YFP融合蛋白在CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度，三通道荧光共振能量转移显微镜G参数：

在CHO细胞内表达CFP-YFP融合蛋白，表达CFP-YFP融合蛋白的CHO细胞用三通道FRET显微镜分别记录CFP，YFP和FRET通道内的平均荧光强度为CFP，YFP和FRET；

③计算三通道荧光共振能量转移显微镜G参数：

计算F_C＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)

    FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)

    G＝[1-(FR-1)×0.094]×F_C/[(FR-1)×0.094×CFP]

式中0.094是本发明使用的系统在440nm激发时YFP荧光团与CFP荧光团的吸收系数之比。