CN111693465B - 一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法，将脉冲激光聚焦在样品上，样品吸收部分脉冲激光，由于光声效应而激发超声信号，通过与显微物镜共聚焦、同轴布置的超声换能器接收该超声信号，获得具有光吸收对比度的图像；同时，透过样品的剩余脉冲激光经过样品的散射和吸收后，照射在同一超声换能器表面上，进而激发出另一超声信号，并被该超声换能器接收到，从中可以获得具有光散射对比度的图像。本发明对于样品上的任意成像点，仅需要一次光激发就可以同时实现光散射‑光吸收双模态显微成像；而且，该方法是一种无需外源标记的高分辨率成像技术，避免了标记物对样品性质可能产生的影响，具有较高的易用性和实用性。

Description

一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法

技术领域

本发明涉及一种能够实现同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像的方法，通过一次扫描，即可同时获得样品光吸收和光散射两种对比度的显微图像。

背景技术

对于透明物质，例如大多数透明细胞、组织病理切片等，当光透过这些物质后的光强的变化细微，采用普通的光学显微镜很难实现清晰成像。因此，对于活细胞、组织病理切片等透明物质进行成像往往需要进行染色，无标记成像仍然是一个细胞、组织病理切片成像的一个重要挑战。

光散射是表征细胞等透明物质的一种有效成像参量。通过测量散射远场的强度、相位和波长依赖性或角度依赖性，可以提取引起散射的消光、结构和折射率等信息，进而成像。由于光散射对细胞形态细微变化高灵敏度，光散射无需外源标记就能够提供有关散射体结构的数据。因此，以光散射为对比度的成像技术在生物医学领域具有重要的应用价值。

光吸收是另一种可以灵敏表征细胞、组织切片等样品的成像参量，光吸收与生物组织的分子组份和生理状态密切相关。由于各种生物分子对特定光波波长具有选择性光吸收，基于光吸收参数的成像能够灵敏地反映组织的分子化学成分特性，提供组织的功能信息。

光吸收和光散射这两种成像对比度，分别提供样品的光学散射和光学吸收信息，反应了样品不同方面的物理和生理属性。可以预期，如果在一次成像过程中能同时获得样品的光吸收和光散射这两种属性，必将更加灵敏地、特异性地反应细胞、无染色组织病理切片等透明样品的生理、病理变化。

为了获得样品的吸收和散射等多种光学信息，现有的常规做法是将多种成像技术集成，通过多次激发、多次扫描获得样品的多种光学信息。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像的方法，即：将脉冲激光聚焦在样品上，激光与样品相互作用，由于光声效应从而产生超声波，该信号强度与样品的光吸收特性有关，从中可以提取样品的光吸收信息，获得具有吸收对比度的图像；同时，经过样品吸收和散射后，透过样品的激光与换能器表面相互作用，并产生另一个超声信号，该信号强度与样品的光散射特性有关，从中可以提取样品具有光散射对比度的图像；因此，对于任意一个成像点仅仅需要一次激光激发就可以同时获得样品的光吸收和光散射两种成像信息。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法，通过一次扫描可同时获取样品的光吸收和光散射两种成像对比度的显微成像方法，该方法是一种无需外源标记的高分辨率、多模态成像技术，它能够同时反映样品的散射和吸收特性。该方法将脉冲激光聚焦在样品上，样品吸收部分脉冲激光，由于光声效应而激发出超声信号，该超声信号的强度与样品的光吸收系数成正比，通过与显微物镜共聚焦、同轴布置的超声换能器接收该超声信号，从中提取样品的光吸收信息，并获得具有光吸收对比度的图像；同时，透过样品的剩余脉冲激光经过样品的散射和吸收后，照射在同一超声换能器表面上，并与该超声换能器表面相互作用，进而激发出另一超声信号并被该超声换能器接收到，该超声信号的强度与脉冲激光透过样品时的光强总衰减相关，基于样品的散射和吸收都会引起光强衰减的特性，分析该超声信号，可以从中提取样品的光散射信息，并获得具有光散射对比度的图像。

本发明方法，对于样品上的任意成像点，仅需要一次光激发就可以同时获得该处光吸收信息和光散射信息，从而实现了同时的光散射-光吸收双模态显微成像。

优选的，所述超声换能器为球形聚焦超声换能器。

具体的，该方法包括如下步骤：

步骤1：将显微物镜和超声换能器分别布置在样品的两侧，显微物镜光轴与超声换能器声轴同轴，并且保持两者共聚焦，即两者焦点位于样品上的同一点；

步骤2：脉冲激光器产生脉冲激光，并通过显微物镜聚焦在样品上；

当脉冲激光照射在样品上时，样品吸收部分脉冲激光，并由于光声效应而激发出超声信号S_II，该超声信号被共焦布置的超声换能器接收；

透过样品的剩余脉冲激光经过样品的散射和吸收后，照射在同一超声换能器表面上，脉冲激光与超声换能器表面相互作用产生另一超声信号S_I；

单次脉冲激光对样品的照射产生的超声信号S_I和S_II都被同一超声换能器接收；

步骤3：脉冲激光器产生脉冲激光的同时，脉冲激光器或光电传感器发出同步触发信号，触发数据采集卡采集超声换能器探测到的超声信号S_I和S_II；

步骤4：根据数据采集卡采集到的信号，提取显微物镜和超声换能器同焦点处的光散射-光吸收双模图像；脉冲激光先后与样品和超声换能器表面发生两次相互作用，分别产生超声信号S_II和S_I，由于脉冲激光达到样品虽然早于脉冲激光达到超声换能器表面，但由于超声声速远远小于光速，实际接收到的超声信号中，脉冲激光在样品上产生的超声信号S_II要晚于脉冲激光在超声换能器表面产生的超声信号S_I，因此超声换能器接收到的波形上存在两个波峰，先出现的波峰对应超声信号S_I，晚出现的波峰对应超声信号S_II，通过对这两个波峰的分析，同时获得样品的光散射-光吸收双模图像；

步骤5：逐点扫描样品，并重复步骤2～4，获得样品上各点的超声信号，进而同时获取样品的光吸收和光散射分布，构建样品的光散射-光吸收双模图像。

具体的，所述步骤4中，具体包括如下步骤：

步骤41：提取光吸收信息

在超声换能器检测到的超声信号中，距离触发时间t≈F/c处存在一个信号峰值，其中，F为超声换能器的焦长(也就是超声换能器与样品之间的距离)，c为样品与超声换能器之间介质的声速；该峰值对应于脉冲激光被样品吸收产生的超声信号S_II，超声信号S_II的强度正比于样品的光吸收系数，提取此信号强度，如峰-峰值，作为样品图像的像素值，它反映了样品的光吸收特性，该图像是具有光吸收对比度的图像；

步骤42：提取光散射信息

在超声换能器检测到的超声信号中，在触发时刻t≈0处也存在一个信号峰值，该峰值对应于脉冲激光被超声换能器表面吸收产生的超声信号S_I，超声信号S_I的强度正比于透过样品的脉冲激光的强度。由于样品对脉冲激光的吸收和散射都会导致透过样品的脉冲激光强度的减弱，但是对于透明样品，一般来说样品吸收引起的激光衰减要远远小于散射造成的激光衰减，因此，透过样品的脉冲激光的强度主要与样品的光散射特性有关。因此，提取此信号强度，如峰-峰值，作为样品图像的像素值，它反映了的样品的光散射特性，该图像是具有光散射对比度的图像。

有益效果：本发明提供的同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法，相对于现有技术具有如下优势：1、本发明利用共聚焦、同轴布置于样品两侧的超声换能器和显微物镜，通过一次激发获得的光声信号，同时获得样品的两幅具有不同对比度的图像，其对比度分别反映样品的光散射特性和光吸收特性；2、本发明的成像方法是基于样品的内源性对比度(光吸收和光散射)，而不依赖于外源性的标记物，避免了外源标记对样品性质可能产生的影响；3、本发明可以通过结合两幅像的信息，进一步提取吸收衰减、散射衰减、吸收光强度、光声转化比率等信息。

附图说明

图1为基于倒置显微镜实现的本发明的散射-吸收双模成像系统的结构示意图；

图2为二元混合微粒的验证实验结果：2(a)为检测到的三个典型波形信号：黑色聚酯球、透明玻璃球和背景，信号有两个明显分离的波峰S_I和S_II，图中小图为超声信号S_I的局部放大；2(b)为从超声信号S_II提取获得的图像；2(c)为从超声信号S_I中提取的图像；

图3为无标记红细胞散射-吸收双模成像结果；3(a)为检测到的两个典型波形信号，红细胞和背景，信号有两个明显分离的波峰S_I和S_II，图中小图为超声信号S_I的局部放大；3(b)为从超声信号S_II中提取的图像；3(c)为从超声信号S_I中提取的图像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如图1所示为一种基于倒置显微镜实现的本发明的散射-吸收双模成像系统，脉冲激光器产生的脉冲激光经光纤耦合器FC、光纤送入准直镜CL，经分光镜BS分为两路，一路经光电二极管PD触发数据采集卡DAQ对超声换能器探测到的超声信号进行采集，另一路经反射镜送入显微物镜OL，显微物镜OL和超声换能器UT分别布置在样品的两侧，显微物镜OL光轴与超声换能器UT声轴同轴，并且保持两者共聚焦，两者焦点位于样品上的同一点，超声换能器UT探测到的超声信号经信号放大器后被数据采集卡DAQ采集到。

下面结合具体实施例对本发明做出进一步说明。

实施例一

采用图1的系统对光学特性不同的二元混合微粒进行成像，包括如下步骤：

步骤1：由50微米直径黑色聚酯球和透明玻璃球组成的二元混合颗粒平铺在共聚焦皿底部，并在共聚焦皿中注入蒸馏水实现超声耦合。

步骤2：将脉冲激光通过光纤耦合器耦合到单模光纤中，单模光纤的出射光经过准直镜准直后入射到倒置显微物镜，并通过共聚焦皿底聚焦在样品上。倒置显微物镜数值孔径为0.6，激光波长532nm，脉冲宽度约为8ns、脉冲重复频率10kHz。光电二极管用于监测激光的强度并触发数据采集卡采集信号。球形聚焦超声换能器置于共聚焦皿上方，并保持其与显微物镜同轴、共聚焦。超声换能器中心频率为22.72MHz，-6dB相对带宽为77.36％，换能器有效直径约为3mm，焦距约为6.83mm。实验过程中，换能器浸没在共聚焦皿内的液体里，以保证良好的声耦合。

步骤3：超声换能器采集激光脉冲激发产生的信号，采集到的超声信号由小信号放大器放大，放大增益为46分贝。脉冲激光器产生脉冲激光的同时，光电二级管的输出同步触发信号，触发数据采集卡采集超声换能器探测到并经放大后的超声信号，采样频率为250MHz，采集到的数据被保存到计算机中，供进一步分析和图像重构。

步骤4：根据数据采集卡采集到的光声信号，提取激光和超声共焦点处的光散射-光吸收双模图像。步骤3采集的信号波形如图2(a)所示，信号包含两个信号峰值，第一个峰大约出现在t≈0，提取此信号峰的峰-峰值作为图像的像素值，获得具有光散射对比度的图像；第二个信号峰值出现在t≈4μs附近，提取此信号峰的峰-峰值作为图像的像素值，可获得具有光吸收对比度的图像；

步骤5：二维电控平移台承载着共聚焦皿逐步移动，平移步长1.0μm，并重复步骤2～4，从而实现对样品的逐点扫描。通过获得样品上各点的信号，进而同时获取样品的光吸收特性和光散射分布，构建样品的光散射-光吸收双模图像。

图2(b)、2(c)是对二元颗粒样品成像的结果。图2(b)是样品的光吸收图像，由于黑色颗粒具有很强的光学吸收，而透明玻璃颗粒的光吸收极弱。因此，该图像上能够清晰的、高对比度的呈现黑色颗粒的图像，而不能呈现透明玻璃颗粒。图2(c)是样品的光散射图像，该图同时清晰地呈现了黑色颗粒和透明玻璃颗粒，这是由于透明玻璃颗粒会引起光信号散射，削弱其达到换能器表面的激光强度。因此，这两幅图像具有不同的成像对比度，能够反映成像样品不同的光学特性。

实施例二

采用图1的系统对红细胞进行无标记成像，包括如下步骤：

步骤1：取小鼠(C57BL/6JGpt，雄性，10周龄，体重约25g)新鲜血液，在共聚焦皿底的上表面涂抹、固定，制作单层红细胞涂片，并在共聚焦皿中注入生理盐水实现超声耦合。

步骤2：将脉冲激光通过光纤耦合器耦合到单模光纤中，单模光纤的出射光经过准直镜准直后入射到倒置显微物镜，并通过共聚焦皿底聚焦在样品上。倒置显微物镜数值孔径为0.6，激光波长532nm，脉冲宽度约为8ns、脉冲重复频率10kHz。光电二极管用于监测激光的强度并触发数据采集卡采集信号。球形聚焦超声换能器置于共聚焦皿上方，并保持其与显微物镜同轴、共聚焦。超声换能器中心频率为22.72MHz，-6dB相对带宽为77.36％，换能器有效直径约为3mm，焦距约为6.83mm。实验过程中，换能器浸没在共聚焦皿内的液体里，以保证良好的声耦合。

步骤3：超声换能器采集激光脉冲激发产生的信号，采集到的信号由小信号放大器放大，放大增益为46分贝。脉冲激光器产生脉冲激光的同时，光电二级管的输出同步触发信号，触发数据采集卡采集超声换能器探测到并经放大后的超声信号，采样频率为250MHz，采集到的数据被保存到计算机中，供进一步分析和图像重构。

步骤4：根据数据采集卡采集到的光声信号，提取激光和超声同焦点处的光散射-光吸收双模图像。步骤3采集的信号波形如图3(a)所示，信号包含两个信号峰值，第一个峰大约出现在t≈0，提取此信号峰的峰-峰值作为图像的像素值，获得具有光散射对比度的图像；第二个信号峰值出现在t≈4μs附近，提取此信号峰的峰-峰值作为图像的像素值，可获得具有光吸收对比度的图像。

步骤5：二维电控平移台承载着共聚焦皿逐步移动，平移步长0.2μm，并重复步骤2～4，从而实现对样品的逐点扫描。通过获得样品上各点的信号，进而同时获取样品的光吸收特性和光散射分布，构建样品的光散射-光吸收双模图像。

图3(b)、3(c)是对红细胞样品成像的结果。图3(b)是红细胞的光吸收图像，由于红细胞对于532nm波长的激光具有较强的光学吸收，因此，该图像上能够清晰的、高对比度的呈现红细胞的图像，我们可以看见该图像能够清晰地显示红细胞的凹凸结构特性。

图3(c)是红细胞样品的光散射图像。通过对图中像素值的定量分析可以发现，红细胞会引起到达换能器表面激光强度高达33％的衰减。然而根据细胞中血氧蛋白浓度、细胞厚度、血样蛋白的光学吸收系数等数据，理论计算可知红细胞光学吸收引起的光强衰减仅为约9％，远远小于图像呈现的33％平均。进一步地利用米散射理论，可以估算红细胞散射引起的光强衰减约为27％。因此该图像的图像对比度主要来源于细胞的光散射特性。该图像中包含有成像样品的光学散射信息。因此，这两幅图像具有不同的成像对比度，能够反映成像样品不同的光学特性。进一步分析获得的散射、吸收像，可以分别提取出样品对应的结构和功能信息。因此，本方法在样品无标记的情况下实现了高对比度高分辨率的样品散射-吸收双模成像，具有较高的易用性和实用性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法，其特征在于：将脉冲激光聚焦在样品上，样品吸收部分脉冲激光，由于光声效应而激发出超声信号，该超声信号的强度与样品的光吸收系数成正比，通过与显微物镜共聚焦、同轴布置的超声换能器接收该超声信号，从中提取样品的光吸收信息，并获得具有光吸收对比度的图像；同时，透过样品的剩余脉冲激光经过样品的散射和吸收后，照射在同一超声换能器表面上，并与该超声换能器表面相互作用，进而激发出另一超声信号并被该超声换能器接收到，该超声信号的强度与脉冲激光透过样品时的光强总衰减相关，基于样品的散射和吸收都会引起光强衰减的特性，分析该超声信号以提取样品的光散射信息，并获得具有光散射对比度的图像；该方法包括如下步骤：

步骤1：将显微物镜和超声换能器分别布置在样品的两侧，显微物镜光轴与超声换能器声轴同轴，并且保持两者共聚焦，即两者焦点位于样品上的同一点；

步骤2：脉冲激光器产生脉冲激光，并通过显微物镜聚焦在样品上；

当脉冲激光照射在样品上时，样品吸收部分脉冲激光，并由于光声效应而激发出超声 信号

，该超声信号被共焦布置的超声换能器接收；

透过样品的剩余脉冲激光经过样品的散射和吸收后，照射在同一超声换能器表面上， 脉冲激光与超声换能器表面相互作用产生另一超声信号

；

单次脉冲激光对样品的照射产生的超声信号

和

都被同一超声换能器接收；

步骤3：脉冲激光器产生脉冲激光的同时，脉冲激光器或光电传感器发出同步触发信 号，触发数据采集卡采集超声换能器探测到的超声信号

和

；

步骤4：根据数据采集卡采集到的信号，提取显微物镜和超声换能器同焦点处的光散 射-光吸收双模图像；脉冲激光与样品和超声换能器表面发生两次相互作用，产生超声信号

和

，超声换能器接收到的波形上存在两个波峰，先出现的波峰对应超声信号

，晚出 现的波峰对应超声信号

，通过对这两个波峰的分析，同时获得样品的光散射-光吸收双 模图像；具体包括如下步骤：

步骤41：提取光吸收信息

在超声换能器检测到的超声信号中，距离触发时间

处存在一个信号峰值，其 中，

为超声换能器的焦长，

为样品与超声换能器之间介质的声速；该峰值对应于脉冲 激光被样品吸收产生的超声信号

，超声信号

的强度正比于样品的光吸收系数，提取 此信号强度作为样品图像的像素值，它反映了样品的光吸收特性，该图像是具有光吸收对 比度的图像；

步骤42：提取光散射信息

在超声换能器检测到的超声信号中，在触发时刻

处也存在一个信号峰值，该峰值 对应于脉冲激光被超声换能器表面吸收产生的超声信号

，超声信号

的强度正比于透 过样品的脉冲激光的强度，提取此信号强度作为样品图像的像素值，它反映了的样品的光 散射特性，该图像是具有光散射对比度的图像

步骤5：逐点扫描样品，并重复步骤2~ 4，获得样品上各点的超声信号，进而同时获取样品的光吸收和光散射分布，构建样品的光散射-光吸收双模图像。

2.根据权利要求1所述的同时获得光吸收和光散射双对比度的显微成像法，其特征在于：所述超声换能器为球形聚焦超声换能器。

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