RU2584922C1 - Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии мозга животных - Google Patents

Abstract

Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии относится к устройствам, обеспечивающим получение в эндоскопическом режиме оптических изображений биологических тканей, в частности, головного мозга свободноподвижных лабораторных животных. В устройстве торец многоканального оптоволоконного зонда совмещается с фокальной плоскостью сканирующего конфокального микроскопа, а другой дистальный торец используется для сбора мультиплексного (мультиспектрального) флуоресцентного оптического сигнала или сигнала комбинационного рассеяния света. Изображение исследуемого объекта формируется в конфокальном режиме из области прилегающего к торцу волокна и передается в обратном направлении в систему регистрации. В качестве источника используется непрерывный одночастотный лазер. Технический результат - обеспечение высокого пространственного разрешения, комплексная регистрация различных функциональных процессов или морфологических особенностей тканей в мозге, проведение исследования без использования биомаркеров, снижение высокочастотных шумов и повышение качества изображений. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 ил.

Description

Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии относится к устройствам, обеспечивающим получение в эндоскопическом режиме оптических изображений биологических тканей, в частности, головного мозга свободноподвижных лабораторных животных.

Быстро прогрессирующие оптические технологии расширяют возможности и области применения методов биовизуализации, обеспечивая возможность регистрации изображения биологических тканей с высоким пространственным разрешением за счет сочетания линейных и нелинейно-оптических методов с использованием флуоресцентных маркеров, обладающих функциональной и морфологической специфичностью. Одно из направлений развития оптических технологий для биомедицинских приложений связано с их реализацией в волоконном формате. Одним из наиболее перспективных методов получения изображений биологических объектов и тканей, в том числе нейронов головного мозга, в эндоскопическом режиме является использование многоканальных оптических световодов.

Идея передачи изображений с помощью пучков оптических волокон была высказана и запатентована еще в пятидесятых годах прошлого века (US 2825260A "Optical image forming devices", US 3043179A "Fiber optical image transfer devices" или "Fiber optical image transfer devices" US 3043910). С тех пор использование специальных типов оптических световодов, включая многоканальных, для целей получения изображений тканей с высоким пространственным разрешением привлекает повышенное внимание [см., например, S. Yashvinder et al. Applied Optics, 38, 7133-7144 (1999); J. Knittel, et al. Optics Communication, 188, 267-273 (2001); B.A. Flusberg, et al. Nature Methods 5, 935 (2008); K.K. Ghosh, et al. Nature Methods 8, 871 (2011)., W. Gobel, et al. Opt. Lett.29,2521 (2004)].

Развитие технологий изготовления многоканальных (многосердцевинных) оптических световодов направлено на уменьшение поперечных размеров самих световодных каналов и расстояния между ними до микронного уровня, что позволяет использовать сборку таких каналов в едином волоконном зонде с малыми поперечными размерами. Большая плотность каналов позволяет получать изображения с клеточным разрешением, а малый поперечный размер зонда обеспечивает возможность его проникновения вглубь ткани с минимальными повреждениями, что особенно важно в случае исследования головного мозга живых животных.

В развитии методик эндоскопии с использованием многоканальных зондов достигнут ряд серьезных научных и технологических успехов. В первую очередь необходимо указать на передовые разработки компании Mauna Kea Technologies (Франция), в которых используются оптические световоды, содержащие большое количество световодных каналов с размерами порядка нескольких микрометров. Компания обладает рядом патентов в этой области - US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", US 20120184842 "Method, an optical probe and a confocal microscopy system for inspecting a solid organ", US 20120123236 "Apparatus and method for brain fiber bundle microscopy" и рядом других. В этих патентах описываются схемы реализации подобных устройств - оптическое излучение заводится в отдельные каналы многоканального волокна, и далее на выходе из свободного (дистального) торца волокна "точечно" возбуждает флуоресценцию исследуемых объектов. Сигнал флуоресценции передается в направлении "назад" в систему регистрацию, где происходит формирование изображения. В указанных патентах приводятся основные конструктивные особенности устройств для исследования различных органов и биологических тканей с помощью многоканальных зондов, и, в частности, описывается устройство и методы для получения изображений нейронов мозга в режиме in vivo. Также в патентах Mauna Kea Technologies содержатся описание различных методик обработки изображений, получаемых из многоканальных волоконных зондов. В патенте US 8237131 "System and method for carrying out fibre-type multiphoton microscopic imaging of a sample" рассматриваются нелинейно-оптические методы с применением сверхкоротких лазерных импульсов для получения изображений тканей. Необходимо отметить, что компания Mauna Kea Technologies представляет на рынке коммерческую систему CellVizio, которая служит для получения флуоресцентных изображений различных органов и тканей с клеточным разрешением. Однако CellVizio являются прибором, предназначенным для решения специфических задач, определяемых измерением оптического сигнала флуоресценции возбуждаемого в исследуемых биологических тканях, содержащих специальные маркерные красители или белки. При этом в CellVizio предусмотрено использование лишь одно- либо двухцветного излучения оптической накачки, что ограничивает набор возможных флуоресцентных красителей, обладающих строгой морфологической специфичностью, что соответственно уменьшает возможности проведения мультиплексных (мультиспектральных), и соответственно, многофункциональных измерений.

Аналогом предлагаемого изобретения можно считать уже упоминавшуюся заявку Mauna Kea Technologies US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", где описаны устройство и принципиальные особенности получения изображений органов и тканей с клеточным разрешением с помощью многоканального волоконно-оптического зонда. В состав устройства входит оптическое многоканальное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Через каналы оптического многоканального волокна излучение накачки передается к объекту, возбуждает флуоресцентный сигнал, который собирается и передается в систему регистрации тем же самым волокном.

В заявке US 20080007733 "Volumetric endoscopic coherence microscopy using a coherent fiber bundle" рассматривается устройство с использованием многосердцевинного волокна для когерентной оптической томографии. Для заведения излучения в световодные каналы используется конфокальная сканирующая система. В качестве возбуждающего излучения используется либо перестраиваемый лазерный источник, либо источник слабокогерентного белого света, что необходимо для обеспечения методики когерентной оптической томографии. В заявках KR 20140006464 и CN 102389288 описываются возможности использования принципов конфокальной микроскопии и многоканального волокна для получения изображений биологических тканей с улучшенным пространственным разрешением в эндоскопическом режиме. В зондирующей системе используется несколько лазерных источников, а в системе регистрации спектрометр.

Физический принцип оптического детектирования во всех описанных устройствах основывается на регистрации флуоресцентного сигнала, что обычно предусматривает наличие биомаркера в исследуемой ткани, чей спектр поглощения соответствует длине волны возбуждающего излучения. Существуют альтернативные безмаркерные методы измерений, основанные на регистрации спонтанного комбинационного (рамановского) отклика исследуемых тканей. На основе спонтанного комбинационного (рамановского) рассеяния света (СКР) разработаны разнообразные инструменты для спектрального анализа и структурно-селективной визуализации объектов в широком диапазоне физических, химических и биологических систем. Для многих приложений критически важной является возможность проведения измерений в эндоскопическом режиме, что служит мощным стимулом для поиска волоконных решений для задач с использованием методики спектроскопии спонтанного комбинационного рассеяния (СКР-спектроскопии). В патенте US 6788860B1 "Chemical imaging fiberscope" рассмотрена возможность визуализации объектов с субмиллиметровым пространственным разрешением с помощью зонда, в котором волоконно-оптические компоненты для доставки излучения накачки были интегрированы со спектральными фильтрами и отделены по пространству от пучков волокон для сбора сигнала. Для целей спектроскопии комбинационного рассеяния в волоконном формате продемонстрировано несколько специальных световодных зондов [S. Stewart et al. Annu. Rev. Anal. Chem.5, 337 (2012); L.V. Doronina-Amitonova et al. Opt. Lett.37, 4642 (2012); R.L. McCreery, et al. Anal. Chem.55, 146 (1983); J.T. Motz, et al. Appl. Opt. 43, 542 (2004)], свойства которых служат цели улучшения эффективности сбора сигнала и фильтрации измеряемого сигнала комбинационного рассеяния из образца от паразитного фона, возникающего из-за комбинационного рассеяния излучения накачки в материале волновода. Многосердцевинные волокна с интегрированными брегговскими решетками были продемонстрированы как многообещающие инструменты для эндоскопии комбинационного рассеяния, свободной от паразитного фона [S. Dochow, et al. Opt. Express20, 20156 (2012)], а также для диагностики раковых тканей [С. Krafft et al. Biomed. Spectrosc. Imagingl, 39-55 (2012)]. Однако в настоящее время не существует отработанной методики волоконно-оптической визуализации биологических тканей на основе спонтанного комбинационного рассеяния света.

В задачу настоящего изобретения входит разработка устройства для получения в эндоскопическом режиме изображений мозга животных, в том числе свободноподвижных, с клеточным разрешением на основе конфокального микроскопа, лазерных источников возбуждения, многосердцевинного оптоволоконного зонда и системы регистрации со спектрометром. Устройство должно обеспечить мультимодальность - проведение измерений с помощью флуоресценции и спонтанного комбинационного рассеяния.

Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии мозга животных содержит лазерную систему оптического возбуждения, конфокальную микроскопную систему, многосердцевинный волоконный зонд с микронными размерами световодных каналов и систему регистрации с встроенным спектрометром для детектирования оптического сигнала с высоким спектральным разрешением, лазерная система оптического возбуждения содержит хотя бы один непрерывный одночастотный лазер. Способ получения мультиплексных изображений на основе многоканального оптоволоконного зонда, в котором используют лазерный источник оптического возбуждения, сигнал оптического возбуждения через многоканальный волоконный зонд передают к мишени, собирают и передают измеряемый оптический сигнал тем же многоканальным волоконным зондом, передают измеряемый оптический сигнал через конфокальную оптическую систему и встроенный спектрометр, детектируют его приемниками излучения, лазерный сигнал оптического возбуждения генерируют по крайней мере одним непрерывным одночастотным лазером и регистрируют встроенным спектрометром. Использование хотя бы одного одночастотного (с одной продольной модой) непрерывного лазера в лазерной системе оптического возбуждения и встроенного спектрометра в системе регистрации обеспечивает мультимодальность измерений - возможность возбуждения и регистрации оптического сигнала различной физической природы.

Лазерная система оптического возбуждения содержит несколько непрерывных одночастотных (с одной продольной модой) лазеров с различными длинами волн излучения. Лазерный сигнал оптического возбуждения генерируют несколькими непрерывными одночастотными лазерами с различными длинами волн. Это обеспечивает мультиплексность (мультиспектральность) измерений. Поскольку полосы поглощения наиболее распространенных биомаркеров составляют десятки нанометров, то для большинства задач достаточно использовать три-четыре источника в спектральной области 400-600 нм (для специфических биомаркеров возможно использование дополнительных источников в более длинноволновой области спектра). Использование лазерных источников в случае передачи излучения через микронные каналы многосердцевинных зондов предпочтительнее по сравнению с устройствами, использующими слабокогерентный источник белого света, так как лазерное излучение обеспечивает более высокую эффективность распространения света в волокне и позволяет получать высококонтрастные изображения тканей головного мозга.

Основной особенностью заявляемого устройства является использование одночастотных (с одной продольной модой) лазерных источников. В случае проведения флуоресцентных измерений это свойство источников накачки обеспечивает значительное уменьшение высокочастотных шумов и повышение качества получаемых изображений. Однако использование одночастотных лазеров с узкой спектральной линией излучения является принципиально важным при реализации измерений на основе спонтанного комбинационного (рамановского) рассеяния света (СКР). Комбинационное рассеяние обеспечивает получение химически селективных изображений, что принципиально позволяет исследовать ткани головного мозга без использования дополнительных маркеров, получая при этом информацию, специфичную определенным молекулярным колебаниям, которые определяются исследуемыми веществами и как бы являются их «отпечатками пальцев».

Приемниками излучения регистрируют мультиплексные флуоресцентные изображения исследуемых объектов. Наличие нескольких лазерных источников накачки с разными длинами волн обеспечивает возможность мультиплексных измерений, а именно, параллельного возбуждения и регистрации флуоресценции в различных спектральных диапазонах от различных маркерных красителей или генетически встроенных белков трансгенных животных, отвечающих за различные функциональные и морфологические свойства исследуемой ткани головного мозга.

Приемниками излучения регистрируют сигнал спонтанного комбинационного рассеяния света. Наличие одночастотных лазерных источников возбуждения и спектрометра в схеме регистрации позволяет проводить анализ оптического сигнала с высоким спектральным разрешением и спектрально отделять измеряемый сигнал комбинационного рассеяния от паразитного комбинационного рассеяния материала волокна. Регистрация спонтанного комбинационного рассеяния обеспечивает схему безмаркерных и химически селективных измерений.

Через многоканальный волоконный зонд регистрируют мультиплексный (мультиспектральный) оптический сигнал в эндоскопическом режиме в мозге свободноподвижных животных. Изображение исследуемого объекта формируется в конфокальном режиме из области прилегающего к торцу волокна и передается в обратном направлении в систему регистрации. Размеры световодных каналов и расстояние между ними составляет единицы микрометров, что позволяет получать изображения биологических тканей в эндоскопическом режиме с клеточным разрешением. Принципы конфокальной микроскопии позволяют изменять и настраивать аксиальное разрешение (менять эффективную область сбора сигнала за торцом волокна). Так минимально открытая диафрагма в системе конфокального микроскопа позволяет считывать сигнал только из того канала в пучке, по которому осуществлялась накачка, тем самым увеличивается пространственное разрешение получаемой картины. Максимально открытая диафрагма, напротив, позволяет считывать сигнал с помощью всех волокон в пучке, уменьшая пространственное разрешение, но при этом значительно увеличивая уровень собранного оптического сигнала, что особенно актуально в случае слабых сигналов спонтанного комбинационного рассеяния.

Реализуемая методика эндоскопии имеет важные преимущества по сравнению со стандартной оптической визуализацией, поскольку при сохранении клеточного разрешения позволяет проникать в исследуемую ткань головного мозг на практически неограниченную глубину. Торец оптического световода совмещается с фокальной плоскостью сканирующего конфокального микроскопа, а другой дистальный торец волокна проникает вглубь исследуемой области мозга через отверстие или ферулу в черепе подопытного животного. При этом сохраняется возможность движения животного и его активность в заданных условиях.

Техническим результатом изобретения является реализация устройства для визуализации тканей головного мозга свободноподвижных животных с высоким пространственным разрешением в эндоскопическом режиме на основе различных физических методов регистрации оптического сигнала. Мультимодальные (регистрация флуоресценции или спонтанного комбинационного рассеяния) и мультиплексные (мультиспектральные) измерения обеспечивают комплексную регистрацию различных функциональных процессов или морфологических особенностей тканей в мозге животных. Спонтанное комбинационное рассеяние обеспечивает получение химически селективных изображений, что принципиально позволяет исследовать ткани головного мозга без использования биомаркеров. Одночастотные лазерные источники позволяют значительно снизить высокочастотные шумы оптической накачки и повысить качество получаемых изображений.

ФИГ. 1. Схема предлагаемого многоканального оптоволоконного нейроинтерфейса для мультимодальной микроскопии и получения мультиплексных изображений тканей головного мозга животных на основе конфокального микроскопа и многосердцевинного оптоволоконного зонда.

ФИГ. 2. Изображения нейронов мозга Thy-EGFP мыши (а), полученные с помощью многосерцевинного зонда и конфокального микроскопа, регистрирующим флуоресцентный ответ от EGFP с дистального конца волоконного зонда. Сборка изображений (б), полученных с помощью многосерцевинного микрозонда при его погружениях на различные глубины внутри фиксированной ткани мозга. Масштабная линейка изображения составляет 50 мкм.

ФИГ. 3. Мультиспектральное (трехцветное) изображение зубчатой фасции гиппокампа трансгенных Thy-1-EGFP мышей, дополнительно прокрашенной красителями DAPI dilactate и Neurotrace Nissl 640/660. Масштабная линейка изображения составляет 100 мкм.

ФИГ. 4. (а) Нормированные спектры спонтанного комбинационного рассеяния многосердцевинного волокна (штрихпунктирная линия 3), полистирольной пластинки (сплошная линия 1), и алмазных наночастиц (пунктирная линия 2). (б) Карта комбинационного отклика полистирольной пластинки с нанесенным дефектом, (в) Карта комбинационного отклика наноалмазных кластеров на поверхности стекла. Масштабная линейка изображений составляет 10 и 20 мкм, соответственно.

Схема и принципы реализации предлагаемого устройства представлены на Фиг. 1. Ключевым элементом эндоскопической системы визуализации является волоконный многосердцевинный зонд (4), сопряженный с конфокальным микроскопом, Непосредственно сам конфокальный микроскоп содержит - систему возбуждения, состоящую из нескольких одночастотных лазерных источников (1); систему сканирования, состоящую из двух гальванозеркал (2); систему фокусировки с объективом (3); систему регистрации, состоящую из приемников излучения - фотоэлектронных умножителей или полупроводниковых детекторов (5), спектрометра (6); систему конфокальной пространственной фильтрации с диафрагмой (7); системы предварительной спектральной селекции (8) и фильтрации (9).

Примеры реализации и использования устройства описаны ниже. Устройство (Фиг. 1) выполнено на основе коммерческого конфокального микроскопа. Непосредственно сам волоконный многосердцевинный зонд (4) содержит несколько тысяч оптических световодных каналов диаметром порядка 2,4 мкм. Расстояние между центрами оптических каналов варьируется в диапазоне от 3,0 до 4,0 мкм. Типичное поле зрения волоконного микрозонда составляет 3.14*150*150 мкм². Излучение лазерных источников (1) на длинах волн 405, 473 и 559 нм заводится в отдельные световодные каналы многосердцевинного волокна через объектив (20х, NA=0,5) с помощью двух гальванозеркал (2). Длина волны лазерных источников возбуждения должна соответствовать полосам поглощения используемых биомаркеров. Гальваносистема сканирует лазерный луч по входному торцу многосердцевинного волокна, помещенного в фокальную плоскость конфокального микроскопа (3). Другой свободный (дистальный) конец волокна помещается в исследуемый объект. Лазерное излучение после прохождения микронных световодных каналов (4) порождает флуоресцентный отклик от биомаркеров, встроенных в исследуемый объект или ткань. Далее вся апертура зонда (все каналы) используется для сбора флуоресцентного отклика от биомаркеров исследуемой ткани, который затем передается в обратном направлении на входной торец волоконного зонда, откуда он собирается тем же фокусирующим объективом (3) и передается в схему конфокального микроскопа. После спектральной селекции с помощью системы предварительной спектральной селекции (8) на основе дихроичного зеркала, оптических фильтров (9) и спектрометра (6) исследуемый сигнал детектируется регистрирующим прибором - фотоэлектронным умножителем или полупроводниковым детектором (5). Трехмерная структура ткани восстанавливается путем сканирования дистального (свободного) конца волоконного зонда внутри исследуемой ткани.

В условиях наших экспериментов использовались живые ткани с контрастным окрашиванием мозга анестезированных трансгенных мышей, в нейронах головного мозга которых происходит экспрессия зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Типичные изображения, полученные с помощью оптоволоконного многосерцевинного зонда, при проведении экспериментов на образцах мозга, извлеченных из мышей не более чем за 1 минуту до измерения, показаны на Фиг. 2а. В этих экспериментах, флуоресцентный отклик от белка EGFP регистрировался дистальным торцом оптоволоконного зонда, погруженного на разные по глубине слои мозга мыши. Трехмерное изображение может быть получено при сканировании дистального конца волокна вглубь ткани мозга мыши. Пространственное разрешение метода визуализации тканей, основанного на использовании многосердцевидного микрозонда, определяется размерами отдельных волокон в пучке. Уровень пространственного разрешения является достаточным для визуализации отдельных нейронов.

Для проведения мультиспектральных флуоресцентных измерений необходимо обеспечить совмещение длины волны возбуждающих лазерных источников со спектральными областями поглощения маркерных красителей либо белков трансгенных животных. Использование различных маркерных красителей принципиально позволяет параллельную регистрацию различных функциональных откликов тканей, в частности, функциональные и морфологические особенности поведения нейронных тканей, в том числе в режиме in vivo. Для трехцветной in vivo визуализации мозга трансгенных Thy-1-EGFP мышей многосерцевинным микрозондом дополнительно использовались красители Neurotrace Nissl 640/660 вместе с DAPI dilactate, апплицированные на зубчатую фасцию гиппокампа мозга животных. Краситель Neurotrace Nissl служит для флуоресцентной окраски вещества Ниссля, обеспечивая возможность идентификации нейронов и их физиологического состояния. В наших экспериментах этот краситель возбуждался лазерным излучением с длиной волны 559 нм. На Фиг. 3 представлены три мультиспектральных параллельных изображения одной и той же области зубчатой фасции гиппокампа живых трансгенных Thyl-EGFP мышей: флуоресценция EGFP Фиг. 3(а), внутриядерной ДНК (DAPI dilactate) Фиг. 3(б), и флуоресцентный сигнал от с Neurotrace Nissl Фиг. 3(в), который связан с общей морфологии ткани, нейронами и кровеносными сосудами. Таким образом, эти измерения демонстрируют возможность одновременного морфологического и функционального анализа структур головного мозга.

Реализация измерений в безмаркерном химически селективном формате является одним из наиболее привлекательных направлений исследований, что может быть достигнуто с помощью спонтанного комбинационного (рамановского) рассеяния света. Спонтанное комбинационное (рамановское) рассеяние света является неупругим рассеянием оптического излучения на резонансных переходах молекул вещества, сопровождающееся изменением частоты излучения. Метод спонтанного комбинационного рассеяния (СКР) в настоящее время является наиболее распространенным методом оптического химического анализа вещества. На основе этого метода развиты также методы химически селективной спектроскопии, позволяющие получать изображения с высоким пространственным разрешением объектов. Реализация СКР в эндоскопическом режиме в волоконном формате является гораздо более сложной задачей. Принципиальная сложность методики заключается в наличии сильного фона от материала самого волокна, который может оказаться гораздо сильнее, чем сам сигнал. В этом случае наличие одночастотных лазерных источников играет ключевую роль. В представленных ниже измерениях, моделирующих характерные масштабы и особенности измерений нейронов головного мозга животных, оптическая накачка осуществлялась одночастотным непрерывным лазером (1) на длине волны 532 нм. После прохождения каналов зонда (4) излучение накачки вызывает комбинационный отклик в освещаемой части исследуемого образца. Этот комбинационный сигнал, как и в случае регистрации флуоресцентного отклика, собирается всей апертурой волоконного пучка и доставляется в обратном направлении к системе регистрации. После коллимации и предварительной фильтрации (9) от излучения накачки системой узкополосных фильтров искомый спектр комбинационного рассеяния выделялся при помощи спектрометра (6) с высоким спектральным разрешением и регистрировался фотоэлектронным умножителем (5). Алмазные наночастицы и полистирол были выбраны в качестве тестовых объектов, так как они представляют собой комбинационно-активные объекты с существенно различными частотными отстройками характерных спектральных линий от возбуждаемого в волоконном пучке комбинационного отклика материала волокна. На Фиг. 4а показан спектр полистирола (сплошная линия 1) и кластеров наночастиц алмаза на стеклянной подложке (пунктирная линия 2) в сравнении со спектром комбинационного отклика материала волокна (штрихпунктирная линия 3). В спектре комбинационного рассеяния алмазных наночастиц доминирует отклик на частоте оптического фонона с отстройкой Ω_R≈1330 см^-1. Этот пик лишь ненамного отстоит от высокочастотной границы спектра комбинационного рассеяния плавленого кварца, наблюдаемой на 1200-1250 см^-1. С другой стороны спектр комбинационного рассеяния СН колебательной моды растяжений полистирола наблюдается в спектральном диапазоне в окрестности Ω_R≈3050 см^-1, где сигнал комбинационного рассеяния очень слабый, что позволяет производить высококонтрастное спектральное разделение комбинационного рассеяния СН колебательной моды растяжений и сигнала комбинационного рассеяния из волоконного зонда. Наличие спектрометра позволяет проводить высококонтрастные измерения и сканировать спектр для различных веществ.

На Фиг. 4б представлена карта комбинационного отклика полистирольной пластинки, снятого при отстройке 3050 см^-1, с учетом нормировки на фон. На Фиг. 4в представлена карта комбинационного отклика наноалмазных кластеров, размещенных на поверхности стекла и визуализированных с помощью того же оптоволоконного зонда. В этом случае также использовалось вычитание фона. Изображения полистирола обеспечивают больший контраст измеренного сигнала комбинационного рассеяния, так как частота соответствующей колебательной моды лежит дальше от высокочастотной границы спектра комбинационного рассеяния плавленого кварца. Таким образом, в модельных экспериментах была продемонстрирована возможность волоконно-оптической безмаркерной визуализации структур с комбинационно-активными линиями в формате эндоскопии с высоким пространственным разрешением, составляющим порядка 3 мкм. Аналогичные измерения также реализуемы в тканях головного мозга животных. Предложенный метод визуализации позволяет надеяться на получение волоконно-оптических зондов с поперечным пространственным разрешением порядка одного микрометра, что соответствует минимальному достижимому в современных волоконных технологиях расстоянию между сердцевинами в пучках волокон.

Claims (7)

1. Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии мозга животных содержит лазерную систему оптического возбуждения, конфокальную микроскопную систему, многосердцевинный волоконный зонд с микронными размерами световодных каналов и систему регистрации с встроенным спектрометром для детектирования оптического сигнала с высоким спектральным разрешением, отличающийся тем, что лазерная система оптического возбуждения содержит хотя бы один непрерывный одночастотный лазер.

2. Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс по п. 1, отличающийся тем, что лазерная система оптического возбуждения содержит несколько непрерывных одночастотных лазеров с различными длинами волн излучения.

3. Способ получения мультиплексных изображений на основе многосердцевинного оптоволоконного зонда, в котором используют лазерный источник оптического возбуждения, сигнал оптического возбуждения через многоканальный волоконный зонд передают к мишени, собирают и передают измеряемый оптический сигнал тем же многоканальным волоконным зондом, передают измеряемый оптический сигнал через конфокальную оптическую систему и встроенный спектрометр, детектируют его приемниками излучения, отличающийся тем, что лазерный сигнал оптического возбуждения генерируют хотя бы одним непрерывным одночастотным лазером

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что лазерный сигнал оптического возбуждения генерируют несколькими непрерывными одночастотными лазерами с различными длинами волн.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что приемниками излучения регистрируют мультиплексные флуоресцентные изображения исследуемых объектов.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что встроенным спектрометром и приемниками излучения регистрируют сигнал спонтанного комбинационного рассеяния света.

7. Способ по пп. 4, 5, 6, отличающийся тем, что через многоканальный волоконный зонд регистрируют мультиспектральный оптический сигнал в эндоскопическом режиме в мозге свободноподвижных животных.

Images