WO2017169210A1 - 細胞検出方法 - Google Patents

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WO2017169210A1
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金子　泰久
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Definitions

  • the present invention relates to a cell detection method.
  • Patent Document 1 uses a sorting function of a flow cytometer (an apparatus used in a flow cytometry method) for a minute cell (micronucleus) that is caused by a chromosomal abnormality and from which a part of the cell is separated. It is described that the main nucleus (parent nucleus) and the small nucleus are separated and recovered.
  • cells are sorted by obtaining information on forward scattered light, side scattered light, and fluorescence intensity of fluorescence from cells, and target cells are placed in a container having a plurality of wells, one per well. Sorting of cells is performed.
  • the container in which the cells are collected is set in a PCR (Polymerase® Chain® Reaction) apparatus, DNA (Deoxyribonucleic® Acid) is amplified, and gene analysis is performed.
  • PCR Polymerase® Chain® Reaction
  • the target cells since the target cells are selected based on the fluorescence intensity information, the cells may be misselected due to non-specific staining.
  • two or more cells may be collected in one well.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a cell detection method capable of performing gene analysis efficiently and accurately only for a target cell.
  • the first information derived from the cells of the sample solution is obtained by a flow cytometry method, and the target cell is arranged with a well having an opening based on the first information.
  • the imaging process for imaging the cells sorted into the container, and the cell image captured by the imaging process the second information derived from the cell is acquired and sorted.
  • the method further includes a step of staining cells before the sorting step.
  • a plurality of wells having openings are arranged in the container.
  • the imaging step includes moving cells to the bottom surface of the well by centrifugation.
  • the imaging step includes imaging the cells sorted into the container from the side opposite to the opening of the well of the container.
  • the sorting step includes associating the position of the well with the first information
  • the determining step includes associating the second information with the position of the associated well and the first information.
  • the first information includes at least one of forward scattered light, side scattered light, and fluorescence
  • the second information includes at least one of fluorescence, cell shape, transmission color, and size.
  • the sample solution contains blood cells.
  • the container has wells arranged in rows and columns.
  • the determination step there is a removal step of taking out only the cells to be analyzed from the container.
  • the extraction step only the cells to be analyzed are extracted using a capillary or pipette.
  • the cells removed in the extraction step are moved to a PCR tube or a PCR plate.
  • the first information and the second information are associated with the position information of the PCR tube or the PCR plate.
  • the container contains a culture solution inside the container.
  • the culture solution contains at least one staining solution.
  • the method further includes a step of replacing the culture solution with a culture solution not containing a staining solution after the imaging step.
  • the cell detection method of the present invention it is possible to perform gene analysis of only the target cell efficiently and accurately.
  • ⁇ Cell detection method> The cell detection method of this embodiment is demonstrated with reference to drawings.
  • a case where blood cells are included in the sample solution and the target cell is a nucleated red blood cell will be described as an example.
  • FIG. 1 is a flowchart of the cell detection method of the present embodiment.
  • the cell detection method includes at least a sorting process (step S1), an imaging process (step S2), and a determination process (step S3).
  • step S1 first information derived from the cells of the sample solution is obtained by flow cytometry, and based on the first information, the target cells are sorted into a container in which wells having openings are arranged. To take.
  • step S2 the cells sorted in the container are imaged.
  • step S3 the cell-derived second information is acquired based on the cell image captured in the imaging step, and the cell to be analyzed is selected from the cells sorted based on the second information. decide.
  • the flow cytometer 10 that realizes the flow cytometry method is used, the first information derived from the cells of the sample solution is acquired, and the cells are sorted into a container.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of the flow cytometer 10.
  • the sample solution S contains blood cells including cells C immunostained by antigen-antibody reaction.
  • Antigen-antibody reaction means that an antibody specifically binds to an antigen having a complementary structure
  • immunostaining means that an antibody linked to a fluorescent label is bound to an antigen present in a cell.
  • Immunostaining includes a direct method and an indirect method.
  • the direct method is a method in which a fluorescent label is directly linked to an antibody and reacted with an antigen.
  • an antibody that can specifically bind to the antigen to be detected (primary antibody) is not linked to a fluorescent label, and an antibody that can specifically bind to the primary antibody (secondary antibody) is fluorescently labeled. It is the method of detecting by connecting.
  • the cells are immunostained by the antigen-antibody reaction as described above.
  • the anti-human CD antibody include an anti-CD3 antibody, an anti-CD4 antibody, an anti-CD14 antibody, an anti-CD25 antibody, an anti-CD127 antibody, and the like, and 4 ′, 6-diamidine-2′-phenyl as a fluorescent label.
  • Indole dihydrochloride (DAPI: 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), propidium iodide (PI), pyronin Y (Pyronin Y), fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) : Phycoerythrin), allophicocyanin (APC), Texas Red (TR (registered trademark)), Hoechst 33342, 7-amino-actinomycin D (7-AAD), Cy3 (2'-Deoxycytidine 5'-triphosphoric acid), Cy5 (Sul oindocyanine succinimidyl ester), DRAQ5 (registered trademark) (manufactured by Biostatus Corporation), Brilliant Violet 570, Brilliant Violet 421, etc. can be mentioned.
  • DAPI 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole
  • PI propidium iodide
  • Pyronin Y fluorescein
  • the culture solution is preferably a phosphate buffer (PBS) or PBS supplemented with 0.1% by weight of bovine serum albumin (BSA: Bovine serum albumin), and the antibody staining the cells is separated from the cells.
  • PBS phosphate buffer
  • BSA bovine serum albumin
  • a staining solution to the culture medium, and it is particularly preferable to add a staining solution that stains nuclei.
  • DRAQ5 which is a nuclear staining solution containing an anthraquinone dye is added.
  • the amount of the culture solution is not particularly limited as long as it is suitable for the amplification step, but it is put in advance in consideration of evaporation during the imaging step so that the amount becomes a predetermined amount before the amplification step.
  • a mode in which the sample is extracted is preferable.
  • the sample solution is prepared as follows. First, a sample to be analyzed containing target cells is prepared. The sample to be analyzed is mixed with, for example, a hemolyzing agent and a fluorescently labeled antibody used for immunostaining, and the cells are immunostained by incubation. A sample solution S is prepared by immunostaining the cells.
  • Sample liquid S is introduced into the flow cell 104 from the nozzle 102.
  • the sheath liquid L is introduced into the flow cell 104.
  • the sample liquid S is squeezed by the sheath liquid L in the flow cell 104. Since the sample solution S is squeezed, the cells C are arranged in a line.
  • the cell C is irradiated with, for example, laser light from the light source 106. Fluorescence labeling by immunostaining of cell C is excited by irradiation with laser light, and cell C emits fluorescence by fluorescence labeling by immunostaining. This fluorescence intensity is detected by the detector 108. The fluorescence intensity of the cell C detected by the detector 108 is input to the control unit 120 and stored as the first information derived from the cell.
  • the control unit 120 includes a calculation unit that performs various processes, a storage unit that stores various programs, data, and the like.
  • Scattered light forward scattered light, side scattered light, etc.
  • the fluorescence intensity by the scattered light from the cell C detected by the detector 110 is input to the control unit 120 and stored as the first information derived from the cell. Note that the size of the cell to be measured can be measured by the forward scattered light, and the structure of the cell of the measurement target can be measured by the side scattered light and the fluorescence.
  • droplets containing cells C to which ultrasonic waves are applied are formed.
  • the control unit 120 charges the droplet positively or negatively based on the detection result.
  • the control unit 120 does not charge the droplets to be discarded.
  • one cell is basically sorted into one well of the container 20 by attracting charged droplets to one of the deflection electrode plates 112 and 114.
  • a plurality of laser light sources having different wavelengths As the light source 106 for exciting immunostaining.
  • a plurality of laser light sources having different wavelengths By using a plurality of laser light sources having different wavelengths, a plurality of fluorescence intensities can be obtained as the first information derived from cells.
  • a fluorescent filter that cuts off the excitation light of the laser light source and selectively transmits the emission wavelength of the fluorescent label by immunostaining in order to detect the fluorescence intensity at the same time.
  • 3 and 4 are perspective views of the container 20.
  • the container 20 has a plurality of wells 202 having an opening and a bottom surface and a plurality of wells 202 and an integrally structured side wall 204 for collecting a plurality of cells.
  • the plurality of wells 202 are arranged in rows and columns.
  • a numerical value indicating a row and an alphabetic character indicating a column are displayed on the opening side of the well 202 of the container 20.
  • cells are collected in each well 202.
  • an identification mark 206 such as a barcode is displayed on the side wall of the container 20, for example.
  • the container 20 in a form different from that in FIG. 3 includes a plurality of tubes 208 having openings and bottom surfaces for collecting a plurality of cells, and a plurality of tubes for holding the plurality of tubes 208. And a support member 210 having a plurality of holes 212.
  • the tube 208 performs the function of a well.
  • the shape of the well is not limited as long as it has an opening and a bottom surface for containing cells.
  • a plurality of holes 212 are formed in rows and columns.
  • a numerical value indicating a row and an alphabetic character indicating a column are displayed on the side of the container 20 where the hole 212 is formed.
  • the cells are collected in each tube 208 held by the support member 210.
  • an identification mark 206 such as a barcode is displayed on the side wall of the support member 210, for example.
  • the tube 208 may be, for example, a single tube or a tube in which a plurality of tubes are connected.
  • the tube 208 may be a tube having a cap (not shown).
  • the position can be easily specified.
  • the container 20 only needs to have one well 202 capable of sorting cells.
  • the control unit 120 of the flow cytometer 10 stores an analysis program for analyzing the detection result based on the first information including the fluorescence intensity caused by cell-derived fluorescence and the fluorescence intensity caused by scattered light. Based on the first information derived from the cell, the control unit 120 uses a scattergram (scatter diagram) with the vertical axis or the horizontal axis as one of the fluorescence intensity of the forward scattered light, the fluorescence intensity of the side scattered light, and the fluorescence intensity. Can be created. By creating a scattergram, the total number of detected cells can be separated into a plurality of populations.
  • FIG. 5 is a scattergram with the fluorescence intensity of FITC as the vertical axis and the fluorescence intensity of DRAQ5 as the horizontal axis.
  • the fluorescence intensity of FITC reflects information related to erythrocyte dysfunction
  • the fluorescence intensity of DRAQ5 reflects information related to nuclei. From this first information, it is possible to estimate what cells exist. Further, by gating the region W on the scattergram, another group can be separated from the total number on the graph or the group. In FIG. 5, by designating the region W by gating, the population estimated to contain nucleated red blood cells is separated from other cells.
  • the cells in the region W designated by gating are sorted into the wells 202 of the container 20 as target cells.
  • control unit 120 stores the position of the well 202 in which the cell is accommodated and the first information derived from the cell in association with each other.
  • the position of the well 202 containing the cells is preferably specified by the row and column displayed on the container 20 and the identification mark 206.
  • Imaging a cell means capturing an image of a cell, and includes imaging a foreign substance (such as dust) that is not actually a cell.
  • An example of the image capturing device 30 is a fluorescence microscope including the image capturing device.
  • FIG. 6 is a schematic configuration diagram of the image pickup device 30.
  • the image pickup device 30 can pick up the cells C collected in the container 20.
  • the image capturing device 30 is configured to obtain the cell-derived second information by capturing the cell C.
  • the cell-derived second information includes at least one of fluorescence, cell shape, transmission color, and size. Fluorescence means the emission of a fluorescent label by immunostaining excited by excitation light.
  • the transmitted color means a color generated by light transmitted through a cell.
  • the image pickup device 30 is arranged on the opposite side of the container 20 away from the table 304, the first light source 302 for excitation for measuring the fluorescence of the cell C, the table 304 for placing the container 20 thereon, and the like.
  • a filter group composed of a lens 306, an excitation filter 308, a dichroic mirror 310, and a fluorescence filter 312 and a well 202 side of the container 20 are irradiated with light for measuring transmitted light.
  • a second light source 314 and an imaging device 316 that images the cell C are provided.
  • the cells C sorted in the container 20 are arranged at a position on the side opposite to the opening (surface) of the well 202 of the container 20. That is, the imaging device 316 can image the cell C from the back surface of the container 20. Excitation light from the first light source 302 is applied to the well 202 from the back surface of the container 20, and light from the second light source 314 is applied to the well 202 from the surface of the container 20.
  • the material of the container 20 is transparent, not self-fluorescent, and does not scatter. It is preferable.
  • the image imaging device 30 can preferably acquire an image obtained by imaging fluorescence emission of the cell C and a bright field image obtained by imaging a light transmission image of the cell C.
  • the first light source 302 for example, a high pressure mercury lamp, a high pressure xenon lamp, a light emitting diode, or a laser diode can be used.
  • a tungsten lamp, a halogen lamp, a white light emitting diode, or the like can be used. Even if these light sources are used, the excitation filter 308 can pass only the target wavelength.
  • the immunostained cell C can be irradiated with light having a target excitation wavelength. Note that a light source similar to the first light source 302 can be used as the second light source 314.
  • the light emitted from the first light source 302 is transmitted only by the excitation filter 308 in the target wavelength region.
  • the light transmitted through the excitation filter 308 is reflected by the dichroic mirror 310 toward the container 20.
  • the light reflected by the dichroic mirror 310 passes through the lens 306 and irradiates the cells C collected in the well 202.
  • the light irradiated to the cell C is a wavelength region that excites the immunostained cell C.
  • the immunostained cell C is excited by excitation light and emits fluorescence having a wavelength different from the irradiated excitation wavelength.
  • the fluorescence from the cell C is imaged by the imaging device 316 via the lens 306, the dichroic mirror 310, and the fluorescence filter 312, and an image is acquired.
  • the acquired fluorescence image is input and stored in the control unit 320 as the second information.
  • the dichroic mirror 310 reflects the light of the wavelength of the excitation light toward the container 20 and the wavelength of the fluorescence.
  • Light can be transmitted to the imaging device 316 side.
  • the fluorescent filter 312 can transmit only fluorescence without transmitting excitation light. Therefore, the imaging device 316 can image fluorescence of the cell C. Since only the fluorescence is transmitted through the fluorescent filter 312, the image captured by the imaging device 316 is not affected by the excitation light, and thus an accurate image can be acquired.
  • the image capturing apparatus 30 of the present embodiment includes a table 304 and a driving device (not shown) for moving the container 20 to an arbitrary position (for example, the X direction, the Y direction, and the Z direction).
  • the specific well 202 of the container 20 can be moved to the observation position by the table 304 and the driving device. It is preferable that the driving device can move the table 304 in the X direction, the Y direction, and the Z direction.
  • the control unit 320 when imaging the transmitted light of the cell C with the 2nd light source 314, it images with the filter group removed.
  • a bright field image By imaging the transmitted light with the imaging device 316, a bright field image can be acquired.
  • the acquired bright field image is input to the control unit 320 and stored therein.
  • the imaging device 316 is not particularly limited as long as it can capture the fluorescence or transmitted light of the cells in the well 202 of the container 20, and for example, a CCD (charge-coupled device) camera can be used.
  • a CCD charge-coupled device
  • the image capturing device 30 in which the image capturing device 316, the first light source 302, and the filter group are disposed on the back surface side of the container 20 and the second light source 314 is disposed on the front surface side of the container has been described.
  • the image pickup device 316, the first light source 302, and the filter group are arranged on the front surface side of the container 20 and the second light source 314 is arranged on the rear surface side of the container. it can.
  • the cell-derived second information is acquired based on the cell image captured in the imaging step, and the cell to be analyzed is determined from the cells sorted in the container 20.
  • the cell to be analyzed is determined from the cells sorted in the container 20.
  • dust or cells different from the intended purpose are collected in the well.
  • gene analysis can be performed efficiently and accurately only for the target cells.
  • information on the intensity of fluorescence, the roundness of the cells, the color generated by the light transmitted through the cells, and the size of the cells for the target cells and the non-target cells are acquired.
  • a range representing the probability of being a cell is determined, a threshold value representing the range is determined, and the threshold value can be determined as a target cell to be analyzed.
  • Various information obtained as such can be used as the second information derived from the cell. For example, if the target cell is a nucleated red blood cell or the like, various types of information in the selection method described in International Publication WO2014021309 and International Publication WO2014021311 can be used.
  • FIG. 7 is a plan view of the container after performing the sorting process.
  • cells in the region W gated in the scattergram shown in FIG. 5 are collected.
  • FIG. 8 is a plan view of the container 20 after performing the imaging process.
  • the cells in all the wells 202 of the container 20 are imaged.
  • a part of the captured image is displayed. Specifically, images of A12 well, D12 well, G12 well, H03 well, H08 well, and H12 well are shown.
  • the cell-derived second information based on the image includes fluorescence, cell shape, and size.
  • nucleated red blood cells are contained in the images of the A12 well, the D12 well, and the G12 well.
  • nucleated red blood cells are not observed in the images of the H03 well, H08 well, and H12 well, and only dust or cell debris can be confirmed. From these results, the cells in the A12 well, D12 well, and G12 well can be determined as cells to be analyzed.
  • FIG. 9 is a plan view of the container 20 in which the well 202 containing the cells to be analyzed is colored. As shown in FIG. 9, in the container 20 having 96 wells 202, it can be understood that the cells sorted into 63 wells 202 are determined as cells to be analyzed.
  • the second information acquired in the imaging process with the position of the plurality of wells 202 associated in the sorting process and the first information.
  • the first information and the second information can be read from the position of the well 202 before performing the gene analysis. It can be confirmed from the first information and the second information whether the cell is to be analyzed. Incorrect gene analysis can be prevented.
  • Associating the position of the well 202 with the first information and the second information is, for example, transmitting / receiving related information between the control unit 120 of the flow cytometer 10 and the control unit 320 of the image capturing apparatus 30 via a network or the like. It is possible to do so.
  • determining the cell to be analyzed based on the first information acquired by the flow cytometry method and the second information acquired in the imaging step allows only the target cell to be efficiently and accurately detected. Genetic analysis can be performed.
  • a removal step of taking out only the cells to be analyzed from the container 20 it is preferable to have a removal step of taking out only the cells to be analyzed from the container 20.
  • the time for gene analysis can be shortened by performing gene analysis or pretreatment thereof.
  • “removing only the cells” means that only the cells are removed and the other components such as the culture solution are not taken out, or the target cells are taken out together with the culture solution present around the cells. .
  • the details to be analyzed can be aspirated from the well 202 of the container 20 with a capillary or pipette and moved to a PCR plate or a PCR tube.
  • a gravity trap type well plate for example, a bottom surface of 1 mm ⁇
  • a barcode is attached to the side wall of the PCR plate or PCR tube, and the first information, the second information, and the position information of the PCR plate or PCR tube are associated with each other. It is preferable.
  • the culture solution contains a staining solution added for suppressing a decrease in fluorescence in the imaging step.
  • a staining solution added for suppressing a decrease in fluorescence in the imaging step.
  • 0.1 mass% BSA-PBS solution with DRAQ5 added at 0.1 ⁇ mol / L as a culture solution is put into a container, and the cells are separated and imaged by flow cytometry, and then 36 ⁇ L is extracted. Then, 36 ⁇ L of 0.1 mass% BSA-PBS solution was added and 36 ⁇ L was removed again. Finally, the remaining 4 ⁇ L and the cells contained therein were sucked together with a capillary or pipette and transferred to a PCR tube. It is preferable.
  • the capillary to be used it is preferable to use a glass having a tip diameter of several tens of microns to 100 ⁇ m, and a pipette having an outer diameter of a tip of 100 to 1 mm and mainly organic resin ( It is preferable to use one made of polypropylene or the like.
  • the container 20 is cut into pieces to accommodate the desired details.
  • the container 20 is cut into pieces to accommodate the desired details.
  • the details to be analyzed can be extracted.
  • the excised well 202 can be moved to a plate for PCR.
  • the analysis should be performed by taking out only the tube 208 containing the target details. Only the details can be taken out.
  • the extracted tube 208 can be moved to a PCR plate.
  • the amplification and gene analysis performed on the extracted cells will be described by taking the target cell as an example of nucleated red blood cells.
  • nucleic acids contained in the nucleated red blood cells which are cells taken out from the container 20, or at least the chromosomes of fetal nucleated red blood cells are amplified.
  • genomic DNA eluted from cells is used from the obtained cells through cell lysis using a surfactant, which is a general method, and proteolysis steps using protease K, etc. .
  • PCR Polymerase chain reaction
  • PicoPLEXWGA kit New
  • GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit Sigma-Aldrich
  • MALBAC method MultipleAnaling ali- ple
  • GenomiPhi GE Healthcare, GenomiPhi is a registered trademark
  • REPLI-g Qiagen, REPLI-g is a registered trademark
  • PicoPLEXWGA kit New England Biolabs
  • the presence or absence of amplification of DNA amplification products obtained by the whole genome amplification method can be confirmed by agarose gel electrophoresis or the like. Furthermore, it is preferable to purify the whole genome amplification product using QIAquickPCR Purification Kit (QIAGEN).
  • NanoDrop ThermoFisher Scientific
  • Quantus Flu It is preferable to measure using orometer (Promega), BioAnalyzer (Agilent), and TapeStation (Agilent).
  • DNA microarray method for gene analysis, DNA microarray method, digital PCR method, next-generation sequencer method, and nCounter System (NanoString) can be used, but in this embodiment, analysis accuracy and speed can be processed once. In view of the large number of samples, it is preferable to use a next-generation sequencer.
  • the DNA microarray method means a method of analyzing gene information expressed in cells by arranging DNA fragments of cells on a substrate at high density and hybridizing to DNA sequences on a plate. .
  • the digital PCR method means a method of distributing a target sample to a plurality of wells, individually executing PCR in parallel, and counting the number of positive reactions at the end of amplification.
  • next-generation sequencer means a sequencer classified in comparison with a capillary sequencer (referred to as a first generation sequencer) using the Sanger method.
  • Next generation sequencers include second generation, third generation, fourth generation, and sequencers that will be developed in the future.
  • the most popular next-generation sequencer at present is a sequencer based on the principle of determining a base sequence by capturing fluorescence or light emission linked to complementary strand synthesis by DNA polymerase or complementary strand binding by DNA ligase. Specific examples include MiSeq (Illumina), HiSeq2000 (Illumina, HiSeq is a registered trademark), Roche 454 (Roche).
  • Examples of means for aligning sequence data obtained by the next-generation sequencer include Burrows-Wheeler Aligner (BWA), and it is preferable to map sequence data to a known human genome sequence by BWA.
  • Examples of means for analyzing genes include SAMtools and BEDtools, and it is preferable to analyze gene polymorphisms, gene mutations, and chromosome numbers using these analysis means.
  • the present invention is not limited to this.

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Abstract

目的の細胞のみを効率的に、かつ精度良く遺伝子解析を行うことができる細胞検出方法を提供する。細胞検出方法は、フローサイトメトリー法により試料液から細胞由来の第１情報を取得し、第１情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取する分取工程と、容器に分取された細胞を撮像する撮像工程と、撮像工程により撮像された細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、分取された細胞の中から、解析する細胞を決定する決定工程と、を有する。

Description

細胞検出方法
　本発明は細胞検出方法に関する。
　試料液から目的の細胞を、フローサイトメトリーを使用することにより、分離回収することが知られている。
　例えば、特許文献１には、染色体異常に起因して生じる、細胞の一部が分離した微小な細胞（小核）を、フローサイトメータ（フローサイトメトリー法に用いられる装置）のソーテイング機能を用いて、主核（親核）と小核に分離して回収することが記載されている。
特開２０００－１５７２９８号公報
　フローサイトメトリー法では、細胞から前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光の蛍光強度の情報を取得することにより細胞を選別し、目的の細胞を複数のウェルを有する容器に、１ウェルに１細胞を分取することが行われている。細胞が分取された容器が、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）装置にセットされ、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）が増幅され、遺伝子解析が行われる。
　しかしながら、フローサイトメトリー法では、蛍光強度の情報に基づいて、目的の細胞を選別しているため、染色の非特異性により誤選別される場合がある。また、１ウェルに２個以上の細胞が分取される場合もある。
　上述の問題を含んだ容器に対し、ＤＮＡを増幅し、遺伝子解析した場合、効率的でなく、また、遺伝子解析の精度にも影響を与えることも考えられる。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、目的の細胞のみを効率的に、かつ精度良く遺伝子解析を行うことができる細胞検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様によると、細胞検出方法は、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、第１情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取する分取工程と、容器に分取された細胞を撮像する撮像工程と、撮像工程により撮像された細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、分取された細胞の中から、解析する細胞を決定する決定工程と、を有する。
　好ましくは、分取工程の前に、細胞を染色する工程を、さらに有する。
　好ましくは、容器には、開口を有する複数のウェルが配列されている。
　好ましくは、撮像工程において、遠心分離によりウェルの底面に細胞を移動させることを含む。
　好ましくは、撮像工程において、容器に分取された細胞を容器のウェルの開口と反対の側から細胞を撮像することを含む。
　好ましくは、分取工程において、ウェルの位置と第１情報とを関連付け、かつ決定工程において、関連付けられたウェルの位置と第１情報とに、第２情報を関連付けることを含む。
　好ましくは、第１情報は、前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光の少なくとも一つを含み、第２情報は蛍光、細胞の形状、透過色、及び大きさの少なくとも一つを含む。
　好ましくは、試料液が血球細胞を含む。
　好ましくは、容器は、ウェルが行と列とに配置される。
　好ましくは、決定工程の後に、容器から解析する細胞のみを取り出す取出工程を有する。
　好ましくは、取出工程において、キャピラリー又はピペットを用いて解析する細胞のみを取り出す。
　好ましくは、取出工程において取り出した細胞を、ＰＣＲ用のチューブ又はＰＣＲ用のプレートに移動する。
　好ましくは、第１情報及び第２情報と、ＰＣＲ用のチューブ又はＰＣＲ用のプレートの位置情報とを関連づける。
　好ましくは、容器は、容器内部に培養液を含む。
　好ましくは、培養液は少なくとも１つの染色液を含む。
　好ましくは、撮像工程の後に、培養液を、染色液を含まない培養液に置換する工程を更に含む。
　本発明の細胞検出方法によれば、目的の細胞のみを効率的に、かつ精度良く遺伝子解析を行うことができる。
細胞検出方法の手順を示したフローチャートである。 フローサイトメータの概念図である。 容器の斜視図である。 容器の斜視図である。 ＦＩＴＣの蛍光強度を縦軸、ＤＲＡＱ５の蛍光強度を横軸とするスキャッタグラムである。 画像撮像装置の概略構成図である。 分取工程を実施した後の容器の平面図である。 撮像工程を実施した後の容器の平面図である。 解析すべき細胞の含まれているウェルを色づけした容器の平面図である。
　以下、添付図面にしたがって本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明は以下の好ましい実施形態により説明される。本発明の範囲を逸脱すること無く、多くの手法により変更を行うことができ、実施形態以外の他の実施形態を利用することができる。したがって、本発明の範囲内における全ての変更が特許請求の範囲に含まれる。
　ここで、図中、同一の記号により示される部分は、同様の機能を有する同様の要素である。また、本明細書中で、数値範囲を“　～　”を用いて表す場合は、“　～　”により示される上限、下限の数値も数値範囲に含むものとする。
　＜細胞検出方法＞
　本実施形態の細胞検出方法について、図面を参照して説明する。なお、本実施形態では、試料液に血球細胞が含まれる場合で、目的の細胞が有核赤血球である場合を例示して説明する。
　図１は、本実施形態の細胞検出方法のフローチャートである。図１に示されるように、細胞検出方法は、分取工程（ステップＳ１）、撮像工程（ステップＳ２）、及び決定工程（ステップＳ３）を、少なくとも備える。
　分取工程（ステップＳ１）では、フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、第１情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取する。撮像工程（ステップＳ２）では、容器に分取された細胞を撮像する。決定工程（ステップＳ３）では、撮像工程により撮像された細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、第２情報に基づいて分取された細胞の中から、解析する細胞を決定する。以下、各工程について説明する。
　＜分取工程＞
　分取工程では、フローサイトメトリー法を実現するフローサイトメータ１０が用いられ、試料液の細胞由来の第１情報が取得され、細胞が容器に分取される。
　図２は、フローサイトメータ１０の概念図である。試料液Ｓには、抗原抗体反応による免疫染色された細胞Ｃを含む血球細胞が含まれている。
　抗原抗体反応とは、抗体が相補的な構造を持つ抗原と特異的に結合することをいい、免疫染色とは、細胞に存在する抗原に、蛍光標識を連結した抗体を結合させることを意味する。
　免疫染色には、直接法と間接法とがあり、直接法は、蛍光標識を直接抗体に連結し、抗原と反応させる方法である。一方、間接法は、検出すべき抗原に特異的に結合できる抗体（１次抗体）には蛍光標識を連結せず、その１次抗体に特異的に結合できる抗体（２次抗体）に蛍光標識を連結して検出する方法である。
　フローサイトメータ１０により、細胞由来の第１情報を得るため、上述したように細胞は抗原抗体反応により免疫染色される。例えば、抗ヒトＣＤ抗体として、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ１２７抗体等を例示することができ、蛍光標識として、４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドールジハイドロクロライド（ＤＡＰＩ：4',6-diamidino-2-phenylindole）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：PropidiumIodide）、ピロニンＹ（Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）、フィコエリスリン（ＰＥ：phycoerythrin）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ：allophicocyanin）、テキサスレッド（ＴＲ（登録商標））、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、Ｃｙ３（２‘－Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｃｙ５（Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ）、ＤＲＡＱ５（登録商標）（Ｂｉｏｓｔａｔｕｓ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ
　Ｖｉｏｌｅｔ　５７０、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１等を挙げることができる。
　分取される容器にはあらかじめ、細胞にダメージを与えないように、培養液を容器内部に入れておくことが好ましい。培養液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Phosphate buffered saline）又は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Bovine serum albumin）０．１質量％を添加したＰＢＳが好ましく、更には細胞を染色した抗体が細胞から離れないように培養液にも染色液を添加しておくことが好ましく、特に核を染色する染色液を添加しておくことが好ましく、例えばアントラキノン色素を含む核の染色液であるＤＲＡＱ５を添加しておくことにより、撮像工程における蛍光強度の低下を抑えられる。また培養液の液量は、増幅工程に適した液量であれば特に制限はないが、撮像工程中の蒸発を考慮してあらかじめ多く入れておき、増幅工程前に所定の液量になるように抜き取る態様が好ましい。
　好ましい一態様として、フローサイトメータでの分取工程の前に染色工程により染色が行われる。この場合、試料液は、次のように調製される。まず、目的の細胞を含む分析対象試料を準備する。分析対象試料に、例えば、溶血剤と、免疫染色に用いる蛍光標識された抗体と混合し、インキュベーションすることにより、細胞を免疫染色する。細胞を免疫染色することにより試料液Ｓが調製される。
　試料液Ｓがノズル１０２からフローセル１０４に導入される。シース液Ｌがフローセル１０４に導入される。フローセル１０４内においてシース液Ｌにより試料液Ｓが絞られる。試料液Ｓが絞られるので、細胞Ｃが一列に配列される。
　細胞Ｃに光源１０６から、例えばレーザ光が照射される。レーザ光の照射により細胞Ｃの免疫染色による蛍光標識が励起され、細胞Ｃは免疫染色による蛍光標識により蛍光を発光する。この蛍光強度が検知器１０８により検知される。検知器１０８により検知された、細胞Ｃの蛍光強度が、細胞由来の第１情報として制御部１２０に入力され、記憶される。制御部１２０は、各種の処理を行う演算部、各種プログラム、及びデータ等が格納された記憶部等を備える。
　光源１０６からのレーザ光の照射による細胞Ｃからの散乱光（前方散乱光、側方散乱光等）が検知器１１０により検知される。検知器１１０により検知された細胞Ｃからの散乱光による蛍光強度が、細胞由来の第１情報として制御部１２０に入力され、記憶される。なお、前方散乱光では測定対象の細胞の大きさが、また側方散乱光および蛍光により、測定対象物の細胞の構造などを測定することができる。
　フローセル１０４には超音波が印加された細胞Ｃを含む液滴が形成される。制御部１２０は、上記の検出結果に基づいて、液滴がプラス、又はマイナスに荷電される。制御部１２０は、廃棄する液滴については荷電しない。偏向電極板１１２、１１４を通過する際、荷電された液滴を何れかの偏向電極板１１２、１１４に引き寄せることにより、基本的には、容器２０の１ウェルに１細胞が分取される。
　免疫染色を励起させる光源１０６として、波長の異なる複数のレーザ光源を使用することが好ましい。例えば、４０５ｎｍの波長を持つレーザ光源と、４８８ｎｍの波長を持つレーザ光源と、５６１ｎｍの波長を持つレーザ光源と、６８３ｎｍの波長を持つレーザ光源と、を備えることが好ましい。波長の異なる複数のレーザ光源を使用することにより、細胞由来の第１情報として、複数の蛍光強度を得ることができる。
　また、同時に蛍光強度を検出するためレーザ光源の励起光をカットし、免疫染色による蛍光標識の発光の波長を選択的に透過させる蛍光フィルタを使用することが好ましい。
　次に、細胞が分取される容器について説明する。図３、及び図４は容器２０の斜視図である。
　図３に示されるように、容器２０は、複数の細胞を回収するため、開口と底面とを有する複数のウェル２０２と、複数のウェル２０２と一体構造の側壁２０４と、を有している。複数のウェル２０２は行と列とに配置される。各々のウェル２０２の位置を特定するために、行を示す数値、及び列を示す英字が容器２０のウェル２０２の開口側に表示されている。図３に示される容器２０では、各々のウェル２０２に細胞が回収される。容器２０を特定するため、容器２０の側壁には、例えば、バーコード等の識別標識２０６が表示される。
　図４に示されるように、図３とは別の形態の容器２０は、複数の細胞を回収するための開口と底面とを有する複数のチューブ２０８と、複数のチューブ２０８を保持するための複数の孔２１２を備える支持部材２１０と、を有している。図４に示されているように容器２０では、チューブ２０８がウェルの機能を果たしている。細胞の収納するための開口と底面とを有していれば、ウェルの形状等は限定されない。
　複数の孔２１２は行と列とに形成される。各々の孔２１２の位置を特定するために、行を示す数値、及び列を示す英字が、容器２０の孔２１２の形成される側に表示されている。図４に示される容器２０では、支持部材２１０に保持された各々のチューブ２０８に細胞が回収される。さらに、容器２０を特定するため、支持部材２１０の側壁には、例えば、バーコード等の識別標識２０６が表示される。なお、チューブ２０８は、例えば、１個単位のチューブであっても良いし、複数個が連結されたチューブであっても良い。また、チューブ２０８はキャップ（不図示）を有するチューブであっても良い。
　容器２０の複数のウェル２０２が行と列とに配されているので、位置を容易に特定することができる。
　容器２０として、複数のウェル２０２を有する例を説明したが、これに限定されない。容器２０は、細胞を分取できる１個のウェル２０２を備えていれば良い。
　フローサイトメータ１０の制御部１２０には、細胞由来の蛍光による蛍光強度と、散乱光による蛍光強度と含む第１情報に基づいて、検出結果を解析するための解析プログラムが記憶されている。制御部１２０は、細胞由来の第１情報に基づいて、前方散乱光の蛍光強度、側方散乱光の蛍光強度、及び蛍光強度の何れかを縦軸又は横軸とするスキャッタグラム（散布図）を作成することができる。スキャッタグラムを作成することにより、検知された全数の細胞を複数の集団に分離することができる。
　図５は、ＦＩＴＣの蛍光強度を縦軸、ＤＲＡＱ５の蛍光強度を横軸とするスキャッタグラムである。ＦＩＴＣの蛍光強度は赤血球の幼弱性に関する情報を、また、ＤＲＡＱ５の蛍光強度は核に関する情報を反映している。これらの第１情報から、どのような細胞が存在するか推定することができる。さらに、スキャッタグラム上で、領域Ｗをゲーティングすることにより、グラフ上の全数、又は集団から別の集団を分離することができる。図５においては、ゲーティングにより領域Ｗを指定することにより、有核赤血球が存在すると推定される集団を、他の細胞から分離している。
　ゲーティングにより指定された領域Ｗの細胞が、目的の細胞として、容器２０のウェル２０２に分取される。
　なお、制御部１２０は、細胞が収容されたウェル２０２の位置と、その細胞由来の第１情報とを、関連付けて記憶する。細胞が収容されたウェル２０２の位置は、容器２０に表示された行と列、及び識別標識２０６とにより、好ましくは、特定される。
　＜撮像工程＞
　撮像工程では、容器に分取された細胞を撮像する。細胞を撮像するとは、細胞を対象として撮像する意味であって、実際には細胞ではない異物（ゴミ等）を撮像する場合も含んでいる。撮像工程では、容器２０に分取された細胞を遠心分離装置によりウェルの底面に細胞を移動させることが好ましく、また、撮像するため画像撮像装置３０を用いることが好ましい。画像撮像装置３０として、撮像装置を備える蛍光顕微鏡を挙げることができる。
　図６は画像撮像装置３０の概略構成図である。画像撮像装置３０は、容器２０に回収された細胞Ｃを撮像することができる。画像撮像装置３０は、細胞Ｃを撮像することにより、細胞由来の第２情報を得ることができるよう構成されている。ここで、細胞由来の第２情報には、蛍光、細胞の形状、透過色、及び大きさの少なくとも一つが含まれている。蛍光とは、励起光により励起された免疫染色による蛍光標識の発光を意味する。透過色とは細胞の透過した光によって生ずる色を意味する。
　本実施形態では、撮像工程において、容器２０に分取された細胞を容器２０のウェル２０２の開口と反対の側から細胞を撮像する場合について説明する。
　画像撮像装置３０は、細胞Ｃの蛍光を測定するための励起用の第１光源３０２と、容器２０を載置するためのテーブル３０４と、テーブル３０４から離間して容器２０の反対側に配置されたレンズ３０６と、励起フィルタ３０８、ダイクロイックミラー３１０および蛍光フィルタ３１２とから構成されるフィルタ群と、容器２０のウェル２０２の側に配置され、透過光を測定するための光を容器２０に照射する第２光源３１４と、細胞Ｃを撮像する撮像装置３１６と、を備えている。
　なお、撮像装置３１６は、容器２０に分取された細胞Ｃを容器２０のウェル２０２の開口（表面）と反対の側の位置に配置されている。すなわち、撮像装置３１６は、容器２０の裏面から細胞Ｃを撮像することができる。第１光源３０２からの励起光は、容器２０の裏面からウェル２０２に照射され、第２光源３１４からの光は、容器２０の表面からウェル２０２に照射される。
　容器２０の裏面側から励起光を照射、また、容器２０を通過して細胞からの蛍光、および、透過光を受光するため、容器２０の材料が透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないことが好ましい。
　画像撮像装置３０は、好ましくは、細胞Ｃの蛍光発光を撮像した画像、及び細胞Ｃの光透過画像を撮影した明視野の画像を取得することができる。
　第１光源３０２として、例えば、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、発光ダイオード、または、レーザダイオードを用いることができる。第１光源３０２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色発光ダイオードなどを用いることができる。これらの光源を用いても励起フィルタ３０８により、目的の波長のみ通過させることができる。免疫染色された細胞Ｃに対して、目的の励起波長の光を照射させることができる。なお、第２光源３１４として、第１光源３０２と同様の光源を用いることができる。
　細胞Ｃからの蛍光強度を撮像装置３１６により画像を取得する場合について説明する。第１光源３０２から照射された光は、励起フィルタ３０８により、目的とされる波長領域の光のみ透過される。励起フィルタ３０８を透過した光は、ダイクロイックミラー３１０により、容器２０の方向に反射される。ダイクロイックミラー３１０により反射された光は、レンズ３０６を透過し、ウェル２０２に回収された細胞Ｃに照射される。細胞Ｃに照射される光は、免疫染色された細胞Ｃを励起する波長領域とされている。免疫染色された細胞Ｃは励起光により励起され、照射された励起波長とは異なる波長の蛍光を発する。細胞Ｃからの蛍光は、レンズ３０６、ダイクロイックミラー３１０、及び蛍光フィルタ３１２を経て撮像装置３１６により撮像され、画像が取得される。取得された蛍光の画像は、第２情報として制御部３２０に入力され、記憶される。励起光とその励起光により発する蛍光と比較すると、蛍光の方が励起光より波長が長くなるので、ダイクロイックミラー３１０により、励起光の波長の光を容器２０の側に反射させ、蛍光の波長の光を撮像装置３１６の側に透過させることができる。また、蛍光フィルタ３１２は、励起光を透過させず、蛍光のみを透過させることができる。したがって、撮像装置３１６において、細胞Ｃの蛍光を撮像することができる。蛍光フィルタ３１２により、蛍光のみを透過させることにより、撮像装置３１６で撮像される画像が励起光に影響されることがないので、正確な画像を取得することができる。
　本実施形態の画像撮像装置３０は、容器２０を任意の位置に移動（例えば、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向）させるため、テーブル３０４と駆動装置（不図示）とを備えている。テーブル３０４と駆動装置とにより、容器２０の特定のウェル２０２を、観察位置に移動させることができる。駆動装置は、テーブル３０４を、Ｘ方向、Ｙ方向、及びＺ方向に移動できることが好ましい。
　細胞Ｃが複数の染色種により染色されている場合、異なるフィルタ群（励起フィルタ３０８、ダイクロイックミラー３１０および蛍光フィルタ３１２）に切り替えることにより、異なる蛍光波長の画像を取得することができる。
　なお、第２光源３１４により、細胞Ｃの透過光を撮像する場合、フィルタ群を取り外した状態で撮像する。透過光を撮像装置３１６で撮像することにより、明視野の画像を取得することができる。取得された明視野の画像は制御部３２０に入力され、記憶される。
　撮像装置３１６としては、容器２０のウェル２０２内の細胞の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
　本実施形態では、撮像装置３１６と第１光源３０２とフィルタ群とが容器２０の裏面側に配置され、第２光源３１４が容器の表面側に配置されている画像撮像装置３０について説明した。これに限定されず、撮像装置３１６と第１光源３０２とフィルタ群とが容器２０の表面側に配置され、第２光源３１４が容器の裏面側に配置される画像撮像装置３０を使用することもできる。
　＜決定工程＞
　決定工程にいて、撮像工程により撮像された細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、容器２０に分取された細胞の中から、解析する細胞を決定する。上述したように、フローサイトメトリーでは、得られた光学的な情報に基づいて細胞を分取するため、ウェルにゴミ、又は目的とは異なる細胞が回収される場合がある。細胞由来の第２情報を取得し、解析する細胞を決定することにより、ゴミ、又は目的とは異なる細胞を取り除くことができる。結果として、目的の細胞のみを効率的に、かつ精度良く遺伝子解析を行うことができる。予め、目的となる細胞と目的でない細胞について蛍光の強度、細胞の丸さ、細胞を透過した光によって生ずる色、細胞の大きさ、の情報を取得しておき、これらの取得情報から、目的の細胞である確からしさを表す範囲を決定し、その範囲を表す閾値を決定し、その閾値を、目的の解析する細胞として決定することができる。そのように取得し各種情報を細胞由来の第２情報として用いることができる。例えば、目的細胞が有核赤血球等であれば国際公開ＷＯ２０１６０２１３０９号公報や国際公開ＷＯ２０１６０２１３１１号公報に記載の選別方法における各種情報を用いることができる。
　図７は分取工程を実施した後の容器の平面図である。この容器２０のウェル２０２には、図５で示されるスキャッタグラムにおいて、ゲーティングされた領域Ｗの細胞が分取されている。
　図８は撮像工程を実施した後の容器２０の平面図である。撮像工程では容器２０の全てのウェル２０２の細胞を撮像する。図８においては、撮像された画像の一部を表示している。具体的には、Ａ１２のウェル、Ｄ１２のウェル、Ｇ１２のウェル、Ｈ０３のウェル、Ｈ０８のウェル、及びＨ１２のウェルの画像が示されている。画像に基づく細胞由来の第２情報として、蛍光、細胞の形状、及び大きさが含まれている。
　図８に示されるように、Ａ１２のウェル、Ｄ１２のウェル、及びＧ１２のウェルの画像には有核赤血球が含まれていることが確認できる。一方、Ｈ０３のウェル、Ｈ０８のウェル、及びＨ１２のウェルの画像には有核赤血球が認められず、ゴミ又は細胞の破片のみが確認できる。この結果から、Ａ１２のウェル、Ｄ１２のウェル、及びＧ１２のウェルの細胞を解析すべき細胞と決定することができる。
　実際においては、細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、全てのウェルについて確認する。図９は、解析すべき細胞の含まれているウェル２０２を色づけした容器２０の平面図である。図９に示されるように、９６個のウェル２０２を有する容器２０の中で、６３個のウェル２０２に分取されている細胞が、解析すべき細胞と決定されたことが理解できる。
　解析すべき細胞と決定する際、分取工程において関連付けられた複数のウェル２０２の位置と第１情報とに、撮像工程において取得された第２情報を関連付けることが好ましい。ウェル２０２の位置と第１情報、及び第２情報を関連付けることにより、例えば、遺伝子解析を行う前にウェル２０２の位置から第１情報、及び第２情報を読み出すことができる。第１情報、及び第２情報から解析すべき細胞か否か確認できる。誤って遺伝子解析することを防ぐことができる。
　ウェル２０２の位置と第１情報、及び第２情報との関連付けは、例えば、フローサイトメータ１０の制御部１２０と画像撮像装置３０の制御部３２０とをネットワーク等を介して、関連情報を送受信等することにより行うことが可能である。
　上述したように、フローサイトメトリー法により取得し第１情報と、撮像工程において取得した第２情報とにより、解析すべき細胞と決定することが、目的の細胞のみを効率的に、かつ精度良く遺伝子解析を行うことができる。
　＜取出工程＞
　決定工程の後に、容器２０から解析する細胞のみを取り出す取出工程を有することが好ましい。解析を行う細胞のみ取り出しすることにより、遺伝子解析または、その前処理を行うことにより、遺伝子解析の時間を短縮することができる。ここで、「細胞のみ取り出しする」とは、細胞だけを取り出して培養液等の他の成分を取り出さないか、又は、細胞の周囲に存在する培養液と共に目的の細胞を取り出しする場合を意味する。
　容器２０から解析する細胞のみを取り出す方法として、いくつかの方法を挙げることができる。
　第１の方法として、解析すべき細部を容器２０のウェル２０２からキャピラリー又はピペットにより吸引し、ＰＣＲ用のプレート又はＰＣＲ用のチューブに移動することができる。具体的には、容器としてＩｎｓｐｈｅｒｏ社製のグラビティートラップ型のウェルプレート(例えば、底面１ｍｍφ)を使用することができる。また、ＰＣＲ用のプレート又は、ＰＣＲ用のチューブの側壁にはバーコードが付与されていて、第１情報と第２情報とＰＣＲ用のプレート又はＰＣＲ用のチューブの位置情報とが関連付けられていることが好ましい。
　また培養液には、撮像工程における蛍光低下抑制のために添加した染色液が含まれていることが好ましい。ただしその場合、増幅工程での遺伝子増幅阻害の副作用があるため、撮像後に染色液を含まない培養液に置換することが好ましい。
　好ましい一態様としては、容器に培養液としてＤＲＡＱ５を０．１μｍｏｌ／Ｌ添加した０．１質量％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液４０μＬを入れて、フローサイトメトリーにより細胞を分取、撮像したのち、３６μＬを抜き取り、０．１質量％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液を３６μＬ入れて再び３６μＬ抜くことを２回繰り返したのち、最後に残りの４μＬとそこに含まれる細胞を一緒にキャピラリー又はピペットにより吸い取り、ＰＣＲチューブへ移動させることが好ましい。ここで、使用するキャピラリーとしては、先端径が数十ミクロンから１００μｍ程度で、ガラス製のものを使用することが好ましく、ピペットとしては、先端外径が百ミクロン以上１ｍｍ以下で主に有機樹脂(ポリプロピレンなど)からなるものを使用することが好ましい。
　第２の方法として、図３に示されるように、複数のウェル２０２と側壁２０４とが一体構造である容器２０の場合、例えば、容器２０を切断して個片化し、目的の細部を収容したウェル２０２のみを切り出すことにより、解析すべき細部のみを取り出すことができる。切断を容易にするため、容器２０の表面に切り取り線等を設けることが好ましい。切り出されたウェル２０２を、ＰＣＲ用のプレートに移動することができる。
　第３の方法として、図４に示されるように、複数のチューブ２０８と支持部材２１０とから構成される容器２０である場合、目的の細部を収容したチューブ２０８のみを取り出すことにより、解析すべき細部のみを取り出すことができる。取り出されたチューブ２０８をＰＣＲ用のプレートに移動することができる。容器２０から解析する細胞のみを取り出す方法を例示したが、その方法は限定されない。
　次に、取出された細胞について実施される、増幅と遺伝子解析について、目的の細胞が有核赤血球を例に説明する。
　増幅工程では、容器２０から取り出された細胞である有核赤血球、又は、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する。
　全ゲノム増幅法においては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、及びプロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることにより、細胞から溶出したゲノムＤＮＡを用いる。
　全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づく試薬ＰｉｃｏＰＬＥＸＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ 
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ　Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号に開示されている、ＭＡＬＢＡＣ法（ＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｏｐｉｎｇ－ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅｓ）に係る試薬を用いることができる。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬として、例えば、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケア社、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉは登録商標）、ＲＥＰＬＩ－ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＲＥＰＬＩ－ｇは登録商標）も同様に用いることができる。本実施形態では、ＰｉｃｏＰＬＥＸＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いることが好ましい。
　全ゲノム増幅法により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動等により増幅有無を確認することが可能である。更に、全ゲノム増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製することが好ましい。
　また、全ゲノム増幅法により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｑｕａｎｔｕｓ　Ｆｌｕ
ｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて測定することが好ましい。
　遺伝子解析として、ＤＮＡマイクロアレイ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シークエンサー法、ｎＣｏｕｎｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社）を用いることが可能であるが、本実施形態においては、解析の精度および速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で次世代シークエンサーを用いることが好ましい。
　ＤＮＡマイクロアレイ法は、基板上に細胞のＤＮＡ断片を高密度に配置し、板上のＤＮＡ配列に対して、ハイブリダイゼーションすることによって、細胞内において発現している遺伝子情報を分析する方法を意味する。
　デジタルＰＣＲ法とは、対象のサンプルを複数のウェルに分配し、個別にＰＣＲを並行して実行し、増幅の終了時に陽性反応の数をカウントする方法を意味する。
　本実施形態において次世代シークエンサーとは、サンガー法を利用したキャピラリーシークエンサー（第一世代シークエンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシークエンサーを意味する。次世代シークエンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、および今後開発されるシークエンサーを含む。現時点において最も普及している次世代シークエンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシークエンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられる。
　増幅工程において得られたＤＮＡの増幅産物を次世代シークエンサーで解析する場合、全ゲノムシーケンス、エキソームシーケンス、アンプリコンシーケンスを用いることが可能である。
　次世代シークエンサーにより得られた配列データをアライメントする手段としては、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓおよびＢＥＤｔｏｏｌｓが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、および染色体数を解析することが好ましい。
　本実施形態では、細胞が血球細胞である場合を例示したが、これに限定されない。
１０　フローサイトメータ
２０　容器
３０　画像撮像装置
１０２　ノズル
１０４　フローセル
１０６　光源
１０８　検知器
１１０　検知器
１１２　偏向電極板
１１４　偏向電極板
１２０　制御部
２０２　ウェル
２０４　側壁
２０６　識別標識
２０８　チューブ
２１０　支持部材
２１２　孔
３０２　第１光源
３０４　テーブル
３０６　レンズ
３０８　励起フィルタ
３１０　ダイクロイックミラー
３１２　蛍光フィルタ
３１４　第２光源
３１６　撮像装置
３２０　制御部
Ｃ　細胞
Ｌ　シース液
Ｓ　試料液
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３　ステップ
Ｗ　領域

Claims (16)

  1. 　フローサイトメトリー法により試料液の細胞由来の第１情報を取得し、前記第１情報に基づいて、目的の細胞を、開口を有するウェルが配列された容器に分取する分取工程と、
    　前記容器に分取された細胞を撮像する撮像工程と、
    　前記撮像工程により撮像された細胞の画像に基づいて、細胞由来の第２情報を取得し、前記分取された細胞の中から、解析する細胞を決定する決定工程と、
    　を有する細胞検出方法。
  2. 　前記分取工程の前に、前記細胞を染色する工程をさらに有する請求項１に記載の細胞検出方法。
  3. 　前記容器には、開口を有する複数のウェルが配列されている請求項１又は２に記載の細胞検出方法。
  4. 　前記撮像工程において、遠心分離により前記ウェルの底面に前記細胞を移動させることを含む請求項１から３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  5. 　前記撮像工程において、前記容器に分取された細胞を前記容器のウェルの開口と反対の側から前記細胞を撮像することを含む請求項１から４の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  6. 　前記分取工程において、前記ウェルの位置と前記第１情報とを関連付け、かつ前記決定工程において、関連付けられた前記ウェルの位置と前記第１情報とに、前記第２情報を関連付けることを含む請求項１から５の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  7. 　前記第１情報は、前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光の少なくとも一つを含み、前記第２情報は蛍光、細胞の形状、透過色、及び大きさの少なくとも一つを含む請求項１から６の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  8. 　前記試料液が血球細胞を含む請求項１から７の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  9. 　前記容器は、前記ウェルが行と列とに配置される請求項１から８の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  10. 　前記決定工程の後に、前記容器から前記解析する細胞のみを取り出す取出工程を有する請求項１から９の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  11. 　前記取出工程において、キャピラリー又はピペットを用いて前記解析する細胞のみを取り出す請求項１０に記載の細胞検出方法。
  12. 　前記取出工程で取り出した前記細胞を、ＰＣＲ用のチューブ又はＰＣＲ用のプレートに移動する請求項１０又は１１に記載の細胞検出方法。
  13. 　前記第１情報及び前記第２情報と、前記ＰＣＲ用のチューブ又は前記ＰＣＲ用のプレートの位置情報とを関連づける請求項１２に記載の細胞検出方法。
  14. 　前記容器は、容器内部に培養液を含む請求項１から１３の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  15. 　前記培養液は少なくとも１つの染色液を含む請求項１４に記載の細胞検出方法。
  16. 　前記撮像工程の後に、前記培養液を、染色液を含まない培養液に置換する工程を更に含む請求項１５に記載の細胞検出方法。
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