CN115144324A - 从乳液中回收产物的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从乳液中回收产物的方法和系统。所述方法包括以下步骤：提供乳液(6),所述乳液(6)包括容纳于载流体(10)中多个液滴(4)，每个液滴包括内部流体(8)；测量所述乳液(6)的多个液滴(4)的至少一个物理参数；根据在测量步骤期间获得的测量结果，将所述乳液的至少部分液滴(4)分类为一个类别；根据所述液滴(4)的类别对至少一部分已分类的液滴进行标记；和利用所述液滴或部分液滴(4)的标记选择性地回收所述液滴(4)或部分液滴(4)，其中，对于多个液滴的每一个液滴，所述测量步骤包括测量同一液滴的若干不同参数。

Description

从乳液中回收产物的方法和系统
本申请是发明名称为“从乳液中回收产物的方法和系统”、申请日为2017年4月14日的PCT国际申请No.：PCT/EP2017/059070进入中国国家阶段的发明专利申请No.：201780027120.2的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种选择和回收产物的方法。这种方法旨在例如用于回收包含于一些乳液的液滴中的特定产物。例如，所述产物可能是由液滴中发生的化学反应或生物反应生成的。
背景技术
已知在分选由液流或气流驱动的分离的颗粒，特别是细胞之前，使用流式细胞仪系统来表征它们。然而，这样的系统需要对颗粒流进行分选，并且在回收之前仅能进行简单的测量。这些系统尤其用于对具有膜或细胞内标记物的细胞进行分选。然而，它们不能根据细胞分泌的分子对细胞进行分选。此外，这些系统不能进行多次连续测量。因此，这些系统不适合通过监测动力学反应来表征产物。因此，不可能使用这样的系统基于多个参数来选择颗粒或液滴，如同在基于复杂表型选择细胞的情况下一样。
文献WO 2010/007307 A2描述了一种用于在腔室中解读乳液的方法，这使得可以获得关于液滴内容物的丰富信息。在测量之后，通过使用吸移特定液滴的微量移液管取出，可以单独回收具有特定特征的特定液滴。
然而，由于特定的液滴分散在乳液的不同位置，因此回收是费力的且难以进行自动化。此外，使用微量移液管对乳液中的一个液滴进行吸取需要拿掉含有乳液的腔室的上盖。这一步骤带来蒸发和液滴污染的风险，这可能导致待回收产物的劣化。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种比现有方法更可靠和更快速的用于选择和回收产物的方法，从而允许对液滴的感兴趣的内容物进行精确的表征以及有效回收液滴的感兴趣的内容物。
为此目的，本发明涉及一种用于选择和回收产物的方法，该方法包括以下步骤：
提供乳液，所述乳液包括容纳于载流体中的多个液滴，每个液滴包括内部流体；
测量乳液的若干液滴的至少一个物理参数；
根据在测量步骤期间获得的测量结果，将所述乳液的至少一些液滴分类为一个类别；
根据所述液滴的类别对至少一些已分类的液滴进行标记；和
利用液滴或部分液滴的所述标记选择性地回收所述液滴或部分液滴。
根据本发明的方法可以包括以下特征中的一个或多个，这些特征单独使用或根据技术上任意可能的组合来使用：
在所述分类步骤期间同时对多个液滴进行分类，并且所述回收步骤包括在对每个已分类液滴进行标记之后，对所述液滴进行分选；
所述测量步骤包括在相同液滴的不同连续时刻重复测量至少一个参数，优选地，在每个液滴内的动力学反应监测；
对于多个液滴的每一滴，所述测量步骤包括对同一液滴的若干不同的参数进行测量。
每个液滴的所述内部流体包括信号试剂，所述标记步骤包括根据所述液滴的分类，对所述信号试剂光学活化的步骤；
在所述分类步骤期间将多个液滴分成多个类别，所述标记步骤包括在预设照射条件下照射一个类别的每一个液滴，所述信号试剂在活化后能够发出光信号，有利地是荧光，根据在所述回收步骤期间发出的光信号水平对所述液滴进行分选，所述信号试剂发出的光信号的水平取决于活化期间的照射条件；
每个液滴的所述内部流体包括信号试剂，所述标记步骤包括根据所述液滴的分类，对所述信号试剂进行热活化的步骤；
所述乳液在二维腔室中提供，在所述测量步骤和所述标记步骤期间，所述乳液以单层液滴的形式保持在所述二维腔室中；
已分类的液滴包括细胞，所述标记步骤包括对所述细胞进行标记，所述选择性回收步骤包括破乳，然后通过细胞计数进行分选；和
所述乳液的每个液滴包括能够与所述液滴特有的成分反应的测试试剂。
本发明还涉及一种用于选择和回收产物的系统，该系统包括：
能够接收乳液的支撑体，所述乳液包括容纳于载流体中的多个液滴，每个液滴包括内部流体，
装置，用于测量所述支撑体中接收的所述乳液中若干液滴的至少一个物理参数，
分类单元，能够根据所述测量步骤中获得的测量结果确定所述乳液的至少一个液滴的分类，
标记设备，能够根据所述液滴的分类决定对液滴或部分液滴进行标记，和
根据所述标记的、所述液滴或部分液滴回收装置。
附图说明
通过阅读下面的描述，仅通过示例的方式并参考附图，将更好地理解本发明，其中，
图1是用于选择和回收产物的系统的示意图，
图2是注入液滴回收系统之前乳液的示意图，
图3～图4示出了用于选择和回收产物的系统的第一示例应用，
图5示出了用于选择和回收产物的系统的第二示例应用，
图6示出了用于选择和回收产物的系统的第三示例应用，
图7示出了用于选择和回收产物的系统的第四示例应用，
图8～图9示出了用于选择和回收产物的系统的第五示例应用，
图10～图11示出了用于选择和回收产物的系统的第六示例应用，
图12示出了用于选择和回收产物的系统的第七示例应用。
具体实施方式
在以下描述中，术语“上游”和“下游”与术语“入口”和“出口”用于指系统流体的正常循环方向。术语“纵向”是指相对于芯片中循环导管的方向所限定的方向。“横向平面”是指垂直于纵向的平面。“直径”是指在横向平面中所考虑的要素的最大横向扩展。
在本说明书的其余部分中，术语“细胞”是指真核细胞或原核细胞。例如，细胞是细菌、酵母、藻类、真菌、哺乳动物细胞等。
用于选择和回收产物的系统1如图1所示。参考图2，提供了用于回收液滴的系统1以分析乳液6的液滴4，并选择性地回收包含于一些液滴4中的产物。
液滴4的乳液6如图2所示。乳液6由分散在载流体10中的内部流体8的多个液滴4组成。每个液滴4构成填充有内部流体8的封闭隔室，在封闭隔室中，可以例如发生化学或生物反应，这可以揭示产物的形成或变化。
乳液6基本上是稳定的，这意味着对于固定体积的乳液6，当固定体积的乳液6在-80℃和80℃之间、1巴条件下保持48小时时，液滴4的数量和体积变化小于5％。乳液6是浓缩的。这意味着乳液6的液滴4的体积分数在5％和99.9％之间，有利地在50％和80％之间，特别是等于74％。优选地，乳液6的液滴4基本上是单分散的，这意味着其多分散性小于5％。液滴4例如具有1pL～2μL的体积。有利地，液滴4的体积介于20μL和50μL之间，特别是应用在细胞分析中。
因此，液滴的直径通常在32微米至46微米之间。
乳液6的至少一些液滴4与乳液6的其他液滴4不同。因此，每个液滴4包括一个与另一个液滴4不同的内部流体8。有利地，所有液滴4的内部流体8包括至少一种相同的共同基质12。
每个液滴4的内部流体8由液滴4的特定成分14和共同基质12构成。特定成分14和共同基质12的比例和/或特定成分14的性质在一个与另一个液滴4之间是不同的。
例如，共同基质12包括适合细胞存活的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水溶液或培养基。有利地，液滴4的高于10％的体积由共同基质12构成。
有利地，每个液滴4的共同基质12包括信号试剂16。在每个液滴4中，信号试剂16存在的比例相同。信号试剂16能够由标记装置28活化，这将在后面描述。
例如，信号试剂16仅在其被活化后才能发射荧光信号。有利地，信号试剂16发射的荧光信号的光强取决于活化条件。
例如，信号试剂16包括由ThermoFisher销售的CMNB-笼化荧光素(5-羧甲氧基-2-硝基苄基)，其名称为“荧光素双-(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)醚，二钾盐(CMNB-)笼化荧光素)”。该化合物是无色的，在光解之前是非荧光的。形成笼状物的基团能够在355nm的紫外(UV)闪光下裂解以释放荧光素。荧光素是一种高度荧光的分子，可用于标记。
液滴4的特定成分14例如是能够彼此反应的化学试剂或生物试剂，或者是反应产物。例如，液滴4的特定成分14是细胞和由细胞分泌的成分，例如蛋白质。
例如，一些液滴4的特定成分14是具有已知激发波长和发射波长的荧光产物，但其比例是未知的。
在第一个示例中，如图3和图4所示，相同的荧光特定性成分14(磺酰罗丹明)的浓度因液滴4的不同而不同，这将在下文描述。
每个液滴4的内部流体8与载流体10不混溶。“不混溶”意味着两种流体之间的分配系数小于10-3。液滴4在乳液6中是轮廓分明的，并且乳液6中的两个相邻液滴4之间的交换限于可溶于或微溶于载流体10中的化合物，即在分布系数大于或等于10-3的情况下和在相邻液滴4之间组成不同的情况下。例如，内部流体8是水相，载流体10是有机相，具体地是油相。载流体10例如包括氢氟醚如FC-40或HFE-7500，以形成氟化油。
载流体10还有利地包含表面活性剂。表面活性剂能够稳定乳液6。表面活性剂例如是聚乙二醇和全氟聚醚(PEG-PFPE)的嵌段共聚物，Ran Biotechnolgies获得的Krytox-Di-PEG或BioRad获得的具有表面活性剂的QX200 TM Droplet Generation Oil。例如，载流体10中的表面活性剂浓度为2％～5％。
如图1所示，系统1包括支撑体20，支撑体20限定用于接收乳液6的腔室22。系统1还包括装置24、分类单元26、标记装置28和回收装置30，其中所述装置24用于测量接收于支撑体20中的乳液6的若干液滴4的至少一个物理参数。
乳液6例如通过制备装置制备。它在通过用于注射乳液的注射模块32置入系统1的腔室之前储存。例如，注射模块32包括注射泵、压电装置或基于压力的流量控制器。
例如，支撑体20是芯片。在该示例中，芯片20是矩形块，其沿纵向轴线X和垂直于纵向轴线X的横向轴线Y延伸。此外，芯片在垂直于纵向轴线X和横向轴线Y的竖轴Z的方向上具有厚度。芯片20包括入口导管34、腔室22和出口导管36。入口导管34能够被放置以与用于注射乳液的注射模块32在上游流体连通。出口导管36能够与回收装置30在下游流体连通，如图1所示。
腔室22用于在测量步骤和标记步骤期间储存在载流体10中的多个液滴4。腔室22有利地具有适合于待研究的乳液6的尺寸，以使液滴4在装载乳液6的步骤之后分布在腔室中。液滴4有利地沿着包括纵向轴线X和横向轴线Y的芯片平面分布在二维层中。没有液滴4叠加在另一个液滴4上。
例如，液滴4在腔室22中是球形的，腔室22沿轴线Z的高度基本上等于液滴4的直径。或者，腔室22的高度小于乳液6的液滴4的直径，并且液滴4在腔室22中沿轴线Z呈扁平圆盘的形状。
腔室22具有测量区域38。测量区域38能够同时包含1,000滴至10,000,000滴乳液，特别是包含105滴乳液。此外，测量区域38的尺寸适合于能够被测量装置24和标记装置28完全扫过。
芯片20至少在测量区域38中是透明的，以允许通过测量装置24测量存在于测量区域38中的液滴4的物理参数。
有利地，芯片20由透明材料制成，例如玻璃或透明塑料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)等。有利地，芯片20的材料对于载流体10是不可渗透的。
测量装置24能够连续地或同时地测量接收在支撑体20中的乳液6的几个液滴4的至少一个物理参数。有利地，它能够测量存在于测量区域38中的所有液滴4的参数。
测量装置24尤其允许对液滴4进行光学测量。
例如，测量装置24包括能够检测来自测量区域38中的液滴4的光的传感器40和光源42。
例如，传感器40是能够生成测量区域38的图像的CCD相机。例如，所获得的图像分辨率使得可以使用形态学标准来识别液滴4中存在的细胞类型。
光源例如能够选择性地照射一个液滴4而不照射相邻的液滴4。
或者，或进一步地，光源42能够完全照亮测量区域38。
例如，光源42是布置成照射测量区域38的液滴4的白光源。或者，或进一步地，光源42包括布置成在测量区域38上发出辐射的激发激光器或荧光灯。
有利地，测量装置24的传感器40和光源42允许在每个液滴的尺度上对若干个荧光通道进行测量。例如，以下组合用于测量装置24：GFP滤光器组件(激发465nm～495nm，二向色505nm，发射515nm～555nm)、TRITC滤光器(激发530nm～560nm，二向色570nm，发射590nm～650nm)和Cy5滤光片(激发600nm～650nm，二向色665nm，发射670nm～725nm)。每个荧光通道可用于测量不同的特征。
测量装置24例如是文献WO 2010/007307A2中描述的二维扫描装置。
此外，测量装置24能够将获得的测量结果传送至分类单元26。
分类单元26能够接收来自测量装置24的信号并处理它们并记录液滴4的特性。例如，分类单元26包括存储器和微处理器。分类单元26能够根据测量步骤中获得的测量结果确定乳液6中至少一个液滴4的分类。
分类标准例如记录在存储器中。或者，或进一步地存储器能够记录测量装置24在不同时刻的连续测量结果，例如，用于在几个液滴4内的动力学反应监测。微处理器能够根据测量结果进行计算，并将计算结果与分类标准的参数进行比较。
有利地，分类单元26包括人机界面，以便用户能够重新找回在测量步骤期间获得的结果，并根据他们的意愿或在测量步骤期间获得的结果来调整分类标准。
根据决定的液滴4的分类，标记设备28能够对液滴4或部分液滴4进行标记。
例如，标记装置28包括激光器，该激光器能够以预设参数特定地照射液滴4，以活化信号试剂16。
在一个示例中，两个独立的光源用于标记装置28和用于测量装置24。
在一个替代方案中，相同的光源42既用于测量装置24又用于标记装置28。例如，在测量步骤期间，光源42照亮整个测量区域38以具有显著的读取流量。然而，在标记步骤期间，光源42选择性地照射液滴4，以免标记两个相邻的液滴4。
或者，标记装置28包括能够以预设参数特定地加热液滴4的源以活化信号试剂16。
或者，标记装置28包括电极电路，该电极电路能够在一个液滴中特定地产生具有预设参数的电场，以通过加热活化信号试剂16，或者对细胞或溶酶体进行选择性裂解。
注射模块32例如能够使乳液6通过腔室20的出口导管离开，从而乳液6注入回收装置30中。
回收装置30能够根据标记允许回收液滴4或部分液滴4。例如，回收装置30允许回收整个液滴4。或者，回收装置30允许回收液滴4的细胞。例如，回收装置30包括流式细胞仪或分选装置。所使用的一种分选装置例如是在2013年出版于Nature Protocols vol 8,870-891的文章“Single-cell analysis and sorting using droplet-basedmicroveidics”中描述的分选装置。
有利地，回收装置30能够测量对应于活化的信号试剂16的细胞并根据所述信号进行分选。
现将描述用于选择和回收产物的第一种方法。提供此前描述的选择和回收系统1用于实施所述方法。
用于注入乳液6的模块32提供有如前所述的乳液6。使用用于注射乳液6的注射装置将液滴4的乳液6注入腔室22中。或者，系统1直接在腔室22中提供乳液6。
有利地，在腔室22中，液滴4根据紧凑的排列方式排列，特别是至少在测量区域38中沿着相对于Z轴的横向平面以交错行的形式排列。
在测量步骤期间，测量存在于测量区域38中乳液6的若干个液滴4的物理参数。
所述测量步骤在所述液滴4无循环的条件下在腔室22中进行。每个液滴的空间位置6与这些参数同时记录在分类装置26的存储器中。
在测量步骤期间，对于给定的激发波长和给定的发射波长，由测量装置24测量液滴4的荧光信号。
例如，所述波长对应于所需产物的波长。
在测量步骤之后，分类装置26根据所获得的测量结果确定液滴4的分类。
例如，在该分类步骤期间，分析结果并将其相互比较，并与分类标准进行比较。分类装置26确定至少一个液滴4属于哪一类别。
在分类期间，例如，在所需产物的荧光通道中具有高于某一阈值的光强的所有液滴4被归到同一类别。阈值例如由相对于乳液6的所有液滴4的平均光强来确定。
有利地，分类是自动化的。或者，由操作员使用人机界面来完成分类。
接下来，根据液滴4的类别使用标记设备28对它们进行标记。
有利地，液滴4在腔室22中保持不动，持续时间为测量步骤和标记步骤所需的时间。
标记例如包括照射液滴4以光学方式活化信号试剂16的步骤。照射例如通过标记装置28的激光完成。
在标记步骤之后，进行回收步骤。回收步骤包括将液滴4或其内容物转移至回收装置30中的步骤。例如，使用注射模块32将乳液6注射至回收装置中。
在标记之后，已经分类，然后标记的液滴4可以根据它们的标记与其他液滴区分开。因此，即使液滴4的空间分布被改变，例如在它们被收集或转移至回收装置30期间，也可以确定它们的类别。
在转移之后，有利地，测量步骤通过回收装置30进行，并且将具有来自信号试剂16的高于检测阈值信号的所有液滴4收集在同一根管中。来自已活化的信号试剂16的信号使得可以在回收步骤期间特定地回收这些液滴4。根据液滴4的标记对它们进行分选。
因此，这种的系统使得可以将乳液6分离成至少两个液滴群并且允许特定地回收一个液滴4的群。
在测量和标记步骤期间将液滴4保持在测量区域38中使得可以获得已标记的液滴4的精细和精确的表征。此外，测量步骤可以比流式细胞仪系统更久。例如，可以进行重复测量。因此，在进行分类步骤之前，每个液滴4的若干个测量结果可以集成在一起。这避免了根据可能被干扰的单个测量结果来选择液滴4。因此，已分类的液滴4在其回收之前被更好地表征。
此外，根据标记信号而不是根据测量信号进行回收。通过在标记之前精确地调整分类标准，可以有效地分离具有接近其他液滴4的测量特征的一个类别的液滴4。
现将根据图3和图4描述实施第一方法中的第一示例。在该示例中，乳液6由三种乳液形成，所述乳液包括含有不同浓度的磺酰罗丹明的液滴。每种乳液的每个液滴4还包含相同比例的信号试剂16，信号试剂16是CMNB笼化的荧光素。
用于标记的信号试剂16的浓度例如在1nM～100μM之间，并且有利地等于2μM。
在测量步骤期间，对于测量区域38的若干个液滴4，记录对应于磺酰罗丹明的荧光信号。图3示出了在对应于磺酰罗丹明的荧光通道中观察到的测量区域38的部分区域。在该图中，可以区分三种类型的液滴4，其分别是具有低光强荧光信号的液滴60、中等光强荧光信号的液滴62或高光强荧光信号的液滴64。在该示例中，每种类型的液滴60、液滴62、液滴64来自具有不同磺酰罗丹明浓度的乳液。液滴4中具有最高光强的液滴64包括最高浓度的磺酰罗丹明。
在分类期间，计算乳液的所有液滴4的中间光强值。光强阈值被计算为例如是该中间值的1.5倍。在所需产物的荧光通道中具有高于该阈值的光强的所有液滴4被归到第一类别。归到第一类别中的这些液滴4对应于图3中具有高光强的液滴64。
在标记步骤期间，通过UV闪光(355nm，持续时间为5秒)选择性地照射属于第一类别的液滴64。通过这些闪光，CMNB笼裂开并释放荧光素。由此这些液滴4的信号试剂16被活化。
图4示出了在标记步骤之后，在对应于荧光素的荧光通道中观察到与图3中测量区域38相同部分的区域。在标记步骤期间，只有具有高光强的液滴64标记在图3中。因此，它们在荧光素通道中具有显著的强度。对比度是显著的，因为未分类的其他液滴60、液滴62未被UV闪光照射，它们的信号试剂16未被活化，因此它们在荧光素的荧光通道中不发出荧光。该图显示了已分类的液滴64已被标记，但其他的液滴未被标记。
在回收步骤期间，根据在对应于荧光素的通道中液滴4的荧光信号，由回收装置30对液滴4进行分选。因此，根据具有高对比度的标记信号，具有高的磺酰罗丹明浓度的液滴64与乳液6的其他液滴60、液滴62分离。因此它们可以被快速有效地回收。
现在将描述用于选择和回收产物的第二种方法。该方法与第一种方法的不同之处在于，在分类步骤期间，在分类步骤期间将多个液滴4分类至多个类别。
在标记步骤期间，用预设的照射条件照射一个类别的每个液滴4，由信号试剂16发出的荧光信号的水平取决于活化期间的照射条件。接下来，在回收步骤期间，根据液滴4的荧光水平对液滴4进行分类。
在第二个示例中，实施第二种方法。直到分类步骤之前，第二个示例与第一个示例相同。在该分类步骤期间，确定两个阈值。第一光强阈值被计算为平均值的1.5倍，第二阈值被计算为平均值的0.5倍。具有高于第一阈值的光强的所有液滴被归至第一类别，并且具有低于第二阈值的光强的所有液滴被归至第二类别。
通过改变发射至液滴4上UV闪光的数量，可以由相同量的CMNB笼化荧光素达到若干种荧光水平，如图5的图所示。这使得可以根据液滴4的类别来改变标记信号。因此，用一束闪光照射第一类别的液滴64。用四束闪光照射第二类别的液滴60。
在标记步骤之后，第二类别中的液滴60在荧光素通道中具有高光强，并且液滴64在荧光素通道中具有较低但易于检测的光强。未分类的液滴62在荧光素通道中不发出荧光。
因此，在回收步骤期间，包含高浓度磺酰罗丹明的液滴64被分离。同样地，基于具有高对比度的标记信号，包含低磺浓度酰罗丹明的液滴60被分离。因此每个类别均可以被有效地回收。
现在将描述用于选择和回收产物的第三种方法。该方法与第一种方法和第二种方法的不同之处在于，每个液滴4的共同基质12还包含一种或多种测试试剂。
所述测试试剂能够测量液滴4中的物理参数。每种测试试剂在乳液6的每个液滴4中以相同的比例存在。
例如，测试试剂是以液滴形式进行ELISA测试所必需的试剂，或者是免疫学测试的试剂。
有利地，至少一种测试试剂或测试反应的产物是荧光的。然后，在对应于不同试剂或荧光产物的不同荧光通道上，通过测量装置24进行测量。
有利地，选择信号试剂16以使所述试剂或所述测试产物的荧光通道不交叉。
在测量步骤期间，通过试验来测试和测量液滴的特定成分14的功效。
有利地，测量步骤包括在不同的连续时刻重复测量测试的特征参数。重复所述测量可以对液滴4内的测试反应进行动力学监测。
在图6所示的第三示例中，测量区域38具有10mm的长度和8mm的宽度，并且包括40,000个液滴。每个不同的点对应于一个液滴，并且不同的灰度级对应于测试试剂的激发通道中的不同荧光光强。测量步骤的持续时间取决于所完成的测试。在图6的示例中，对于40,000滴液的四个不同荧光通道的测量持续约10分钟。
一旦完成测量，就可以根据结果对液滴进行分类。因此，该分类涉及若干已测量的参数。因此，可以根据测试结果对液滴4进行分类。例如，根据在液滴4中进行的反应的产率和所述反应的速率对液滴4进行分类。
例如，在分类步骤中在与抗原的亲和力测试中取得良好结果的液滴4被识别。它们被归类为与其测试结果相关的类别。
对这些液滴进行的标记可以容易地使用常规分选仪将它们与其他液滴分开。因此，可以利用与液滴类别相对应的标记信号容易地回收液滴。
该方法可以简单地回收液滴，因为它是基于单个参数完成的，但选择它们却是复杂的并且需要基于若干个参数。由于回收很简单，所以可以使用其他方法在下游对所回收的液滴进行分析。例如，如果液滴中含有细胞，则可以对它们进行测序或将其放回培养物中。
现将根据图7描述第四个示例说明第三种方法的实施。在该示例中，目的是识别和分离产生抗破伤风类毒素(TT)蛋白的抗原的抗体的细胞。
形成包含40pL的液滴并包含零个或一个产生抗体的细胞的乳液6。每个液滴包含允许对所产生的抗体，特别是对TT测试试剂进行表型表征的试剂。此外，每个液滴4包含光活化标记物，例如笼化荧光素。
根据适合于测量区域38的每个液滴4能够被单独照射和观察的二维排列，使液滴4排列在腔室22中。
在测量步骤期间，测量抗体数量的亲和性。图7示出了对于每个液滴4，根据所测量的抗体亲和力的抗体分泌速率。在该图中，每个点对应于一个液滴4。例如，这种图显示在分类装置26上以允许用户选择分类标准。
在该示例中，测量区域38中存在15,000个液滴；12,000个液滴包含细胞。在这12,000滴个液滴中，只有200个液滴具有可检测量的抗TT的抗体，其中，只有21个液滴具有高亲和力。将这21个液滴归至第一类别以回收。有利地，包含具有低亲和力的抗体的其他液滴被归至第二类别以用于比较。此外，包括未产生的抗体的细胞的若干液滴和不包括细胞的若干液滴被归至第三类别和第四类别，以便随后在其他实验中用作空白或阴性对照从而能够表征细胞。
对分类液滴进行照射可以在所述液滴中特定地活化光活化标记物，而相邻的液滴4不被照射。在标记步骤期间，用对应于它们类别的参数一个接一个地照射所选择的液滴4。
在回收步骤期间，在管子中选择性地回收包括最多抗体或最佳抗体的液滴4，并且可以将分泌所述抗体的细胞放回至培养物中。或者，在回收后，使用已知技术对细胞进行裂解并对其DNA或其RNA进行扩增和测序。
该系统能够在大量的其他类别细胞的测量噪音中不使很少的这些细胞被噪音淹没。
现将描述用于选择和回收产物的第四种方法。信号试剂16包括待活化的细胞标记物。已分类的液滴包含细胞。一旦被活化，细胞标记物就能够使其自身附着并标记已分类液滴中存在的细胞的膜。例如，固定在膜上的活化细胞标记物是荧光性的。
标记步骤包括对细胞进行标记，选择性的回收步骤包括破乳，然后通过细胞计数分选。
例如，细胞的标记是细胞膜、细胞内的或在细胞器(例如溶酶体)上的标记。
这种信号可以在回收步骤期间特定性地回收已标记的细胞。在该回收步骤期间，乳液6被破坏，使得液滴4的内相8融合并形成连续相。对连续相进行回收。通过细胞计数对连续相进行分选，例如在细胞分选仪中通过荧光能够分离标记的细胞。根据在标记步骤期间完成的标记，对连续相的细胞进行分选。
这种方法使得可以在对许多细胞进行复杂的表型测量后特定地回收细胞。
现将描述第五个示例以说明第四种方法的实施。在该示例中，目的是在标记步骤期间直接对细胞进行标记，然后通过破乳来回收它们。
例如，在引入液滴之前，用非荧光试剂对细胞进行标记，该非荧光试剂与可接近膜的成分(例如与蛋白质中存在的胺基团和某些脂质)反应。最有利的试剂被光活化，并且该试剂在此过程中变成荧光性的。该试剂例如是CMND笼化羧基荧光素、由ThermoFisher销售的SE(5-羧基荧光素-双-(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)醚；β-丙氨酸-甲酰胺；琥珀酰亚胺基酯)。在对液滴和细胞进行回收后，使用UV光活化产生可分选的荧光细胞。
或者，在实验前用Sulfo-SBED(磺基-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-[生物素酰氨基]-2-(对叠氮基-苯甲酰氨基)-异氰酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯，Thermo Fisher33033)标记细胞。该配合物包含三个反应基团：能够与伯胺基团反应的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、光活化基团(叠氮基-苯甲酰胺基团)和生物素分子。在实验之前将该标记添加至所有细胞。它与细胞膜中存在于蛋白质或膜脂质中的胺基反应。
形成包含40pL的液滴并包含零个或一个Sulfo-SBED官能化的细胞的乳液6。液滴像之前一样排列在腔室22中。
在测量步骤和分类步骤之后，所选择的液滴的细胞被UV光照射。
UV光活化叠氮基-苯甲酰胺基团，该基团与细胞膜反应形成了由两个化学基团连接至细胞表面的分子。标记后，回收液滴并破乳。
离心步骤能够纯化细胞。回收所有细胞使得操作细胞更容易，并且使感兴趣细胞的损失更少。
最后，将细胞在含有还原剂(例如25mM的二硫苏糖醇(DTT))的溶液中孵育。这使得将二硫化物基团键合到生物素上的羟基琥珀酰亚胺基链断裂。因此，在标记步骤期间，从未被UV射线活化的所有细胞中除去生物素。在已标记的细胞中，二硫化物基团的键也被打断，但活化的叠氮基-苯甲酰胺将生物素保持在细胞膜上。
因此，只有在标记步骤中被照射的细胞在其膜上具有生物素分子。
接下来，可以用荧光链霉亲和素标记生物素，例如由ThermoFisher销售的链霉亲和素-Alexa555。因此，标记的细胞相对于细胞群的其余部分是高度荧光性的。接下来，可以通过FACS回收细胞。
或者，生物素化的细胞结合到具有链霉亲和素的官能化磁珠上。接下来，通过磁性方法从溶液中移除细胞来纯化细胞。
或者，在形成乳液之前，用另一种具有荧光素基团或特定化学基团，如叠氮化物、生物素、NTA等，可活化的膜标记物对细胞进行官能化。
在一个替代方案中，信号试剂16包括允许标记待活化的DNA或RNA的引物或试剂，例如信使RNA标记。此外，细胞例如在相应的液滴4中裂解。
该信号试剂16一旦被活化，就能够例如使用荧光信号标记所选择的液滴4中存在的DNA或信使RNA。
或者，感兴趣的DNA或RNA用化学基团如叠氮化物、炔烃、螯合剂(如次氮基三乙酸(NTA))或磁性颗粒进行标记。这样的标记可以在回收步骤期间特定性地回收已标记的DNA，RNA或mRNA。在该回收步骤期间，乳液被破坏，使得液滴的内相形成连续相。
用于所使用的信号试剂16，使用合适的纯化方法纯化已标记的DNA或RNA。例如，通过用于NTA的镍树脂纯化，通过对于叠氮化物或炔烃的点击化学对它们进行回收。
这种技术例如有助于对目标mRNA进行测序。
在一个替代方案中，液滴4不包含信号试剂16。标记步骤包括对已分类的液滴4的细胞进行激光裂解。在回收步骤期间，破坏乳液6，并通过离心纯化产物。除去未裂解的细胞及碎片。这使得可以特定地回收所选细胞的细胞质。
一种替代方案包括裂解未标记液滴的所有细胞。在回收步骤期间，使乳液6破乳，除去裂解的细胞及其碎片。这使得可以特定性地回收所选细胞。
在一个替代方案中，信号试剂16的活化增加了其密度。在标记步骤期间，已分类的液滴4的密度增加。在回收步骤期间，不破乳而将乳液注入能通过密度进行分离的装置，例如在倾析烧瓶中。这使得可以回收已分类的液滴4。
在一个替代方案中，信号试剂16能够在局部加热条件下被活化。局部加热用于裂解细胞或脂质体。所考虑的脂质体释放分子，该分子可以有利地在释放后对液滴或细胞进行标记。这种释放的分子能对细胞或液滴进行荧光标记，或能改变细胞的性质。
标记步骤包括根据液滴4的分类对信号试剂16进行热活化的步骤。在标记步骤期间，使用标记装置局部加热所选择的液滴。
现将描述第五种方法。该方法在图8和图9中所示的第五示例中实施。
该方法与先前描述的方法的不同之处在于，液滴包括至少一个颗粒簇(agrégat)，其限定沿主轴伸长的物体，至少一些液滴包含至少一个能够附着在所述簇上的靶向成分，测量步骤包括对靶向成分在所述簇上的结合的特征性物理参数进行测量。
如图8所示，支撑体20包括能够形成磁场B的供应装置70，使得颗粒形成细长的簇72。
所述颗粒是超顺磁性颗粒。当施加磁场时，所述颗粒能够以纵列的形式形成细长的簇72。对靶向成分在簇上的结合的特征物理参数的进行的测量是局部地在位于液滴中的多个点中完成的，测量步骤优选地包括确定在液滴内测量的值的积分。在测量步骤期间，对颗粒进行组织以纵列形式形成细长的簇72。该系统可以获得用于动力学监测具有更好对比度的荧光测量结果。
第五个示例说明了在测量步骤中同时对液滴中分离的独特原代细胞产生的单克隆抗体的给定抗原测量分泌动力学和亲和力的可能性。允许选择液滴4的独特成份14是由原代细胞分泌的单克隆抗体。通过动力学测量该分泌物。
在该示例中，液滴的体积为40皮升。在该示例中，待分析和待分类的细胞是预先从小鼠脾脏中提取的B淋巴细胞，并使用标准方法(Pan B试剂盒II#130-104-443，MiltenyiBiotec)纯化。
测试试剂包括抗原、定量实体和能够形成簇72并具有捕获实体的颗粒。所述抗原能够与所需抗体形成配合物。定量实体也能够与抗体形成配合物。
抗原是荧光抗原，更具体地是“TT-AF488”，它是预先用AlexaFluor-488荧光团进行官能化的破伤风类毒素蛋白，这是一种标准试剂盒的标记程序，例如由ThermoFisher提供。每个液滴包含25nM的TT-AF488。用于形成液滴纵列的磁性颗粒用捕获实体标记至饱和，本示例中是“CaptureSelectTM生物素抗-LC-kappa(鼠)缀合物”(ThermoFisher#7103152500)。这些颗粒是链霉亲和素磁性颗粒(Ademtech#0433)，用捕获实体标记为饱和。在该示例中，使用的定量实体是Rabbit Fab 2anti-FCmouse AF647，JacksonIR#315-606-146。每个液滴包含75nM的该定量实体。
抗原的荧光信号与定量实体的荧光信号的比率与抗体的解离常数相关。通过固定在珠的列(la colonne de billes)上的抗体相关的荧光抗原浓度测量值和同时在珠的列上捕获的抗体浓度测量值来评估解离常数Kd。
图9是显示单个细胞尺度上的磁珠线(la ligne de billes magnétiques)的重定位信号与液滴的分散信号之比随时间(以分钟计)的变化的曲线图。“重定位信号”是指簇附近的荧光信号，并且“分散的信号”是指其他液滴中的荧光信号。
此外，归功于滴定曲线，可以将测量的信号与单克隆抗体的浓度相关联。该浓度如图9所示。滴定曲线例如用测量装置24由包含已知量的抗TT抗体(称为TT7)的乳液完成。用于生成滴定曲线的TT7从Brandon J DeKosky等人发表的文章中公开的序列表达的重组蛋白获得，该文章标题为“High-throughput sequencing of the paired humanimmunoglobulin heavy and light chain repertoire”，发表在2013年NatureBiotechnology31卷，第166～169页。
根据本发明的用于选择和回收产物的方法比现有方法更可靠和更快速，从而允许对感兴趣的内容物进行精确的表征以及对液滴的感兴趣的内容物进行有效地回收。
该方法的一个优点是它可以在回收之前进行动力学测量。这可以监测对刺激的生物响应，并且可以计算不同的参数。此外，能够进行多次测量使得可以在测试期间更好地区分假阳性和阳性。
该系统1可用于研究单细胞水平的细胞系统。此外，该系统允许根据复杂表型进行选择。例如，在测量步骤期间可以观察到细胞和细菌之间的相互作用。这将使得可以根据它们与细菌相关的行为，对不同组中的细胞进行分类和回收。同样地，在测量步骤期间可以观察到存在于同一液滴中的不同细胞之间的相互作用。
系统1使得可以通过液滴来表征细胞分泌物。所分析的细胞分泌物可以是抗体、细胞因子和激素分泌物。如果液滴包含一个细胞，则液滴中的分泌物对应于该细胞。因此，能够测量分泌物的参数并且能够回收整个液滴或产生所述分泌物的细胞是非常有利的。一方面，这种系统使得可以在允许其表型的功能性表征的同时进行抗体产生细胞的体内研究，特别是通过确定分泌的抗体与靶向抗原的结合系数、亲和力和特异性，另一方面是对所述细胞的回收。例如，所述回收使得可以研究所选细胞的基因型。根据细胞的表型来选择细胞避免了必须对其表型不感兴趣的细胞进行测序，并且使得可以更容易找到感兴趣的遗传序列。实际上，相关性更容易确定了，并且测量噪音也减少了。
图10～图11示出了用于选择和回收产物的系统的第六个示例的应用，该第六个示例类似于第一个示例。
图10示出了在使用根据本发明的方法的选择之前由包含不同浓度的磺酰罗丹明的液滴形成的乳液6。
在该示例中，通过释放笼化荧光素，只对包含浓度为200nM的磺酰罗丹明的液滴进行标记。接下来，只回收已标记的液滴。
图11示出了已回收的液滴的图像。这些液滴具有基本相同的光强。
现将参考图12描述第七个示例。图12示出了使用笼化羧基荧光素-NHS标记的细胞。在该实验中，选择的标准是低浓度的磺酰罗丹明。仅对包含浓度为200nM的磺酰罗丹明的液滴进行标记。通过将细胞暴露于紫外线对所选择的液滴进行标记。
现将描述第八个示例。该示例阐述了用生物素对细胞进行标记。
在该第八个示例中，将每毫升10MIO细胞的溶液与50μMSulfo-SBED在冰上孵育15分钟。通过离心法回收细胞，润洗并重悬于缓冲溶液中。
将细胞分成两批。第一批暴露在紫外线下10秒钟。第二批不暴露于紫外线。
接下来，向每批中加入5mM DTT(还原剂)，并将溶液在4摄氏度下孵育30分钟。
对于细胞不暴露于紫外线的第二批，信号试剂被打断。
相反，在接收UV光的第一批细胞中，信号试剂通过官能团与细胞结合。
接下来，将细胞洗涤两次，并向细胞中加入300mM链霉亲和素-alexa 555。
观察到链霉亲和素-alexa 555仅与已暴露于紫外线的细胞结合并仅标记已暴露于紫外线的细胞。
现将描述第九种方法。该示例说明了对荧光标记的细胞进行细胞计数分析。在该实验中，来自细胞系的细胞以10个细胞/毫升的浓度被取出。加入100微升200mM笼化荧光素-NHS溶液。接着，将细胞在冰上孵育30分钟，然后包被成液滴。将11.34％的细胞暴露于UV光下，并从腔室中取出乳液，破乳，然后纯化细胞。仅对暴露于UV光的细胞进行标记。
为了将细胞与细胞碎片区分开，将细胞与活细胞标记物红色钙黄绿素一起孵育。
通过细胞计数分析，可以测量出9.43％的阳性细胞是活的并且已标记的。
在另一个示例中，在检测IgG分泌后对分泌IgG的细胞进行标记。

Claims (10)

1.一种选择和回收产物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包括容纳于载流体(10)中多个液滴(4)的乳液(6)，每个液滴包括内部流体(8)，
测量乳液(6)的若干液滴(4)的至少一个物理参数，
根据在测量步骤期间获得的测量结果，将所述乳液的至少一些液滴(4)分类为一个类别，
根据所述液滴的类别对至少一些已分类的液滴进行标记，和
利用所述液滴或部分液滴(4)的所述标记选择性地回收所述液滴(4)或部分所述液滴(4)，
其中，对于多个液滴的每一个液滴，所述测量步骤包括测量同一液滴(4)的若干不同参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，每个液滴(4)的所述内部流体(8)包括信号试剂(16)，所述标记步骤包括根据所述液滴(4)的分类对所述信号试剂(16)进行光学活化的步骤，和/或
所述标记步骤包括根据所述液滴(4)的分类，对所述信号试剂(16)进行热活化的步骤，和/或
所述标记步骤包括通过增加所述信号试剂(16)密度活化所述信号试剂(16)，所述回收步骤优选包括不破乳而将乳液注入能通过密度进行分离的装置中，例如在倾析烧瓶中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，在所述分类步骤期间将多个液滴(4)分类成多个类别，所述标记步骤由在预设照射条件下照射来自一个类别的每个液滴(4)，所述信号试剂(16)在活化后能够发出光信号，有利地是荧光，根据在所述回收步骤期间发出的光信号水平对所述液滴(4)进行分选，所述信号试剂(16)发出的光信号的水平取决于活化期间的照射条件。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中已分类的液滴(4)包括至少一个细胞，
所述标记步骤包括对每一个液滴(4)的所述内部流体(8)中存在的细胞标记物进行活化的步骤，和/或
所述标记步骤包括基于所述已分类的液滴(4)对所述液滴(4)的至少一些细胞进行裂解。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中每一个液滴(4)的内部流体(8)包括信号试剂(16)，所述信号试剂(16)包括引物或试剂，用于标记一旦在所述标记步骤中被活化的存在于所选择的液滴(4)中的DNA或RNA，
有利地，所述DNA或RNA通过化学基团和/或磁性颗粒进行标记，在所述回收步骤中已标记的DNA，RNA或mRNA被特定地回收，并优选地随后被测序。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述乳液的每个液滴包括能够与所述液滴特有的成分反应的测试试剂，所述测试试剂例如为用于在液滴中进行ELISA测试或免疫学测试的试剂，
优选地，至少一种试剂或测试反应的产物是发荧光的，在所述测量步骤中，在对应于不同试剂或荧光产物的不同荧光通道上进行测量。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分类步骤基于选自如下的分类标准进行：分泌速率，与抗原的亲和性，细胞间的相互作用，细胞与细菌间的相互作用和/或细胞分泌物。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述乳液(6)在二维腔室(22)中提供，在所述测量步骤和所述标记步骤期间，所述乳液(6)以单层液滴(4)的形式保持在所述二维腔室(22)中。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，已分类的液滴(4)包括细胞，所述标记步骤包括对所述细胞进行标记，并且所述选择性回收步骤包括破乳，优选地然后进行分选。
10.一种用于选择和回收产物的系统(1)，所述系统(1)包括：
能够接收乳液(6)的支撑体(20)，所述乳液(6)包括容纳于载流体(10)中的多个液滴(4)，每个液滴(4)包含内部流体(8)；
装置(24)，所述装置(24)用于测量所述支撑体(20)中接收的所述乳液(6)中的若干液滴(4)的至少一个物理参数；
分类单元(26)，所述分类单元(26)能够根据所述测量步骤中获得的测量结果确定所述乳液(6)至少一个液滴(4)的分类；
标记设备(28)，所述标记设备(28)能够根据所述液滴的分类决定，对液滴(4)或部分液滴(4)进行标记；和
基于所述标记的、液滴(4)或部分液滴(4)的回收装置(30)，
其中，用于测量的所述装置(24)配置为测量同一液滴(4)的若干不同参数。
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