CN107849556A

CN107849556A - 癌组织的异质性标记物及其使用

Info

Publication number: CN107849556A
Application number: CN201680037950.9A
Authority: CN
Inventors: 佐谷秀行; 有马好美; 千场隆
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2018-03-27
Also published as: EP3318632B1; EP3318632A1; JP6202659B2; US20180188258A1; WO2017002943A1; EP3318632A4; EP3318632B8; JPWO2017002943A1

Abstract

本发明提供判定用基因标记物，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，所述判定用基因标记物从由CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7构成的组中选择。

Description

癌组织的异质性标记物及其使用

技术领域

本发明涉及癌组织的异质性标记物及其使用。更具体地，涉及用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物、蛋白质标记物、试剂盒以及判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体的判定方法。本申请要求2015年7月1日在日本申请的日本特愿2015-133033号的优先权，并在此引用其内容。

背景技术

已知在一个癌组织中混有性质不同的癌细胞的情况。在这种状态下，称为肿瘤内异质性(intratumor heterogeneity)，被认为是难以进行癌治疗的一个原因(例如，参照非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Inda M.M.,et al.,Tumor heterogeneity is an active processmaintained by a mutant EGFR-induced cytokine circuit in glioblastoma.,GenesDev.,24(16),1731-1745,2010.

发明内容

当前，还不存在用于判定癌组织的异质性(癌组织包含异质的癌细胞群体的状态)的方法。因此，本发明的目的在于提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物。另外，本发明的目的还在于提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用蛋白质标记物、癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用试剂盒以及癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定方法。

本发明如下所述。

(1)一种判定用基因标记物，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，所述判定用基因标记物从钙调蛋白样蛋白3(CALML3)、双糖链蛋白聚糖(BGN)、氯离子通道辅助蛋白2(CLCA2)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂A(CSTA)、醛脱氢酶1家族成员A1(ALDH1A1)、神经生长因子受体(NGFR)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)、弹性蛋白(ELN)、SNRPN上游读框(SNURF)以及半乳凝素-7(LGALS7)所构成的组中选择。

(2)一种判定用蛋白质标记物，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，所述判定用蛋白质标记物由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因编码。

(3)一种癌预后判定用标记物，所述癌预后判定用标记物由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因或者所述基因编码的蛋白质构成。

(4)一种判定用试剂盒，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，所述判定用试剂盒包括：引物组，用于扩增从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的cDNA；探针，与从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的mRNA特异性杂交；或者针对由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因编码的蛋白质的特异性结合物质。

(5)一种癌预后判定用试剂盒，包括：引物组，用于扩增从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的cDNA；探针，与从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的mRNA特异性杂交；或者针对由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因编码的蛋白质的特异性结合物质。

(6)一种判定方法，用于判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体，包括：检测工序，检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的表达；以及判定工序，在检测到所述基因的表达的情况下，判定所述癌组织样品包含异质的癌细胞群体。

(7)根据(6)所述的判定方法，所述检测工序通过检测所述基因的mRNA来进行。

(8)根据(6)所述的判定方法，所述检测工序通过检测所述基因编码的蛋白质来进行。

(9)根据(6)至(8)中任一项所述的判定方法，所述癌组织样品是源于乳腺癌、恶性黑素瘤、肺癌或者胰腺癌的癌组织样品。

(10)根据(9)所述的判定方法，所述乳腺癌是雌激素受体(-)孕激素受体(-)HER2(-)乳腺癌。

(11)根据(6)至(10)中任一项所述的判定方法，异质的所述癌细胞群体包含ZEB1(+)CLDN1(-)细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞。

(12)一种癌预后判定方法，包括：检测工序，检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的表达；以及判定工序，在检测到所述基因的表达的情况下，判定所述癌组织样品来源的患者预后不良。

(13)一种异质的癌细胞群体，表达从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因。

根据本发明，能够提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物以及cDNA标记物。另外，还能够提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用蛋白质标记物、癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用试剂盒以及癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定方法。

附图说明

图1(a)是表示多个乳腺癌细胞株中的ZEB1基因的表达分析结果的图。图1(b)是表示多个乳腺癌细胞株中的CLDN1基因的表达分析结果的图。

图2是表示实验例3的结果的图。

图3(a)是表示将癌组织的切片组织标本通过抗ZEB1抗体染色的结果的照片。图3(b)是表示将与图3(a)大致相同视野的切片组织标本通过抗CLDN1抗体染色的结果的照片。

图4(a)以及图4(b)是表示实验例6的结果的图。

图5是表示实验例7的结果的图。

图6是表示实验例8的分析结果的图。

图7(a)～(j)是表示实验例10的结果的照片。

图8(a)～(j)是表示实验例11的实时定量PCR的结果的图。

具体实施方式

[用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用标记物]

在一个实施方式中，本发明提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物以及这些基因的cDNA的cDNA标记物，这些判定用基因标记物从CALML3(钙调蛋白样蛋白3、登录号：NM_005185、序列号25)、BGN(双糖链蛋白聚糖、登录号：NM_001711、序列号26)、CLCA2(氯离子通道辅助蛋白2、登录号：NM_006536、序列号27)、CSTA(半胱氨酸蛋白酶抑制剂A(StefinA)、登录号：NM_005213、序列号28)、ALDH1A1(醛脱氢酶1家族成员A1、登录号：NM_000689、序列号29)、NGFR(神经生长因子受体、登录号：NM_002507、序列号30)、S100A8(S100钙结合蛋白A8、登录号：NM_002964、序列号31)、ELN(弹性蛋白、登录号：NM_000501、序列号32)、SNURF(SNRPN上游读框、登录号：NM_005678、序列号33)以及LGALS7(半乳凝素-7、登录号：NM_002307、序列号34)所构成的组中选择。

即，本实施方式的标记物可以是从CALML3cDNA、BGN cDNA、CLCA2cDNA、CSTA cDNA、ALDH1A1cDNA、NGFR cDNA、S100A8cDNA、ELN cDNA、SNURF cDNA以及LGALS7cDNA所构成的组中选择的、用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用cDNA标记物。

如后面实施例中所述，本发明的发明人将通过单独移植方式未形成肿瘤的细胞株与通过单独移植方式形成肿瘤的细胞株混合并移植到裸鼠上，从而意想不到地制作出由异质的细胞群体构成的癌组织。因此，通过鉴别CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7作为在包含异质的癌细胞群体的癌组织中特异表达的基因，完成本发明。

由此，在癌组织中检测到这些基因中的任一种或多种表达的情况下，可以判断为该癌组织包含有异质的癌细胞群体。

另外，如后面实施例中所述，本发明的发明人发现包含异质的癌细胞群体的癌组织存在预后不良的倾向。由此，从由CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7构成的组中选择的基因以及cDNA也可以为癌预后判定用基因标记物。

在癌组织中检测到这些基因中的任一种或多种表达的情况下，可以预测具有该癌组织的癌患者预后不良。

在本说明书中，预后不良是指癌细胞的增殖较快、癌的转化能力较高、癌组织对抗癌剂的抗性较高、或者患者的生存率较低等。

上述基因标记物可以是基于选择性剪接等得到的上述基因的剪接变体。另外，上述基因标记物也可以是包含单核苷酸多态性(SNP)等的上述基因的变异体。

另外，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用标记物也可以是上述基因编码的蛋白质。即，判定用标记物可以是蛋白质标记物。

另外，与上述的基因标记物同样，从由CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7构成的组中选择的基因编码的蛋白质也可以为癌预后判定用蛋白质标记物。

可以通过RT-PCR、DNA阵列分析、印迹法、免疫染色、ELISA、蛋白质印迹、流式细胞仪分析等检测癌组织中的上述基因标记物或者蛋白质标记物的表达。

作为用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用标记物，在CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7的基因、cDNA、或者该基因编码的蛋白质中特别优选CALML3、CLCA2、CSTA以及LGALS7的基因、cDNA、或者该基因编码的蛋白质。如后面实施例中所述，实际中，可以在人类乳腺癌的临床检体中确认CALML3、CLCA2、CSTA以及LGALS7基因的表达。

[用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用试剂盒]

在一个实施方式中，本发明提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用试剂盒，包括：引物组，用于扩增从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的cDNA；探针，与从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的mRNA特异性杂交；或者针对从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因编码的蛋白质的特异性结合物质。

如上所述，在癌组织中检测到上述基因中的任一种或多种表达的情况下，可以预测具有该癌组织的癌患者预后不良。由此，本实施方式的试剂盒可以为癌预后判定用试剂盒。

(引物组)

本实施方式的试剂盒可以包括用于扩增从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的cDNA的引物组。

只要引物组能够扩增这些基因的cDNA的至少一个部分，则不特别限定其序列。对于具体的引物组的碱基序列，作为一个例子，可列举后面实施例中所述的序列。

对于构成上述引物组的至少一种引物，可以具有含上述任一种基因的碱基序列中的外显子与外显子分界的碱基序列。这种引物具有自然界中不存在的碱基序列。

(探针)

本实施方式的试剂盒可以包括与从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的mRNA特异性杂交的探针。

探针例如可以是具有与上述的基因的mRNA的至少一个部分的碱基序列互补的碱基序列的核酸片段。另外，为了提高稳定性、杂交时的特异性等，探针可以具有各种化学修饰。例如，为了抑制核酸酶等水解酶的分解，可以将磷酸残基置换为例如硫代磷酸(PS)、甲基膦酸、二硫代磷酸等化学修饰的磷酸残基。另外，也可以由肽核酸(PNA)等核酸类似物构成至少一部分。

另外，上述探针可以具有含上述任一种基因的碱基序列中的外显子与外显子分界的碱基序列。这种探针具有自然界中不存在的碱基序列。

探针可以固定在固相上。作为固相，例如可以列举珠子、板状基板、膜等。

例如，可以将探针固定在板状基板的表面而形成微阵列。在该情况下，例如，从癌组织样品中提取RNA，通过荧光物质进行标识，与微阵列杂交，检测与微阵列上的探针结合的RNA，从而能够检测癌组织中上述基因的表达。在检测到上述基因中的任一种或多种表达的情况下，可以判定该癌组织包含异质的癌细胞群体。

(特异性结合物质)

本实施方式的试剂盒可以包括针对从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因编码的蛋白质的特异性结合物质。

作为特异性结合物质，例如可以列举抗体、抗体片段、适体等。例如，可以将上述蛋白质作为抗原使小鼠等动物免疫，从而制作抗体。或者，可以通过噬菌体库等抗体库进行筛选等制作抗体。另外，作为抗体片段，可以列举Fv、Fab、scFv等。上述抗体或者抗体片段可以是多克隆的，也可以是单克隆的。

适体是对标识物质具有特异性结合能力的物质。作为适体，可以列举核酸适体、肽适体等。例如，可以通过指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligand byexponential enrichment)(SELEX)法等筛选对上述蛋白质具有特异性结合能力的核酸适体。另外，例如，可以通过使用酵母的双杂交(Two-hybrid)法等筛选对上述蛋白质具有特异性结合能力的肽适体。

只要特异性结合物质能够与上述蛋白质特异结合，则不特别限定，可以是市面上出售的结合物质。

例如，通过使用上述特异性结合物质将固定的癌组织的切片标本免疫染色，能够检测上述蛋白质的存在。另外，还可以通过蛋白质印迹、ELISA法、或者流式细胞仪分析等检测上述蛋白质的存在。

存在上述蛋白质中的任一种或多种则表明癌组织包含有异质的癌细胞群体。

[用于判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体的判定方法]

在一个实施方式中，本发明提供判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体的判定方法，包括：检测工序，检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的表达；以及判定工序，在检测到所述基因的表达的情况下，判定所述癌组织样品包含异质的癌细胞群体。

如上所述，在癌组织样品中检测到上述基因中的任一种或多种表达的情况下，可以预测具有该癌组织的癌患者预后不良。由此，本实施方式的判定方法可以为癌预后判定方法。

可以通过检测上述基因的mRNA来进行上述检测工序。或者，也可以通过检测上述基因编码的蛋白质来进行上述检测工序。

可以通过RT-PCR、DNA阵列分析、印迹法等检测上述基因的mRNA。另外，可以通过免疫染色、ELISA、蛋白质印迹、流式细胞仪分析等检测上述基因编码的蛋白质。

在检测到上述基因中的任一种或多种表达的情况下，可以判定该癌组织样品包含有异质的癌细胞群体。

上述的癌组织样品可以源于乳腺癌、恶性黑素瘤、肺癌或者胰腺癌。这些癌中存在异质的癌细胞群体，由于包含异质的癌细胞群体，可预测预后不良。

上述乳腺癌可以是雌激素受体(-)孕激素受体(-)HER2(-)乳腺癌，即，未表达雌激素受体、孕激素受体以及HER2的乳腺癌。这种乳腺癌也被称为三阴性乳腺癌，可知是预后不良的乳腺癌。

另外，上述异质的癌细胞群体包含ZEB1(+)CLDN1(-)细胞即表达ZEB1而未表达CLDN1的细胞、以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞即未表达ZEB1而表达CLDN1的细胞。

ZEB1(锌指E-盒结合同源盒1(Zinc finger E-box-binding homeobox 1))是诱导上皮间质转化的转录因子，该上皮间质转化是指上皮细胞丧失其细胞极性以及与周围细胞的细胞接合功能而得到移动、渗入的能力，从而变化为间质类细胞的现象。另外，CLDN1(密封蛋白1(Claudin1))是紧密连接存在的主要蛋白质。

如后面实施例中所述，作为包含异质的癌细胞群体的癌组织的一个例子，可以列举包含ZEB1(+)CLDN1(-)细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞的癌组织。

[异质的癌细胞群体]

在一个实施方式中，本发明提供表达从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因的异质的癌细胞群体。本实施方式的癌细胞群体优选活体上形成的癌细胞群体。如后面实施例中所述，例如，通过在免疫缺陷的小鼠上移植混合有ZEB1(+)CLDN1(-)的癌细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)的癌细胞的混合物，从而能够形成异质的癌细胞群体作为患癌小鼠的癌组织。

[其他实施方式]

在一个实施方式中，本发明提供从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因的cDNA。如上所述，这些cDNA可以用作判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物或者癌预后判定用标记物。

在一个实施方式中，本发明提供检测癌组织样品中的所述基因的表达的方法，包括下述工序：从患者采集癌组织样品；以及通过聚合酶链式反应(PCR)、使用微阵列的基因表达分析、或者检测针对所述基因编码的蛋白质的特异性结合物质，来检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因或者cDNA的表达。

在一个实施方式中，本发明提供判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体的判定方法，包括下述工序：从患者采集癌组织样品；以及通过聚合酶链式反应(PCR)、使用微阵列的基因表达分析、或者检测针对所述基因编码的蛋白质的特异性结合物质，来检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因或者cDNA的表达。本实施方式的判定方法可以为癌预后判定方法。

实施例

下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于以下的实施例。

＜具有异质的癌组织的模型小鼠的制作＞

[实验例1]

(研究乳腺癌细胞株中的ZEB1以及CLDN1的表达)

本发明的发明人通过实时定量PCR来研究三阴性乳腺癌细胞株即MDA-MB-436、BT549、MDA-MB-157、MDA-MB-231、Hs578T、HCC1937、BT20、MDA-MB-468细胞中的ZEB1基因以及CLDN1基因的表达。对于ZEB1基因的扩增，使用引物ZEB1Fw(序列号1)以及ZEB1Rv(序列号2)。另外，对于CLDN1基因的扩增，使用引物CLDN-s(序列号3)以及CLDN-as(序列号4)。

图1(a)是表示各乳腺癌细胞株中的ZEB1基因的表达分析结果的图。另外，图1(b)是表示各乳腺癌细胞株中的CLDN1基因的表达分析结果的图。

其结果，本发明的发明人发现MDA-MB-231细胞株为ZEB1(+)CLDN1(-)。另外，发现HCC1937细胞株为ZEB1(-)CLDN1(+)。

[实验例2]

(患癌小鼠的制作)

将MDA-MB-231细胞株以及HCC1937细胞株以HCC1937细胞株的细胞数量多于MDA-MB-231细胞株的细胞数量的方式、优选HCC1937细胞株的细胞数量:MDA-MB-231细胞株的细胞数量为2:1以上的方式、例如以9:1方式混合而成的混合物移植到免疫缺陷小鼠(4周龄、雌性、BALB/c-nu)的4号乳腺脂肪组织中，制作患癌小鼠(下面，有时称为“混合小鼠”)。作为对照，分别仅将MDA-MB-231细胞株以及HCC1937细胞株移植到免疫缺陷小鼠(4周龄、雌性、BALB/c-nu)的4号乳腺脂肪组织中，制作患癌小鼠(下面，有时分别称为“231小鼠”、“1937小鼠”)。

[实验例3]

(观察肿瘤体积随时间的变化)

随时间测量实验例2制作的混合小鼠、231小鼠以及1937小鼠在移植癌细胞后的30天内的肿瘤直径，观察肿瘤体积随时间的变化。

图2是表示各患癌小鼠的肿瘤体积随时间的变化的图。其结果，在仅移植HCC1937细胞株的1937小鼠上显然没有形成肿瘤。另外，尽管在1937小鼠上没有形成肿瘤，但是，在HCC1937细胞株中混合MDA-MB-231细胞株并进行移植的混合小鼠上形成了肿瘤。另外，混合小鼠与仅移植了同样数量MDA-MB-231细胞株的231小鼠相比，明显形成了较大的肿瘤。

[实验例4]

(患癌小鼠的癌组织的免疫染色)

在癌细胞株移植16天后，从与实验例2同样制作的混合小鼠上摘除癌组织。然后，将摘除的癌组织通过多聚甲醛固定，进行石蜡包埋。然后，制作癌组织的切片组织标本，通过免疫染色，研究ZEB1蛋白质以及CLDN1蛋白质的表达。

图3(a)是表示将癌组织的切片组织标本通过抗ZEB1抗体(目录号“sc-10572”、Santa Cruz公司)染色的结果的照片。图3(b)是表示将与图3(a)大致相同视野的切片组织标本通过抗CLDN1抗体(目录号“ab15098”、Abcam公司)染色的结果的照片。

根据实验例3的结果可知，在1937小鼠上显然没有形成肿瘤。

根据该结果考虑混合小鼠的癌组织可能仅由ZEB1(+)CLDN1(-)即MDA-MB-231细胞构成，CLDN1蛋白质未表达。但出乎意料的是，在混合小鼠的癌组织中，不仅确认到ZEB1蛋白质的表达，还确认到CLDN1蛋白质的表达。另外，可以看出，ZEB1蛋白质的表达与CLDN1蛋白质的表达相互排斥，ZEB1(+)细胞是CLDN1(-)，CLDN1(+)细胞是ZEB1(-)。

即，在混合小鼠的癌组织中混合存在ZEB1(+)CLDN1(-)细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞，确认形成了异质的癌组织。

根据实验例3以及实验例4的结果可以明确，通过将MDA-MB-231细胞株与HCC1937细胞株的混合物移植到免疫缺陷小鼠上，能够制作具有异质的癌组织的模型小鼠。另外，可以看出，异质的癌组织会形成更大的肿瘤，因此，相对于同质的癌组织而言，其恶性度更高。

＜异质的癌组织的恶性度的评估＞

[实验例5]

(肺转移的评估)

从通过实验例2制作的混合小鼠以及231小鼠上，在癌细胞株移植11周后摘除肺，通过多聚甲醛固定，进行石蜡包埋。然后，制作肺的切片组织标本，进行苏木精-伊红染色，通过显微镜观察，研究癌的肺转移灶的存在。

其结果，混合小鼠与231小鼠相比，肺转移灶形成较多。

根据该结果也可以看出，异质的癌组织相对于同质的癌组织，其恶性度较高。

[实验例6]

(研究抗癌剂的治疗效果)

对于与实验例2同样制作的混合小鼠以及231小鼠，每周进行一次紫杉醇(3mg/kg)的腹腔内给药，随时间测量肿瘤直径，观察肿瘤体积随时间的变化(分别是n＝5)。作为对照，观察取代紫杉而进行生理盐水腹腔内给药(对照组)的肿瘤体积随时间的变化的情况(分别是n＝5)。

图4(a)是表示231小鼠的结果的图。另外，图4(b)是表示混合小鼠的结果的图。图中，“紫杉醇”示出了紫杉醇加入组的结果，“对照”示出了对照组的结果。其结果，混合小鼠的癌组织与231小鼠的癌组织相比，对紫杉醇的耐药性显然较高。根据该结果也可知，异质的癌组织相对于同质的癌组织，其恶性度较高。

[实验例7]

(研究ZEB1(+)CLDN1(+)乳腺癌患者的预后)

使用来源于295名乳腺癌患者的癌组织样品的微阵列基因表达分析结果(参照ChangH.Y.et al.,Robustness,scalability,and integration of a wound-responsegeneexpression signature in predicting breast cancer survival.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,102(10),3738-3743,2005.PMID:15701700)来研究ZEB1(+)CLDN1(+)乳腺癌患者、ZEB1(-)CLDN1(+)乳腺癌患者、ZEB1(+)CLDN1(-)乳腺癌患者以及ZEB1(-)CLDN1(-)乳腺癌患者的预后(生存率)。其中，认为ZEB1(+)CLDN1(+)的癌组织是混有ZEB1(+)CLDN1(-)细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞的异质的癌组织。

图5是表示研究结果的图。其结果，ZEB1(+)CLDN1(+)乳腺癌患者的生存率显然较低。根据该结果也可知，异质的癌组织的恶性度较高。

以上，根据实验例4～7的结果可知，异质的癌组织的恶性度较高。

＜癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用标记物的探索＞

[实验例8]

(详尽的转录组分析)

对与实验例2同样制作的混合小鼠、231小鼠以及1937小鼠的癌组织进行详尽的转录组分析。

首先，从各患癌小鼠上摘除癌组织，提取RNA。然后，使用试剂盒(商品名称“TruSeqRNA Sample Preparation Kit v2”、illumina公司)制作文库。然后，使用新一代测序仪(型号“GenomeAnalyzerIIx”、illumina公司)进行序列分析，进行生物信息学分析。

更具体的讲，使用软件“Xenome”将检测到的碱基序列分离成源于人类的碱基序列以及源于小鼠的碱基序列。然后，使用软件“Tophat”，将得到的碱基序列数据与参考序列进行匹配。然后，将匹配的碱基序列数据与已知基因序列一起可视化，使用软件“Avadis”比较各样品之间的mRNA表达。

图6是表示使用软件“Avadis”的分析结果的图。作为使用软件“Avadis”的分析结果，在混合小鼠的癌组织中呈高表达，在231小鼠以及1937小鼠的癌组织中几乎没有被认定为表达的基因，发现了图6的中央下方区域的圆圈区域所示的基因。这些基因是判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物的候补。

[实验例9]

(基于实时定量PCR的候补基因的表达分析)

对于实验例8中作为判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物的候补而发现的基因，进行实时定量PCR的表达分析。

首先，从与实验例2同样制作的混合小鼠、231小鼠以及1937小鼠上摘除癌组织，从一部分中提取RNA。另外，将一部分通过多聚甲醛固定并且包埋在石蜡中，用于后续试验。

然后，从提取的RNA合成cDNA，通过实时定量PCR分析候补基因的表达。

其结果，对于在实验例8的转录组分析中231小鼠以及1937小鼠上几乎未发现表达的CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7基因，通过实时定量PCR，确认在混合小鼠的癌组织中呈高表达。即，对于这些基因，由于混合MDA-MB-231细胞以及HCC1937细胞并移植后，癌细胞群体显示出异质性而检测出高表达，因此，可以用作判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物。其中，对于CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、ELN、LGALS7基因，尽管通过后面所述的离体实验将MDA-MB-231细胞与HCC1937细胞混合没有确认到表达量增加(参照图8)，但在混合小鼠的癌组织中还是呈高表达。在转录组分析中，该表达量与231小鼠以及1937小鼠的癌组织的表达量相比，其差值较大。

在表1中，示出了CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7基因的用于实时定量PCR的引物的名称以及序列号。

表1

实验例10

(基于免疫染色的候补基因的表达分析)

对于实验例8中作为判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物的候补而发现的基因，通过免疫染色研究其表达。

更具体地，将通过实验例9制作的混合小鼠以及231小鼠的癌组织的标本切断成薄片，制作组织切片标本，进行苏木精-伊红染色以及免疫染色。

图7(a)～(j)是表示免疫染色的典型结果的照片。图7(a)是表示将混合小鼠的癌组织标本通过抗CALML3抗体(目录号“GTX114954”、Gene Tex公司)染色的结果的照片。图7(b)是表示作为对照将231小鼠的癌组织标本通过抗CALML3抗体(同上)染色的结果的照片。

图7(c)是表示将混合小鼠的癌组织标本通过抗CLCA2抗体(目录号“NBP2-33482”、Novus Biologicals公司)染色的结果的照片。图7(d)是表示作为对照将231小鼠的癌组织标本通过抗CLCA2抗体(同上)染色的结果的照片。图7(e)是表示将混合小鼠的癌组织标本通过抗CSTA抗体(目录号“HPA001031”、ATRAS antibodies公司)染色的结果的照片。图7(f)是表示作为对照将231小鼠的癌组织标本通过抗CSTA抗体(同上)染色的结果的照片。图7(g)是表示将混合小鼠的癌组织标本通过抗LGALS7抗体(目录号“HPA001549”、ATRASantibodies公司)染色的结果的照片。图7(h)是表示作为对照将231小鼠的癌组织标本通过抗LGALS7抗体(同上)染色的结果的照片。图7(i)是表示将混合小鼠的癌组织标本通过抗S100A8抗体(目录号“NBP2-25269”、Novus Biologicals公司)染色的结果的照片。图7(j)是表示作为对照将231小鼠的癌组织标本通过抗S100A8抗体(同上)染色的结果的照片。

其结果，确认了CALML3、CLCA2、CSTA、LGALS7以及S100A8蛋白质在混合小鼠的癌组织中呈高表达，在231小鼠的癌组织中几乎没有发现表达。

[实验例11]

(使用离体样品的实时定量PCR的候补基因的表达分析)

对于实验例8中作为判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物的候补而发现的基因，使用离体样品进行基于实时定量PCR的表达分析。

首先，将231细胞、1937细胞、以及231细胞与1937细胞以1:1的方式混合的细胞在培养皿内培养5天，作为离体样品。然后，从各细胞样品中分别提取RNA。然后，基于提取的RNA合成cDNA，通过实时定量PCR进行候补基因的表达分析。与实验例9同样地进行实时定量PCR。

图8是表示实时定量PCR的结果的图。图8中，“231”表示231细胞的结果，“1937”表示1937细胞的结果，“混合”表示231细胞与1937细胞以1:1的方式混合的细胞的结果。

其结果，在以离体方式混合231细胞与1937细胞而形成的样品中，没有确认到来自实验例9以及10中得到的移植癌细胞群体的活体样品中发现的这种CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDHA1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7基因的高表达。

根据该结果可以明确，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物在仅离体混合癌细胞进行培养的方式中没有呈高表达，首次在活体中形成异质的癌细胞群体的情况下就会呈高表达。

[实验例12]

(乳腺癌手术检体的免疫染色)

对于实验例8中作为判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物的候补而发现的基因，通过临床检体的免疫染色确认其表达。

更具体地，使用获得知情同意书的乳腺癌患者的、通过手术得到的组织的进行福尔马林固定石蜡包埋的切片组织标本，进行免疫组织染色，研究CALML3、CLCA2、CSTA以及LGALS7蛋白质的表达。

其结果，确认到CALML3、CLCA2、CSTA以及LGALS7蛋白质的染色，在人类乳腺癌手术检体中，能够确认检测到这些标记物蛋白质的表达。

根据其结果可知，在实际中，可以将用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物、cDNA标记物、以及蛋白质标记物用于人类样本。

工业实用性

根据本发明，能够提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用基因标记物。另外，还能够提供用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用蛋白质标记物、癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定用试剂盒、以及判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体的判定方法。

序列表

<110> 学校法人庆应义塾

<120> 癌的异质性标记物及其使用

<130> PC-22151

<150> JP2015-133033

<151> 2015-07-01

<160> 34

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ZEB1 Fw

<400> 1

ggcagagaat gagggagaag 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ZEB1 Rv

<400> 2

cttcagacac ttgctcacta ctc 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CLDN1-s

<400> 3

ctgccttctg ggaggtg 17

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CLDN1-as

<400> 4

cgctggaagg tgcagg 16

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CALML3-F

<400> 5

ggagaagctg agtgacgagg a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CALML3-R

<400> 6

acaccagcac acggacaaac 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BGN-F

<400> 7

atccacgaca accgcatc 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BGN-R

<400> 8

ccaggttcaa agccactgtt c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CLCA2-F

<400> 9

cccagcccac tctattcca 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CLCA2-R

<400> 10

gctcctcctc atttctgcct ac 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CSTA-F

<400> 11

cgccactcca gaaatcca 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CSTA-R

<400> 12

ctgcacagct tccaattttc c 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ALDH1A1-F

<400> 13

gccataacaa tctcctctgc tct 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ALDH1A1-R

<400> 14

cccagttctc ttccatttcc a 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物NGFR-F

<400> 15

tccctgtcta ttgctccatc ct 22

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物NGFR-R

<400> 16

gctgttggct ccttgcttg 19

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物S100A8-F

<400> 17

gagaccgagt gtcctcagta tatca 25

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物S100A8-R

<400> 18

cacgcccatc tttatcacca 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ELN-F

<400> 19

gcagctaaat acggtgctgc t 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ELN-R

<400> 20

cctgggaaaa tgggagacaa 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物SNURF-F

<400> 21

atcctgcaag atggccgaat c 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物SNURF-R

<400> 22

tggttgcttc gcattctttg gc 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LGALS7/7B-F

<400> 23

tgccagcagg ttccatgtaa ac 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LGALS7/7B-R

<400> 24

ttgctccttg ctgttgaaga cc 22

<210> 25

<211> 1417

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> CALML3

<400> 25

agggcagggg cgtctgccaa tgatggggga ggactctgct gcttcttaag ctccagcgtc 60

tcaagccagg gcgagacagc ccgccggccg cccggatctc cacctgccac cccagagctg 120

ggacagcagc cgggctgcgg cactgggagg gagaccccac agtggcctct tctgccaccc 180

acgcccccac ccctggcatg gccgaccagc tgactgagga gcaggtcaca gaattcaagg 240

aggccttctc cctgtttgac aaggatgggg acggctgcat caccacccgc gagctgggca 300

cggtcatgcg gtccctgggc cagaacccca cggaggccga gctgcgggac atgatgagtg 360

agatcgaccg ggacggcaac ggcaccgtgg acttccccga gttcctgggc atgatggcca 420

ggaagatgaa ggacacggac aacgaggagg agatccgcga ggccttccgc gtgttcgaca 480

aggacggcaa cggcttcgtc agcgccgccg agctgcgaca cgtcatgacc cggctggggg 540

agaagctgag tgacgaggag gtggacgaga tgatccgggc cgcggacacg gacggagacg 600

gacaggtgaa ctacgaggag tttgtccgtg tgctggtgtc caagtgaggc cggcgcccac 660

catgctcctg ggcgcccacg cggcccacag ggcaagaacc cggggcctcc cgcctcctcc 720

cccatccccc tgcctcccct gggcactgtg gcttcctcct gcgcctggtt gattcagccc 780

acctctctgc atcccgcttc ccgcgtctct tctctgcact cctgccgacc ttcccacctg 840

ctcgtctgaa tgacacggaa cgctcccact gcaggcaaac cgtgacgccc tccccactcg 900

ggagaagcag agctgacctt aggaccgagc accagggcag gttgcgctga ctctgcggcc 960

ctccaggacg gacaccgggt gaccccttag ggcacccagg caagatccct aagaggcacc 1020

caatgcccag gccagggggg ctgcagccct cagcccccgc caggattccc gcaggctcct 1080

ggactggaag ctccctccgc ggtcggattc tggagggtgg gaggcatctt ggcctgcagt 1140

aagcggtgct gacggggact ctggccacag aggtcaggcc tcctgaaaac agcactgcct 1200

tccgcgctgc cccagcttgc cccattcctt gtccgccaac ccaccgtgat tcatcttctg 1260

aagctgggag tgaaactggg tcagctgtaa cctgttccta ttcatctgga aggagggagg 1320

cttggatgag caggggatga gagctgcagg gaaataaatg agatattcgt ccttatttca 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1417

<210> 26

<211> 2470

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> BGN

<400> 26

cctttcctcc ctccccgccc tctccccgct gtcccctccc cgtcggcccg cctgcccagc 60

ctttagcctc ccgcccgccg cctctgtctc cctctctcca caaactgccc aggagtgagt 120

agctgctttc ggtccgccgg acacaccgga cagatagacg tgcggacggc ccaccacccc 180

agcccgccaa ctagtcagcc tgcgcctggc gcctcccctc tccaggtcca tccgccatgt 240

ggcccctgtg gcgcctcgtg tctctgctgg ccctgagcca ggccctgccc tttgagcaga 300

gaggcttctg ggacttcacc ctggacgatg ggccattcat gatgaacgat gaggaagctt 360

cgggcgctga cacctcgggc gtcctggacc cggactctgt cacacccacc tacagcgcca 420

tgtgtccttt cggctgccac tgccacctgc gggtggttca gtgctccgac ctgggtctga 480

agtctgtgcc caaagagatc tcccctgaca ccacgctgct ggacctgcag aacaacgaca 540

tctccgagct ccgcaaggat gacttcaagg gtctccagca cctctacgcc ctcgtcctgg 600

tgaacaacaa gatctccaag atccatgaga aggccttcag cccactgcgg aagctgcaga 660

agctctacat ctccaagaac cacctggtgg agatcccgcc caacctaccc agctccctgg 720

tggagctccg catccacgac aaccgcatcc gcaaggtgcc caagggagtg ttcagcgggc 780

tccggaacat gaactgcatc gagatgggcg ggaacccact ggagaacagt ggctttgaac 840

ctggagcctt cgatggcctg aagctcaact acctgcgcat ctcagaggcc aagctgactg 900

gcatccccaa agacctccct gagaccctga atgaactcca cctagaccac aacaaaatcc 960

aggccatcga actggaggac ctgcttcgct actccaagct gtacaggctg ggcctaggcc 1020

acaaccagat caggatgatc gagaacggga gcctgagctt cctgcccacc ctccgggagc 1080

tccacttgga caacaacaag ttggccaggg tgccctcagg gctcccagac ctcaagctcc 1140

tccaggtggt ctatctgcac tccaacaaca tcaccaaagt gggtgtcaac gacttctgtc 1200

ccatgggctt cggggtgaag cgggcctact acaacggcat cagcctcttc aacaaccccg 1260

tgccctactg ggaggtgcag ccggccactt tccgctgcgt cactgaccgc ctggccatcc 1320

agtttggcaa ctacaaaaag tagaggcagc tgcagccacc gcggggcctc agtgggggtc 1380

tctggggaac acagccagac atcctgatgg ggaggcagag ccaggaagct aagccagggc 1440

ccagctgcgt ccaacccagc cccccacctc gggtccctga ccccagctcg atgccccatc 1500

accgcctctc cctggctccc aagggtgcag gtgggcgcaa ggcccggccc ccatcacatg 1560

ttcccttggc ctcagagctg cccctgctct cccaccacag ccacccagag gcaccccatg 1620

aagctttttt ctcgttcact cccaaaccca agtgtccaag gctccagtcc taggagaaca 1680

gtccctgggt cagcagccag gaggcggtcc ataagaatgg ggacagtggg ctctgccagg 1740

gctgccgcac ctgtccagac acacatgttc tgttcctcct cctcatgcat ttccagcctt 1800

tcaaccctcc ccgactctgc ggctcccctc agcccccttg caagttcatg gcctgtccct 1860

cccagacccc tgctccactg gcccttcgac cagtcctccc ttctgttctc tctttccccg 1920

tccttcctct ctctctctct ctctctctct ctctctttct gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1980

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtcttgtg cttcctcaga cctttctcgc ttctgagctt 2040

ggtggcctgt tccctccatc tctccgaacc tggcttcgcc tgtccctttc actccacacc 2100

ctctggcctt ctgccttgag ctgggactgc tttctgtctg tccggcctgc acccagcccc 2160

tgcccacaaa accccaggga cagcagtctc cccagcctgc cctgctcagg ccttgccccc 2220

aaacctgtac tgtcccggag gaggttggga ggtggaggcc cagcatcccg cgcagatgac 2280

accatcaacc gccagagtcc cagacaccgg ttttcctaga agcccctcac ccccactggc 2340

ccactggtgg ctaggtctcc ccttatcctt ctggtccagc gcaaggaggg gctgcttctg 2400

aggtcggtgg ctgtctttcc attaaagaaa caccgtgcaa cgtggctccg tgaaaaaaaa 2460

aaaaaaaaaa 2470

<210> 27

<211> 4043

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> CLCA2

<400> 27

tcccagatgg atccacccca gacttttcaa agaagacacc tccttcatct tgtgttctaa 60

aaccttgcaa gttcaggaag aaaccatctg catccatatt gaaaacctga cacaatgtat 120

gcagcaggct cagtgtgagt gaactggagg cttctctaca acatgaccca aaggagcatt 180

gcaggtccta tttgcaacct gaagtttgtg actctcctgg ttgccttaag ttcagaactc 240

ccattcctgg gagctggagt acagcttcaa gacaatgggt ataatggatt gctcattgca 300

attaatcctc aggtacctga gaatcagaac ctcatctcaa acattaagga aatgataact 360

gaagcttcat tttacctatt taatgctacc aagagaagag tatttttcag aaatataaag 420

attttaatac ctgccacatg gaaagctaat aataacagca aaataaaaca agaatcatat 480

gaaaaggcaa atgtcatagt gactgactgg tatggggcac atggagatga tccatacacc 540

ctacaataca gagggtgtgg aaaagaggga aaatacattc atttcacacc taatttccta 600

ctgaatgata acttaacagc tggctacgga tcacgaggcc gagtgtttgt ccatgaatgg 660

gcccacctcc gttggggtgt gttcgatgag tataacaatg acaaaccttt ctacataaat 720

gggcaaaatc aaattaaagt gacaaggtgt tcatctgaca tcacaggcat ttttgtgtgt 780

gaaaaaggtc cttgccccca agaaaactgt attattagta agctttttaa agaaggatgc 840

acctttatct acaatagcac ccaaaatgca actgcatcaa taatgttcat gcaaagttta 900

tcttctgtgg ttgaattttg taatgcaagt acccacaacc aagaagcacc aaacctacag 960

aaccagatgt gcagcctcag aagtgcatgg gatgtaatca cagactctgc tgactttcac 1020

cacagctttc ccatgaatgg gactgagctt ccacctcctc ccacattctc gcttgtacag 1080

gctggtgaca aagtggtctg tttagtgctg gatgtgtcca gcaagatggc agaggctgac 1140

agactccttc aactacaaca agccgcagaa ttttatttga tgcagattgt tgaaattcat 1200

accttcgtgg gcattgccag tttcgacagc aaaggagaga tcagagccca gctacaccaa 1260

attaacagca atgatgatcg aaagttgctg gtttcatatc tgcccaccac tgtatcagct 1320

aaaacagaca tcagcatttg ttcagggctt aagaaaggat ttgaggtggt tgaaaaactg 1380

aatggaaaag cttatggctc tgtgatgata ttagtgacca gcggagatga taagcttctt 1440

ggcaattgct tacccactgt gctcagcagt ggttcaacaa ttcactccat tgccctgggt 1500

tcatctgcag ccccaaatct ggaggaatta tcacgtctta caggaggttt aaagttcttt 1560

gttccagata tatcaaactc caatagcatg attgatgctt tcagtagaat ttcctctgga 1620

actggagaca ttttccagca acatattcag cttgaaagta caggtgaaaa tgtcaaacct 1680

caccatcaat tgaaaaacac agtgactgtg gataatactg tgggcaacga cactatgttt 1740

ctagttacgt ggcaggccag tggtcctcct gagattatat tatttgatcc tgatggacga 1800

aaatactaca caaataattt tatcaccaat ctaacttttc ggacagctag tctttggatt 1860

ccaggaacag ctaagcctgg gcactggact tacaccctga acaataccca tcattctctg 1920

caagccctga aagtgacagt gacctctcgc gcctccaact cagctgtgcc cccagccact 1980

gtggaagcct ttgtggaaag agacagcctc cattttcctc atcctgtgat gatttatgcc 2040

aatgtgaaac agggatttta tcccattctt aatgccactg tcactgccac agttgagcca 2100

gagactggag atcctgttac gctgagactc cttgatgatg gagcaggtgc tgatgttata 2160

aaaaatgatg gaatttactc gaggtatttt ttctcctttg ctgcaaatgg tagatatagc 2220

ttgaaagtgc atgtcaatca ctctcccagc ataagcaccc cagcccactc tattccaggg 2280

agtcatgcta tgtatgtacc aggttacaca gcaaacggta atattcagat gaatgctcca 2340

aggaaatcag taggcagaaa tgaggaggag cgaaagtggg gctttagccg agtcagctca 2400

ggaggctcct tttcagtgct gggagttcca gctggccccc accctgatgt gtttccacca 2460

tgcaaaatta ttgacctgga agctgtaaaa gtagaagagg aattgaccct atcttggaca 2520

gcacctggag aagactttga tcagggccag gctacaagct atgaaataag aatgagtaaa 2580

agtctacaga atatccaaga tgactttaac aatgctattt tagtaaatac atcaaagcga 2640

aatcctcagc aagctggcat cagggagata tttacgttct caccccaaat ttccacgaat 2700

ggacctgaac atcagccaaa tggagaaaca catgaaagcc acagaattta tgttgcaata 2760

cgagcaatgg ataggaactc cttacagtct gctgtatcta acattgccca ggcgcctctg 2820

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<223> CSTA

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<223> ALDH1A1

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aatgcgtctt gtgaaattgt gtagagtgtt tgtgagcttt ttgttccctc attctgcatt 1380

aataatagct aataataaat gcatagagca attaaactgt gaggtactgt tgtatatatt 1440

tttttgcctg ttgattttga tgagatctta agttactgtg gatgagggtg atgcctatta 1500

agcagttgat tcaaatcata ttctctttaa ttcttaggat aaaaaggttt tctgctatct 1560

aaaaaaaaaa aaaaa 1575

<210> 34

<211> 515

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> LGALS7

<400> 34

acggctgccc aacccggtcc cagccatgtc caacgtcccc cacaagtcct cactgcccga 60

gggcatccgc cctggcacgg tgctgagaat tcgcggcttg gttcctccca atgccagcag 120

gttccatgta aacctgctgt gcggggagga gcagggctcc gatgccgcgc tgcatttcaa 180

cccccggctg gacacgtcgg aggtggtctt caacagcaag gagcaaggct cctggggccg 240

cgaggagcgc gggccgggcg ttcctttcca gcgcgggcag cccttcgagg tgctcatcat 300

cgcgtcagac gacggcttca aggccgtggt tggggacgcc cagtaccacc acttccgcca 360

ccgcctgccg ctggcgcgcg tgcgcctggt ggaggtgggc ggggacgtgc agctggactc 420

cgtgaggatc ttctgagcag aagcccaggc gggcccgggg ccttggctgg caaataaagc 480

gttagcccgc agcgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 515

Claims

1.一种判定用基因标记物，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，其特征在于，所述判定用基因标记物从钙调蛋白样蛋白3(CALML3)、双糖链蛋白聚糖(BGN)、氯离子通道辅助蛋白2(CLCA2)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂A(CSTA)，醛脱氢酶1家族成员A1(ALDH1A1)、神经生长因子受体(NGFR)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)、弹性蛋白(ELN)、SNRPN上游读框(SNURF)以及半乳凝素-7(LGALS7)所构成的组中选择。

2.一种判定用蛋白质标记物，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，其特征在于，所述判定用蛋白质标记物由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因编码。

3.一种癌预后判定用标记物，其特征在于，所述癌预后判定用标记物由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因或者所述基因编码的蛋白质构成。

4.一种判定用试剂盒，用于判定癌组织是否包含异质的癌细胞群体，其特征在于，所述判定用试剂盒包括：

引物组，用于扩增从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的cDNA；

探针，与从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的mRNA特异性杂交；或者

针对由从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因编码的蛋白质的特异性结合物质。

5.一种癌预后判定用试剂盒，其特征在于，包括：

6.一种判定方法，判定癌组织样品是否包含异质的癌细胞群体，其特征在于，包括：

检测工序，检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的表达；以及

判定工序，在检测到所述基因的表达的情况下，判定所述癌组织样品包含异质的癌细胞群体。

7.根据权利要求6所述的判定方法，其特征在于，

所述检测工序通过检测所述基因的mRNA来进行。

8.根据权利要求6所述的判定方法，其特征在于，

所述检测工序通过检测所述基因编码的蛋白质来进行。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的判定方法，其特征在于，

所述癌组织样品是源于乳腺癌、恶性黑素瘤、肺癌或者胰腺癌的癌组织样品。

10.根据权利要求9所述的判定方法，其特征在于，

所述乳腺癌是雌激素受体(-)孕激素受体(-)HER2(-)乳腺癌。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的判定方法，其特征在于，

异质的所述癌细胞群体包含ZEB1(+)CLDN1(-)细胞以及ZEB1(-)CLDN1(+)细胞。

12.一种癌预后判定方法，其特征在于，包括：

检测工序，检测癌组织样品中的从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的至少一种基因的表达；以及判定工序，在检测到所述基因的表达的情况下，判定所述癌组织样品来源的患者预后不良。

13.一种异质的癌细胞群体，其特征在于，所述异质的癌细胞群体表达从CALML3、BGN、CLCA2、CSTA、ALDH1A1、NGFR、S100A8、ELN、SNURF以及LGALS7所构成的组中选择的基因。