CN108064292A - RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制 - Google Patents

RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且与SEQ NO.1基本互补。所述双链RNA用于诱导针对亨廷顿蛋白外显子1序列的RNAi。本发明的双链RNA能够减少动物模型中的神经元细胞死亡和亨廷顿蛋白聚集体。

Description

RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制
背景技术
亨廷顿蛋白基因也被称为HTT或HD(亨廷顿舞蹈病)基因，编码亨廷顿蛋白。亨廷顿蛋白基因是约13.5kb的大基因(亨廷顿蛋白约350kDa)。亨廷顿舞蹈病是亨廷顿蛋白基因中的基因突变引起的遗传性神经变性疾病。基因突变涉及亨廷顿蛋白基因中被称为CAG三核苷酸重复的DNA片段。通常，人亨廷顿蛋白基因中的CAG片段重复多次，即约10-35次。患上亨廷顿舞蹈病的人在至少一个等位基因中有扩大数量的CAG重复。患病的人通常从一位患病的父母遗传了突变的等位基因。在极少数情况下，患有亨廷顿舞蹈病的个体的父母均不患有该病(散发性HD)。具有36-39个CAG重复的人可能会出现亨廷顿舞蹈病的病征和症状，而具有40个或更多CAG重复的人几乎总是会罹患这种疾病。CAG重复的尺寸的增加导致生成延长的(突变的)亨廷顿蛋白。该蛋白在细胞中被加工成较小的片段，该较小的片段具有细胞毒性并在神经元中积累和聚集。这会破坏神经元的正常功能并导致神经元的最终死亡。这是在脑部发生的引起亨廷顿舞蹈病的病征和症状的过程。
RNA干扰(RNAi)是一种涉及序列特异性下调mRNA的天然存在的机制。mRNA的下调导致表达的蛋白质的量减少。RNA干扰是由双链RNA引发的。双链RNA的一条链与其靶标，即mRNA，基本上或完全互补。该链被称为引导链。RNA干扰的机制涉及引导链并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该复合体是通过互补碱基配对结合其靶mRNA的多转换(multipleturnover)复合体。一旦结合到其靶mRNA，它可以切割mRNA或降低翻译效率。RNA干扰自发现以来被广泛用于敲减特定的靶基因。已经使用的诱导RNA干扰的触发因素包括使用小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。此外，天然触发RNAi的分子，即所谓的小分子RNA(miRNA)，已被用于制造模仿其天然存在的对应物的人工miRNA。这些策略的共同之处在于，它们提供了被设计为靶向所选择的基因的、基本上双链的RNA分子。利用RNAi的序列特异性模式的基于RNAi的治疗方法正在开发中，并且有几种目前正在进行临床试验(参见i.a.Davidson和McCray,Nature Reviews-Genetics,2011；Vol.12；329-340)。
由于亨廷顿舞蹈病涉及突变亨廷顿蛋白的表达，其积累导致疾病发生，而RNA干扰提供了治疗该疾病的机会，因为它可以降低亨廷顿蛋白基因的表达。基于这种方法的范例涉及减少突变Htt蛋白，以由此减少由突变Htt蛋白产生的毒性作用，从而实现亨廷顿舞蹈病症状的减少和/或延迟，或者甚至完全预防亨廷顿舞蹈病症状。在现有技术中靶向亨廷顿蛋白基因抑制被假设为包括列出大约两千个假设的siRNA靶序列(WO2005105995)。降低亨廷顿蛋白基因表达的策略是本领域已知的，并涉及特异性靶向突变的亨廷顿蛋白基因(例如US20090186410，US20110172291)。或者，也已经使用RNA干扰来靶向突变基因和非突变基因(例如，Rodriguez-Lebron et al.,2005,Mol Ther.Vol 12No.4:618-633；Franich etal.,2008,Mol Ther,Vol.16No.5；947-956；Drouet et al.,2009,Annals of Neurology；Vol.65No.3；276-285以及McBride et al.Mol Ther.2011Dec；19(12):2152-62；US20080015158,WO2008134646)。在后一种情况下，证明了野生型亨廷顿蛋白质的敲减不具有任何明显的不利影响。
发明内容
本发明提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且与SEQ IDNo.1基本互补。测试大量靶序列以有效敲减亨廷顿蛋白基因。发现本发明选择的双链RNA可有效降低亨廷顿蛋白基因表达。当直接通过转染或间接通过DNA的递送(例如转染)或通过载体介导的表达(由此可表达所述双链RNA)将所述双链RNA提供于细胞中时，所述双链RNA能够降低突变型亨廷顿蛋白基因和正常的亨廷顿蛋白基因的表达。此外，证明了当本发明的双链RNA作为siRNA提供或于miRNA支架中提供时，其能够降低靶基因表达。当在动物模型中测试时，证明了本发明的双链RNA能够减少神经元细胞死亡和亨廷顿蛋白聚集体。本发明提供的双链RNA与本领域中靶向亨廷顿蛋白基因的双链RNA相比有改进，或至少提供了其替代方案。
本发明的双链RNA可以作为siRNA、shRNA、pre-miRNA(pre-miRNA)或pri-miRNA(pri-miRNA)提供。这样的双链RNA可被直接递送到靶细胞，例如，通过使用例如转染方法的细胞摄取。优选地，使用基因治疗载体实现所述递送，其中siRNA、shRNA、pre-miRNA或pri-miRNA的表达盒包括在载体中。这样，可以恒定地为细胞供应双链RNA，以实现持久的亨廷顿蛋白基因抑制而不需要重复给药。优选地，所选择的病毒载体是AAV5。因此，本发明还提供了本发明的双链RNA的医疗用途(例如治疗亨廷顿舞蹈病)，其中此类医疗用途还可以包括能够表达本发明的所述双链RNA的表达盒或病毒载体，例如AAV5。
附图说明
图1为人亨廷顿蛋白(HTT)基因和靶序列。(A)具有CAG扩增(黑色)和miH1-H21的靶序列(浅灰色)的人HTT基因(L27350.1)的示意图；(B)HTT基因的外显子1RNA序列(SEQ IDNO.2)。CAG重复序列为核苷酸367-429。(C)测试的外显子1的靶序列的示意图(H1，185-205；H2，186-206；H3，189-209；H4，191-211；H5，194-214；H6，196-216；H7，250-270；H8，261-281，H9，310-330；H10，311-331，H11，339-359，H12，345-365，H13，454-474；H14，459-479；H15，477-497；H16，486-506；H17，492-512；H18，498-518；H19，549-569；H20，557-577；H21，558-578，H1-H21对应于SEQ ID NO.23-43)。所示出的序列是DNA序列。数字是指SEQ ID NO.2中相应的RNA核苷酸序列。除DNA编码“t”而RNA编码“U”之外，SEQ ID NO.2的相应RNA靶序列具有C)中所列的序列。
图2.双链RNA和表达盒的实例。(A)具有所示miH12引导序列(灰色)的miH12pre-miH12-155(SEQ ID NO.44)和pre-miH12-451支架(SEQ ID NO.45)的pri-miRNA/pre-miRNA支架的实例。(B)本发明的双链RNA以及它们是如何被RNAi机制加工的示意图。双链RNA可以是短发夹RNA(1)或延伸的siRNA(2)。发夹RNA或延伸的siRNA在近端具有第一RNA序列，如图所示(用1和括号表示)。短发夹RNA或延伸的siRNA可以在细胞中通过RNAi机制来加工以产生siRNA(3)，其也可以是本发明的双链RNA，其的包含第一RNA序列的一条链可被并入RISC复合体(4)。双链RNA可以包含在pri-miRNA序列(5)或pre-miRNA序列(6)中。pri-miRNA可以通过RNAi机制加工以产生pre-miRNA并且随后产生成熟的miRNA双链体(7)，其的包含第一RNA序列的一条链可以并入RISC复合体(4)。pre-miRNA、pri-miRNA和miRNA双链体中第一RNA序列的位置用1和括号示出。(C)pVD-CMV-miH12-155表达盒的DNA序列(CMV启动子(1-588)、间插序列、绿色荧光蛋白GFP序列(713-1432)、5'pri-miRNA侧翼(1433-1514))、5'pre-miRNA、引导链(第一RNA序列)(1520-1540)、环序列(loop sequence)、过客链(第二RNA序列)(1560-1578)、3'pre-miRNA)3'pri-miRNA侧翼(1584-1704)、HSV TKpolyA信号(1705-1976)；(D)pVD-CAG-miH12-451的DNA序列(CAG启动子(43-1715)、5'pri-miRNA侧翼(1716-2017)、5'pre-miRNA、引导链(第一RNA序列)(2034-2054)、第二RNA序列&3'pre-miRNA、3'pri-miRNA侧翼(2090-2320)、hGH polyA信号(2321-2417)和(E)pVD-PGK-miH12-451表达盒的DNA序列(PGK启动子(23-277)、5'pri-miRNA侧翼(278-794)、5'pre-miRNA、引导链(第一RNA序列)(811-831)、第二RNA序列&3'pre-miRNA、3'pri-miRNA侧翼(867-1097)、hGH polyA 信号(1098-1194)。(F)由pVD-CMV-miH12-155编码的pri-miH12-155序列。(G)由pVD-CAG-miH12-451编码的pri-miH12-451序列。(G)由pVD-PGK-miH12-451编码的pri-miH12-451序列。对于图(E)、(F)和(G)，字体类型与以上相应DNA中所用相同，启动子序列为粗体，绿色荧光蛋白序列为斜体下划线(仅C)，pri-miRNA序列具有正常的字体类型，引导链(第一RNA序列)是粗体斜体，过客链或第二RNA序列是斜体，pre-miRNA序列加下划线，polyA信号是粗体下划线。
图3.miH1-21的体外敲减效能。(A)通过靶向外显子1的总HTT敲减。将LucHTT与miH1-miH21在Hek293T细胞中共转染。在转染后48小时测量海肾荧光素酶荧光(RL)和萤火虫荧光素酶荧光(FL)。使用miScr(对照)作为阴性对照，设为100％。miH12显示出最强的敲减效率。(B)LucHTT敲减是通过长度为19-23个核苷酸的合成siH12进行的。
图4.具有不同启动子的miH12-451的体外敲减效能。(A)LucHTT报道基因已与CAG-miH12或PGK-miH12变体共转染，并且如上文图3中所述测定敲减效能。(B)在特定的LucHTT*报道基因上测量由CAG或PGK启动子表达的miH12-451*的过客(*)链活性。没有检测到过客链活性。
图5.AAV5递送的miH12的体内效能。(a)实验构建。以1:5的比例将AAV5-Luc73QHTT和AAV5-CMV-miScr-155或AAV5-CMV-miH12-155共注射给小鼠。测量点用箭头表示；(b)通过IVIS测量注射后6周动物体内的AAV5-Luc73QHTT敲减；(c)由AAV5-miH12引起的AAV5-Luc73QHTT敲减趋势在注射后长达6周。
图6.在大鼠HD机理模型中人HTT敲减的概念证明。(A)实验构建；(B)脑组织学显示AAV5-CMV-miH12-155组具有较少的神经变性(DARP32)和较少的突变型Htt(EM48)聚集体；(C)GFP脑组织学；(D)Iba1免疫激活标志物脑组织学。
图7.在人源化Hu97/18HD小鼠标模型中的人HTT敲减。(A)在缓慢经纹状体内注射、对流增强扩散(CED)经纹状体内注射或脑室内(ICV)注射AAV5-CMV-miH12-155后，鼠脑中的转导效率。注射后5周观察到GFP荧光。(B)测量AAV5-miHTT递送后鼠脑中的人HTT敲减的蛋白免疫印迹。(C)HTT蛋白质免疫印迹定量。
图8.所选择H12靶与现有技术靶序列的比较。在Hek293T细胞中将LucHTT与所示的siRNA(A)和miRNA构建体(B和C)共转染。在转染后48小时测量海肾荧光素酶荧光和萤火虫荧光素酶荧光。miH12和siH12显示出最强的敲减效率。
具体实施方式
本发明提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且与SEQ IDNo.1基本互补。
SEQ ID NO.1(5'-CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3')对应于亨廷顿蛋白基因的外显子1(SEQ ID NO.2)的靶序列。如图1B所示的外显子1具有21个重复CAG序列，即核苷酸367-429。图1B所示的外显子1序列对应于与疾病无关的正常亨廷顿蛋白基因。与亨廷顿舞蹈病相关的对应的突变型亨廷顿蛋白基因包含远远多于21个的CAG重复序列。如上所述，具有36到39个CAG重复的人可能会出现亨廷顿舞蹈病的病征和症状，而具有40个或更多个重复的人几乎总是罹患该病。靶序列SEQ ID NO.1基本全部包含在外显子1序列中，无论CAG重复的数目如何。
SEQ ID NO.1对应于SEQ ID NO.2的核苷酸345-365。使用被设计为诱导SEQ IDNO.2的序列特异性抑制的双链RNA对外显子1中的18个不同靶序列进行靶向性测试(参见图1和图3A)，并且发现特别是靶向来自外显子1的该序列可用于降低亨廷顿蛋白基因表达。发现具有2个核苷酸突出端的、由19、20、21、22和23个连续的碱基对组成的、长度不同的siRNA，对于该序列是有效的，在引导序列位置携带与SEQ ID NO.1互补的21个核苷酸序列的两个单独的miRNA支架也是有效的(见图3A、3B和4)。因此，与亨廷顿蛋白靶序列SEQ IDNO.1基本互补的第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度。
本发明的第一RNA序列包含在双链RNA的引导链中，也被称为反义链，因为它与有义靶序列是互补的(“反的”)。第二RNA序列包含在过客链中，也称为“有义链”，因为它可能与靶序列基本相同或与靶序列相同。第一RNA序列和第二RNA序列包含在双链RNA中并且是基本互补的。根据本发明的所述双链RNA将诱导RNA干扰从而降低亨廷顿蛋白突变型基因和野生型蛋白基因的表达。因此，应当理解，基本互补意味着不需要使第一RNA序列和第二RNA序列的所有核苷酸碱基配对(即完全互补)，或使第一RNA序列和SEQ ID NO.1的所有核苷酸碱基配对。只要双链RNA能够诱导RNA干扰，从而序列特异性地靶向包含SEQ ID NO.1的序列，则这种基本互补性在本发明考虑之列。
因此，在一个实施方案中，本发明的双链RNA包含第一RNA序列和第二RNA序列，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，并且其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且基本上与SEQ ID NO.1互补，该双链RNA能够诱导RNA干扰以序列特异性地降低包含SEQ ID NO.1的RNA转录物的表达。在另一个实施方案中，所述诱导RNA干扰以降低包含SEQ ID NO.1的RNA转录物的表达意味着它将降低人亨廷顿蛋白基因的表达。
可以通过使用标准荧光素酶报道基因测定法和适当的对照，如实施例中所述的和本领域已知的方法(Zhuang et al.2006Methods Mol Biol.2006；342：181-7)容易地确定是否是这种情况。例如，可以使用包含SEQ ID No.1的荧光素酶报道基因来证明本发明的双链RNA能够进行序列特异性敲减。此外，如实施例部分所示，可以用特异性抗体确定亨廷顿蛋白表达，以确定蛋白质免疫印迹分析中的表达量，RNA印迹(Northern blot)分析可检测RNA转录物的量。
因此，本发明的双链RNA用于诱导RNA干扰。本发明的双链RNA用于降低包含SEQ IDNO.1的转录物的表达，例如SEQ ID NO.2或具有不同数目的CAG重复的类似物。
如上所述，双链RNA能够诱导RNA干扰。适用于诱导RNAi双链RNA结构在本领域中是熟知的。例如，小干扰RNA(siRNA)包含两条单独的RNA链，一条链包含第一RNA序列，另一条链包含第二RNA序列。经常使用的siRNA设计包括具有3'双核苷酸突出端的19个连续碱基对(参见图2A)。该设计基于观察到的较大的双链RNA的Dicer处理，该处理会产生具有这些特征的siRNA。3'突出端可以包含在第一RNA序列中。3'突出端可以在第一RNA序列之外。组成siRNA的两条链的长度可以是19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸或更多。两条链中的每一条包含第一RNA序列和第二RNA序列。包含第一RNA序列的链也可以由其组成。包含第一RNA序列的链也可以由第一RNA序列和突出端序列组成。
siRNA也可以用作Dicer底物。例如，Dicer底物可以是由具有27个连续碱基对的两条链的RNA组成的27聚体。第一RNA序列位于27聚体双链体的3'末端。在3'末端，像siRNA一样，是双核苷酸突出端。3'突出端可以包含在第一RNA序列中。3'突出端可以在第一RNA序列之外。在第一RNA序列的5'末端，可以包括其他的序列，所述其他的序列与相邻于SEQ IDNO.1的靶序列互补或不互补。siRNA dicer底物的另一端是平端的。这种Dicer底物设计导致优先被Dicer加工从而形成类似如上所述的siRNA设计的siRNA，其具有19个连续碱基对并且在两个3'末端具有双核苷酸突出端。在任何情况下，siRNA等都由两条单独的RNA链组成(Fire et al.1998,Nature.1998Feb 19；391(6669):806-11)，每条RNA链包含本发明的第一RNA序列和第二RNA序列或由其组成。
本发明的双链RNA不需要将第一RNA序列和第二RNA序列两者包含在两条单独的链中。第一RNA序列和第二RNA序列也可以包含在RNA的单条链中，例如shRNA。shRNA从5'到3'方向可以包含第二RNA序列-环序列-第一RNA序列-任选的双核苷酸突出序列。或者，shRNA从5'到3'方向可以包含第一RNA序列-环序列-第二RNA序列-任选的双核苷酸突出序列。这样的RNA分子通过基本互补的第一RNA序列和第二RNA序列形成分子内碱基对。合适的环序列是本领域公知的(如Dallas et al.2012Nucleic Acids Res.2012Oct；40(18):9255-71和Schopman et al.,Antiviral Res.2010May；86(2):204-11中所示)。
环序列也可以是茎环序列，由此使shRNA的双链区域延伸。不受理论的约束，与上述的siRNA dicer底物相似，shRNA通常由Dicer加工以得到例如具有如上所述的siRNA设计的siRNA，即具有19个连续的碱基对并且在两个3'末端具有双核苷酸突出端。如果通过Dicer加工双链RNA，优选使第一RNA序列和第二RNA序列处于末端。
本发明的双链RNA也可以并入pre-miRNA或pri-mi-RNA支架中。小分子RNA(即miRNA)为源自在例如哺乳动物细胞中表达的双链RNA分子的引导链。miRNA是由pre-miRNA前体分子通过RNAi机制加工而得到的，类似于如上所述的shRNA或延伸的siRNA的加工，并且被并入活化的RNA诱导的沉默复合体(RISC)中(Tijsterman M,Plasterk RH.Dicers atRISC；the mechanism of RNAi.Cell.2004Apr 2；117(1):1-3)。不受理论束缚，pre-miRNA是发夹分子，该发夹分子可以是更大的RNA分子(pri-miRNA)的一部分，例如，包含在内含子中，内含子首先被Drosha加工以形成pre-miRNA发夹分子。pre-miRNA分子是一个shRNA样分子，随后可以通过Dicer对其进行加工以产生siRNA样双链的双链体。作为双链RNA双链体的一部分的miRNA，即引导链，随后被并入RISC中。RNA分子例如自然界中存在的RNA分子，即pri-miRNA、pre-miRNA或miRNA双链体，可用作产生特异性靶向所选基因的人工miRNA的支架。基于预测的RNA结构，例如使用例如m-fold软件所预测的RNA结构，存在于RNA结构中的天然miRNA序列(即双链体，pre-miRNA或pri-miRNA)以及与其互补的结构中存在的序列被除去并替换成本发明的第一RNA序列和第二RNA序列。可以选择第一RNA序列和第二RNA序列，使得形成的RNA结构(即pre-miRNA、pri-miRNA和/或miRNA双链体)类似于相应的预测的原始序列。如在自然界中发现的pre-miRNA、pri-miRNA和miRNA双链体(由通过互补碱基配对杂交的两个单独的RNA链组成)通常不是完全碱基配对的，即并非与如上所定义的第一链和第二链对应的所有核苷酸都是碱基配对的，并且第一链和第二链通常不是相同的长度。在例如Liu YP Nucleic Acids Res.2008May；36(9):2811-24中对如何使用miRNA前体分子作为任何选定的靶序列的支架和基本互补的第一RNA序列的支架进行了描述。
在任何情况下，上述内容清楚表明包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA可以包含其他核苷酸和/或核苷酸序列。双链RNA可以包含在单条RNA序列中或者包含在两条单独的RNA链中。不受理论的束缚，无论双链RNA使用什么设计，其设计均使得包含本发明的第一RNA序列的反义序列可以通过RNAi机制处理，如此该序列可以并入RISC复合体中发挥作用。本发明的包含第一RNA序列或由其构成的序列能够序列特异性地靶向SEQ ID NO.1。因此，只要双链RNA能够诱导RNAi，这样的双链RNA就在本发明的考虑之列。因此，在一个实施方案中，本发明的双链RNA包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA中。
在本文中术语互补被定义为可以通过氢键结合另一个核酸序列的核酸序列的核苷酸，即能够进行碱基配对的核苷酸。核糖核苷酸(即RNA的构建单元)由含有糖、磷酸和选自嘌呤(鸟嘌呤、腺嘌呤)或嘧啶(尿嘧啶，胞嘧啶)的碱基的单体(核苷酸)组成。互补的RNA链形成双链RNA。双链RNA可以由两条单独的互补RNA链形成，或者两条互补RNA链可以包含在一条RNA链中。在互补RNA链中，核苷酸胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)可以形成碱基对，鸟嘌呤和尿嘧啶(G和U)以及尿嘧啶和腺嘌呤(U和A)形成碱基对。术语基本互补意味着不需要使第一RNA序列和第二RNA序列完全互补，或不需要使第一RNA序列和SEQ ID NO.1完全互补。例如，图2A所示的第一核苷酸和第二核苷酸是基本互补的，而不是完全互补的。
在一个实施方案中，第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间的基本互补性由无错配、一个错配核苷酸或两个错配核苷酸的情况组成。应当理解，一个错配的核苷酸是指在与SEQID NO.1碱基配对的第一RNA序列的整个长度上，有一个核苷酸不与SEQ ID NO.1碱基配对。无错配是指所有核苷酸均与SEQ ID NO.1碱基配对，具有两个错配是指两个核苷酸不与SEQID NO.1碱基配对。第一RNA序列也可长于21个核苷酸，在这种情况下，在SEQ ID NO.1的整个长度上确定基本互补性。这意味着当本实施方案中的SEQ ID NO.1与第一RNA序列碱基配对时，在其整个长度上没有错配或具有一个或两个错配。例如，如图3B和实施例所示，测试了第一核苷酸序列长度为22和23个核苷酸的siRNA。这些第一核苷酸序列没有错配，并且与SEQ ID NO.1完全互补。只要本发明的双链RNA能够降低包含SEQ ID NO.1的转录物(例如萤光素酶报道基因或例如包含SEQ ID NO.1的转录物)的表达，根据本发明可以允许第一核苷酸序列和SEQ ID NO.1之间有一些错配。在该实施方案中，第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间的基本互补性包括在第一RNA序列或SEQ ID NO.1的全长上，以其中最短的序列为准，没有错配或具有一个或两个错配。
在一个实施方案中，第一RNA序列和SEQ ID NO.1具有至少15、16、17、18或19个碱基配对的核苷酸。优选地，第一RNA序列和SEQ ID NO.1是基本互补的，所述互补性包含至少19个碱基对。在另一个实施方案中，第一RNA序列具有至少8、9、10、11、12、13或14个与SEQID NO.1的连续核苷酸碱基配对的连续核苷酸。在另一个实施方案中，第一RNA序列具有至少19个与SEQ ID NO.1的连续核苷酸碱基配对的连续核苷酸。在另一个实施方案中，第一RNA序列包含至少19个与SEQ ID NO.1的19个连续核苷酸碱基配对的连续核苷酸。在另一个实施方案中，第一RNA序列具有至少17个与SEQ ID NO.1碱基配对的核苷酸，并具有至少15个与SEQ ID NO.1的连续核苷酸碱基配对的连续核苷酸。第一核苷酸的序列长度最多为21、22、23、24、25、26或27个核苷酸。
如上所述，本发明的错配是指第一RNA序列的核苷酸不与SEQ ID NO.1碱基配对。不会进行碱基配对的核苷酸为A和C、C和U、或A和G。错配也可由核苷酸的缺失或核苷酸的插入造成。当错配是第一RNA序列中的缺失时，这意味着相对于第一RNA序列的全长，SEQ IDNO.1的核苷酸不与第一RNA序列碱基配对。可以碱基配对的核苷酸是A-U、G-C和G-U。G-U碱基对也称为G-U摇摆或摇摆碱基对。在一个实施方案中，第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间的GU碱基对数目为0、1或2。在一个实施方案中，第一RNA序列与SEQ ID NO.1之间没有错配，一个G-U碱基对或多个G-U对是允许的。优选地，在第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间不存在G-U碱基对，或者第一RNA序列和SEQ ID NO.1仅具有为A-U或G-C的碱基对。优选地，在第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间不存在G-U碱基对并且不存在错配。因此，本发明的双链RNA的第一RNA序列优选与SEQ ID NO.1完全互补，所述互补性由G-C和A-U碱基对组成。
在第一核苷酸序列和SEQ ID NO.1之间可不需要具有完全互补性(即，完全碱基配对(无错配)并且无G-U碱基对)，这样第一核苷酸序列仍然可以充分抑制基因表达。此外，例如可以设想不具有完全互补性以避免或减少偏离目标(off-target)的序列特异性基因抑制，同时保持对包含SEQ ID NO.1的转录物的序列特异性抑制。然而，可以优选具有完全互补性，因为其可导致更有效的抑制。不受理论约束，在第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间具有完全互补性可允许包含所述第一RNA序列的活化的RISC复合体切割其靶序列，而具有错配可能仅允许抑制翻译，后者导致的抑制作用没那么强大。
在一个实施方案中，第一RNA序列具有至少19个核苷酸、优选20个核苷酸、更优选至少21个核苷酸的序列长度。序列长度也可以是至少22个核苷酸，或至少23个核苷酸。本发明的第一RNA序列可以选自SEQ ID NO.3-7。
表1：第一RNA序列
已经证明表1的第一RNA序列特异性抑制包含SEQ ID NO.1的转录物，如实施例部分中所述。
在一个实施方案中，本发明的双链RNA的第一核苷酸序列与SEQ ID NO.1完全互补。这意味着在第一RNA序列或SEQ ID NO.1的整个长度上(以最短者为准)，第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间没有错配。优选地，第一核苷酸序列和SEQ ID NO.1是完全互补的，仅包括G-C和A-U碱基对。优选地，第一RNA序列选自与SEQ ID NO.1完全互补的SEQ ID NO.3-7。最优选地，第一RNA序列是SEQ ID NO.5。当第一核苷酸序列是21个核苷酸或更少个核苷酸(SEQ ID NO.3、4和5)时，第一核苷酸序列的所有核苷酸都与SEQ ID NO.1碱基配对。当第一核苷酸序列长于21个核苷酸(SEQ ID NO.6和7)时，SEQ ID NO.1的所有核苷酸均与第一核苷酸序列碱基配对。包含在第一RNA序列中的其他核苷酸不与SEQ ID NO.1碱基配对。当第一核苷酸序列长于21个核苷酸并且其他核苷酸是引导链的一部分时，优选其他核苷酸与SEQ ID NO.2中存在的SEQ ID NO.1的侧翼序列互补。
关于第二RNA序列，第二RNA序列与第一RNA序列基本互补。第二RNA序列与第一RNA序列组合形成双链RNA。如上所述，这是用于形成RNA干扰机制的合适底物，使得源自第一RNA序列的引导序列包含在RISC复合体中，以便序列特异性抑制其靶标的表达，即亨廷顿蛋白基因表达。如上所述，这种双链RNA优选包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA中。
第二RNA序列的序列与靶序列具有相似性。然而，与第一RNA序列和SEQ ID NO.1之间的基本互补性相比，第二RNA序列与第一RNA序列的基本互补性可以选择为具有更低的基本互补性。因此，第二RNA序列可以包含0、1、2、3、4或更多个错配，0、1、2、3或更多个G-U摇摆碱基对，并且可以包括插入0、1、2、3、4个核苷酸和/或缺失0、1、2、3、4个核苷酸。优选地，第一RNA序列和第二RNA序列是基本互补的，所述互补性包括0、1、2或3个G-U碱基对和/或其中所述互补性包含至少17个碱基对。
这些错配、G-U摇摆碱基对、插入和缺失是关于第一RNA序列，即在第一RNA序列和第二RNA序列之间形成的双链区域。只要第一RNA序列和第二RNA序列可以基本上进行碱基配对并且能够诱导SEQ ID NO.1的序列特异性抑制，本发明允许这种基本互补性。还应当理解，第一RNA序列和第二RNA序列之间的基本互补性可取决于所选择的双链RNA设计。它可取决于例如所选择的将双链RNA并入其中的miRNA支架。
表2：第二RNA序列
在一个实施方案中，第二RNA序列选自SEQ ID NO.8-14。在表2中列出了根据本发明的所述第二RNA序列的实例。SEQ ID NO.8、9、10、11和12在其全长上与SEQ ID NO.1完全互补。SEQ ID NO.13和14可以与具有对应于21个核苷酸的SEQ ID NO.5的序列的第一核苷酸序列组合，该第一核苷酸序列在全长上与SEQ ID NO.1互补。SEQ ID NO.13与具有两个核苷酸缺失(导致SEQ ID NO.5的相应的2个碱基不进行碱基配对)和进行碱基配对的19个核苷酸的SEQ ID NO.5互补。SEQ ID NO.14与具有两个核苷酸缺失、两个错配和进行碱基配对的17个核苷酸的SEQ ID NO.5互补。互补性也可以在图2B中看到，因为SEQ ID NO.5和SEQID NO.13的组合存在于miH12_155中，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14的组合存在于miH12_451a中。因此，上述内容清楚地表明，与SEQ ID NO.1相比，第二RNA序列不需要与第一RNA序列的互补性，而是可包含导致错配的缺失、插入和突变。
由上述可以清楚地看出，相对于完全互补(即完全碱基配对)的第一RNA序列和第二RNA序列，第一RNA序列和第二RNA序列之间的基本互补性可包括错配、缺失和/或插入。在一个实施方案中，第一RNA序列和第二RNA序列具有至少11个连续的碱基对。因此，第一RNA序列的至少11个连续核苷酸和第二RNA序列的至少11个连续核苷酸是完全互补的。在另一个实施方案中，第一RNA序列和第二RNA序列具有碱基配对的至少15个核苷酸。在第一RNA序列的至少15个核苷酸与第二RNA序列的至少15个核苷酸之间的所述碱基配对可以由G-U、G-C和A-U碱基对组成，或者可以由G-C和A-U碱基对组成。在另一个实施方案中，第一RNA序列和第二RNA序列具有碱基配对的至少15个核苷酸并具有碱基配对的至少11个连续碱基对。在另一个实施方案中，第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中所述互补性包含至少17个碱基对。所述17个碱基对可以优选为17个连续的碱基对，所述碱基配对由G-U、G-C和A-U碱基对组成或由G-C和A-U碱基对组成。
在一个实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列选自SEQ ID NO.3和8；SEQID NO.4和9；SEQ ID NO.5和10；SEQ ID NO.5和13；SEQ ID NO.5和14；SEQ ID NO.6和11；以及SEQ ID NO.7和12。第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的这些组合被证明当包含在siRNA或miRNA支架中时是有效的。
因为30个连续碱基对或更长的双链RNA可以通过双链RNA(dsRNA)活化的蛋白激酶途径触发先天免疫应答，所以基本互补的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列优选不形成这样的双链RNA。因此，双链RNA优选少于30个连续的碱基对。优选地，包含本发明的双链RNA的pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA不包含30个连续的碱基对。
优选地，本发明的双链RNA包含在pre-miRNA或pri-miRNA支架中。pri-miRNA支架包含pre-miRNA支架。pre-miRNA支架包含本发明的双链RNA，即第一RNA序列和第二RNA序列。优选地，本发明的双链DNA包含在衍生自miR-451a(也称为miR-451)或miR-155的pri-miRNA支架中。包含在pre-miRNA支架内的本发明的双链RNA的实例示于图2A中。这些pre-miRNA的序列列于下表3。
表3：具有SEQ ID NO.5的pre-miRNA支架
SEQ ID NO.15的pre-mRNA(pre-miRNA)序列由对应于SEQ ID NO.15的核苷酸1-16的5'臂、对应于SEQ ID NO.5(即SEQ ID NO.15的核苷酸17-37)的第一RNA序列、对应于SEQID NO.14(即SEQ ID NO.15的核苷酸38-56)的第二RNA序列和对应于SEQ ID NO.15的核苷酸57-72的3'-臂组成。本发明的pre-miR451a支架包含对应于SEQ ID NO.15的核苷酸1-16的5'-臂、随后是本发明的第一核苷酸序列、本发明的第二核苷酸序列以及对应于SEQ IDNO.15的核苷酸57-72的3'-臂。优选地，选择第一RNA序列和第二RNA序列使得当包含在pri-miR451a支架中时，可获得如图2B所示的或与其高度相似的预测结构。优选地，在第一RNA序列和第二RNA序列之间形成的碱基对是G-C、G-U和A-U碱基对，优选地，第一RNA序列的序列长度为21个核苷酸，并且第二RNA序列的长度优选为19个核苷酸。优选地，在第一RNA序列和第二RNA序列之间形成的碱基对是G-C和A-U碱基对，优选地，第一RNA序列的序列长度为21个核苷酸，并且第二RNA序列的长度优选为19个核苷酸。不受理论的束缚，因为pri-R451a支架不会导致将被RNAi机制加工的过客链并入RISC，因此该pri-R451a支架是优选的(Cheloufi et al.,2010Jun 3；465(7298):584-9)。原则上siRNA或miRNA双链体的两条链都可以并入RISC。由于过客链(对应于第二序列)可导致靶向亨廷顿蛋白转录物以外的转录物，因此使用pri-miR451a或pre-miR451a支架可使得能够避免这种不希望的靶向。当测试潜在的“过客链”活性时，在pri-451a支架的情况下没有检测到活性(见图4A和4B)。认为pre-miRNA发夹的加工不依赖于Dicer并且是被Ago2切割的(Yang et al.,Proc Natl AcadSci U S A.2010Aug 24；107(34):15163-8)。
SEQ ID NO.16的pre-mRNA序列由对应于SEQ ID NO.16的核苷酸1-5的5'臂、对应于SEQ ID NO.5(即SEQ ID NO.16的核苷酸6-26)的第一RNA序列、SEQ ID NO.16的核苷酸27-45表示的环序列、对应于SEQ ID NO.13(即SEQ ID NO.16的核苷酸46-64)的第二RNA序列和对应于SEQ ID NO.16的核苷酸65-69的3'-臂组成。包含根据本发明的第一RNA序列和第二RNA序列的pre-155支架包括对应于SEQ ID NO.16的核苷酸1-5的5'臂、第一RNA序列、对应于SEQ ID NO.16的核苷酸27-45的环序列、第二RNA序列和对应于SEQ ID NO.16的核苷酸65-69的3'-臂组成。优选地，选择第一RNA序列和第二RNA序列使得当其包含在pre-miR155支架(或pri-miRNA支架)中时可以获得与如图2B所示的高度相似的预测结构。优选地，在第一RNA序列和第二RNA序列之间形成的碱基对是G-C或A-U碱基对，优选地，第一RNA序列的序列长度为21个核苷酸，并且第二RNA序列的长度优选为19个核苷酸。所述19个核苷酸优选与长度为21个核苷酸的第一核苷酸序列的核苷酸2-18完全互补。
当pre-miRNA被包含在较大的RNA序列中时，其需要允许Drosha进行识别和切割的5'-单链侧翼序列和3'-单链侧翼序列。适于使Drosha进行识别和切割的所述序列是5'-pri-miRNA序列和3'-pri-miRNA序列。例如，如图5A所示的表达的pre-miH12_155序列在表达载体CMV-miH12-155中具有为miR155的5'-pri-miRNA和3'-pri-miRNA序列的侧翼(图2C)。包含miRH12_155的pri-miRNA序列在图2F中列出，5'-pri-miRNA对应于核苷酸1-87，3'-pri-miRNA对应于核苷酸147-272。同样，由图2D和2E中其各自的载体表达的CAG-miH12-451和PGK-miH12-451pri-miRNA序列示于图2G和2H。表达的CAG-miH12-451RNA的5'-pri-miRN和3'-pri-miRNA对应于核苷酸1-302和375-605，表达的PGK-miH12-451RNA的5'-pri-miRNA和3'-pri-miRNA分别对应于核苷酸1-516和589-819。单链侧翼的长度可以变化，但通常约为80个核苷酸(Zeng and Cullen,J Biol Chem.2005 Jul29；280(30):27595-603；Cullen,Mol Cell.2004Dec 22；16(6):861-5)。可以容易地确定单链侧翼的最小长度，因为当它变得太短时，Drosha处理可能失败并且序列特异性抑制将被减少甚至将不存在。在一个实施方案中，相对于具有至少50个核苷酸的预测的pre-miRNA结构，根据本发明携带第一RNA序列和第二RNA序列的pri-miRNA支架具有5'-序列侧翼和3'-序列侧翼。pre-miRNA和pri-miRNA衍生的序列优选全部衍生自同一天然存在的pri-miRNA序列。
SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的pre-miRNA序列由图2C(SEQ ID NO.16)、图2D(SEQ ID NO.15)和图2E(SEQ ID NO.15)所示的DNA序列编码。包含所述pre-miRNA序列的pri-miRNA序列描述于图2F(SEQ ID NO.16)、图2G(SEQ ID NO.15)和图2H(SEQ ID NO.15)中。由CMV-miH12-155编码的pri-miRNA对应于图2C的核苷酸1433-1704，CAG-miH12-451编码的pri-miRNA对应于图2D的核苷酸1716-2320，PGK-miH12-451编码的pri-miRNA对应于图2E的核苷酸278-1097。同样，第一RNA序列和第二RNA序列将按照以上文针对pre-miRNA所描述的方式并入。
可以使用本领域已知的方法(例如脂质转染、转染)或使用任何其它合适的方法将并入siRNA、shRNA、pri-mRNA支架或pre-miRNA支架的本发明的双链RNA提供于细胞中。本发明的双链RNA可以是合成双链RNA或天然双链RNA。合成双链RNA可以包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。所述双链RNA具有与其天然对应物相似的性质，并且与完全由非合成双链RNA组成的双链RNA相比具有类似或改进的RNA干扰活性。例如，合成siRNA可以在其设计中包括使用锁核酸(通过2'-O和4'-C原子之间的亚甲基桥(橙色)连接的核糖环)、修饰的核苷酸(例如包含硫代磷酸、2'-O-Me、2'-O-烯丙基和2'-脱氧氟尿苷的核苷酸)。众所周知，诸如siRNA的双链RNA可以在碱基配对位点和非碱基配对位点上容纳相当多的修饰而没有显著的活性损失。优选地，本发明的双链RNA是由天然核苷酸组成的双链RNA，例如通过双链RNA的表达中得到的双链RNA。
因此，在一个实施方案中，本发明的所述双链RNA由DNA序列编码。编码所述双链RNA(例如包含在siRNA、shRNA、pri-mRNA支架或pre-miRNA支架中的双链RNA)的所述DNA序列包含在表达盒中。应当理解，当双链RNA为例如由两条RNA链组成的siRNA时，需要两种表达盒，一种表达盒编码包含第一RNA序列的RNA链，另一种表达盒编码包含第一RNA链的RNA链。当双链RNA包含在单个RNA分子(例如，编码shRNA、pre-miRNA或pri-miRNA)中时，一个表达盒就足够了。pol II表达盒可以包含启动子序列、编码待表达的RNA的序列、随后是多聚腺苷酸化序列。如果被表达的双链RNA包括pri-miRNA支架，则编码的RNA序列可编码内含子序列和外显子序列以及5'-UTR和3'-UTR。pol III表达盒通常包含启动子序列，随后是编码RNA(例如shRNA序列、pre-miRNA或包含在例如siRNA或延伸的siRNA中的双链RNA的链)的DNA序列。pol I表达盒可以包含pol I启动子，其后是RNA编码序列和3'-Box。用于双链RNA的表达盒是本领域公知的，并且任何类型的表达盒都能胜任，例如，可以使用pol III启动子、pol II启动子或pol I启动子(i.a.ter Brake et al.,Mol Ther.2008Mar；16(3):557-64,Maczuga et al.,BMC Biotechnol.2012Jul 24；12:42)。表达本发明双链RNA的表达盒的实例描述于图2C-E中。
优选使用pol II启动子，例如PGK启动子、CBA启动子或CMV启动子(参见图2C-D)。由于亨廷顿舞蹈病影响神经元，使用神经特异性启动子可能是特别有用的。合适的神经特异性启动子的实例是神经元特异性烯醇化酶(NSE)、人突触蛋白1、caMK激酶和微管蛋白。可以考虑的其它合适的启动子是诱导型启动子，即仅当宿主细胞暴露于某种特定刺激时才启动转录的启动子。
可以使用例如转染方法将本发明所述的表达盒递送到细胞中。任何合适的手段都足以递送本发明的表达盒。优选使用稳定地将表达盒递送到细胞中的基因治疗载体，从而可以实现稳定表达如上所述的可诱导针对亨廷顿蛋白基因的序列特异性抑制的双链RNA。合适的载体可以是慢病毒载体、基于反转录转座子的载体系统或AAV载体。应当理解，由于例如慢病毒载体的载体携带RNA基因组，该RNA基因组将编码所述表达盒，使得在细胞转染后形成所述DNA序列和所述表达盒。优选使用病毒载体，例如AAV。优选地，使用的AAV载体是血清型5的AAV载体。血清型5的AAV可以对于转染神经元特别有用，如实施例所示。下述文献很好地描述了包含任何目标表达盒的AAV载体的产生：WO2007/046703、WO2007/148971、WO2009/014445、WO2009/104964、WO2011/122950、WO2013/036118，其全部内容并入本文。
在本发明中可用于例如在昆虫或哺乳动物细胞系中产生AAV载体的AAV序列可以衍生自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上显著同源的基因组序列，提供相同的一系列遗传功能，产生基本物理等同和功能等同的病毒体，并通过实际相同的机制复制和组装。对于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，请参见GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini et al.(1997,J.Vir.71:6823-33)；Srivastava et al.(1983,J.Vir.45:555-64)；Chlorini et al.(1999,J.Vir.73:1309-1319)；Rutledge et al.(1998,J.Vir.72:309-319)；和Wu et al.(2000,J.Vir.74:8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本发明上下文的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，用于本发明上下文中的AAVITR序列衍生自AAV1、AAV2和/或AAV5。同样，Rep52、Rep40、Rep78和/或Rep68编码序列优选衍生自AAV1、AAV2和AAV5。然而，用于本发明上下文中的编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列可以取自已知的42种血清型中的任何一种，更优选来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通过例如衣壳重排技术和AAV衣壳库新开发的AAV样颗粒。
在另一个实施方案中，提供了包含本发明的所述DNA序列或所述表达盒的宿主细胞。例如，所述表达盒或DNA序列可以包含在细菌中含有的质粒中。所述表达盒或DNA序列也可以包含在产生例如病毒载体的生产细胞中。
如实施例部分所示并且如上所述，本发明的双链RNA、本发明的DNA序列、本发明的表达盒和本发明的基因治疗载体用于医学治疗，特别是用于亨廷顿舞蹈病的治疗。当使用AAV载体(或同样用于基因治疗载体)时，所述治疗包括将本发明的AAV载体直接输注到脑中。在进一步的实施方案中所述直接输注包括将载体鞘内输注入脑脊液。这种鞘内输注代表了一种将基因治疗载体递送到CNS并靶向神经元的有效方式。优选地，通过将AAV载体注射入纹状体经由纹状体内对流增强扩散(CED)来递送AAV载体从而靶向纹状体结构和皮质结构。更优选地，为了更大范围地覆盖CNS，向纹状体以及丘脑中进行注射。因此，通过在纹状体或纹状体和丘脑中的对流增强扩散(CED)注射经纹状体内或经纹状体和丘脑递送AAV载体。这种注射优选通过MRI引导注射进行。所述治疗方法对于患有亨廷顿舞蹈病的人类受试者特别有用。应理解，亨廷顿舞蹈病的治疗涉及患有亨廷顿舞蹈病的人类受试者，包括具有罹患亨廷顿舞蹈病遗传倾向但尚未显示该疾病的病症的人类受试者。因此，对患有亨廷顿舞蹈病的人类受试者的治疗包括对携带具有超过35个CAG重复的亨廷顿等位基因的任何人类受试者的治疗。
实施方案
1.一种双链RNA，其包含第一RNA序列和第二RNA序列，其中所述第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中所述第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度，并且与SEQID NO.1基本互补。
2.根据实施方案1所述的双链RNA，其中所述双链RNA能够降低亨廷顿蛋白基因的表达。
3.根据实施方案1或2所述的双链RNA，其中所述双链RNA包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA内，优选包含在pre-miRNA支架内。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列具有至少20个核苷酸、优选至少21个核苷酸的序列长度。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列与SEQ IDNO.1完全互补。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的双链RNA，其中第一链选自SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的双链RNA，其中所述第一链和第二链选自以下组合：SEQ ID NO.3和8；SEQ ID NO.4和9；SEQ ID NO.5和10；SEQ ID NO.5和13；SEQ IDNO.5和14；SEQ ID NO.6和11；和SEQ ID NO.7和12。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的双链RNA，其中所述双链RNA包含在源自miR-451a或miR-155的pre-miRNA支架中。
9.编码实施方案1-8中任一项所述的双链RNA的DNA序列。
10.编码实施方案1-9中任一项所述的双链RNA的表达盒。
11.根据实施方案10所述的表达盒，其中所述表达盒包含PGK启动子、CMV启动子、神经特异性启动子或CBA启动子。
12.包含实施方案10或11所述的表达盒的基因治疗载体。
13.根据实施方案12所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体为AAV载体，优选血清型5的AAV载体。
14.包含实施方案9所述的DNA序列或实施方案10或11所述的表达盒的宿主细胞。
15.实施方案1-8中任一项所述的双链RNA、实施方案9所述的DNA序列、实施方案10或11所述的表达盒、实施方案12或13所述的基因治疗载体用于医学治疗的用途。
16.实施方案1-8中任一项所述的双链RNA、实施方案9所述的DNA序列、实施方案10或11所述的表达盒、实施方案12或13所述的基因治疗载体用于治疗亨廷顿舞蹈病的用途。
实施例
miRNA支架表达构建体&siRNA
为了构建基于miR155的miRNA支架载体，将与图1所示的HTT中选定的靶序列完全互补的具有21个核苷酸(bp)的序列嵌入到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的pri-mir-155主链中得到pVD-CMV-miHTT-155(图2C示出了表达盒序列的实例，表达的RNA中包含的pre-miRNA和pri-miRNA序列分别示于图2B和图2F中)。基于Invitrogen(BLOCK-iT，Pol II miR RNAi表达载体试剂盒，Verson E，2007年6月22日，25-0857)提供的说明书，通过在pcDNA6.2-GW/emGFP-mir155的BsaI位点对合成的双链寡核苷酸进行退火设计pri-mir-155构建体。使用Mfold软件(Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15，(2003))，使用mfold版本3.5(可从http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold获得)验证了由miHtt构建体编码的所有人工pre-miRNA的结构。携带对应于SEQ ID NO.5的序列的pre-miRNA-155支架的预测结构示于图2B中。编码用于pri-miRNA-155支架的表达构建体的DNA序列列于图2C中(SEQ ID NO.17)，该pri-miRNA-155支架包含SEQ ID NO.5作为选择的第一序列。该构建体也称为miH12，其靶向H12。对于其他20个选定的靶序列，将这些序列设计为与图1所示的靶序列完全互补，并且miRNA支架具有与图2B所示的相同结构特征，即嵌入支架中的第二RNA序列对应于与所选择的第一RNA序列完全互补但在中心有两个核苷酸缺失的序列。作为对照，类似地使用加扰RNA(scrambled RNA)序列作为第一RNA序列，并且如上所述，设计第二RNA序列以构建载体pVD-CMV-miScr-155。构建体含有GFP用于使miRNA表达和转染在体外和体内可见。
构建了基于miR451a的miRNA支架载体。基于预测的成熟mir-451序列合成编码pri-miR-451支架的DNA序列，该预测的成熟mir-451序列被H12靶序列(即SEQ ID NO.5)取代作为第一RNA序列。第二RNA序列被设计为与第一RNA序列的核苷酸2-18完全互补。选择第二RNA序列使得人工pre-miRNA序列的预测RNA结构采用与原始野生型结构相似的结构。使用Mfold软件(Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15，(2003)，使用mfold版本3.5，该版本可以在http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold获得)验证了由构建体编码的pre-miRNA的结构。使用SEQ ID NO.5的预测结构如图2B所示。制备了两种不同的miR451a支架表达载体。表达构建体的DNA序列示于图2D和2E中，包含在表达的RNA中的相应的各个pri-miRNA支架序列列于图2G和2H。图2D示出了pVD-CAG-miH12-451的表达盒的DNA序列，pVD-CAG-miH12-451使用CAG启动子表达miRNA支架，并且在图2E中示出了pVD-PGK-miH12-451的表达盒的DNA序列，其使用PGK启动子。
设计了在miH12靶标处(即SEQ ID NO.1)靶向HTT的合成siRNA，长度为19-23bp(表1)。siRNA包含对应于SEQ ID NO.3和8；SEQ ID NO.4和9；SEQ ID NO.5和10；SEQ ID NO.6和11；以及SEQ ID NO.7和12的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。siRNA被设计为在两条链中都具有3'-UU突出端。
报道基因构建体
按照Promega(siCHECKTM Vectors，C8011，Promega Benelux b.v.，莱顿市，荷兰)提供的说明书设计并克隆含有完整HTT外显子1序列的psiCheck-2构建体LucHTT。LucHTT包含SEQ ID NO.1及如存在于SEQ ID NO.2中的其侧翼序列(参见图1B)。报道基因LucH12_451a包含与被设计为由pVD-CAG-miH12-451和pVD-PGK-miH12-451表达的第二RNA序列互补的序列。所有的构建体已被测序，并且已经证实为正确的序列。所有miRNA支架和siRNA的敲减效率均在体外用特定荧光素酶报道基因测定。使用miHtt和荧光素酶报道基因以1:1比例(miR-155、PGK-miH12-451)或1:10比例(CAG-miH12-451，即CAG启动子非常强)共转染Hek293T细胞。在转染后(p.t.)48小时测量海肾萤光素酶敲减，并将萤火虫萤光素酶作为内部对照进行测量。使用miScr作为阴性对照，并设定为100％。
体外结果
在靶向外显子1的miH1-miH21构建体中，miH12诱导最强的荧光素酶报道基因敲减，减少75-80％(图3A)。靶向H12(即SEQ ID NO.1)的siRNA都被证明具有相似的敲碱效率，并显示出随着剂量的增加敲减越强力。与所测试的其他siRNA相比，具有19和21个碱基对的SiRNA显示出更多的抑制。对从pVD-CMV-miHTT-155表达的RNA进行下一代测序(NGS)分析，显示出了对对应于第一RNA序列和第二RNA序列的引导链和过客链(参见例如图2B(7))的偏好，该第一RNA序列和第二RNA序列被设计成为miRNA支架的一部分。测试pVD-CAG-miH12-451和pVD-PGK-miH12-451对LucHTT和LucH12_451a的靶向性。CAG和PGK构建体都显示出序列特异性抑制(图4A)，而包含与构建体的第二RNA序列完全互补的序列的Luc报道基因没有减少。
在小鼠中使用AAV载体进行体内敲减
将来自pVD-CMV-miHTT-155的表达构建体CMV-miH12-155克隆至AAV5载体主链中，使用杆状病毒生产系统产生AAV5。作为对照，CMV-miScr-155也被并入AAV5主链以作为阴性对照。为了监测脑转染效率，表达盒含有GFP(图5A)。携带荧光素酶报道基因构建体的AAV-5载体Luc73QHTT包含靶序列SEQ ID NO.1(即具有73个CAG重复的完整HTT外显子1序列)及存在于SEQ ID NO：2中的其侧翼序列(参见图1B)。用2μl AAV5-Luc73QHtt/SNP(3.6×1012gc/ml)和AAV5-miScr(1.8×1013gc/ml)或AAV5-miH12(1.8×1013gc/ml)以1:5的比例共同注射Balb/6小鼠(N5)。一个单独的组注射AAV5-Luc73QHtt/SNP和PBS。在注射后(p.i.)2、4和6天通过MS监测萤光素酶表达。注射后1周，与仅注射了miScr和Luc19QHtt/wt的动物相比，miH12明显敲减了Luc19QHtt/wt(图7b和c)。证明了与对照组相比，荧光素酶报道基因表达有最终显著降低的趋势，大脑中几乎无法检测到该表达(miH12#1和#2)，这表明CMV-miH12-155对HTT靶标的强烈敲减。在实验结束时，CMV-miH12-155组中的Luc73QHtt/SNP荧光值比miScr低约1log。
在HD动物模型中使用AAV载体进行体内敲减
在LV-171-82Q HD大鼠模型中测试AAV5-CMV-miH12-155(Drouet et al.2009,AnnNeurol.2009Mar；65(3):276-85)。该模型基于与包含SNP C/T的外显子67的片段连接的具有82个CAG重复的HTT突变体片段的前171个氨基酸的纹状体过表达。为HD大鼠注射AAV5-CMV-miH12-155或对照AAV5-CMV-miScr-155(图6A)。大鼠纹状体内注射LV-171-82Q，一周后注射AAV5-CMV-miH12-155或AAV5-CMV-miScr-155。基于早期和晚期时间点处HD大鼠脑切片的组织学染色(DARP32，EM48，GFP和Iba1)确定AAV5-CMV-miH12-155的神经保护作用(图6B、6C和6D，注射后2周)。DARP32病变(图6B，上组)表示神经变性，其可作为白点在脑切片上观察到。该组清楚地显示出较少的神经元死亡，因此在AAV5-CMV-miH12-155大鼠的脑切片中没有白点。将脑切片染色，可以看到突变的HTT聚集体(EM48，图6B)为切片上的小棕点。与对照组相比，注射AAV5-CMV-miH12-155的HD大鼠的神经变性和突变的HTT聚集体明显减少(图6B，中间组和下组)。在注射后8周的晚期时间点获得相似的结果(数据未示出)。GFP组织学(棕色染色)结果表明本研究中使用的所有载体均有效地转染了纹状体(图6C)。另外，基于Iba1染色，在注射后8周几乎没有检测到免疫应答(图6D)。
随后在人源化Hu97/18HD小鼠模型(Southwell et al.2013,Hum MolGenet.2013Jan 1；22(1):18-34)中进一步测试AAV5-CMV-miH12-155。该模型将鼠Hdh基因替换为人HTT的两个拷贝，一个携带97个CAG重复，另一个载体携带18个重复。对Hu97/18小鼠模型中由疾病进展导致的运动变化、精神病学变化、认知变化、电生理学变化、神经病理学变化和生物化学变化进行了详细表征。将AAV5-CMV-miH12-155注射于2月龄的人源化Hu97/18HD小鼠模型中，通过经由纹状体中的对流增强扩散进行的脑内递送(IC-CED)或经由纹状体中缓慢递送(IC-缓慢递送)进行的脑内递送或大脑室中的脑室内递送(ICV)。GFP荧光表明在慢递送和CED递送时小鼠纹状体的完全转染(图7A)。人类HTT的蛋白质免疫印迹分析显示，当进行CED递送时，HTT在纹状体中被AAV5-CMV-miH12-155敲减(图7B)。
比较H12与现有技术的靶序列
将H12序列附近的现有技术靶序列与H12序列进行比较。构建siRNA和miRNA支架，并使用如上所述的荧光素酶报道基因系统进行直接比较。将低浓度的siRNA转染(0.25nM)，一式三份，以避免脱靶效应使结果出现偏差。制备的siRNA具有完全互补的引导链和过客链(G-C和A-U碱基对)，并且在两条链中都具有UU-3'突出端。使用加扰siRNA作为对照，并相对于对照测量各值。H12siRNA显示出最强的抑制作用(参见图8A)。同样地，如上所述根据Invitrogen的说明书基于miR-155制备miRNA支架，并进行直接比较。通过将与R6.1和R6.2靶序列完全互补的19个和18个核苷酸替换成来自Invitrogen的工程化miR-155支架的引导序列来制备R6.1和R6.2支架。因此，根据Dicer对pre-miRNA的加工，经加工的R6引导链可以在序列的末端含有来自miR-155支架的核苷酸。如上所述，使用不同比例的miRNA构建体和报道基因(miRNA支架构建体:荧光素酶报道基因)转染miRNA支架。使用加扰的miRNA构建体作为对照，并相对于对照测量各值。图8B示出1:1比例的情况，而图8C示出1:10比例的情况。H12miRNA支架显示出最强的抑制作用。对于siRNA和miRNA，H 12都显示出明显的强抑制作用，特别是在被认为与体内应用最相关的低浓度条件下。
表4.现有技术的靶标与H12的比较
示出了靶序列。与H12靶序列具有同一性的靶核苷酸加下划线示出。(SI.表示SEQID NO；L.表示核苷酸长度；Id.表示与H12具有同一性的核苷酸的数目)。(R1衍生自siRNAsiHUNT-2，siRNA siHUNT-2来自Rodriguez-Lebron et al.,2005,Mol Ther.Vol 12No.4:618-633；R2衍生自表达的shRNA shD2F，该表达的shRNA shD2F来自Franich et al.,2008,Mol Ther,Vol.16No.5；947-956)；R3衍生自siRNA-DExon1，siRNA-DExon1来自US20080015158；R4衍生自HDAS 07WO2008134646；R6.1和R6.2衍生自具有约1750个假想的siRNA的列表，这些假想的siRNA旨在靶向亨廷顿蛋白基因(WO2005105995)。

Claims (16)

1.一种双链RNA，其包含第一RNA序列和第二RNA序列，其中所述第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中所述第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度，并且与SEQ IDNO.1基本互补。
2.根据权利要求1所述的双链RNA，其中所述双链RNA能够降低亨廷顿蛋白基因表达。
3.根据权利要求1或2所述的双链RNA，其中所述双链RNA包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA内，优选包含在pre-miRNA支架内。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列具有至少20个核苷酸、优选至少21个核苷酸的序列长度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列与SEQ ID NO.1完全互补。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的双链RNA，其中第一链选自SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的双链RNA，其中第一链和第二链选自以下组合：SEQID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.10；SEQID NO.5和SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11；以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.12。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的双链RNA，其中所述双链RNA包含在源自miR-451a或miR-155的pre-miRNA支架中。
9.编码权利要求1-8中任一项所述的双链RNA的DNA序列。
10.编码权利要求1-9中任一项所述的双链RNA的表达盒。
11.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述表达盒包含PGK启动子、CMV启动子、神经特异性启动子或CBA启动子。
12.包含权利要求10或11所述的表达盒的基因治疗载体。
13.根据权利要求12所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体为AAV载体，优选血清型5的AAV载体。
14.包含权利要求9所述的DNA序列或权利要求10或11所述的表达盒的宿主细胞。
15.权利要求1-8中任一项所述的双链RNA、权利要求9所述的DNA序列、权利要求10或11所述的表达盒、权利要求12或13所述的基因治疗载体用于医学治疗的用途。
16.权利要求1-8中任一项所述的双链RNA、权利要求9所述的DNA序列、权利要求10或11所述的表达盒、权利要求12或13所述的基因治疗载体用于治疗亨廷顿舞蹈病的用途。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111356763A (zh) * 2017-09-22 2020-06-30 建新公司 变体RNAi
CN112469421A (zh) * 2018-05-15 2021-03-09 华盛顿大学 减少剪接病和治疗rna显性疾病的组合物和方法
CN114728018A (zh) * 2019-11-01 2022-07-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 亨廷顿(HTT)iRNA药剂组合物及其使用方法
WO2022206819A1 (zh) * 2021-03-30 2022-10-06 南京大学 一种用于治疗亨廷顿病的rna递送系统

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
SG177564A1 (en) 2009-07-06 2012-02-28 Ontorii Inc Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
EP2734208B1 (en) 2011-07-19 2017-03-01 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
WO2014010718A1 (ja) 2012-07-13 2014-01-16 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
EP2872485B1 (en) 2012-07-13 2020-12-16 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
AU2015207773B2 (en) 2014-01-16 2021-06-17 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
EP3218484A4 (en) 2014-11-14 2018-05-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
PT3237618T (pt) * 2014-12-24 2019-07-04 Uniqure Ip Bv Supressão do gene huntingtina induzida por arni
JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2018-03-08 ジェンザイム・コーポレーション バリアントＲＮＡｉ
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
LT3386511T (lt) 2015-12-10 2021-08-25 Ptc Therapeutics, Inc. Hantingtono ligos gydymo būdai
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
WO2017201258A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3458588A4 (en) 2016-05-18 2020-01-15 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATING POLYNUCLEOTIDES
US10457940B2 (en) * 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3634953B1 (en) 2017-06-05 2024-01-03 PTC Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
CN111182898B (zh) 2017-06-28 2024-04-16 Ptc医疗公司 用于治疗亨廷顿氏病的方法
EP3645121A4 (en) 2017-06-28 2021-03-17 PTC Therapeutics, Inc. HUNTINGTON'S DISEASE TREATMENT METHODS
AU2018352236A1 (en) 2017-10-16 2020-04-23 The Curators Of The University Of Missouri Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CN108384803A (zh) * 2017-12-19 2018-08-10 上海百力格生物技术有限公司 一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法
US20210009590A1 (en) 2018-03-27 2021-01-14 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for treating huntington's disease
EP3794125A4 (en) * 2018-05-15 2022-07-13 University of Massachusetts MODIFIED AAV CONSTRUCTS AND USES THEREOF
EP3814357B1 (en) 2018-06-27 2024-05-01 PTC Therapeutics, Inc. Heterocyclic and heteroaryl compounds for treating huntington's disease
JP2021529513A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
EP3850098A1 (en) 2018-09-12 2021-07-21 uniQure IP B.V. Rnai induced c9orf72 suppression for the treatment of als/ftd
EP3884067A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 uniQure IP B.V. A companion diagnostic to monitor the effects of gene therapy
WO2020104295A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3
WO2020104469A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. Method and means to deliver mirna to target cells
JP2022516779A (ja) * 2019-01-09 2022-03-02 ウニベルシダージ デ コインブラ 二本鎖ｒｎａ及びその使用
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
EP4031148A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 uniQure IP B.V. Targeting misspliced transcripts in genetic disorders
KR20220093335A (ko) 2019-11-01 2022-07-05 노파르티스 아게 헌팅턴병의 진행을 늦추는 치료를 위한 스플라이싱 조절제의 용도
JP2023521347A (ja) * 2020-04-07 2023-05-24 ユニキュアー アイピー ビー．ブイ． アンジオポエチン様３（ａｎｇｐｔｌ３）をサイレンシングするための遺伝子構築物及びその使用
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
WO2022031591A2 (en) * 2020-08-03 2022-02-10 University Of Massachusetts Oligonucleotides for htt-1a modulation
TW202304446A (zh) 2021-03-29 2023-02-01 瑞士商諾華公司 剪接調節子用於減慢杭丁頓氏舞蹈症進展的治療之用途
EP4359525A1 (en) 2021-06-21 2024-05-01 uniQure biopharma B.V. Gene constructs for silencing alpha-synuclein and uses thereof
WO2023147058A2 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Compositions for treating neurological disease
WO2023198745A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of apoe
WO2023198662A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Novel systems for nucleic acid regulation
WO2023198702A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of c9orf72
WO2023198663A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of snca

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005105995A2 (en) * 2004-04-14 2005-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20080015158A1 (en) * 2003-05-14 2008-01-17 Kanazawa Ichiro Inhibition of the Expression of Huntingtin Gene
WO2008134646A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
CN102439136A (zh) * 2009-03-26 2012-05-02 加州大学校董 产生用于疾病修饰的抑制性rna的间充质干细胞
CN102946908A (zh) * 2010-06-18 2013-02-27 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 显性等位基因表达抑制剂
CN103224556A (zh) * 2013-01-31 2013-07-31 清华大学 亨廷顿舞蹈症的靶位蛋白质及其编码基因和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8680063B2 (en) 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
WO2008005562A2 (en) 2006-07-07 2008-01-10 University Of Massachusetts Rna silencing compositions and methods for the treatment of huntington's disease
WO2007046703A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Improved aav vectors produced in insect cells
EP3023500B1 (en) 2006-06-21 2020-02-12 uniQure IP B.V. Insect cells for the production of aav vectors
EP2530152B1 (en) 2007-05-31 2017-12-27 University of Iowa Research Foundation Reduction of off-target RNA interference toxicity
PT2173888T (pt) 2007-07-26 2016-11-17 Uniqure Ip Bv Resumo
CN102007209B (zh) 2008-02-19 2013-11-13 阿姆斯特丹分子治疗(Amt)股份有限公司 细小病毒rep和cap蛋白在昆虫细胞中的表达优化
EP3421603B1 (en) * 2009-05-02 2021-10-06 Genzyme Corporation Gene therapy for neurodegenerative disorders
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
EP3502254A1 (en) * 2010-04-23 2019-06-26 Cold Spring Harbor Laboratory Novel structurally designed shrnas
DK2744895T3 (en) 2011-09-08 2016-01-04 Uniqure Ip Bv REMOVAL OF INFECTED VIRA FROM AAV PREPARATIONS
PT3237618T (pt) * 2014-12-24 2019-07-04 Uniqure Ip Bv Supressão do gene huntingtina induzida por arni

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080015158A1 (en) * 2003-05-14 2008-01-17 Kanazawa Ichiro Inhibition of the Expression of Huntingtin Gene
WO2005105995A2 (en) * 2004-04-14 2005-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2008134646A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
CN102439136A (zh) * 2009-03-26 2012-05-02 加州大学校董 产生用于疾病修饰的抑制性rna的间充质干细胞
CN102946908A (zh) * 2010-06-18 2013-02-27 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 显性等位基因表达抑制剂
CN103224556A (zh) * 2013-01-31 2013-07-31 清华大学 亨廷顿舞蹈症的靶位蛋白质及其编码基因和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDGARDO RODRIGUEZ-LEBRON: "Intrastriatal rAAV-Mediated Delivery of Anti-huntingtin shRNAs Induces Partial Reversal of Disease Progression in R6/1 Huntington’s Disease Transgenic Mice", 《MOLECULAR THERAPY》 *
NICHOLAS R FRANICH: "AAV Vector-mediated RNAi of Mutant Huntingtin Expression Is Neuroprotective in a Novel Genetic Rat Model of Huntington"s Disease", 《MOLECULAR THERAPY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111356763A (zh) * 2017-09-22 2020-06-30 建新公司 变体RNAi
CN111356763B (zh) * 2017-09-22 2024-03-12 建新公司 变体RNAi
CN112469421A (zh) * 2018-05-15 2021-03-09 华盛顿大学 减少剪接病和治疗rna显性疾病的组合物和方法
CN114728018A (zh) * 2019-11-01 2022-07-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 亨廷顿(HTT)iRNA药剂组合物及其使用方法
WO2022206819A1 (zh) * 2021-03-30 2022-10-06 南京大学 一种用于治疗亨廷顿病的rna递送系统

Also Published As

Publication number Publication date
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US11371044B2 (en) 2022-06-28
JP2018502601A (ja) 2018-02-01
EP3237618B1 (en) 2019-05-22
AU2015370903A1 (en) 2017-07-20
NZ733296A (en) 2021-10-29
US20230119344A1 (en) 2023-04-20
JP2021000136A (ja) 2021-01-07
US10174321B2 (en) 2019-01-08
EP3540063A1 (en) 2019-09-18
US20190144860A1 (en) 2019-05-16
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PT3237618T (pt) 2019-07-04
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AU2015370903B2 (en) 2021-06-17
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KR20170120572A (ko) 2017-10-31
EP3237618A1 (en) 2017-11-01
WO2016102664A1 (en) 2016-06-30

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