ES2732023T3 - Supresión del gen de la huntingtina inducida por ARNi - Google Patents
Supresión del gen de la huntingtina inducida por ARNi Download PDFInfo
- Publication number
- ES2732023T3 ES2732023T3 ES15817385T ES15817385T ES2732023T3 ES 2732023 T3 ES2732023 T3 ES 2732023T3 ES 15817385 T ES15817385 T ES 15817385T ES 15817385 T ES15817385 T ES 15817385T ES 2732023 T3 ES2732023 T3 ES 2732023T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- rna
- seq
- sequence
- double stranded
- mirna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title description 30
- 230000001629 suppression Effects 0.000 title description 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 title 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 118
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 117
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 69
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 118
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 54
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 26
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 claims description 9
- 108091032770 miR-451 stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 108091030646 miR-451a stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 46
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 41
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 29
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 13
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 12
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 10
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 101001030705 Homo sapiens Huntingtin Proteins 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 5
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000054185 human HTT Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 101150053137 AIF1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 3
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- -1 hRNA Substances 0.000 description 3
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150043003 Htt gene Proteins 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100160997 Mus musculus Rchy1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 241000519995 Stachys sylvatica Species 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091007426 microRNA precursor Proteins 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- TXWCDJYEKHLJSO-MYINAIGISA-N 1-[(2s,4s,5r)-2-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(F)N1C(=O)NC(=O)C=C1 TXWCDJYEKHLJSO-MYINAIGISA-N 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000821100 Homo sapiens Synapsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001030728 Rattus norvegicus Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010946 mechanistic model Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Psychology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un ARN bicatenario que comprende una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN, en donde la primera y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias, en donde la primera secuencia de ARN tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos y es complementaria a la SEC ID NO. 1, en donde la primera secuencia de ARN se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO.3, la SEC ID NO.4, la SEC ID NO.5, la SEC ID NO.6 y la SEC ID NO.7, y en la que dicho ARN bicatenario es capaz de reducir la expresión del gen de la huntingtina.
Description
DESCRIPCIÓN
Supresión del gen de la huntingtina inducida por ARNi
Antecedentes
El gen de la huntingtina, también conocido como el gen HTT o HD (enfermedad de Huntington), codifica la proteína huntingtina. El gen de la huntingtina es un gen grande de aproximadamente 13,5 kb (la proteína huntingtina tiene aproximadamente 350 kDa). La enfermedad de Huntington es un trastorno genético neurodegenerativo causado por una mutación genética en el gen de la huntingtina. La mutación genética implica a un segmento de ADN del gen de la huntingtina conocido como la repetición del trinucleótido CAG. Normalmente, el segmento CAG en el gen de la huntingtina en los seres humanos se repite varias veces, es decir, aproximadamente 10-35 veces. Las personas que desarrollan la enfermedad de Huntington tienen una expansión de la cantidad de repeticiones de CAG en al menos un alelo. Una persona afectada generalmente hereda el alelo mutado de un progenitor afectado. En los casos raros, la persona con la enfermedad de Huntington no tiene un progenitor con el trastorno (HD esporádica). Las personas que poseen entre 36 y 39 repeticiones CAG pueden desarrollar signos y síntomas de la enfermedad de Huntington, mientras que las personas con 40 o más repeticiones casi siempre desarrollan el trastorno. El aumento en el tamaño de la repetición CAG conduce a la producción de una proteína huntingtina alargada (mutada). Esta proteína se procesa en la célula en fragmentos más pequeños que son citotóxicos y que se acumulan y se agregan en las neuronas. Esto da como resultado una interrupción de la función normal y la muerte eventual de las neuronas. Este es el proceso que ocurre en el cerebro que subyace a los signos y síntomas de la enfermedad de Huntington.
La interferencia del ARN (ARNi) es un mecanismo natural que involucra la regulación específica de la secuencia del ARNm. La regulación a la baja del ARNm da como resultado una reducción de la cantidad de proteína que se expresa. La interferencia del ARN se desencadena por el ARN bicatenario. Una de las cadenas del ARN bicatenario es sustancial o completamente complementaria a su diana, el ARNm. Esta cadena se denomina la cadena guía. El mecanismo de la interferencia del ARN implica la incorporación de la cadena guía en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Este complejo es un complejo de recambio múltiple que, a través de un apareamiento básico complementario, se une a su ARNm diana. Una vez unido a su ARNm diana, puede dividir el ARNm o reducir la eficiencia de la traducción. La interferencia del ARN se ha utilizado ampliamente desde su descubrimiento para destruir genes diana específicos. Los desencadenantes para inducir la interferencia del ARN que se han empleado involucran el uso de ARNsi o ARNsh. Además, las moléculas que pueden desencadenar naturalmente el ARNi, los llamados miARN, se han utilizado para preparar miARN artificiales que imitan a sus contrapartes naturales. Estas estrategias tienen en común que proporcionan moléculas de ARN sustancialmente bicatenario que están diseñadas para reconocer a un gen de elección. Diversos enfoques terapéuticos basados en ARNi que utilizan la modalidad de la secuencia específica del ARNi se encuentran en desarrollo y varios están actualmente en la fase de ensayos clínicos (ver i.a. Davidson y McCray, Nature Reviews - Genetics, 2011; Vol.12; 329- 340).
Dado que la enfermedad de Huntington implica la expresión de una proteína de huntingtina mutante, la acumulación de la misma conduce a la enfermedad, la interferencia de ARN brinda la oportunidad de tratar la enfermedad, ya que puede reducir la expresión del gen de la huntingtina. El paradigma subyacente a este enfoque implica una reducción de la proteína Htt mutante para reducir así los efectos tóxicos resultantes de la proteína Htt mutante que logra una reducción y/o retraso de los síntomas de la enfermedad de Huntington, o incluso para prevenir los síntomas de la enfermedad de Huntington por completo. La supresión del gen de la huntingtina se ha formulado como hipótesis en la técnica anterior, incluida la lista de aproximadamente dos mil secuencias diana de ARNsi hipotéticas (documento WO2005105995). Las estrategias para reducir la expresión del gen de la huntingtina son conocidas en la técnica e involucran la selección específica de genes de la huntingtina mutantes (por ejemplo, documentos US20090186410, US20110172291). Alternativamente, la interferencia del ARN también se ha empleado para reconocer a genes mutantes y no mutantes (por ejemplo, Rodriguez-Lebron et al., 2005, Mol Ther. Vol 12 No.4: 618-633; Franich et al., 2008, Mol Ther, vol. 16 Numero 5; 947-956; Drouet et al., 2009, Annals of Neurology; Vol. 65 No. 3; 276-285 y McBride et al. Mol Ther. 2011 Dec; 19 (12): 2152-62; documento US20080015158, documento WO2008134646). En este último caso, se ha demostrado que el bloqueo natural de la proteína huntingtina no tiene ningún efecto perjudicial aparente.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un ARN bicatenario que comprende una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN en la que la primera y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias; caracterizado porque la primera secuencia de ARN tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos y es sustancialmente complementaria de la SEC. ID NO. 1, en la que la primera cadena se selecciona del grupo que consiste en SEC iD NO.3, SEC ID NO.4, SEC ID NO.5, SEC ID NO.6 y SEC ID NO. 7 y en la que el ARN bicatenario es capaz de reducir la expresión del gen de la huntingtina. Se probó una gran cantidad de secuencias diana para el bloqueo efectivo del gen de la huntingtina. Se encontró que el ARN bicatenario seleccionado de la presente invención era eficaz para reducir la expresión del gen de la huntingtina. Dicho ARN bicatenario, cuando se proporciona en una célula, ya sea directamente a través de la transfección o indirectamente a través de la administración de ADN (por ejemplo, transfección) o a través de la expresión mediada por vector sobre la cual se puede expresar dicho ARN bicatenario, es capaz de reducir la expresión de tanto el gen de la huntingtina
mutado como cualquier gen normal de la huntingtina. Además, se demostró que el ARN bicatenario de la invención era capaz de reducir la expresión del gen diana cuando se proporcionaba como un ARNip o en una estructura de miARN. Cuando se probó en un modelo animal, se demostró que el ARN bicatenario según la invención era capaz de reducir la muerte celular neuronal y los agregados de huntingtina. El ARN bicatenario, como se proporciona en la presente invención, proporciona una mejora en comparación con los ARN bicatenario en la técnica que se refiere al gen de la huntingtina, o proporciona al menos una alternativa al mismo.
El ARN bicatenario, según la invención, se puede proporcionar como un ARNip, un ARNsh, un pre-miRNA o un primiRNA. Dichos ARN bicatenarios pueden administrarse directamente a las células diana, p. ej. a través de la captación celular utilizando, por ejemplo, métodos de transfección. Preferiblemente, dicho suministro se logra usando un vector de terapia génica, en el que se incluye en un vector un casete de expresión para el ARNip, ARNhc, pre-miRNA o pri-miRNA. De esta manera, se puede proporcionar a las células un suministro constante de ARN bicatenario para lograr la supresión del gen de la huntingtina duradera sin requerir una administración repetida. Preferiblemente, el vector viral de elección es el AAV5. La presente invención también proporciona así el uso médico de un ARN bicatenario según la invención, tal como el tratamiento de la enfermedad de Huntington, en donde dicho uso médico también puede comprender un casete de expresión o un vector viral, tal como el AAV5, capaz de expresar dicho ARN bicatenario de la invención.
Figuras
Figura 1. Gen de la huntingtina humana (HTT) y secuencias diana. (A) Esquema del gen HTT humano (L27350.1) con expansiones de CAG (negro) y secuencias diana para miH1-H21 (gris claro) (B) Secuencia de ARN del exón 1 del gen HTT (SEC ID NO.2). La secuencia de repetición CAG es desde los nts. 367-429. (C) Esquema de las secuencias diana analizadas para el exón 1 (H1, 185-205; H2, 186-206; H3, 189-209; H4, 191-211; H5, 194-214; H6, 196-216; H7, 250-270; H8, 261-281, H9, 310-330; H10, 311-331, H11, 339-359, H12, 345-365, H13, 454-474; H14, 459-479; H15, 477-497; H16, 486-506; H17, 492-512; H18, 498-518; H19, 549-569; H20, 557-577; H21, 558-578, H1-H21 correspondiente a las SEC ID NOs. 23-43). Las secuencias representadas son secuencias de ADN. Los números se refieren a las secuencias de nucleótidos de ARN correspondientes en la SEC ID NO.2. Las secuencias diana de ARN correspondientes de SEC ID NO.2 tienen la secuencia que se enumera en C), excepto que en donde el ADN codifica una "t", el ARN codifica un "U".
Figura 2. Ejemplos de ARN bicatenarios y casetes de expresión. (A) Ejemplos de estructuras pri-/pre-miRNA para miH12 pre-miH12-155 (SEC ID NO.44) y estructura pre-miH12-451 (SEC ID NO.45) con guía de miH12 (gris) indicada. (B) Representación esquemática de los ARN bicatenario de acuerdo con la invención y cómo pueden ser procesados por la maquinaria del ARNi. Un ARN bicatenario puede ser un ARN de horquilla corta (1) o un ARNip extendido (2). El ARN de horquilla o el ARNip extendido tiene la primera secuencia de ARN en el extremo proximal, como se indica (indicado con 1 y paréntesis). Un ARN corto de horquilla o un ARNip extendido pueden procesarse por la maquinaria de ARNi en la célula para producir un ARNip (3), que también puede ser un ARN bicatenario según la invención, de los cuales una cadena que comprende la primera secuencia de ARN puede ser Incorporada en el complejo RISC (4). Un ARN bicatenario puede estar comprendido en una secuencia de pri-miARN (5) o una secuencia de pre-miARN (6). El pri-miARN puede ser procesado por la maquinaria del ARNi para producir un pre-miARN y posteriormente un dúplex de miARN maduro (7), de los cuales una cadena que comprende la primera secuencia de ARN puede incorporarse en el complejo RISC (4). La posición de la primera secuencia de ARN en el dúplex de pre-miRNA, pri-miRNA y miRNA se indica con 1 y paréntesis. (C) Secuencia de ADN del casete de expresión pVD-CMV-miH12-155 (promotor CMV (1-588), secuencia intermedia, secuencia de GFP de la proteína fluorescente verde (713-1432), flanco 5' pri-miRNA (1433-1514) , pre-miARN 5', cadena guía (primera secuencia de ARN) (1520-1540), secuencia de bucle, cadena de pasajero (segunda secuencia de ARN) (1560-1578), pre-miARN 3') flanco pri-miARN 3' (1584 -1704), señal HSV TKpolyA (1705-1976); (D) secuencia de ADN de pVD-CAG-miH12-451 (promotor CAG (43-1715), flanco 5' pri-miRNA (1716-2017), pre-miRNA 5', cadena guía (primera secuencia de ARN) (2034-2054), segunda secuencia de ARN y, 3' pre-miARN, flanco 3' pri-miARN (2090-2320), señal de hGH poli A (2321-2417) y (E) secuencia de ADN del casete de expresión pVD-PGK-miH12-451 (promotor PGK (23-277), flanco 5' pri-miRNA (278-794), 5' pre-miRNA, cadena guía (primera secuencia de a Rn ) (811-831), segunda secuencia de ARN y, 3' pre-miRNA, flanco 3' pri-miRNA (867-1097), señal de hGH poliA (1098-1194). (F) secuencia pri-miH12-155 que está codificada por pVD-CMV-miH12-155. (G) secuencia pri-miH12-451 que está codificada por pVD-CAG-miH12-451. (G) secuencia pri-miH12-451 que está codificada por pVD-PGK-miH12-451. Para la figura (E), (F) y (G), el tipo de letra es la misma que se usó anteriormente para el ADN correspondiente. Las secuencias promotoras están en negrita, la secuencia de la proteína verde fluorescente está en cursiva subrayada (solo C), las secuencias de pri-miRNA tienen un tipo de letra normal, la cadena guía (primera secuencia de ARN) está en cursiva y en negrita y la cadena pasajera o la segunda secuencia de ARN está en cursiva, las secuencias pre-miRNA están subrayadas y la señal poliA está subrayada en negrita.
Figura 3. Eficacia de bloqueo in vitro de miH1 -21. (A) Bloqueo total de HTT apuntando al exón 1. LucHTT se cotransfectó en células Hek293T con miH1-miH21. La fluorescencia de luciferasa en Renilla y luciérnaga se midió 48 h después de la transfección. miScr (ctrl) se utilizó como control negativo y se estableció en 100%. miH12 mostró la mayor eficiencia de bloqueo. (B) El bloqueo de LucHTT fue por el siH12 sintético con 19-23 nucleótidos de longitud.
Figura 4. Eficacia de bloqueo in vitro de miH12-451 con diferentes promotores. (A) El indicador LucHTT se ha cotransfectado con las variantes de CAG-miH12 o PGK-miH12 y la eficacia de bloqueo se determinó como se describió anteriormente para la Fig. 3. (B) La actividad de la cadena del pasajero (*) de miH12-451*, expresada a partir de los promotores CAG o PGK, se midió en los indicadores específicos de LucHTT*. No se detectó ninguna actividad en la cadena de pasajero.
Figura 5. Eficacia in vivo de miH12 suministrado por AAV5. (A) Configuración experimental. A los ratones se les co inyectó AAV5-Luc73QHTT y AAV5-CMV-miScr-155 o AAV5-CMV-miH12-155 en una proporción de 1:5. Los puntos de medición se indican con flechas; (B) se midió el bloqueo de AAV5-Luc73QHTT en animales 6 semanas p.i. por IVIS; (C) Tendencia de bloqueo de AAV5-Luc73QHTT por AAV5-miH12 hasta 6 semanas p.i.
Figura 6. Prueba de concepto de bloqueo de HTT humano en un modelo mecanicista de rata HD. (A) Configuración experimental; (B) histología cerebral que muestra menos neurodegeneración (DARP32) y menos agregados de Htt mutantes (Em48) en el grupo AAV5-CMV-miH12-155; (C) histología cerebral de GFP; (D) histología cerebral con marcador de la activación inmune Iba1.
Figura 7. Bloqueo de HTT humano en el modelo de ratón Hu97/18 HD humanizado. (A) Eficacia de la transducción en cerebro murino tras una inyección intraestriatal lenta, inyección intraestriatal por convección con difusión mejorada (CED) o inyección intracerebral ventricular (ICV) de AAV5-CMV-miH12-155. La fluorescencia de GFP se observó 5 semanas después de la inyección. (B) La transferencia Western mide el bloqueo de HTT humano en cerebro murino tras la administración de AAV5-miHTT. (C) Cuantificación por transferencia Western de HTT.
Figura 8. Comparación de la diana H12 seleccionada con secuencias diana de la técnica anterior. LucHTT se cotransfectó en células Hek293T con las construcciones de ARNip (A) y miRNA (B y C) indicadas. La fluorescencia de luciferasa de Renilla y luciérnaga se midió 48 h después de la transfección. miH12 y siH 12 mostraron la mayor eficiencia de bloqueo.
Descripción detallada
La presente invención proporciona un ARN bicatenario que comprende una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN en la que la primera y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias, caracterizadas porque la primera secuencia de ARN tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos y es sustancialmente complementaria de la SEC. ID NO. 1, en la que la primera cadena se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO.3, SEC ID NO.4, SEC ID NO.5, SEC ID NO. 6 y SEC ID NO. 7, y en la que el ARN bicatenario es capaz de reducir la expresión del gen de la huntingtina.
La SEC ID NO.1 (5-CUUCGAGUCCCUCAAGUCCUU-3') corresponde a una secuencia diana del gen de la huntingtina del exón 1 (SEC ID NO. 2). El exón 1, como se muestra en la Figura 1B tiene 21 secuencias CAG repetidas desde los nt. 367-429. La secuencia del exón 1, como se muestra en la fig. 1B, corresponde a un gen de huntingtina normal que no está asociado con la enfermedad. Los genes de la huntingtina mutantes correspondientes asociados con la enfermedad de Huntington comprenden mucho más de 21 secuencias de repetición CAG. Como se dijo, con de 36 a 39 repeticiones CAG, se pueden desarrollar signos y síntomas de la enfermedad de Huntington, mientras que con 40 o más repeticiones, casi siempre se desarrolla el trastorno. La secuencia diana SEC ID NO.1 está comprendida en prácticamente todas las secuencias del exón 1, independientemente del número de repeticiones CAG.
La SEC ID NO. 1 corresponde a los nucleótidos nrs. 345-365 de la SEC ID NO.2. Se probaron 18 secuencias diana diferentes en el exón 1 para determinar la orientación utilizando ARN bicatenarios que se diseñaron para inducir una inhibición específica de la secuencia de la SEC ID NO.2. (véanse la figura 1 y la figura 3A) y se encontró que, en particular, la diana de esta secuencia desde el exón 1 fue útil para reducir la expresión del gen de la huntingtina. Se encontró que los ARNip que varían en longitud, es decir, que consisten en 19, 20, 21, 22 y 23 pares de bases consecutivas con 2 salientes de nucleótidos además, eran efectivos contra esta secuencia, así como dos estructuras miARN separadas que llevaban una secuencia de 21 nucleótidos complementaria a la SEC. ID N0.1 en la posición de la secuencia guía (véanse las figuras 3A, 3B y 4). Por lo tanto, la primera secuencia de ARN, que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana de la huntingtina SEC ID NO.1, tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos.
La primera secuencia de ARN de acuerdo con la invención está comprendida en la cadena guía del ARN bicatenario, también denominada cadena antisentido, ya que es complementaria ("anti") a la secuencia diana de sentido. La segunda secuencia de ARN está comprendida en la cadena pasajera, también denominada "cadena de sentido", ya que puede tener una identidad de secuencia sustancial o ser idéntica a la secuencia diana. Las secuencias de ARN primera y segunda están comprendidas en un ARN bicatenario y son sustancialmente complementarias. Dicho ARN bicatenario, según la invención, es para inducir la interferencia del ARN y reducir de ese modo tanto la expresión de genes mutantes de huntingtina como naturales. Por lo tanto, se entiende que sustancialmente complementario significa que no se requiere que todos los nucleótidos de la primera y la segunda secuencia de ARN se emparejen, es decir, que sean completamente complementarios, o todos los nucleótidos de la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 se emparejen. Siempre que el ARN bicatenario sea capaz de inducir la
interferencia del ARN para secuenciar de este modo específicamente una secuencia que comprenda la SEC ID NO.1, tal complementariedad sustancial se contempla en la invención.
Por lo tanto, el ARN bicatenario según la invención comprende una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN, en donde la primera y la segunda secuencia de a Rn son sustancialmente complementarias, y en donde la primera secuencia de ARN tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos y es complementaria a la SEC ID NO. 1, siendo capaz de inducir la interferencia de ARN para secuenciar específicamente la expresión de un transcrito de a Rn que comprende la SEC ID NO.1. En la invención, dicha inducción de interferencia de ARN, que reduce la expresión de un transcrito de ARN que comprende la SEC ID NO.1, significa que es para reducir la expresión del gen de la huntingtina humano.
Se puede determinar fácilmente si este es el caso mediante el uso de ensayos estándar de indicadores de luciferasa y controles apropiados, como se describe en los ejemplos y como se conoce en la técnica (Zhuang et al. 2006 Methods Mol Biol. 2006; 342:181-7). Por ejemplo, un indicador de luciferasa que comprende la SEC ID N° 1 puede usarse para mostrar que el ARN bicatenario de acuerdo con la invención es capaz de bloquear la secuencia específica. Además, como se muestra en la sección del ejemplo, la expresión de la huntingtina se puede determinar con anticuerpos específicos para determinar la cantidad de expresión en un análisis de transferencia Western, al igual que el análisis de transferencia Northern que detecta la cantidad de transcripción de ARN.
Por lo tanto, el ARN bicatenario según la invención es para usarlo en la inducción de la interferencia del ARN. El ARN bicatenario según la invención es para usarlo en la reducción de la expresión de transcripciones que comprenden la SEC ID NO.1, como por ejemplo la SEC ID NO.2 o similares con un número variable de repeticiones CAG.
Como se dijo, el ARN bicatenario es capaz de inducir interferencia de ARN. Se sabe de la técnica que las estructuras de ARN bicatenario son adecuadas para inducir el ARNi. Por ejemplo, un ARN interferente pequeño (ARNip) comprende dos cadenas de ARN separadas, una cadena que comprende la primera secuencia de ARN y la otra cadena que comprende la segunda secuencia de ARN. Un diseño de ARNip que se usa a menudo implica 19 pares de bases consecutivas con salientes de dos nucleótidos en 3' (véase la figura 2A). Este diseño se basa en el procesamiento de Dicer observado de ARN bicatenarios más grandes que dan como resultado los ARNsi que tienen estas características. El saliente 3' puede estar comprendido en la primera secuencia de ARN. El saliente 3' puede ser añadido a la primera secuencia de ARN. La longitud de las dos cadenas de las que está compuesto un ARNip puede ser de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27 nucleótidos o más. Cada una de las dos cadenas comprende la primera y la segunda secuencia de ARN. La cadena que comprende la primera secuencia de ARN también puede consistir en la misma. La cadena que comprende la primera secuencia de ARN también puede consistir en la primera secuencia de ARN y la secuencia del saliente.
Los ARNip también pueden servir como sustratos Dicer. Por ejemplo, un sustrato Dicer puede ser un 27 unidades que consista en dos cadenas de ARN con 27 pares de bases consecutivas. La primera secuencia de ARN se coloca en el extremo 3' del dúplex de 27 unidades. En el extremo 3', como en el caso de los ARNip, hay un saliente de dos nucleótidos. El saliente 3' puede estar comprendido en la primera secuencia de ARN. El saliente 3' puede ser añadido a la primera secuencia de ARN. En el 5' de la primera secuencia de ARN, se pueden incluir secuencias adicionales que sean complementarias a la secuencia diana adyacente a la SEC ID NO.1 o no. El otro extremo del sustrato Dicer de ARNsi tiene un extremo romo. Este diseño de sustrato Dicer da como resultado una preferencia en el procesamiento por Dicer de tal manera que se forma un ARNip como el diseño de ARNip como se describió anteriormente, con 19 pares de bases consecutivas y 2 salientes de nucleótidos en ambos extremos 3'. En cualquier caso, los ARNip, o similares, están compuestos por dos cadenas de ARN separadas (Fire et al. 1998, Nature. 1998 19 de febrero; 391 (6669): 806-11) comprendiendo o consistiendo cada cadena en el ARN de la primera y la segunda secuencia de acuerdo con la invención.
El ARN bicatenario según la invención no requiere que tanto la primera como la segunda secuencia de ARN estén comprendidas en dos cadenas separadas. La primera y la segunda secuencia de ARN también pueden estar comprendidas en una sola cadena de ARN, como p. ej. un ARNhc. Un ARNhc puede comprender desde 5'- segunda secuencia de ARN - secuencia de bucle - primera secuencia de ARN - secuencia del saliente opcional de 2 nt - 3'. Alternativamente, un ARNhc puede comprender desde 5'- primera secuencia de ARN - secuencia de bucle -segunda secuencia de ARN - secuencia del saliente opcional de 2 nt - 3'. Dicha molécula de ARN forma pares de bases intramoleculares a través de la primera y segunda secuencia de ARN sustancialmente complementarias. Las secuencias bucle adecuadas son muy conocidas en la técnica (es decir, como se muestra en Dallas et al. 2012 Nucleic Acids Res. 2012 Oct; 40 (18): 9255-71 y Schopman et al., Antiviral Res. 2010 Mayo; 86 (2): 204-11).
La secuencia bucle también puede ser una secuencia de tallo-bucle, por lo que se extiende la región bicatenaria del ARNsh. Sin estar vinculado a ninguna teoría, como el sustrato de ARNip Dicer que se describe anteriormente, un ARNhc generalmente es procesado por Dicer para obtener, por ejemplo, un ARNsi que tiene un diseño de ARNsi tal como se describe anteriormente, que tiene, p. ej., 19 pares de bases consecutivas y saliente de 2 nucleótidos en ambos extremos 3'. En el caso de que el ARN bicatenario sea procesado por Dicer, se prefiere tener la primera y la segunda secuencia de ARN al final de.
Un ARN bicatenario según la invención también puede incorporarse en una estructura pre-miARN o pri-miARN. Los micro ARN, es decir, miARN, son cadenas guía que se originan a partir de moléculas de ARN bicatenario que se expresan, p. ej. en células de mamíferos. Un miARN se procesa a partir de una molécula precursora pre-miARN, similar al procesamiento de un ARNhc o un ARNip extendido como se describe anteriormente, por la maquinaria de ARNi y se incorpora en un complejo de silenciamiento inducido por ARN activado (RISC) (Tijsterman M, Plasterk RH. Dicers at RISC; the mechanism of RNAi. Cell. 2 de abril de 2004; 117 (1):1-3). Sin estar limitado por ninguna teoría, un pre-miARN es una molécula en forma de horquilla que puede ser parte de una molécula de ARN más grande (primiARN), por ejemplo, comprendida en un intrón, que primero es procesado por Drosha para formar una molécula de horquilla pre-miARN. La molécula pre-miARN es una molécula similar a ARNhc que posteriormente puede ser procesada por Dicer para dar como resultado un dúplex bicatenario similar a ARNip. El miARN, es decir, la cadena guía, que forma parte del dúplex de ARN bicatenario se incorpora posteriormente en RISC. Una molécula de ARN tal como está presente en la naturaleza, es decir, un pri-miARN, un pre-miARN o un miARN dúplex, se puede usar como estructura para producir un miARN artificial que reconoce específicamente un gen de elección. Basado en la estructura de ARN predicha, por ej., como se predijo usando, por ejemplo, el software m-fold, la secuencia de miARN natural, tal como está presente en la estructura del ARN (es decir, dúplex, pre-miARN o pri-miARN), y la secuencia presente en la estructura que es complementaria con la misma se eliminan y reemplazan con una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN de acuerdo con la invención. La primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN pueden seleccionarse de manera tal que las estructuras de ARN que se forman, es decir, pre-miARN, pri-miARN y/o el dúplex miARN, se parezcan a las secuencias originales predichas correspondientes. Los dúplex de pre-miARN, pri-miARN y miARN (que consisten en dos cadenas de ARN separadas que se hibridan a través del apareamiento de bases complementarias), como se encuentra en la naturaleza, a menudo no están completamente apareados por bases, es decir, no todos los nucleótidos que se corresponden con la primera y segunda cadena como se definió anteriormente están apareados, y la primera y la segunda cadena a menudo no tienen la misma longitud. La forma de usar moléculas precursoras de miARN como estructuras para cualquier secuencia diana seleccionada y la primera secuencia de ARN sustancialmente complementaria se describe, p. ej. en Liu YP Nucleic Acids Res. 2008 Mayo; 36 (9): 2811 -24.
En cualquier caso, como queda claro a partir de lo anterior, el ARN bicatenario que comprende la primera y la segunda secuencia de ARN puede comprender nucleótidos adicionales y/o secuencias de nucleótidos. El ARN bicatenario puede estar comprendido en una secuencia de ARN única o comprendido en dos cadenas de ARN separadas. Sin pretender imponer ninguna teoría, cualquiera que sea el diseño que se use para el ARN bicatenario, está diseñado de manera tal que una secuencia antisentido que comprende la primera secuencia de ARN de la invención puede procesarse por la máquina de ARNi de manera que pueda incorporarse en el complejo RISC para tener su acción. Dicha secuencia que comprende o consiste en la primera secuencia de ARN de la invención es capaz de reconocer específicamente la secuencia SEC ID NO.1. Por lo tanto, siempre que el ARN bicatenario sea capaz de inducir ARNi, tal ARN bicatenario se contempla en la invención. Por lo tanto, en una realización, el ARN bicatenario según la invención está comprendido en una estructura pre-miARN, una estructura pri-miARN, un ARNsh o un ARNip.
El término complementario se define en este documento como los nucleótidos de una secuencia de ácidos nucleicos que puede unirse a otra secuencia de ácido nucleico a través de enlaces de hidrógeno, es decir, nucleótidos que son capaces de emparejarse. Los ribonucleótidos, los bloques de construcción del ARN, están compuestos de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una base que es una purina (guanina, adenina) o pirimidina (uracilo, citosina). Las cadenas de ARN complementarias forman ARN bicatenario. Se puede formar un ARN bicatenario a partir de dos cadenas de ARN complementarias separadas o las dos cadenas de ARN complementarias pueden estar comprendidas en una cadena de ARN. En las cadenas de ARN complementarias, los nucleótidos citosina y guanina (C y G) pueden formar un par de bases, guanina y uracilo (G y U), y uracilo y adenina (U y A). El término complementariedad sustancial significa que no se requiere que la primera y la segunda secuencia de ARN sean completamente complementarias, o que la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 sean completamente complementarias. Por ejemplo, el primer y segundo nucleótidos, como se muestra en la figura 2A, son sustancialmente complementarios y no completamente complementarios.
De acuerdo con la invención, la complementariedad entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 consiste en no tener apareamientos erróneos. Se entiende que un nucleótido no apareado significa que, a lo largo de toda la longitud de la primera secuencia de ARN que se basa en la SEC ID NO.1, el nucleótido no se empareja con la SEC ID NO.1. No tener desajustes significa que todos los pares de bases de nucleótidos con SEC ID No.1, y con 2 apareamientos erróneos significa que dos nucleótidos no se emparejan con SEC ID NO.1. La primera secuencia de ARN también puede ser más larga que 21 nucleótidos, en este escenario, la complementariedad sustancial se determina en toda la longitud de la SEC ID NO.1. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3B y los ejemplos, se analizaron los ARNsi que tenían una longitud de la primera secuencia de nucleótidos de 22 y 23 nucleótidos. Estas primeras secuencias de nucleótidos no tenían apareamientos erróneos y eran completamente complementarias a la SEC ID NO.1. El ARN bicatenario de acuerdo con la invención es capaz de reducir la expresión de los transcritos que comprenden la SEC ID NO.1, como un indicador de luciferasa o, por ejemplo, una transcripción que comprende la SEC ID NO.1. De acuerdo con esta invención, la complementariedad entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 consiste en no tener apareamientos erróneos en toda la longitud de la primera secuencia de ARN o la SEC ID NO.1, la que sea la más corta.
En una realización, la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 tienen al menos 19 nucleótidos en ese par de bases. Preferiblemente, la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO. 1 son sustancialmente complementarias, y dicha complementariedad comprende al menos 19 pares de bases. En otra realización, la primera secuencia de ARN tiene al menos 19 nucleótidos consecutivos que forman un par de bases con los nucleótidos consecutivos de la SEC ID NO.1. En otra realización, la primera secuencia de ARN tiene al menos 19 nucleótidos consecutivos que forman un par de bases con los 19 nucleótidos consecutivos de la SEC ID NO.1.
Como se dijo, un apareamiento erróneo de acuerdo con la invención significa que un nucleótido de la primera secuencia de ARN no se empareja con la SEC ID NO.1. Los nucleótidos que no forman pares de bases son A y C, C y U, o A y G. Un apareamiento erróneo también puede dar como resultado una eliminación de un nucleótido, o una inserción de un nucleótido. Cuando el apareamiento erróneo es una eliminación en la primera secuencia de ARN, esto significa que algún nucleótido de la SEC ID NO.1 no está emparejado con la primera secuencia de ARN cuando se compara con la longitud total de la primera secuencia de a Rn . Los nucleótidos que pueden formar pares de bases son A-U, G-C y G-U. El par de bases G-U también se denomina apareamiento por balanceo G-U. En una realización, el número de pares de bases G-U entre la primera secuencia de ARN y la s Ec ID NO.1 es 0, 1 ó 2. En una realización, no hay apareamientos erróneos entre la primera secuencia de ARN y SEC ID NO.1 y se permiten un par de bases G-U o pares G-U. Preferiblemente, no puede haber pares de bases G-U entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID nO.1, o la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 solo tiene pares de bases que son A-U o G-C. Preferiblemente, no hay pares de bases G-U y no hay apareamientos erróneos entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1. Por lo tanto, la primera secuencia de ARN del ARN bicatenario según la invención preferiblemente es completamente complementaria a la SEC ID NO.1, y dicha complementariedad consiste en las pares de bases G-C y A-U.
Sin estar ligado a ninguna teoría, tener una complementariedad completa entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 puede permitir que el complejo RISC activado que comprende dicha primera secuencia de ARN escinda su secuencia diana, mientras que tener apareamientos erróneos solo puede producir la inhibición de la traducción, dando como resultado esto último una inhibición menos potente.
La primera secuencia de ARN de acuerdo con la invención se selecciona de las SEC ID NO. 3-7.
Tabla 1: Primeras secuencias de ARN.
Se ha demostrado que las primeras secuencias de ARN de la tabla 1 inhiben específicamente los transcritos que comprenden la SEC ID NO.1 como se describe en la sección de ejemplos.
La primera secuencia de nucleótidos del ARN bicatenario según la invención es completamente complementaria con la SEC ID NO.1. Esto significa que no hay apareamientos erróneos entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1 en toda la longitud de la primera secuencia de ARN o la SEC ID NO.1, cualquiera que sea la más corta. Preferiblemente, la primera secuencia de nucleótidos y la SEC ID NO.1 son completamente complementarias, y comprenden solo las pares de bases G-C y A-U. Preferiblemente, la primera secuencia de ARN se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID NO 3-7, que son completamente complementarias con la SEC ID NO.1. Lo más preferiblemente, la primera secuencia de ARN es la SEC ID NO. 5. Cuando la primera secuencia de nucleótidos tiene 21 nucleótidos o menos (SEC ID NO. 3, 4 y 5), todos los nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos se aparean con SEC ID NO.1. Cuando la primera secuencia de nucleótidos es más larga que 21 nucleótidos (SEC ID NOs.6 y 7), todos los nucleótidos de s Ec ID NO.1 forman un par de bases con la primera secuencia de nucleótidos. Los nucleótidos adicionales que están comprendidos en la primera secuencia de ARN no forman pares de bases con la SEC ID NO.1. Cuando la primera secuencia de nucleótidos es más larga de 21 nucleótidos y otros nucleótidos deben ser parte de la cadena guía, preferiblemente los otros nucleótidos son complementarios con la secuencia que flanquea la secuencia de la SEC ID NO.1, cuando está presente en la SEC ID NO.2.
Con respecto a la segunda secuencia de ARN, la segunda secuencia de ARN es sustancialmente complementaria con la primera secuencia de ARN. La segunda secuencia de ARN combinada con la primera secuencia de ARN forma un ARN bicatenario. Como se ha dicho, esto es para formar un sustrato adecuado para la maquinaria de
interferencia de ARN, de modo que una secuencia guía derivada de la primera secuencia de ARN esté comprendida en el complejo RISC para secuenciar específicamente e inhibir la expresión de su diana, es decir, la expresión génica de la huntingtina. Como se ha dicho, dicho ARN bicatenario está comprendido preferiblemente en una estructura pre-miARN, una estructura de pri-miARN, un shARN o un ARNip.
La secuencia de la segunda secuencia de ARN tiene similitudes con la secuencia diana. Sin embargo, la complementariedad sustancial con la primera secuencia de ARN puede seleccionarse para disponer de una complementariedad menos sustancial en comparación con la complementariedad sustancial entre la primera secuencia de ARN y la SEC ID NO.1. Por lo tanto, la segunda secuencia de ARN puede comprender 0, 1, 2, 3, 4 o más apareamientos erróneos, 0, 1, 2, 3 o más pares de bases de balanceo de G-U, y puede comprender inserciones de 0, 1, 2, 3, 4 nucleótidos y/o deleciones de 0, 1, 2, 3, 4 nucleótidos. Preferiblemente, la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias, comprendiendo dicha complementariedad 0, 1, 2 ó 3 pares de bases G-U y/o en donde dicha complementariedad comprende al menos 17 pares de bases.
Estos apareamientos erróneos, los pares de bases de balanceo G-U, las inserciones y las eliminaciones, son con respecto a la primera secuencia de ARN, es decir, la región bicatenaria que se forma entre la primera y la segunda secuencia de ARN. Mientras la primera y la segunda secuencia de ARN pueden sustancialmente formar pares de bases, y son capaces de inducir una inhibición específica de secuencia de la SEC ID NO.1, se permite tal complementariedad sustancial de acuerdo con la invención. También se entiende que la complementariedad sustancial entre la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN puede depender del diseño de ARN bicatenario elegido. Puede depender, por ejemplo, de la estructura de miARN que se elija para la incorporación del ARN bicatenario.
Tabla 2. Segundas secuencias de ARN.
En una realización, la segunda secuencia de ARN se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID NO. 8-14. En la Tabla 2, se enumeran ejemplos de dichas segundas secuencias de a Rn de acuerdo con la invención. Las SEC ID NOs. 8, 9, 10, 11 y 12 son completamente complementarios con la SEC ID NO.1 en toda su longitud. Las SEC ID NOs. 13 y 14 pueden combinarse con un primer nucleótido que tiene una secuencia correspondiente a la SEC ID NO.5 de 21 nucleótidos, que es complementaria con la SEC ID NO.1 en toda su longitud. La SEC ID NO.13 es complementaria de la SEC ID NO.5 que tiene una deleción de dos nucleótidos (lo que da como resultado los 2 nucleótidos correspondientes de la SEC ID NO.5 no apareados) y 19 nucleótidos apareados. La SEC ID NO.14 es complementaria de la SEC ID NO.5 que tiene una deleción de dos nucleótidos, dos apareamientos erróneos y 17 nucleótidos apareados. La complementariedad también se puede ver en la figura 2B, ya que la combinación de SEC ID NO.5 y s Ec ID NO.13 está presente en miH12_155, y la combinación de SEC ID NO.5 y SEC ID NO.14 está presente en miH12_451a. Por lo tanto, como queda claro a partir de lo anterior, la segunda secuencia de ARN no requiere complementariedad con la primera secuencia de ARN, pero puede comprender deleciones, inserciones y mutaciones que den lugar a apareamientos erróneos, en comparación con la SEC ID NO.1.
Como queda claro a partir de lo anterior, la complementariedad sustancial entre la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN puede comprender apareamientos erróneos, deleciones y/o inserciones relativas con una primera y segunda secuencia de ARN que son completamente complementarias (es decir, completamente apareadas). En una realización, la primera y la segunda secuencia de ARN tienen al menos 11 pares de bases consecutivas. Por lo tanto, al menos 11 nucleótidos consecutivos de la primera secuencia de ARN y al menos 11 nucleótidos consecutivos de la segunda secuencia de ARN son completamente complementarios. En otra realización, la primera y la segunda secuencia de ARN tienen al menos 15 nucleótidos que forman un par de bases. Dicho apareamiento de bases entre al menos 15 nucleótidos de la primera secuencia de ARN y al menos 15 nucleótidos de la segunda secuencia de ARN puede consistir en pares de bases G-U, G-C y A-U, o puede consistir en las pares de bases G-C y A-U. En otra realización más, la primera y la segunda secuencia de ARN tienen al menos 15 nucleótidos que forman un par de bases y tienen al menos 11 pares de bases consecutivas. En otra
realización más, la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias, en donde dicha complementariedad comprende al menos 17 pares de bases. Dichos 17 pares de bases pueden ser preferiblemente 17 pares de bases consecutivos, consistiendo dicho apareamiento de bases en las pares de bases G-U, G-C y A-U o consistiendo en las pares de bases G-C y A-U.
En una realización, la primera y la segunda secuencia de nucleótidos se seleccionan del grupo de SEC ID NOs. 3 y 8; 4 y 9; 5 y 10; 5 y 13; 5 y 14; 6 y 11; y 7 y 12. Estas combinaciones de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos demostraron ser efectivas cuando estaban comprendidas en estructuras de ARNsi o miARN.
La primera y la segunda secuencia de nucleótidos que son sustancialmente complementarias preferiblemente no forman un ARN bicatenario de 30 pares de bases consecutivos o más, ya que pueden desencadenar una respuesta inmune innata a través de la ruta de la proteína quinasa activada por el ARN bicatenario (ARNbc). Por lo tanto, el ARN bicatenario es preferiblemente menor que 30 pares de bases consecutivos. Preferiblemente, una estructura pre-miARN, una estructura pri-miARN, un ARNhc o un ARNip que comprende el ARN bicatenario según la invención no comprende 30 pares de bases consecutivas.
Preferiblemente, el ARN bicatenario según la invención está comprendido en una estructura de pre-miARN o primiARN. Un estructura pri-miARN comprende una estructura pre-miARN. La estructura pre-miARN comprende el ARN bicatenario de la invención, es decir, la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN. Preferiblemente, el ADN bicatenario según la invención está comprendido en una estructura de pri-miARN derivada de miR-451a (también denominada miR-451) o miR-155. En la Figura 2A se muestran ejemplos de ARN bicatenarios de acuerdo con la invención comprendidos en una estructura pre-miARN. La secuencia de estos pre-miARN se enumeran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Estructuras pre-miARN con SEC ID NO. 5
La secuencia de pre-miARN de la SEC ID NO.15 consiste en un extremo 5' correspondiente a los nucleótidos 1-16 de la SEC ID NO.15, una primera secuencia de ARN correspondiente a la SEC ID NO.5 desde los nucleótidos 17-37 de la SEC ID NO.15, una segunda secuencia de ARN correspondiente a la SEC ID NO.14 desde los nucleótidos 38 56 de la SEC ID NO.15, y un extremo 3' correspondiente a los nucleótidos 57-72 de la SEC ID NO.15. La estructura pre-miR451a de acuerdo con la invención comprende el extremo 5' correspondiente a los nucleótidos 1-16 de la SEC ID NO.15, seguido de la primera secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, la segunda secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, y el extremo 3' correspondiente a los nucleótidos 57-72 de la SEC ID NO.15. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencias de ARN se seleccionan de manera tal que, cuando están comprendidas en la estructura pri-miR451a, se obtiene una estructura predicha altamente similar o como se muestra en la Figura 2B. Preferiblemente, los pares de bases que se forman entre la primera y la segunda secuencia de ARN son los pares de bases G-C, G-U y A-U y, preferiblemente, la longitud de secuencia de la primera secuencia de ARN tiene 21 nucleótidos y la longitud de la segunda secuencia de ARN tiene preferiblemente 19 nucleótidos. Preferiblemente, los pares de bases que se forman entre la primera y la segunda secuencia de ARN son los pares de bases G-C y A-U y, preferiblemente, la longitud de secuencia de la primera secuencia de ARN tiene 21 nucleótidos y la longitud de la segunda secuencia de ARN tiene preferiblemente 19 nucleótidos. Sin pretender imponer ninguna teoría, esta estructura pri-R451a puede preferirse, ya que no permite que ninguna cadena pasajera sea procesada por la maquinaria de ARNi para incorporarse a RISC (Cheloufi et al., 3 de junio de 2010; 465 (7298): 584-9). A partir de un dúplex ARNip o miARN, en principio ambas cadenas pueden incorporarse en RISC. Como la cadena pasajera (correspondiente a la segunda secuencia) puede dar como resultado la selección de transcripciones distintas a una transcripción huntingtina, el uso de la estructura pri-miR451a o pre-miR451a puede permitir que se evite esa orientación no deseada. Cuando se probó la actividad potencial de la "cadena pasajera", no se detectó ninguna actividad con la estructura pri-451 a (véanse las figuras 4A y 4B). Se entiende que el procesamiento de la horquilla pre-miARN es independiente de Dicer y que se divide por Ago2 (Yang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 24 de agosto de 2010; 107 (34): 15163-8).
La secuencia de pre-miARN de la SEC ID NO.16 consiste en un extremo 5' correspondiente a los nucleótidos 1-5 de la SEC ID NO.16, una primera secuencia de ARN correspondiente a la SEC ID NO.5 de los nucleótidos 6-26 de la SEC ID NO.16, una secuencia bucle de los nucleótidos 27-45 de la SEC ID NO.16, una segunda secuencia de ARN correspondiente a la SEC ID NO.13 de los nucleótidos 46-64 de la SEC ID NO.16 y un extremo 3' correspondiente a los nucleótidos 65-69 de la SEC ID NO.16. La estructura pre-155 que comprende la primera y la segunda secuencia de ARN de acuerdo con la invención comprende el extremo 5' correspondiente a los nucleótidos 1-5 de la SEC ID
NO.16, la primera secuencia de ARN, una secuencia bucle correspondiente a los nucleótidos 27-45 de la SEC ID NO.16, la segunda secuencia de ARN y un extremo 3' correspondiente a los nucleótidos 65-69 de la SEC ID NO.16. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de aRn se seleccionan de manera tal que cuando están comprendidas en la estructura pre-miR155 (o la estructura de pri-miARN) se obtiene una estructura predicha muy similar a la mostrada en la Figura 2B. Preferiblemente, los pares de bases que se forman entre la primera y la segunda secuencia de ARN son pares de bases G-C o A-U y, preferiblemente, la longitud de la secuencia de la primera secuencia de ARN es de 21 nucleótidos y la longitud de la segunda secuencia de ARN es preferiblemente de 19 nucleótidos. Dichos 19 nucleótidos son preferiblemente completamente complementarios con los nucleótidos 2-18 de una primera secuencia de nucleótidos de 21 nucleótidos de longitud.
Una secuencia pre-miARN, cuando está comprendida en una secuencia de ARN más grande, requiere secuencias flanqueantes monocatenarias de 5' y 3' que permiten el reconocimiento y la escisión de Drosha. Dichas secuencias, que son adecuadas para permitir el reconocimiento y la escisión de Drosha, son la secuencia 5'-pri-miARN y la secuencia 3'-pri-miARN. Por ejemplo, la secuencia pre-miH12_155, expresada como se muestra en la figura 5A, está flanqueada por 5'-pri-miARN y las secuencias 3'-pri-miARN de miR155 en el vector de expresión CMV-miH12-155 (Figura 2C). La secuencia pri-miARN que comprende el miRH 12-155 se muestra en la Figura 2F, el 5'-primiARN correspondiente a los nucleótidos 1-87 y el 3'-pri-miARN correspondiente a 147-272. Del mismo modo, las secuencias de pri-miARN CAG-miH12-451 y PGK-miH12-451, que se expresan por sus respectivos vectores en las figuras 2D y 2E, se muestran en las figuras 2G y 2H. El 5'-pri-miARN y el 3'-pri-miARN del ARN de CAG-miH12-451 expresado, correspondientes a los nucleótidos 1-302 y 375-605, y el 5'-pri-miARN y el 3'-pri-miARN de la expresión de ARN de PGK-miH12-451 correspondiente respectivamente a los nucleótidos 1-516 y 589-819. La longitud de los flancos de una sola cadena puede variar, pero suele ser de alrededor de 80 nt (Zeng y Cullen, J Biol Chem. 29 de julio de 2005; 280 (30): 27595-603; Cullen, Mol Cell. 22 de diciembre de 2004; 16 (6): 861-5). La longitud mínima de los flancos monocatenarios se puede determinar fácilmente como cuando se hace demasiado corto, el procesamiento de Drosha puede fallar y la inhibición específica de la secuencia se reducirá o incluso estará ausente. En una realización, la estructura de pri-miARN que lleva la primera y la segunda secuencia de ARN de acuerdo con la invención tiene un flanco de la secuencia 5' y un flanco de la secuencia 3' con respecto a la estructura de remiARN predicha de al menos 50 nucleótidos. Las secuencias derivadas de pre-miARN y de pri-miARN se derivan todas preferiblemente de la misma secuencia de pri-miARN de origen natural.
La secuencia de pre-miARN de SEC ID NO.15 y SEC ID NO.16 está codificada por las secuencias de ADN como se muestra en las figuras 2C (SEC ID NO.16), 2D (SEC ID NO.15) y 2E (SEC ID nO.15). Las secuencias de Pri-miARN que comprenden dichas secuencias de pre-miARN se representan en las figuras 2F (SEC ID NO.16), G (SEC ID No .15) y H (SEC ID NO.15). El pri-miARN codificado por CMV-miH12-155 corresponde a los nucleótidos 1433-1704 de la Figura 2C, de CAG-miH12-451 a los nucleótidos 1716-2320 de la Figura 2D y de PGK-miH12-451 a los nucleótidos 278-1097 de la Figura 2E. Del mismo modo, la primera y la segunda secuencia de ARN deben incorporarse como se describió anteriormente para los pre-ARNm.
Los ARN bicatenarios de acuerdo con la invención, incorporados en un ARNip, ARNsh, una estructura de pri-ARNm o una estructura de pre-miARN pueden proporcionarse en una célula usando métodos conocidos en la técnica, tales como la lipofección, transfección o utilizando cualquier otro medio adecuado para ello. Los ARN bicatenarios según la invención pueden ser ARN bicatenarios sintéticos o ARN bicatenarios naturales. Los ARN sintéticos bicatenarios pueden comprender ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. Dicho ARN bicatenario tiene propiedades similares en comparación con sus contrapartes naturales y una actividad de interferencia de ARN similar o mejorada respecto a los ARN bicatenarios que consisten completamente en ARN bicatenario no sintético. Por ejemplo, los ARNip sintéticos pueden incluir en su diseño el uso de Ácidos Nucleicos Bloqueados (un anillo de ribosa conectado por un puente de metileno (naranja) entre los átomos de 2'-O y 4'-C), nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos que comprenden fosforotioatos, 2'-O-Me, 2'-O-alilo y 2'-desoxifluorouridina. Es bien sabido que los ARN bicatenarios, p. ej. los ARNip, pueden acomodar un gran número de modificaciones en las posiciones apareadas y no apareadas sin una pérdida significativa de actividad. Preferiblemente, el ARN bicatenario de la invención es un ARN bicatenario que consiste en nucleótidos naturales, tales como los obtenidos a partir de la expresión de un ARN bicatenario a partir de.
Por lo tanto, en una realización, dichos ARN bicatenarios de la invención están codificados por una secuencia de ADN. Dicha secuencia de ADN que codifica dicho ARN bicatenario, p. ej. como está comprendido en un ARNip, ARNhc, estructura de pri-ARNm o estructura de pre-miARN, está comprendida en un casete de expresión. Se entiende que cuando el ARN bicatenario debe ser, por ejemplo, un ARNip, que consta de dos cadenas de ARN, entonces se requieren dos casetes de expresión. Uno que codifica una cadena de ARN que comprende la primera secuencia de ARN, el otro casete que codifica una cadena de ARN que comprende la primera cadena de ARN. Cuando el ARN bicatenario está comprendido en una única molécula de ARN, p. ej. codificando un ARNhc, premiARN o pri-miARN, un casete de expresión puede ser suficiente. Un casete de expresión pol II puede comprender una secuencia promotora, secuencia que codifica el ARN a expresar seguido de una secuencia de poliadenilación. En el caso de que el ARN bicatenario que se expresa comprenda una estructura de pri-miARN, la secuencia de ARN codificada puede codificar secuencias de intrones y secuencias de exones y 3'-UTR y 3'-UTR. Un casete de expresión de pol III comprende en general una secuencia promotora, seguida por la secuencia de ADN que codifica el ARN (por ejemplo, la secuencia de ARNsh, el pre-miARN o una cadena de los ARN bicatenarios que deben estar comprendidos, por ejemplo, en un ARNsi o ARNsi extendido). Un casete de expresión pol I puede comprender un
promotor pol I, seguido de la secuencia de codificación de ARN y un 3'-Box. Los casetes de expresión para los ARN bicatenarios son bien conocidos en la técnica, y cualquier tipo de casete de expresión puede ser suficiente, por ejemplo. se puede usar un promotor pol III, un promotor pol II o un promotor pol I (es decir, ter Brake et al., Mol Ther.
2008 Mar; 16 (3): 557-64, Maczuga et al., BMC Biotechnol. 24 de julio de 2012; 12:42). Los ejemplos de casetes de expresión que expresan un ARN bicatenario según la invención se representan en las figuras 2C-E.
Preferiblemente, se usa un promotor pol II, tal como el promotor PGK, un promotor CBA o un promotor CMV (véanse las figuras 2C-D). Como la enfermedad de Huntington afecta a las neuronas, en particular, puede ser útil usar un promotor neuroespecífico. Ejemplos de promotores neuroespecíficos adecuados son la enolasa específica de neuronas (NSE), la sinapsina 1 humana, la quinasa caMK y la tubulina. Otros promotores adecuados que pueden contemplarse son promotores inducibles, es decir, un promotor que inicie la transcripción solo cuando la célula huésped esté expuesta a algún estímulo particular.
Dichos casetes de expresión de acuerdo con la invención pueden transferirse a una célula, usando, por ejemplo, métodos de transfección. Cualquier medio adecuado puede ser suficiente para transferir un casete de expresión de acuerdo con la invención. Preferiblemente, se usan vectores de terapia génica que transfieren de manera estable el casete de expresión a las células, de modo que se puede lograr una expresión estable de los ARN bicatenarios que inducen la inhibición específica de la secuencia del gen de la huntingtina como se describe anteriormente. Los vectores adecuados pueden ser vectores lentivirales, sistemas de vectores basados en retrotransposones, o vectores de AAV. Se entiende que cuando, por ej., los vectores lentivirales llevan un genoma de ARN, el genoma de ARN codificará dicho casete de expresión de tal manera que, después de la transducción de una célula, se formarán dicha secuencia de ADN y dicho casete de expresión. Preferiblemente, se usa un vector viral tal como el AAV. Preferiblemente, el vector AAV que se usa es un vector AAV del serotipo 5. El AAV del serotipo 5 puede ser particularmente útil para transducir neuronas como se muestra en los ejemplos. La producción de vectores de AAV que comprende cualquier casete de expresión de interés está bien descrita en los documentos WO2007/046703, WO2007/148971, WO2009/014445, WO2009/104964, WO2011/122950, WO2013/036118.
Se pueden derivar las secuencias de AAV que se pueden usar en la presente invención para la producción de vectores de AAV, p. ej., producidas en líneas celulares de insectos o mamíferos, a partir del genoma de cualquier serotipo de AAV. En general, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa en los niveles de aminoácidos y ácidos nucleicos, proporcionan un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente física y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan por mecanismos prácticamente idénticos. Para la secuencia genómica de los diversos serotipos de AAV y una descripción general de las similitudes genómicas, consúltense, por ejemplo, número de entrada de GenBank U89790; número de entrada de GenBank J01901; número de entrada de GenBank AF043303; número de entrada de GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir.
73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72: 309-319); y Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Los serotipos 1, 2, 3, 4 y 5 de AAV son una fuente preferida de secuencias de nucleótidos de AAV para usar en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, las secuencias ITR de AAV para usar en el contexto de la presente invención se derivan de AAV1, AAV2 y/o AAV5. Del mismo modo, las secuencias de codificación Rep52, Rep40, Rep78 y/o Rep68 se derivan preferiblemente de AAV1, AAV2 y AAV5. Sin embargo, las secuencias que codifican las proteínas de la cápside de VP1, VP2 y VP3 para usar en el contexto de la presente invención pueden tomarse de cualesquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferiblemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o partículas similares a AAV recientemente desarrolladas obtenidas, por ejemplo, por técnicas de barajado de cápside y bibliotecas de cápside AAV.
En otra realización, se proporciona una célula huésped que comprende dicha secuencia de ADN, o dicho casete de expresión de acuerdo con la invención. Por ejemplo, dicho casete de expresión o secuencia de ADN puede estar comprendido en un plásmido contenido en bacterias. Dicho casete de expresión o secuencia de ADN también puede estar comprendido en una célula de producción que produce, p. ej., un vector viral.
Tal como se muestra en la sección de los Ejemplos, y como se explicó anteriormente, el ARN bicatenario según la invención, la secuencia de ADN según la invención, el casete de expresión según la invención y el vector de terapia génica según la invención son para uso en un tratamiento médico, en particular para usar en el tratamiento de la enfermedad de Huntington. Dicho tratamiento médico, cuando se usa un vector de AAV (o también para un vector de terapia génica) comprende una infusión directa del vector de AAV de la invención en el cerebro. Dicha infusión directa en otras realizaciones comprende una infusión intratecal del vector en el líquido cefalorraquídeo. Dicha infusión intratecal representa una forma eficiente de administrar el vector de terapia génica al SNC y de atacar las neuronas. Preferiblemente, las estructuras estriatales y corticales se atacan a través de una difusión por convección intraestriatal (CED) de la administración de vectores de AAV a través de inyecciones en el estriado. Más preferiblemente, para una mayor cobertura del SNC, las inyecciones son en el cuerpo estriado y también en el tálamo. Por lo tanto, los vectores de AAV se administran por vía intraestriacal, o se administran por vía intrastriaca e intratalamicamente a través de inyecciones mejoradas de difusión por convección (CED) en el cuerpo estriado, o el cuerpo estriado y el tálamo. Dichas inyecciones se llevan a cabo preferiblemente a través de inyecciones guiadas por MRI. Dichos métodos de tratamiento son particularmente útiles para sujetos humanos que tienen la enfermedad de Huntington. Se entiende que el tratamiento de la enfermedad de Huntington involucra a sujetos humanos que tienen la enfermedad de Huntington, incluidos los sujetos humanos que tienen una predisposición genética a
desarrollar la enfermedad de Huntington que aún no muestran signos de la enfermedad. Por lo tanto, el tratamiento de sujetos humanos con la enfermedad de Huntington incluye el tratamiento de cualquier sujeto humano que tenga un alelo de huntingtina con más de 35 repeticiones CAG.
Ejemplos
Construcciones de expresión de estructuras de miARN y ARNips
Para crear vectores con estructuras miARN basados en miR155, se incorporaron 21 secuencias de nucleótidos (pb) completamente complementarias con las secuencias diana seleccionadas en HTT como se indica en la Figura 1, en el esqueleto pri-mir-155 de pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen, Carlsbad, CA) dando como resultado un pVD-CMV-miHTT-155 (en la Figura 2C se representa un ejemplo de una secuencia del casete de expresión, la secuencia de pre-miARN y pri-miARN como se describe en el ARN expresado se muestra en la figura 2B y 2F, respectivamente). Los constructos de pri-mir-155 se diseñaron según las instrucciones proporcionadas por Invitrogen (BLoCk-ÍT, Kits del Vector de expresión de ARNi de Pol II miR, Versión E, 22 de junio de 2007, 25-0857) por recocido de oligonucleótidos sintéticos bicatenarios en el sitio Bsal de pcDNA6.2-GW/emGFP-mir155. La estructura de todos los pre-miARNs artificiales codificados por las construcciones de miHtt se verificó utilizando el software Mfold (Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003), usando mfold versión 3.5, disponible en línea en http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold). La estructura predicha de la estructura pre-miARN-155 que lleva la secuencia correspondiente con la SEC ID NO.5 se muestra en la figura 2B. La secuencia de ADN que codifica el constructo de expresión para la estructura pri-miARN-155 con la SEC ID NO.5 como una primera secuencia seleccionada se muestra en la figura 2C (SEC ID NO. 17); este constructo también se conoce como miH12 y su diana H12. Para las otras 20 secuencias diana seleccionadas, las secuencias se diseñaron para ser completamente complementarias con las secuencias diana como se muestra en la Figura 1, y la estructura de miARN tiene las mismas características estructurales que se muestran en la Figura 2B, es decir, la segunda secuencia de ARN incluida en la estructura corresponde a la secuencia en la que la primera secuencia de ARN seleccionada es completamente complementaria, pero con una deleción de 2 nucleótidos en el centro. De manera similar, como control, se usó una secuencia de ARN aleatorizada como primera secuencia de ARN, y al igual que anteriormente, se diseñó una segunda secuencia de ARN para crear un vector pVD-CMV-miScr-155. Las construcciones contenían GFP para permitir la expresión de miARN y la visualización de la transducción in vitro e in vivo.
Se creó un vector de estructura miARN basado en miR451a. La secuencia de ADN que codifica la estructura primiR-451 se sintetizó en base a que la secuencia de mir-451 madura predicha se reemplazó por la secuencia diana H12, es decir, SEC ID NO.5 como primera secuencia de ARN. La segunda secuencia de aRn se diseñó para ser completamente complementaria a los nucleótidos 2-18 de la primera secuencia de ARN. La segunda secuencia de ARN se seleccionó de manera que la estructura de ARN predicha de la secuencia de pre-miARN artificial adoptó una estructura similar a la estructura natural original. La estructura del pre-miARN codificada por las construcciones se verificó utilizando el software Mfold (Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003), usando mfold versión 3.5, disponible en línea en http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold). La estructura predicha que utiliza la SEC ID NO.5 se muestra en la Figura 2B. Se hicieron dos vectores que expresaban estructuras miR451a diferentes. Las secuencias de ADN de las construcciones de expresión se representan en las figuras 2D y 2E, las correspondientes secuencias de la estructura de pri-miARN respectivas según lo comprendido en el ARN expresado, se muestran en las figuras 2G y 2H. La Figura 2d muestra la secuencia de ADN del casete de expresión de pVD-CAG-miH12-451, que expresa la estructura de miARN con un promotor CAG, y en la figura 2E, la secuencia de ADN del casete de expresión de pVD-PGK-miH12-451 es mostrada, que utiliza un promotor PGK.
Se diseñó un siARN sintético dirigido a HTT en la diana miH12, es decir, SEC ID NO.1 con longitudes de 19-23 pb (Tabla 1). Los ARNip comprendían la primera y la segunda secuencia de nucleótidos correspondientes a las SEC ID NO. 3 y 8; 4 y 9; 5 y 10; 6 y 11; y 7 y 12. Los ARNip fueron diseñados para tener los salientes 3'-UU en ambas cadenas.
Construcciones del indicador
Se diseñaron y clonaron construcciones de psiCheck-2 LucHTT que contienen la secuencia completa del exón 1 de HTT siguiendo las instrucciones proporcionadas por Promega (siCHECK™ Vectors, C8011, Promega Benelux b.v., Leiden, Países Bajos). LucHTT comprende la SEC ID NO.1 y las secuencias de flanqueo de la misma como están presentes en la sEc ID NO.2 (véase Fig. 1B). El indicador LucH12_451a comprende la secuencia complementaria con la segunda secuencia de ARN diseñada para ser expresada por pVD-CAG-miH12-451 y pVD-PGK-miH12-451. Todas las construcciones han sido secuenciadas y la secuencia correcta ha sido verificada. La eficacia del bloqueo de todas las estructuras de miARN y ARNip se determinó en indicadores específicos de luciferasa in vitro. Las células Hek293T se cotransfectaron con el miHtt y el indicador de luciferasa en una relación 1:1 (miR-155, PGK-miH12-451), o una relación 1:10 (CAG-miH12-451, es decir, el promotor CAG es muy fuerte). El bloqueo de la luciferasa de Renilla se midió 48 h después de la transfección (p.t), y el de luciérnaga se midió como control interno. Se utilizó miScr como control negativo y se estableció en 100%.
Resultados in vitro
Entre las construcciones de miH1-miH21 que reconocen al exón 1, miH12 indujo el bloqueo del indicador de luciferasa más fuerte con una reducción del 75-80% (Figura 3A). Los ARNip que reconocen a H12, es decir, SEC ID NO.1, se demostró que todos tenían una eficiencia de bloqueo similar, mostrando que, con un aumento en la dosis, había un bloqueo más fuerte. Los siARN de 19 y 21 pares de bases mostraron un poco más de inhibición en comparación con los otros ARNip probados. Se realizó un análisis de secuenciación de la siguiente generación (NGS) del ARN expresado a partir de pVD-CMV-miHTT-155 y se mostró una preferencia en las cadenas guía y pasajera (véase, por ejemplo, la fig. 2B (7)) correspondiente a la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN tal como se diseñó para formar parte de la estructura de miARN. Se probaron pVD-CAG-miH12-451 y pVD-PGK-miH12-451 para determinar tanto la diana de LucHTT como de LucH12_451a. Tanto la construcción CAG como la PGK mostraron una inhibición específica de la secuencia (Figura 4A), mientras que no se redujo el indicador de Luc que comprendía una secuencia totalmente complementaria con la segunda secuencia de ARN de las construcciones.
Bloqueo in vivo utilizando vectores AAV en ratones
El constructo de expresión CMV-miH12-155 de pVD-CMV-miHTT-155 se clonó en un esqueleto de vector AAV5 y AAV5 producido usando el sistema de producción de baculovirus. Como control, CMV-miScr-155 también se incorporó en una estructura AAV5 para servir como control negativo. Para controlar la eficiencia de la transducción cerebral, los casetes de expresión contenían GFP (Figura 5A). Un vector AAV-5 que transporta un constructo indicador de luciferasa, Luc73QHTT, que comprende la secuencia diana SEC ID NO.1 (es decir, la secuencia completa del exón 1 de HTT con 73 repeticiones CAG) y las secuencias flanqueantes de la misma como están presentes en la SEC ID NO.2 (véase Fig.1 B). A ratones Balb/6 (N5) se les inyectó de forma intraestrial 2 |jl de AAV5-Luc73QHtt/SNP (3,6 x 1012 gc/ml) y AAV5-miScr (1,8x1013 gc/ml) o AAV5-miH12 (1,8x1013 gc/ml) en una proporción de 1:5. Un grupo separado se inyectó con AAV5-Luc73QHtt/SNP y PBS. La expresión de luciferasa se controló a las 2, 4 y 6 p.i. por MS.). Ya a la semana p.i., hubo un claro bloqueo de Luc19QHtt/wt por miH12 en comparación con los animales miScr y solo Luc19QHtt/wt (Figura 7b y c). Se mostró una tendencia que indicaba una disminución significativa en la expresión del indicador de luciferasa con el tiempo, siendo casi indetectable (miH12 N°. 1 y N°. 2) en el cerebro en comparación con los grupos de control que indicaban un fuerte bloqueo de la diana HTT por CMV-miH12-155. Al final del experimento, la fluorescencia de Luc73QHtt/SNP en el grupo CMV-miH12-155 fue aproximadamente 1 log más bajo en comparación con miScr.
Bloqueo in vivo utilizando vectores AAV en modelos de animales HD
AAV5-CMV-miH12-155 se probó en un modelo de rata HD LV-171-82Q (Drouet et al. 2009, Ann Neurol. 2009 Mar; 65 (3): 276-85). El modelo se basa en la sobreexpresión estriatal de los primeros 171 aminoácidos del fragmento mutante de HTT con 82 repeticiones CAG vinculadas a un fragmento del exón 67 que contiene el SNP C/T. A las ratas HD se les inyectó AAV5-CMV-miH12-155 o un control AAV5-CMV-miScr-155 (Figura 6A). A las ratas se les inyectó intraestrialmente LV-171 -82Q y, una semana después, AAV5-CMV-miH12-155 o AAV5-CMV-miScr-155. El efecto neuroprotector de AAV5-CMV-miH12-155 se determinó en función de la tinción histológica (DARP32, EM48, GFP e Iba1) de las secciones de cerebro de rata HD en los puntos de tiempo iniciales y finales (Figuras 6B, 6C y 6D, 2 semanas p.i.). Las lesiones DARP32 (fig. 6B, panel superior) indican cierta neurodegeneración y se pueden observar como manchas blancas en las secciones del cerebro. El panel muestra claramente menos muerte neuronal y, por lo tanto, no hay manchas blancas en las secciones cerebrales de ratas AAV5-CMV-miH12-155. Las secciones del cerebro se tiñeron para los agregados de HTT mutantes (EM48, Figura 6B) vistos como pequeños puntos marrones en los portaobjetos. Claramente, hubo menos neurodegeneración y menos agregados de HTT mutantes en ratas HD inyectadas con AAV5-CMV-miH12-155 en comparación con el grupo de control (Figura 6B, paneles medio y más bajo). Se obtuvieron resultados similares en el punto de tiempo final de 8 semanas después de la inyección (datos no mostrados). Los resultados histológicos de GFP (tinción marrón) indicaron una transducción estriatal eficiente con todos los vectores utilizados en el presente estudio (Figura 6C). Además, casi no se detectó respuesta inmune a las 8 semanas p.i. según la tinción de Iba1 (Figura 6D).
AAV5-CMV-miH12-155 se probó posteriormente en el modelo de ratón Hu97/18 HD humanizado (Southwell et al.
2013, Hum Mol Genet. 1 de enero de 2013; 22(1): 18-34). Este modelo tiene el gen Hdh murino reemplazado por dos copias del HTT humano, uno con 97 repeticiones CAG y el otro con 18. Se ha realizado una caracterización detallada de los cambios motores, psiquiátricos, cognitivos, electrofisiológicos, neuropatológicos y bioquímicos en el modelo de ratón Hu97/18 como resultado de la progresión de la enfermedad. AAV5-CMV-miH12-155 se inyectó en un modelo de ratón Hu97/18 HD humanizado de 2 meses de edad mediante la administración por vía intracerebral mediante difusión por convección mejorada (IC-CED) en el estriado o lento (suministro lento de IC) en el estriado o administración intracerebroventricular (ICV) en los ventrículos del cerebro. La fluorescencia de GFP indicó la transducción completa del cuerpo estriado de ratón en la administración lenta y CED (Figura 7A). El análisis de transferencia Western del HTT humano mostró un bloqueo por AAV5-CMV-miH12-155 en el cuerpo estriado cuando se aplicó la administración de CED (Figura 7B).
Comparación H12 con secuencias diana de la técnica anterior
Las secuencias diana de la técnica anterior en la proximidad de la secuencia H12 se compararon con las secuencias H12. Se construyeron estructuras de ARNsi y miARN y se llevó a cabo una comparación directa utilizando el sistema
indicador de luciferasa como se describió anteriormente. Se transfectaron bajas concentraciones de ARNsi (0,25 nM) por triplicado para evitar efectos fuera del diana que sesgaban los resultados. Se fabricaron ARNip con cadenas guía y pasajero completamente complementarias (pares de bases G-C y A-U) y con un saliente u U-3' en ambas cadenas. Se utilizó un ARNip barajado como control y los valores se midieron en relación con el control. El ARNip de H12 mostró la inhibición más fuerte (véase la figura 8A). Del mismo modo, los estructuras de miARN se hicieron en base a miR-155 como se describe anteriormente de acuerdo con las instrucciones de Invitrogen y también se hizo una comparación directa. Las estructuras R6.1 y R6.2 se hicieron reemplazando 19 y 18 nucleótidos que eran perfectamente complementarios con las secuencias diana R6.1 y R6.2 en la secuencia guía de la estructura miR-155 diseñada a partir de Invitrogen. Por lo tanto, dependiendo del procesamiento de pre-miARN por parte de Dicer, la cadena guía R6 procesada puede contener nucleótidos de la estructura de miR-155 al final de la secuencia. Las estructuras de miARN se transfectaron como se describe anteriormente utilizando diferentes relaciones entre la construcción de miARN y el indicador (constructo de estructuras de miARN: indicador de luciferasa). Se usó una construcción de miARN mezclada como control y los valores se midieron en relación con el control. La Figura 8B muestra una relación de 1:1, mientras que la figura 8C muestra una relación de 1:10. La estructura miARN H12 mostró la inhibición más fuerte. H12 mostró una fuerte inhibición pronunciada tanto para los ARNip como los miARN, en particular a bajas concentraciones, que pueden considerarse más relevantes para la aplicación in vivo.
Tabla 4. Dianas de la técnica anterior en comparación con H12. Se muestran las secuencias diana. Los nucleótidos diana que tienen identidad con la secuencia diana H12 están subrayados. (SI. indica SEC ID NO.; L. indica la longitud del nucleótido, Id. Indica el número de nucleótidos que tienen identidad con H12). (R1 se deriva del ARNip siHUNT-2 de Rodriguez-Lebron et al., 2005, Mol Ther. Vol 12 No.4: 618-633, R2 se deriva de un ARNhc shD2 expresado de Franich et al., 2008, Mol Ther, vol. 16 Numero 5; 947-956), R3 se deriva de ARNip-DExonl del documento US20080015158, R4 se deriva de HDAS 07 del documento WO2008134646, R6.1 y R6.2 se derivan de una lista de aproximadamente 1750 ARNips hipotéticos diseñados para reconocer al gen de la huntingtina (documento WO2005105995).
Claims (11)
1. Un ARN bicatenario que comprende una primera secuencia de ARN y una segunda secuencia de ARN, en donde la primera y la segunda secuencia de ARN son sustancialmente complementarias, en donde la primera secuencia de ARN tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos y es complementaria a la SEC ID NO. 1, en donde la primera secuencia de ARN se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID NO.3, la SEC ID NO.4, la SEC ID NO.5, la SEC ID NO.6 y la SEC ID NO.7, y en la que dicho ARN bicatenario es capaz de reducir la expresión del gen de la huntingtina.
2. Un ARN bicatenario según la reivindicación 1, en el que el ARN bicatenario está comprendido en una estructura pre-miARN, una estructura pri-miARN, un ARNhc o un ARNip, preferiblemente una estructura pre-miARN.
3. Un ARN bicatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la primera secuencia de ARN y la segunda secuencia de ARN se seleccionan del grupo que consiste en las combinaciones de SEC ID NO. 3 y 8; SEC ID NO. 4 y 9; SEC ID NO. 5 y 10; SEC ID NO. 5 y 13; SEC ID NO. 5 y 14; SEC ID NO. 6 y 11; y SEC ID NO. 7 y 12.
4. Un ARN bicatenario según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el ARN bicatenario está comprendido en una estructura pre-miARN de miR-451a o miR-155.
5. Un ARN bicatenario según la reivindicación 4, en el que el ARN bicatenario está comprendido en un ARN que comprende la SEC ID NO. 15, SEC ID NO. 16, SEC ID NO. 20, SEC ID NO. 21 o SEC ID NO. 22.
6. Un ADN que codifica el ARN bicatenario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un casete de expresión que codifica un ARN bicatenario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
8. Un casete de expresión según la reivindicación 7, en el que el casete de expresión comprende el promotor PGK, un promotor de CMV, un promotor neuroespecífico o un promotor de CBA.
9. Un casete de expresión según la reivindicación 8, en el que el casete de expresión comprende las SEC ID NO.17, 18 ó 19.
10. Un vector de terapia génica que comprende el casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Un vector de terapia génica según la reivindicación 10, en el que el vector de terapia génica es un vector AAV, preferiblemente un vector AAV del serotipo 5.
12. Una célula huésped que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 6 o el casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
13. Un ARN bicatenario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ADN según la reivindicación 6, un casete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, un vector de terapia génica según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, para usar en un tratamiento médico.
14. Un ARN bicatenario según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ADN según la reivindicación 6, un casete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, un vector de terapia génica según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, para usar en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14200308 | 2014-12-24 | ||
| PCT/EP2015/081157 WO2016102664A1 (en) | 2014-12-24 | 2015-12-23 | Rnai induced huntingtin gene suppression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2732023T3 true ES2732023T3 (es) | 2019-11-20 |
Family
ID=52282540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15817385T Active ES2732023T3 (es) | 2014-12-24 | 2015-12-23 | Supresión del gen de la huntingtina inducida por ARNi |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US10174321B2 (es) |
| EP (2) | EP3540063A1 (es) |
| JP (2) | JP6839094B2 (es) |
| KR (1) | KR102636633B1 (es) |
| CN (1) | CN108064292B (es) |
| AU (1) | AU2015370903B2 (es) |
| CA (1) | CA2971920C (es) |
| CO (1) | CO2017007335A2 (es) |
| CY (1) | CY1121733T1 (es) |
| DK (1) | DK3237618T3 (es) |
| EA (1) | EA037696B1 (es) |
| ES (1) | ES2732023T3 (es) |
| HK (1) | HK1246344B (es) |
| HR (1) | HRP20190992T1 (es) |
| HU (1) | HUE043842T2 (es) |
| IL (1) | IL252990B (es) |
| LT (1) | LT3237618T (es) |
| MX (1) | MX381121B (es) |
| PL (1) | PL3237618T3 (es) |
| PT (1) | PT3237618T (es) |
| RS (1) | RS58862B1 (es) |
| SI (1) | SI3237618T1 (es) |
| SM (1) | SMT201900347T1 (es) |
| TR (1) | TR201908969T4 (es) |
| WO (1) | WO2016102664A1 (es) |
Families Citing this family (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9394333B2 (en) | 2008-12-02 | 2016-07-19 | Wave Life Sciences Japan | Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids |
| MX342945B (es) | 2009-07-06 | 2016-10-18 | Ontorii Inc * | Profármacos de ácido nucleico novedosos y métodos de uso de los mismos. |
| DK2620428T3 (da) | 2010-09-24 | 2019-07-01 | Wave Life Sciences Ltd | Asymmetrisk hjælpegruppe |
| US9605019B2 (en) | 2011-07-19 | 2017-03-28 | Wave Life Sciences Ltd. | Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids |
| KR20240148947A (ko) | 2012-07-13 | 2024-10-11 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 제어 |
| SG11201500243WA (en) | 2012-07-13 | 2015-04-29 | Shin Nippon Biomedical Lab Ltd | Chiral nucleic acid adjuvant |
| SG11201500239VA (en) | 2012-07-13 | 2015-03-30 | Wave Life Sciences Japan | Asymmetric auxiliary group |
| EP3095460A4 (en) | 2014-01-15 | 2017-08-23 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
| WO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
| WO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
| ES2917473T3 (es) | 2014-01-16 | 2022-07-08 | Wave Life Sciences Ltd | Diseño quiral |
| RU2020108189A (ru) | 2014-11-14 | 2020-03-11 | Вояджер Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als) |
| MX2017006217A (es) | 2014-11-14 | 2018-05-02 | Voyager Therapeutics Inc | Polinucleotidos moduladores. |
| SMT201900347T1 (it) * | 2014-12-24 | 2019-07-11 | Uniqure Ip Bv | Soppressione del gene huntingtina indotta da rnai |
| SG11201706444TA (en) | 2015-02-10 | 2017-09-28 | Genzyme Corp | VARIANT RNAi |
| WO2016161388A1 (en) | 2015-04-03 | 2016-10-06 | University Of Massachusetts | Fully stabilized asymmetric sirna |
| CN108025089A (zh) | 2015-07-22 | 2018-05-11 | 波涛生命科学有限公司 | 寡核苷酸组合物及其方法 |
| EP3334499A4 (en) | 2015-08-14 | 2019-04-17 | University of Massachusetts | BIOACTIVE CONJUGATES FOR THE RELEASE OF OLIGONUCLEOTIDES |
| CN110946865B (zh) | 2015-12-10 | 2024-01-26 | Ptc医疗公司 | 用于治疗亨廷顿病的方法 |
| CN109477108A (zh) | 2016-05-04 | 2019-03-15 | 波涛生命科学有限公司 | 寡核苷酸组合物和其方法 |
| AU2017267665C1 (en) | 2016-05-18 | 2023-10-05 | Voyager Therapeutics, Inc. | Modulatory polynucleotides |
| BR112018073472A2 (pt) | 2016-05-18 | 2019-08-27 | Voyager Therapeutics, Inc. | composições e métodos de tratamento da doença de huntington |
| US10457940B2 (en) * | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
| CN111108198A (zh) | 2017-05-05 | 2020-05-05 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗亨廷顿病的组合物和方法 |
| EP3634953B1 (en) | 2017-06-05 | 2024-01-03 | PTC Therapeutics, Inc. | Compounds for treating huntington's disease |
| CN110799647A (zh) | 2017-06-23 | 2020-02-14 | 马萨诸塞大学 | 双尾自递送sirna及相关的方法 |
| MX2019015578A (es) | 2017-06-28 | 2020-07-28 | Ptc Therapeutics Inc | Metodos para tratar la enfermedad de huntington. |
| CN111163838B (zh) | 2017-06-28 | 2023-03-28 | Ptc医疗公司 | 用于治疗亨廷顿氏病的方法 |
| MY205041A (en) * | 2017-09-22 | 2024-09-29 | Genzyme Corp | Variant rnai |
| CN111479924B (zh) | 2017-10-16 | 2024-06-14 | 沃雅戈治疗公司 | 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗 |
| US20200237799A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| CN108384803A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-08-10 | 上海百力格生物技术有限公司 | 一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法 |
| JP7399870B2 (ja) | 2018-03-27 | 2023-12-18 | ピーティーシー セラピューティクス， インコーポレイテッド | ハンチントン病を処置するための化合物 |
| BR112020023298A2 (pt) * | 2018-05-15 | 2021-03-09 | University Of Washington | composições e métodos para reduzir a spliceopatia e tratamento de distúrbios de dominância de rna |
| WO2019222413A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | University Of Massachusetts | Modified aav constructs and uses thereof |
| PL3814357T3 (pl) | 2018-06-27 | 2024-09-16 | Ptc Therapeutics, Inc. | Związki heterocykliczne i heteroarylowe do leczenia choroby huntingtona |
| KR20210038845A (ko) | 2018-06-27 | 2021-04-08 | 피티씨 테라퓨틱스, 인크. | 헌팅턴병 치료를 위한 헤테로아릴 화합물 |
| US20210254103A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-08-19 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord |
| EP3840759A4 (en) | 2018-08-23 | 2022-06-01 | University Of Massachusetts | O-METHYL RICH FULLY STABILIZED OLIGONUCLEOTIDES |
| EP3850098A1 (en) | 2018-09-12 | 2021-07-21 | uniQure IP B.V. | Rnai induced c9orf72 suppression for the treatment of als/ftd |
| AU2019385638A1 (en) | 2018-11-19 | 2021-06-03 | Uniqure Ip B.V. | A companion diagnostic to monitor the effects of gene therapy |
| CA3120177A1 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Uniqure Ip B.V. | Method and means to deliver mirna to target cells |
| CN113383077A (zh) | 2018-11-19 | 2021-09-10 | 优尼科Ip有限公司 | RNAi诱导的ataxin-3减少以用于治疗脊髓小脑共济失调3型 |
| MX2021008331A (es) * | 2019-01-09 | 2021-08-05 | Univ De Coimbra | Arn bicatenario y usos del mismo. |
| AU2020207935A1 (en) | 2019-01-18 | 2021-08-26 | University Of Massachusetts | Dynamic pharmacokinetic-modifying anchors |
| CN114245794B (zh) | 2019-05-13 | 2024-09-13 | Ptc医疗公司 | 用于治疗亨廷顿氏病的化合物 |
| US20220251567A1 (en) | 2019-07-10 | 2022-08-11 | Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherche Médicale) | Methods for the treatment of epilepsy |
| KR20220047989A (ko) | 2019-08-09 | 2022-04-19 | 유니버시티 오브 매사추세츠 | Snp를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 |
| US12365894B2 (en) | 2019-09-16 | 2025-07-22 | University Of Massachusetts | Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery |
| EP4031148A1 (en) * | 2019-09-16 | 2022-07-27 | uniQure IP B.V. | Targeting misspliced transcripts in genetic disorders |
| CN119499394A (zh) * | 2019-11-01 | 2025-02-25 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 亨廷顿（HTT）iRNA药剂组合物及其使用方法 |
| US20240216369A1 (en) | 2019-11-01 | 2024-07-04 | Novartis Ag | The use of a splicing modulator for a treatment slowing progression of huntington's disease |
| CA3174872A1 (en) * | 2020-04-07 | 2021-10-14 | Sander Jan Hendrik Van Deventer | Gene constructs for silencing angiopoietin-like 3 (angptl3) and uses thereof |
| US12534724B2 (en) | 2020-05-26 | 2026-01-27 | University Of Massachusetts | Synthetic oligonucleotides having regions of block and cluster modifications |
| WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
| WO2022031591A2 (en) * | 2020-08-03 | 2022-02-10 | University Of Massachusetts | Oligonucleotides for htt-1a modulation |
| MX2023011466A (es) | 2021-03-29 | 2024-02-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Composiciones de agentes de ácido ribonucleico de interferencia (arni) de huntingtina (htt) y métodos de uso de estas. |
| TW202304446A (zh) | 2021-03-29 | 2023-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 剪接調節子用於減慢杭丁頓氏舞蹈症進展的治療之用途 |
| CN115141848A (zh) * | 2021-03-30 | 2022-10-04 | 南京大学 | 一种用于治疗亨廷顿病的rna递送系统 |
| EP4359525A1 (en) | 2021-06-21 | 2024-05-01 | uniQure biopharma B.V. | Gene constructs for silencing alpha-synuclein and uses thereof |
| CN119677545A (zh) * | 2022-01-27 | 2025-03-21 | 阿斯克生物公司 | 用于治疗神经系统疾病的组合物 |
| WO2023198663A1 (en) | 2022-04-12 | 2023-10-19 | Uniqure Biopharma B.V. | Nucleic acid regulation of snca |
| WO2023198702A1 (en) | 2022-04-12 | 2023-10-19 | Uniqure Biopharma B.V. | Nucleic acid regulation of c9orf72 |
| EP4508213A1 (en) | 2022-04-12 | 2025-02-19 | uniQure biopharma B.V. | Nucleic acid regulation of apoe |
| US20250230437A1 (en) | 2022-04-12 | 2025-07-17 | Uniqure Biopharma B.V. | Novel systems for nucleic acid regulation |
| AU2024256392A1 (en) | 2023-04-18 | 2025-10-23 | Uniqure Biopharma B.V. | Gene delivery vehicles comprising rna and antibodies |
| WO2025051805A1 (en) | 2023-09-04 | 2025-03-13 | Uniqure Biopharma B.V. | Novel neurotropic recombinant adeno-associated virus particles |
| WO2025078602A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Uniqure Biopharma B.V. | Nucleic acid regulation of msh3 in repeat expansion disorders |
| WO2025078606A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Uniqure Biopharma B.V. | Further novel systems for nucleic acid regulation |
| WO2025078598A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Uniqure Biopharma B.V. | Novel nucleic acid regulation of huntingtin gene |
| WO2025106739A1 (en) * | 2023-11-14 | 2025-05-22 | Nchroma Bio, Inc. | Compositions and methods for epigenetic regulation of htt expression |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004239114B2 (en) * | 2003-05-14 | 2008-03-13 | Japan Science And Technology Agency | Inhibition of the expression of huntingtin gene |
| US8680063B2 (en) | 2003-09-12 | 2014-03-25 | University Of Massachusetts | RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders |
| WO2008005562A2 (en) | 2006-07-07 | 2008-01-10 | University Of Massachusetts | Rna silencing compositions and methods for the treatment of huntington's disease |
| EP1735443A2 (en) | 2004-04-14 | 2006-12-27 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| EP2311967B1 (en) | 2005-10-20 | 2017-09-20 | UniQure IP B.V. | Improved AAV vectors produced in insect cells |
| KR101589259B1 (ko) | 2006-06-21 | 2016-02-01 | 유니큐어 아이피 비.브이. | 곤충세포 내 ａａｖ의 생산에 유용한 ａａｖ-ｒｅｐ78의 번역을 위한 변형된 개시 코돈을 갖는 벡터 |
| WO2008134646A2 (en) * | 2007-04-26 | 2008-11-06 | University Of Iowa Research Foundation | Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof |
| PT2164967E (pt) * | 2007-05-31 | 2015-10-27 | Univ Iowa Res Found | Redução da toxicidade não dirigida do arn de interferência |
| DK3093345T3 (da) | 2007-07-26 | 2019-06-24 | Uniqure Ip Bv | Baculovirusvektorer omfattende gentagne kodende sekvenser med differentielle foretrukne kodoner |
| CA2715924C (en) | 2008-02-19 | 2021-01-12 | Andrew Christian BAKKER | Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells |
| CN102439136A (zh) * | 2009-03-26 | 2012-05-02 | 加州大学校董 | 产生用于疾病修饰的抑制性rna的间充质干细胞 |
| SG10202109219SA (en) * | 2009-05-02 | 2021-10-28 | Genzyme Corp | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
| WO2011122950A1 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. | Monomeric duplex aav vectors |
| ES2699630T3 (es) * | 2010-04-23 | 2019-02-12 | Cold Spring Harbor Laboratory | Novedosos ARNhc diseñados estructuralmente |
| CN102946908B (zh) * | 2010-06-18 | 2015-04-22 | Lsip基金运营联合公司 | 显性等位基因表达抑制剂 |
| EP3425044A1 (en) | 2011-09-08 | 2019-01-09 | uniQure IP B.V. | Removal of contaminating viruses from aav preparations |
| WO2014117050A2 (en) * | 2013-01-26 | 2014-07-31 | Mirimus, Inc. | Modified mirna as a scaffold for shrna |
| CN103224556B (zh) * | 2013-01-31 | 2015-04-15 | 清华大学 | 亨廷顿舞蹈症的靶位蛋白质及其编码基因和应用 |
| SMT201900347T1 (it) * | 2014-12-24 | 2019-07-11 | Uniqure Ip Bv | Soppressione del gene huntingtina indotta da rnai |
-
2015
- 2015-12-23 SM SM20190347T patent/SMT201900347T1/it unknown
- 2015-12-23 US US15/538,964 patent/US10174321B2/en active Active
- 2015-12-23 LT LTEP15817385.6T patent/LT3237618T/lt unknown
- 2015-12-23 KR KR1020177020454A patent/KR102636633B1/ko active Active
- 2015-12-23 PT PT15817385T patent/PT3237618T/pt unknown
- 2015-12-23 PL PL15817385T patent/PL3237618T3/pl unknown
- 2015-12-23 TR TR2019/08969T patent/TR201908969T4/tr unknown
- 2015-12-23 HU HUE15817385A patent/HUE043842T2/hu unknown
- 2015-12-23 MX MX2017008500A patent/MX381121B/es unknown
- 2015-12-23 CA CA2971920A patent/CA2971920C/en active Active
- 2015-12-23 HK HK18105533.3A patent/HK1246344B/en unknown
- 2015-12-23 CN CN201580071228.2A patent/CN108064292B/zh active Active
- 2015-12-23 DK DK15817385.6T patent/DK3237618T3/da active
- 2015-12-23 RS RS20190744A patent/RS58862B1/sr unknown
- 2015-12-23 ES ES15817385T patent/ES2732023T3/es active Active
- 2015-12-23 AU AU2015370903A patent/AU2015370903B2/en active Active
- 2015-12-23 SI SI201530791T patent/SI3237618T1/sl unknown
- 2015-12-23 WO PCT/EP2015/081157 patent/WO2016102664A1/en not_active Ceased
- 2015-12-23 HR HRP20190992TT patent/HRP20190992T1/hr unknown
- 2015-12-23 EA EA201791417A patent/EA037696B1/ru unknown
- 2015-12-23 EP EP19167349.0A patent/EP3540063A1/en active Pending
- 2015-12-23 EP EP15817385.6A patent/EP3237618B1/en active Active
- 2015-12-23 JP JP2017552234A patent/JP6839094B2/ja active Active
-
2017
- 2017-06-18 IL IL252990A patent/IL252990B/en unknown
- 2017-07-24 CO CONC2017/0007335A patent/CO2017007335A2/es unknown
-
2018
- 2018-11-16 US US16/193,908 patent/US10767180B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-13 CY CY20191100616T patent/CY1121733T1/el unknown
-
2020
- 2020-07-15 US US16/930,035 patent/US11371044B2/en active Active
- 2020-10-01 JP JP2020167128A patent/JP2021000136A/ja active Pending
-
2022
- 2022-05-24 US US17/751,934 patent/US20230119344A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2732023T3 (es) | Supresión del gen de la huntingtina inducida por ARNi | |
| ES2759317T3 (es) | Compuestos terapéuticos para la enfermedad de Huntington | |
| HK1246344A1 (en) | Rnai induced huntingtin gene suppression | |
| US20240398988A1 (en) | RNAi induced C9ORF72 suppression for the treatment of ALS/FTD | |
| US20220010314A1 (en) | Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3 | |
| WO2019156115A1 (ja) | オリゴデンドロサイト特異的プロモータ、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ、該プロモータ及び／又は該ｍｉＲＮＡを含むベクター並びに該ベクターを含む医薬組成物 | |
| AU2022339042A1 (en) | Microrna system | |
| HK40011616A (en) | Rnai induced huntingtin gene suppression | |
| NZ733296B2 (en) | Rnai induced huntingtin gene suppression | |
| BR112017013573B1 (pt) | Rna de cadeia dupla, cassete de expressão, e, vetor de terapia de gene | |
| HK1236224B (en) | Huntington's disease therapeutic compounds | |
| HK1236224A1 (en) | Huntington's disease therapeutic compounds |