CN112522271A

CN112522271A - 一种sgRNA及其应用

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Publication number: CN112522271A
Application number: CN202011540970.2A
Authority: CN
Inventors: 梁峻彬; 王士民; 徐辉; 古博
Original assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112522271B

Abstract

本发明涉及一种sgRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。所述sgRNA序列靶向破坏PTBP1 mRNA，所述sgRNA序列的结构域序列选自SEQ ID NO:1‑31中任一所示基础序列，或由所述基础序列3’端和/或5’端截短至少一个碱基后得到序列长度≥20nt的截短序列，或与所述基础序列或截短序列相似性≥90％的扩展序列。采用该sgRNA，可靶向破坏人PTBP1 mRNA，有效降低PTBP1 mRNA水平，用于治疗PTBP1 mRNA过表达相关的疾病，或通过将常规PTBP1 mRNA水平下调而治疗有关疾病，如肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病等，具有重要的应用意义。

Description

一种sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种sgRNA及其应用。

背景技术

神经退行性疾病的特征是来自大脑特定区域的神经元进行性和不可逆转的丧失。神经元丢失的模式是选择性的，主要影响皮层下区域(基核)和大脑皮层，导致自主运动控制异常、记忆力减退和认知能力下降。最终导致肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病等发生。当前阶段有效治疗这些神经退行性疾病的治疗选择仍然很少，对相应治疗药物仍存在迫切的临床需求。

当前研究的一个有前途的方向是使用再生技术在受损区域重新生长出健康和具有功能性的神经组织。目前为促进神经再生而研究的各种方法包括基于干细胞的疗法，由水凝胶制成的支架，电纺纤维和导电材料，以及使用可溶性或非扩散性生长因子等(Binanet al.Approaches for Neural Tissue Regeneration.Stem Cell Rev and Rep 10,44-59,2014)。

抑制多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein，PTBP1)的表达可实现星形胶质细胞到神经元的定向转分化，即可以应对神经退行性疾病的神经元丧失，是一种有希望的神经再生技术。目前认为，通过抑制PTBP1将星形胶质细胞转分化成神经元是治疗神经退行性疾病最理想、最有前景的策略和手段之一。

PTBP1是一个重要的mRNA调控因子，通过四个不同的结合区域与RNA相结合，改变RNA的结构和调控RNA的可变剪切，影响mRNA的剪接、翻译、稳定性和定位。PTBP1在神经元的生长和分化、T细胞的活化、精子发生、胚胎发育和红细胞发育等生理过程中发挥了重要作用。

通过靶向降低PTBP1表达水平可治疗多种疾病，包括神经退行性疾病。例如，有报道称通过抑制PTBP1蛋白的表达实现星形胶质细胞到神经元的定向转分化，可治疗帕金森病。通过敲除穆勒细胞内PTBP1，促其转分化成视神经节细胞，可提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。通过敲除PTBP1，可促进成纤维细胞转化为心肌细胞，用于治疗心脏病。还有文献报道PTBP1通过激活PTEN/autophagy、HIF1α等通路，促进肿瘤细胞的增殖/迁移，因此敲低PTBP1水平也有望治疗相关癌症。

帕金森病(PD)是一种常见的运动障碍疾病，全球患病人数达580万，为常见的神经退行性疾病之一。60岁以上的老年人高发PD，发病率超过1％，65岁老人发病率超过1.7％。PD最主要的病理特征是中脑黑质多巴胺能(dopaminergic，DA)神经元选择性、进行性死亡，黑质-纹状体通路的纤维退化。目前临床治疗仍以左旋多巴(L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)替代治疗为主。现有在研究的基因治疗PD的方案，主要围绕这补充中脑和纹状体部位多巴胺神经递质，或将星形胶质细胞转分化成多巴胺能神经元两个方向进行。如利用慢病毒将酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)、环水解酶1(Cyclohydrolase 1，CH1)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(Aromatic L-amino aciddecarboxylase，AADC)递送至纹状体，通过补充多巴胺含量，改善病人的行为学。

目前尚无通过CRISPR-Cas13d系统靶向编辑人源细胞中PTBP1 mRNA的研究。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种sgRNA(单分子gRNA，single guide RNA)，使用本发明的sgRNA，利用CRISPR-Cas13d系统(例如CRISPR-CasRx系统)，可靶向破坏人PTBP1 mRNA，有效降低PTBP1 mRNA水平。

本发明提供一种sgRNA，所述sgRNA序列靶向破坏PTBP1 mRNA，所述sgRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:1-31中任一所示基础序列，或由所述基础序列3’端和/或5’端截短至少一个碱基后得到序列长度≥20nt的截短序列，或与所述基础序列或截短序列相似性≥90％的扩展序列。

可以理解的，所述扩展序列优选与上述基础序列或截短序列具有≥95％的序列相似性，更进一步，具有≥98％的序列相似性。

可以理解的，所述sgRNA包含与靶序列反向互补的靶向结构域，以及固定序列结构域(骨架序列)，如图1所示，其中，固定序列结构域按照常规方式设计即可。

本发明sgRNA通过靶向结构域和骨架序列足以允许Cas13d核酸酶(例如CasRx)靶向PTBP1 mRNA。发明人提供的sgRNA发明的核心在于靶向结构域，本领域技术人员可以知道，将本发明的sgRNA靶向结构域与任意合适的骨架序列连接形成单分子gRNA(sgRNA)后都可以实现将Cas13d核酸酶(例如CasRx)靶向至PTBP1 mRNA的功能，达到本发明的技术效果。

另外，本发明人对人PTBP1 mRNA序列进行调研、考察以及实验验证后发现，在其3’-UTR区域有多个miRNA调控位点。现已知mRNA在其生命周期内会与蛋白成分组成复合物等形式，碱基序列较少暴露。不受理论限制地，所述miRNA调控位点可能即是mRNA分子上相对容易暴露的位置，发明人根据这一思路设计了靶向miRNA调控位点的多个指导序列，并经过试验筛选，得到本发明的部分sgRNA，有效敲低了PTBP1 mRNA水平。

发明人经过实验发现，靶向PTBP1 mRNA上某些位点的靶向结构域序列长度为30nt的sgRNA具有优异的效果，将靶向结构域序列截短至20nt时(靶向位点仍在这一区域)基本都能维持较好的结果，而靶向所述30nt外的临近位点的部分sgRNA效果较差。

在一些实施例中，所述sgRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:1-89中任一所示基础序列，或与所述基础序列相似性≥90％的扩展序列。

在一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:1-8，SEQ ID NO:12-24，SEQ IDNO:26-27，SEQ ID NO:29-30，SEQ ID NO:32-44，SEQ ID NO:51-75，SEQ ID NO:78-81，SEQID NO:84-87任一所示序列。采用上述序列作为sgRNA的靶向结构域序列，具有较好的编辑效率。

在一些实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:1-7，SEQ ID NO:12-13，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32-43，SEQ ID NO:51-53，SEQ ID NO:74-75，SEQ ID NO:84-85任一所示序列。采用上述序列作为sgRNA的靶向结构域序列，具有最佳的编辑效率。

在一些实施例中，所述sgRNA使用Cas13d-sgRNA系统通用的sgRNA骨架序列。

进一步地，在一些实施例中，所述sgRNA使用CasRx-sgRNA系统通用的sgRNA骨架序列。

再进一步地，在一些实施例中，所述sgRNA骨架序列为5’-CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC-3’(SEQ ID NO:90)。

在一些实施例中，所述sgRNA与Cas13d核酸酶组合使用；或使用它们的编码核酸。所述Cas13d核酸酶包括但不限于EsCas13d、RfxCas13d(CasRx)、AdmCas13d、P1E0Cas13d、UrCas13d、RffCas13d、RaCas13d，它们与其它序列(例如，核定位序列[NLS]或标签序列等)的融合蛋白，或上述蛋白的合适突变体。

本发明sgRNA可在任意核苷酸上进行合适的化学修饰。

本发明还公开了一种编码靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA的表达载体，包含编码如上述的sgRNA的核苷酸序列。

上述表达载体，可表达用于靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA，可以理解的，本领域技术人员可参照常规技术构建。

本发明还公开了一种靶向破坏PTBP1 mRNA的组合物，包含sgRNA系统和Cas13d酶系统，所述sgRNA系统直接或间接包含上述的sgRNA，所述Cas13d酶系统直接或间接包含Cas13d酶。

可以理解的，上述直接包含sgRNA指直接使用sgRNA(包括但不限于化学合成的sgRNA)进行配制，间接包含sgRNA指可通过基因工程的转录等常规手段产生sgRNA；同样的，对于直接包含Cas13d酶指直接使用纯化的Cas13d蛋白进行配制，间接包含Cas13d酶指通过基因工程的手段间接产生Cas13d酶。

在一些实施例中，所述Cas13d酶为EsCas13d、RfxCas13d(CasRx)、AdmCas13d、P1E0Cas13d、UrCas13d、RffCas13d、RaCas13d，它们与其它序列(例如，核定位序列[NLS]或标签序列等)的融合蛋白，或上述蛋白的合适突变体。进一步地，在一些实施例中，所述Cas13d酶为CasRx。

在一些实施例中，所述sgRNA至少为2条。将Cas13d酶与至少2条所述sgRNA组合使用来破坏PTBP1 mRNA，或使用它们的编码核酸。

在一些实施例中，2条sgRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:1-89中的任意两者。进一步地，在一些实施例中，2条sgRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:1-7、12-13、24、29、32-43、51-53、74-75、84-85中的任意两者。

选用上述sgRNA相配合，靶向2个或更多个靶位点，编辑效果优于单独一种sgRNA(靶向1个靶位点)，可更有效地降低PTBP1 mRNA水平。

本发明还公开了一种递送上述靶向破坏PTBP1 mRNA的组合物的递送系统，所述递送系统采用RNP递送、脂质体递送、纳米粒递送、病毒递送中的至少一种。

在一些实施例中，所述递送系统采用病毒递送。进一步地，在其中一些实施例中，所述递送系统采用AAV(腺相关病毒)递送。

本发明还公开了上述的sgRNA、上述的sgRNA表达载体、上述的组合物、上述的递送系统在制备用于治疗将PTBP1 mRNA水平下调有利的疾病的药物中的应用。结合现有技术可合理推测，在这些疾病中，通过将PTBP1 mRNA水平下调可产生有利的结果。

在其中一些实施例中，所述疾病包括：肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA，可利用CRISPR-Cas系统靶向破坏人PTBP1 mRNA，在未筛选细胞阳性转染率的情况下即有效降低PTBP1 mRNA水平，用于治疗PTBP1 mRNA过表达相关的疾病，或通过将常规PTBP1 mRNA水平下调而治疗有关疾病。例如，通过将常规PTBP1 mRNA水平下调诱导神经元数量的增加而治疗各类神经退行性疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病等。

2.经本发明筛选得到的sgRNA，具有较高的编辑效率，并有效降低PTBP1 mRNA水平，从而具有较好的应用前景。

3.进一步地，尤其是本发明的部分sgRNA(靶向结构域30nt或将其截短至20nt)相比靶向30nt外的临近位点的sgRNA取得了预料不到的技术效果。

4.在药物研发领域，常会遇到动物实验数据不能很好地用于预测人体实验的情况。本发明提供经过人源细胞实验验证的sgRNA，对于人体研究具有更好的预测性，有助于相应药物研发。

5.本发明部分sgRNA靶向破坏PTBP1 mRNA的3’-UTR区域的miRNA调控位点，且有效敲低了PTBP1 mRNA水平。

附图说明

图1示意了本发明sgRNA的靶向结构域序列与PTBP1 mRNA分子上的靶序列反向互补；

图2为实施例中部分sgRNA靶向位点在鼠源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图一；

图3为实施例中部分sgRNA靶向位点在鼠源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图二；

图4为实施例中部分sgRNA靶向位点在鼠源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图三；

图5为实施例中部分sgRNA靶向位点在鼠源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图四；

图6为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图一；

图7为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图二；

图8为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图三；

图9为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图四；

图10为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图五；

图11为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图六；

图12为实施例中部分sgRNA靶向位点在人源细胞PTBP1 mRNA上的靶向位置示意图七；

图13为实施例中ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA2+3质粒的图谱示意图；

图14为实施例中AAVs对中脑GFAP(+)星形胶质细胞的感染示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本实施例所用试剂、材料如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。

实施例

一、sgRNA载体设计与构建

1.sgRNA设计。

设计靶向PTBP1 mRNA的sgRNA，其靶向结构域序列(与mRNA分子上的靶序列反向互补)长度为20-30nt。

所设计sgRNA的靶向结构域如下表1所示。图2-12示出了所设计sgRNA在PTBP1mRNA上的靶向位置，其中方框表示sgRNA的靶向位点，方框中数字为sgRNA的编号。

其中，在下述质粒转染鼠N2A细胞实验中，使用本发明设计的sgRNA 1-11和sgRNA32-50。在下述质粒转染人293T细胞实验中，使用本发明设计的sgRNA 1-89。

其中，sgRNA 1-11和sgRNA 32-50靶向的是人鼠同源序列。

sgRNA 1-20和sgRNA 32-67可靶向人PTBP1 mRNA的CDS区域。sgRNA 21-31和sgRNA68-89可靶向miRNA在人PTBP1 mRNA上的调控位点区域。

本实施例中，sgRNA骨架序列为5’-CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC-3’(SEQ ID NO:90)

表1.sgRNA的靶向结构域序列

2.构建质粒。

分别合成靶序列对应的Oligo DNA，正义链为靶序列的反向互补序列，并且根据BpiI酶切位点的选择，5’加AAAC，反义链为靶序列5’加CTTG。

将上述靶序列对应的Oligo DNA正义链和反义链混合，95℃孵育5分钟后放置在冰上冷却退火形成带粘性末端的双链DNA。

pXR004质粒使用BpiI酶切线性化，37℃反应1小时。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物。

退火产物和pXR004-BpiI酶切线性化回收产物使用T4连接酶进行连接，连接产物使用热击法转化大肠杆菌感受态细胞Stbl3，转化后向离心管中加入不含抗生素的LB液体培养基，置于恒温摇床37℃、200rpm振荡培养60分钟使菌体复苏。

将复苏后的Stbl3细胞涂布氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，于恒温培养箱37℃倒置培养。从上述平板上分别挑取单菌落接种到50μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，使用引物U6Promoter-F(5’-GGGCCTATTTCCCATGATTCCTT-3’)(SEQ ID NO:91)和f1ori-R(5’-GCTGGCAAGTGTAGCGGTCA-3’)(SEQ ID NO:92)，对上述菌液进行PCR鉴定。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，筛选出包含阳性克隆的菌液，接种至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12-16小时。

提取质粒并测定质粒浓度后，取部分质粒进行Sanger测序，测序正确的质粒保存于-20℃备用。

将包含编码靶向PTBP1 mRNA的sgRNA n的序列的载体命名为pXR004-PTBP1-sgRNAn(n为数字序号)。

二、在细胞中检测编辑效率

进行质粒转染实验，检测各sgRNA的编辑效率。

1.N2A细胞的质粒转染

使用无血清培养基稀释Lipofectamine 3000脂质体转染试剂以及克隆了sgRNA的pXR004-PTBP1-sgRNA n1质粒、pXR004-PTBP1-sgRNA n2质粒(n1、n2代表数字序号)、表达CasRx的pXR001质粒，质粒按1:1:2比例共转染；或仅转染一种sgRNA质粒pXR004-PTBP1-sgRNA n1，pXR004-PTBP1-sgRNA n1与pXR001质粒按1:1比例共转染。单独转染pXR001+pXR004空载质粒设为阴性对照组。混合两种稀释液保温10分钟后，把复合物加入12孔板，然后将细胞悬浮液加入到复合物。

转染质粒72小时后，使用艾科瑞通用型RNA提取试剂盒提取N2A细胞总RNA后，使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行gDNA消化以及逆转录反应，获得相应的cDNA。Q-PCR反应使用SYSB Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，以gapdh为内参，通过罗氏lightcycler480II，获得各组对PTBP1 mRNA切割后mRNA的水平。Q-PCR每个样品每对引物平行做3个复孔。Q-PCR引物见下表。

表2.N2A细胞Q-PCR所用的引物

2.293T细胞的质粒转染。

使用无血清培养基稀释Lipofectamine 2000脂质体转染试剂以及克隆了sgRNA的pXR004-PTBP1-sgRNA n1、pXR004-PTBP1-sgRNA n2质粒、表达CasRx的pXR001质粒，质粒按1:1:2比例共转染。或仅转染一种sgRNA质粒，pXR004-PTBP1-sgRNA n1与pXR001质粒按1:1比例共转染。单独转染pXR001+pXR004空载质粒设为阴性对照组。混合两种稀释液保温20分钟后，把复合物加入24孔板，然后将细胞悬浮液加入到复合物。

转染质粒72小时后，使用艾科瑞通用型RNA提取试剂盒提取293T细胞总RNA后，使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行gDNA消化以及逆转录反应，获得相应的cDNA。Q-PCR反应使用SYSB Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，以gapdh为内参，通过罗氏lightcycler480II，获得各组对PTBP1 mRNA切割后mRNA的水平。Q-PCR每个样品每对引物平行做3个复孔。Q-PCR引物见下表3。

表3. 293T细胞Q-PCR所用的引物

3、实验结果

经编辑后细胞中PTBP1 mRNA表达水平测试结果见下表4、表5(各分组用所使用质粒表达的sgRNA表示，为求简要表中省略了表达CasRx的pXR001质粒)。结果数据用3次试验结果的平均值表示。

表4.CRISPR-CasRx系统编辑鼠源N2A细胞后的PTBP1 mRNA水平

注：NA表示未进行实验。

表5.CRISPR-CasRx系统编辑人源293T细胞后的PTBP1 mRNA水平

注：NA表示未进行实验。

从上述结果中可以看出，在鼠源N2A细胞中，对PTBP1 mRNA敲低作用最强的是sgRNA1-7、10、32-43、47-48，其次为sgRNA 11、49-50，再次为sgRNA 8-9、44-46。

而在人源293T细胞中，对PTBP1 mRNA敲低作用最强的是sgRNA 1-7、12-13、24、29、32-43、51-53、74-75、84-85，其次为sgRNA 8、14-23、26-27、30、44、54-73、78-81、86-87，再次为sgRNA 9-11、25、28、31、45-50、76-77、82-83、88-89。

sgRNA 1-11、32-50靶向的是人鼠同源序列，在鼠源N2A细胞和人源293T细胞中对PTBP1 mRNA的敲低作用大体上一致。但也存在不一致的情况，如sgRNA 8、44在鼠源细胞中编辑效果差，但在人源细胞中较好；sgRNA 10、47-48在鼠源细胞中编辑效果很好，但在人源细胞中差。上述结果提示，对于以非人源细胞中得出的实验结果，在人源细胞中并非表现完全一致，需注意种属差异带来的编辑效率差异，以及其它难以意料的差异。

另外，在人源293T细胞中，sgRNA 1、32-33与sgRNA 15、56-57的靶向位点虽然在PTBP1mRNA分子上很接近(如图6所示)，但令人意外的是前者较后者有着显著增强的编辑效果，编辑后使得PTBP1 mRNA水平大为降低，达到了预料不到的技术效果。

类似地，如图7-8所示，发明人还发现sgRNA 2-4、34-37相比靶向临近位点的sgRNA17、60-61具有明显增强的编辑效果，sgRNA 5、38-39、6、40-41相比靶向临近位点的sgRNA20、66-67同样具有明显增强的编辑效果，达到了预料不到的技术效果。

三、动物实验

1、病毒包装

采用常规方法构建得到可表达CasRx、sgRNA 2、sgRNA 3的ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA 2+3质粒(序列为SEQ ID NO:101)，如图13所示。另外用同样方法构建得到ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA 2+1质粒、ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA 2+6质粒、ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA 1+5质粒(各质粒中sgRNA编码序列的顺序与ssAAV-GFAP(681bp)-CasRx-U6-sgRNA 2+3质粒对应相同)。

通过转染上述质粒，使用常规方法在293T细胞中培养、分离得到血清型AAV-php.eb，其可表达CasRx和sgRNA。另外按同样方法制备得到sgRNA空载(表达CasRx，不表达sgRNA)的AAV-php.eb。

2、注射AAV到小鼠右侧脑黑质部位；

根据《小鼠脑立体定位图谱》座标：以前囟为原点，设置AP：-3.0mm，ML：1.2mm，DV：4.5mm。通过立体定位仪(David Kopf)进行。

将AAV病毒按2×10¹²vg/ml的浓度进行稀释，并吸于微量注射器内。

通过腹腔注射0.15-0.2ml的5％水合氯醛麻醉小鼠，而后迅速将小鼠固定于两个耳棒之间，剃除小鼠头顶毛发、消毒后切开皮肤至暴露前后囟，调整立体定位仪使前后囟位于同一水平。以前囟作为原点，确定微量注射器注射到黑质的位置，并用颅骨钻小心钻孔，钻孔过程中应避免局部过热和损伤脑实质。钻孔后将微量注射针针头缓慢插入小鼠脑内，至上述坐标位置后停止，按0.5μl/min的速度，注射2μl病毒，注射完毕后留针5min。最后缝合皮肤，再次消毒缝合处。

实验组小鼠注射上述可表达sgRNA的AAV-php.eb，阴性对照组小鼠注射上述sgRNA空载的AAV-php.eb。每组3只小鼠。

3、注射病毒一周后，对小鼠进行灌注收样，冰冻切片

a)麻醉小鼠：小鼠称重，10％水合氯醛腹腔注射(按400mg/kg)；1-2min后小鼠即处于麻醉状态；

b)经心脏灌注、固定：用剪刀沿前正中线剪开小鼠胸廓，暴露心脏，用平头针从左心室心尖处插入到主动脉，并用动脉夹固定针头。打开蠕动泵并以10ml/min流速灌注灭菌1xPBS(4℃)3min，4％PFA(4℃)8min。

c)剥离鼠脑：用剪刀剪断小鼠脖颈，并用眼科小剪沿矢状缝剪开颅骨，分离颅底神经后，小心取出整个脑组织；

d)后固定：脑组织置于4％PFA(4℃)中，4℃环境固定8-12h；

e)脱水：30％浓度蔗糖将脑组织进行脱水，4℃环境脱水36h左右。

f)包埋：OCT包埋脑组织，并迅速置于-80℃冰箱中2h以上。长期可保存于-80℃；

g)切片：预冷冰冻切片机至-20℃，并将包埋好的脑组织从-80℃环境拿到-20℃环境进行复温。按中脑冠状面进行切片，按10μm厚度进行切片，冰冻切片收集后于-80℃保存。

4、免疫荧光染色检测病毒感染率和特异性

a)漂洗：1×TBS洗10min×3次；

b)封闭：5％donkey血清in 0.3％TBST，室温孵育1h；

c)一抗(GFAP、HA-tag)：按相应的抗体滴度配于一抗稀释液中，4℃孵育过夜；

d)漂洗：0.05％TBST漂洗10min×3次；

e)二抗(Donkey Anti-Rb 555、goat Anti-MzIgG1-488)：根据一抗种属选择相应的荧光二抗，二抗和细胞核染料DAPI一同配制在一抗稀释液中，室温避光孵育1h；

f)漂洗：脑片避光，0.05％TBST漂洗10min×3次；

g)贴片、封片、拍照：吸走玻片上多余的TBS；晾干后用mounting medium封片，置于避光处。待凝固后用蔡司倒置荧光显微镜进行观察、拍照。

以上实验中所用抗体如下表所示。

表6免疫荧光所用抗体列表

荧光结果显示，本发明的AAV-php.eb在脑内的转运效率高。脑对侧未有显著HA-tag信号情况下，注射AAV-php.eb-GFAP-HA-CasRx-sgRNA病毒后，阴性对照组和实验组小鼠均测到了HA-tag信号，且只与部分GFAP信号重叠，说明可成功且特异感染GFAP(+)星形胶质细胞。

图14示例性地给出了sgRNA 2+3组小鼠的实验结果，图中结果显示，与脑注射对侧相比，sgRNA空载和sgRNA 2+3组均测到了显著的HA-tag信号，且通过染色星形胶质细胞的表达标记蛋白(GFAP)后发现，HA-tag信号与GFAP存在明显重叠，且不与其他细胞重叠，说明星形胶质细胞内表达了HA-tag信号，进一步说明本发明的AAV-php.eb可特异感染GFAP(+)星形胶质细胞。

5、AAVs注射一周后，取小鼠脑组织进行Q-PCR，检测编辑效率

对注射AAVs一周的小鼠进行快速颈椎脱臼处死，迅速取出脑组织，并用PBS冰水混合物洗去血液，置于间隔为1mm的冠状切面的模具中，模具置于冰上。用干净刀片切割并取出包含大部分中脑黑质区域的2mm组织块，平放于-20℃冰盒上，用洁净手术刀分离黑质区域，重量5mg左右，置于1.5ml EP管中。

使用艾科瑞通用型RNA提取试剂盒提取黑质组织总RNA后，使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行gDNA消化以及逆转录反应，获得相应的cDNA。Q-PCR反应使用SYSB Green ProTaq HS预混型qPCR试剂盒，以gapdh为内参，通过罗氏lightcycler 480II，获得各组对PTBP1mRNA切割后mRNA的水平。Q-PCR每个样品每对引物平行做3个复孔。Q-PCR引物同表2。

AAVs注射小鼠、提取RNA、反转合成cDNA以及qPCR均需独立的3次生物性重复实验，通过2^-ΔΔCT计算方法获得三次平均结果，见下表7。

表7.CRISPR-CasRx系统编辑小鼠黑质区域GFAP(+)细胞后的PTBP1 mRNA水平

分组	PTBP1 mRNA相对水平
		sgRNA空载(阴性对照组)	1.00
sgRNA 2+3组	0.61
		sgRNA 2+1组	0.72
sgRNA 2+6组	0.69
		sgRNA 1+5组	0.65

从上述结果可以看出，与sgRNA空载组相比，实验组小鼠黑质注射仅一周后即可显著降低PTBP1 mRNA水平，说明本产品可成功编辑星形胶质细胞内PTBP1 mRNA。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州瑞风生物科技有限公司

<120> 一种sgRNA及其应用

<160> 101

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gugguuggag aacuggaugu agaugggcug 30

<210> 2

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

augcgcagcg ugcagcaggc guuguagaug 30

<210> 3

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagucgaugc gcagcgugca gcaggcguug 30

<210> 4

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcgugcag caggcguugu agauguucug 30

<210> 5

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauaaagagg cuuuggggug ugacucucuc 30

<210> 6

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cguucuccuu cuuauugaac aggaucuuca 30

<210> 7

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

guucaggugg cucauggcca gcugggccug 30

<210> 8

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuucccgugc agcuugugcc cguucaggug 30

<210> 9

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

guaguccuug gucaggcccu gguccuccug 30

<210> 10

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caucuugcgg uccuucugga agaacuugaa 30

<210> 11

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcccaucugg aucagugcca ucuugcgguc 30

<210> 12

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ugacacaagu agagaaaagc ucgucagauc 30

<210> 13

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caaguagaga aaagcucguc agauccccgc 30

<210> 14

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

uugcugucau uuccguuugc ugcagaagcc 30

<210> 15

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggccgcgcag cacagggguc accgaggugu 30

<210> 16

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

uggagaaaau cuggugcagc acauccaggg 30

<210> 17

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccguccagcg acagcuuggc gugcugggcg 30

<210> 18

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcugagauua uaccaggugc accgaaggcc 30

<210> 19

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ugaccagcaa uacagaauuu ccugcccccg 30

<210> 20

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acgcgcugca cgucaccgua gacgccgaaa 30

<210> 21

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

guggcuuuuc ucuggaauga uggaaguugu 30

<210> 22

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

uuaaaaaaau aaaaucucug gucugcuaag 30

<210> 23

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gugaacuaga uuuaauuuuu uuaaaaacag 30

<210> 24

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aggcagguuu uuuaaggcac aaggaagcca 30

<210> 25

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aacugcaaag uauauaauac agagauuaug 30

<210> 26

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gucaacugga aauauugcua ggcacagacg 30

<210> 27

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aagauuagaa uauuugguca acuggaaaua 30

<210> 28

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaacuauuuc uuuugcauau aaaugaaaaa 30

<210> 29

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

acagaaauga gacuuugguc caaaauuuga 30

<210> 30

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agguauaaaa aauuauaaau auuuacaccc 30

<210> 31

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cuccgcgguc acaauacuga gccuggaauu 30

<210> 32

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gugguuggag aacuggaugu 20

<210> 33

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aacuggaugu agaugggcug 20

<210> 34

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

augcgcagcg ugcagcaggc 20

<210> 35

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ugcagcaggc guuguagaug 20

<210> 36

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aagucgaugc gcagcgugca 20

<210> 37

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

caggcguugu agauguucug 20

<210> 38

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aauaaagagg cuuuggggug 20

<210> 39

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cuuuggggug ugacucucuc 20

<210> 40

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cguucuccuu cuuauugaac 20

<210> 41

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cuuauugaac aggaucuuca 20

<210> 42

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

guucaggugg cucauggcca 20

<210> 43

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cucauggcca gcugggccug 20

<210> 44

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cuucccgugc agcuugugcc 20

<210> 45

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

guaguccuug gucaggcccu 20

<210> 46

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gucaggcccu gguccuccug 20

<210> 47

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

caucuugcgg uccuucugga 20

<210> 48

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

uccuucugga agaacuugaa 20

<210> 49

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gcccaucugg aucagugcca 20

<210> 50

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

aucagugcca ucuugcgguc 20

<210> 51

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ugacacaagu agagaaaagc 20

<210> 52

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

agagaaaagc ucgucagauc 20

<210> 53

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

aaagcucguc agauccccgc 20

<210> 54

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

uugcugucau uuccguuugc 20

<210> 55

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

uuccguuugc ugcagaagcc 20

<210> 56

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ggccgcgcag cacagggguc 20

<210> 57

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cacagggguc accgaggugu 20

<210> 58

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

uggagaaaau cuggugcagc 20

<210> 59

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cuggugcagc acauccaggg 20

<210> 60

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ccguccagcg acagcuuggc 20

<210> 61

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acagcuuggc gugcugggcg 20

<210> 62

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gcugagauua uaccaggugc 20

<210> 63

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

uaccaggugc accgaaggcc 20

<210> 64

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ugaccagcaa uacagaauuu 20

<210> 65

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

uacagaauuu ccugcccccg 20

<210> 66

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

acgcgcugca cgucaccgua 20

<210> 67

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

cgucaccgua gacgccgaaa 20

<210> 68

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

guggcuuuuc ucuggaauga 20

<210> 69

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ucuggaauga uggaaguugu 20

<210> 70

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

uuaaaaaaau aaaaucucug 20

<210> 71

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

aaaaucucug gucugcuaag 20

<210> 72

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

gugaacuaga uuuaauuuuu 20

<210> 73

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

uuuaauuuuu uuaaaaacag 20

<210> 74

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

aggcagguuu uuuaaggcac 20

<210> 75

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

uuuaaggcac aaggaagcca 20

<210> 76

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

aacugcaaag uauauaauac 20

<210> 77

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

uauauaauac agagauuaug 20

<210> 78

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

aauauugcua ggcacagacg 20

<210> 79

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gucaacugga aauauugcua 20

<210> 80

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

uauuugguca acuggaaaua 20

<210> 81

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

aagauuagaa uauuugguca 20

<210> 82

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

uuuugcauau aaaugaaaaa 20

<210> 83

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

aaacuauuuc uuuugcauau 20

<210> 84

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

acagaaauga gacuuugguc 20

<210> 85

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

gacuuugguc caaaauuuga 20

<210> 86

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

agguauaaaa aauuauaaau 20

<210> 87

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

aauuauaaau auuuacaccc 20

<210> 88

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

cuccgcgguc acaauacuga 20

<210> 89

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

acaauacuga gccuggaauu 20

<210> 90

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

caaguaaacc ccuaccaacu ggucgggguu ugaaac 36

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

gggcctattt cccatgattc ctt 23

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

gctggcaagt gtagcggtca 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

cgtcccgtag acaaaatggt 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

tcaatgaagg ggtcgttgat 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

agaggaggct gccaacacta 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

gtccagggtc actgggtaga 20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

ccatggggaa ggtgaaggtc 20

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gaaggggtca ttgatggcaa c 21

<210> 99

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

attgtcccag atatagccgt tg 22

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

gctgtcattt ccgtttgctg 20

<210> 101

<211> 7254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gaaacatatc ctggtgtgga gtaggggacg ctgctctgac 180

agaggctcgg gggcctgagc tggctctgtg agctggggag gaggcagaca gccaggcctt 240

gtctgcaagc agacctggca gcattgggct ggccgccccc cagggcctcc tcttcatgcc 300

cagtgaatga ctcaccttgg cacagacaca atgttcgggg tgggcacagt gcctgcttcc 360

cgccgcaccc cagcccccct caaatgcctt ccgagaagcc cattgagcag ggggcttgca 420

ttgcacccca gcctgacagc ctggcatctt gggataaaag cagcacagcc ccctaggggc 480

tgcccttgct gtgtggcgcc accggcggtg gagaacaagg ctctattcag cctgtgccca 540

ggaaagggga tcaggggatg cccaggcatg gacagtgggt ggcagggggg gagaggaggg 600

ctgtctgctt cccagaagtc caaggacaca aatgggtgag gggagagctc tccccatagc 660

tgggctgcgg cccaacccca ccccctcagg ctatgccagg gggtgttgcc aggggcaccc 720

gggcatcgcc agtctagccc actccttcat aaagccctcg catcccagga gcgagcagag 780

ccagagcagg ttggagagga gacgcatcac ctccgctgct cgcaccggtg ccaccatgag 840

ccccaagaag aagagaaagg tggaggccag catcgaaaaa aaaaagtcct tcgccaaggg 900

catgggcgtg aagtccacac tcgtgtccgg ctccaaagtg tacatgacaa ccttcgccga 960

aggcagcgac gccaggctgg aaaagatcgt ggagggcgac agcatcagga gcgtgaatga 1020

gggcgaggcc ttcagcgctg aaatggccga taaaaacgcc ggctataaga tcggcaacgc 1080

caaattcagc catcctaagg gctacgccgt ggtggctaac aaccctctgt atacaggacc 1140

cgtccagcag gatatgctcg gcctgaagga aactctggaa aagaggtact tcggcgagag 1200

cgctgatggc aatgacaata tttgtatcca ggtgatccat aacatcctgg acattgaaaa 1260

aatcctcgcc gaatacatta ccaacgccgc ctacgccgtc aacaatatct ccggcctgga 1320

taaggacatt attggattcg gcaagttctc cacagtgtat acctacgacg aattcaaaga 1380

ccccgagcac catagggccg ctttcaacaa taacgataag ctcatcaacg ccatcaaggc 1440

ccagtatgac gagttcgaca acttcctcga taaccccaga ctcggctatt tcggccaggc 1500

ctttttcagc aaggagggca gaaattacat catcaattac ggcaacgaat gctatgacat 1560

tctggccctc ctgagcggac tgaggcactg ggtggtccat aacaacgaag aagagtccag 1620

gatctccagg acctggctct acaacctcga taagaacctc gacaacgaat acatctccac 1680

cctcaactac ctctacgaca ggatcaccaa tgagctgacc aactccttct ccaagaactc 1740

cgccgccaac gtgaactata ttgccgaaac tctgggaatc aaccctgccg aattcgccga 1800

acaatatttc agattcagca ttatgaaaga gcagaaaaac ctcggattca atatcaccaa 1860

gctcagggaa gtgatgctgg acaggaagga tatgtccgag atcaggaaaa atcataaggt 1920

gttcgactcc atcaggacca aggtctacac catgatggac tttgtgattt ataggtatta 1980

catcgaagag gatgccaagg tggctgccgc caataagtcc ctccccgata atgagaagtc 2040

cctgagcgag aaggatatct ttgtgattaa cctgaggggc tccttcaacg acgaccagaa 2100

ggatgccctc tactacgatg aagctaatag aatttggaga aagctcgaaa atatcatgca 2160

caacatcaag gaatttaggg gaaacaagac aagagagtat aagaagaagg acgcccctag 2220

actgcccaga atcctgcccg ctggccgtga tgtttccgcc ttcagcaaac tcatgtatgc 2280

cctgaccatg ttcctggatg gcaaggagat caacgacctc ctgaccaccc tgattaataa 2340

attcgataac atccagagct tcctgaaggt gatgcctctc atcggagtca acgctaagtt 2400

cgtggaggaa tacgcctttt tcaaagactc cgccaagatc gccgatgagc tgaggctgat 2460

caagtccttc gctagaatgg gagaacctat tgccgatgcc aggagggcca tgtatatcga 2520

cgccatccgt attttaggaa ccaacctgtc ctatgatgag ctcaaggccc tcgccgacac 2580

cttttccctg gacgagaacg gaaacaagct caagaaaggc aagcacggca tgagaaattt 2640

cattattaat aacgtgatca gcaataaaag gttccactac ctgatcagat acggtgatcc 2700

tgcccacctc catgagatcg ccaaaaacga ggccgtggtg aagttcgtgc tcggcaggat 2760

cgctgacatc cagaaaaaac agggccagaa cggcaagaac cagatcgaca ggtactacga 2820

aacttgtatc ggaaaggata agggcaagag cgtgagcgaa aaggtggacg ctctcacaaa 2880

gatcatcacc ggaatgaact acgaccaatt cgacaagaaa aggagcgtca ttgaggacac 2940

cggcagggaa aacgccgaga gggagaagtt taaaaagatc atcagcctgt acctcaccgt 3000

gatctaccac atcctcaaga atattgtcaa tatcaacgcc aggtacgtca tcggattcca 3060

ttgcgtcgag cgtgatgctc aactgtacaa ggagaaaggc tacgacatca atctcaagaa 3120

actggaagag aagggattca gctccgtcac caagctctgc gctggcattg atgaaactgc 3180

ccccgataag agaaaggacg tggaaaagga gatggctgaa agagccaagg agagcattga 3240

cagcctcgag agcgccaacc ccaagctgta tgccaattac atcaaataca gcgacgagaa 3300

gaaagccgag gagttcacca ggcagattaa cagggagaag gccaaaaccg ccctgaacgc 3360

ctacctgagg aacaccaagt ggaatgtgat catcagggag gacctcctga gaattgacaa 3420

caagacatgt accctgttca gaaacaaggc cgtccacctg gaagtggcca ggtatgtcca 3480

cgcctatatc aacgacattg ccgaggtcaa ttcctacttc caactgtacc attacatcat 3540

gcagagaatt atcatgaatg agaggtacga gaaaagcagc ggaaaggtgt ccgagtactt 3600

cgacgctgtg aatgacgaga agaagtacaa cgataggctc ctgaaactgc tgtgtgtgcc 3660

tttcggctac tgtatcccca ggtttaagaa cctgagcatc gaggccctgt tcgataggaa 3720

cgaggccgcc aagttcgaca aggagaaaaa gaaggtgtcc ggcaattccg gatccggacc 3780

taagaaaaag aggaaggtgg cggccgctta cccatacgat gttccagatt acgcttgagg 3840

taccctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 3900

tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 3960

taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 4020

gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata gcaggcatgc tggggagagg 4080

gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt agagagataa 4140

ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt 4200

aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc 4260

ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa 4320

acaccgcaag taaaccccta ccaactggtc ggggtttgaa acatgcgcag cgtgcagcag 4380

gcgttgtaga tgcaagtaaa cccctaccaa ctggtcgggg tttgaaacaa gtcgatgcgc 4440

agcgtgcagc aggcgttgca agtaaacccc taccaactgg tcggggtttg aaactttttt 4500

tcccgggaat ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 4560

cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 4620

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc 4680

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct 4740

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 4800

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 4860

gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 4920

ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 4980

gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 5040

tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt 5100

tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 5160

ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 5220

ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 5280

gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 5340

agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 5400

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 5460

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 5520

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 5580

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 5640

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 5700

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 5760

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 5820

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 5880

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 5940

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 6000

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 6060

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 6120

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 6180

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 6240

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta 6300

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 6360

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 6420

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 6480

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 6540

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 6600

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 6660

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 6720

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 6780

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 6840

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 6900

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 6960

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 7020

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 7080

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 7140

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 7200

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 7494

Claims

1.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列靶向破坏PTBP1 mRNA，所述sgRNA的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:1-31中任一所示基础序列，或由所述基础序列3’端和/或5’端截短至少一个碱基后得到序列长度≥20nt的截短序列，或与所述基础序列或截短序列相似性≥90％的扩展序列。

2.根据权利要求1所述的靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO:1-8，SEQ ID NO:12-24，SEQ ID NO:26-27，SEQ ID NO:29-30，SEQ ID NO:32-44，SEQ ID NO:51-75，SEQ ID NO:78-81，SEQ ID NO:84-87任一所示序列。

3.根据权利要求1所述的靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO:1-7，SEQ ID NO:12-13，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:32-43，SEQID NO:51-53，SEQ ID NO:74-75，SEQ ID NO:84-85任一所示序列。

4.一种编码靶向破坏PTBP1 mRNA的sgRNA的表达载体，其特征在于，包含编码如权利要求1-3任一项所述的sgRNA的核苷酸序列。

5.一种靶向破坏PTBP1 mRNA的组合物，其特征在于：包含sgRNA系统和Cas13d酶系统，所述sgRNA系统直接或间接包含权利要求1-3任一项所述的sgRNA，所述Cas13d酶系统直接或间接包含Cas13d酶。

6.根据权利要求5所述的靶向破坏PTBP1 mRNA的组合物，其特征在于：所述Cas13d酶为CasRx。

7.根据权利要求5所述的靶向破坏PTBP1 mRNA的组合物，其特征在于：所述sgRNA至少为2条。

8.一种递送权利要求5所述组合物的递送系统，其特征在于，所述递送系统采用RNP递送、脂质体递送、纳米粒递送、病毒递送中的至少一种。

9.权利要求1-3中任一项所述的sgRNA、权利要求4所述的sgRNA表达载体、权利要求5-7中任一项所述的组合物、权利要求8所述的递送系统在制备用于治疗将PTBP1 mRNA水平下调有利的疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括：肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。